“Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, através da

transferência de massa diferencial destes entre duas fases que estão em contato íntimo.”

Migração Diferencial dos componentes

Aspectos históricos da comatografia:

1906: Botânico russo utilizou os termos
• Cromatografia
• Cromatograma
• Método Cromatográfico
• Separação dos componentes da mistura a partir de extrato de folhas e gemas de ovo,
utilizando colunas recheadas com vários sólidos e éter de petróleo.

Chrom – cor
Graphe – escrever
Embora o processo não dependa da cor, o termo cromatografia permaneceu

Classificações da Cromatografia
1. Conforme a Técnica empregada
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
FE: sólido sobre uma superfície plana
FM : sistema de solventes
• Cromatografia em Coluna (CC)
FE: sólido dentro de uma coluna cilíndrica
FM: sistema de solventes
• Cromatografia Gasosa (CG)
FE: sólido ou líquido dentro de uma coluna capilar
FM: gás pressurizado
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
FE: sólido dentro de uma coluna de aço
FM: sistema de solventes

2. Conforme a quantidade a ser analisada

• Analítica
CCD – espessura da cromatoplaca – 0,25 mm
CC – diâmetro interno da coluna – 2 a 6 mm
• Preparativa:
CCD – espessura da cromatoplaca – 1 mm
CC – diâmetro interno da coluna – 6 a 50 mm
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD

1. Definição
Separa componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma
camada delgada de adsorvente retida sobre uma superfície plana.
2. Principais usos
• Para a determinação do número de componentes em uma mistura: de um extrato
bruto ou de mistura reacional
• Para a determinação da identidade de duas substâncias: se duas substâncias
apresentarem uma mesmo mancha elas podem ser idênticas
• Para monitorar o progresso de uma reação: analisa-se apenas uma amostra da
mistura reacional
• Para determinar a eficiência de uma purificação: Após técnicas de separação, é
possível verificar se a purificação foi efetiva.
• Para determinar as condições apropriadas para uma coluna cromatográfica: testar
vários meios para separação das substâncias.
• Para monitorar uma coluna cromatográfica: Durante a purificação, é possível
acompanhá-la por CCD.

3. Vantagens
• Fácil execução
• Separação em curto espaço de tempo
• Reprodutibilidade
• Baixo custo

4. Termos técnicos
Rf : fator de retenção

x2
5. Adsorventes (fase estacionária) mais utilizados
• Sílica SiO2 Ácido sílica amorfo altamente poroso (Fase Polar)

Quanto mais polar a substância mais

tempo ficará adsorvida na sílica!

• Alumina - Al2O3
• Substâncias apolares

6. Sistema de solventes (fase móvel)

• Há uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra pela superfície do
adsorvente.
• Série elutrópica:
n-hexano, THF, CHCl3, DCM, AcOEt, ACN, EtOH, MeOH, H2O

polaridade

7. Procedimento prático

7.1 Preparação das placas

Pode-se utilizar placas prontas
7.2 Ativação das Placas
 (105-110o C por 30 a 60 min)
7.3 Seleção da fase móvel
Seguindo a série elutrópica, escolher um sistema de solventes que melhor separe a
mistura (tentativa e erro)

7.4 Aplicação as amostra nas placas

- Com capilar (qualitativa)
- Com micro-seringa (quantitativa)
7.5 Revelação dos cromatogramas
- Tornar visíveis as manchas que aparecem na cromatoplaca
- Vários métodos podem ser utilizados

E. robusta E. saligna Eucalyptus sp. E. uniflora

• Revelação sob luz ultravioleta a 254 nm

- Indicado para substâncias com cromóforos (sistemas conjugados), pois absorvem radiação
UV e tornam-se fluorescentes
- A placa deve conter fluoresceína (indicador de fluorescência)
• Revelação com vapores de iodo
- Revelador universal para qualquer substância orgânica
- Forma manchas marrons
- A placa é colocada em uma cuba com iodo, que sublima à temp. ambiente
- Pode ser eliminado por aquecimento
• Métodos químicos (destrutivo)
- A solução do revelador é borrifada na cromatoplaca com ar comprimido
- Após aquecimento: ocorre uma reação da substância com o revelador formando uma
mancha colorida
- Exemplos: CeSO4 (universal), valinina (compostos aromáticos), ninidrina (aminoácidos), FeCl 3
(fenólicos)
• Métodos biológicos (método bioautográfico)
- Quando há uma procura por substâncias com atividade biológica (p. ex. antifúngica)
- Revelador: suspensão de fungos
- Baseia-se na inibição do crescimento do fungo

7.6 Cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP)

Utilizada para separar misturas na ordem de 30 mg
- Preparação da placa (20X20 cm) com 1 mm de espessura
- Aplicação com um pente
- Revelação apenas com luz ultravioleta
- Extração da substância a partir da sílica com solvente orgânico polar
- Evaporação do solvente leva à substância pura
CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

1. Definição
Mesmo princípio da CCD mas a fase estacionária está dentro de um tubo de vidro.

2. Esquema da coluna cromatográfica

Amostra

3. Principais usos
Separação e purificação de substâncias em maior escala (a partir de 50 mg até 50 g)

4. Processos de adsorção em coluna

A atividade cromatográfica do sólido (fase estacionária) tendo grupos polares aumenta
sobre substâncias polares observando a seguinte ordem:

-CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-

5. Procedimento prático
• Escolha do eluente por CCD
• Enchimento da coluna com a fase estacionária
- proporção adsorvente/substância: 25:1
- o enchimento deve ser uniforme
• Aplicação da amostra
- colocada no topo da coluna
- a amostra pode estar solubilizada em um mínimo de solvente ou misturada com o
adsorvente
• Eluição
 - ordem crescente de polaridade (exemplo)
- a fase móvel arrasta os componentes da amostra a serem cromatografados
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)

1. Definição
Separação baseada na distribuição das substâncias da amostra entre a fase
estacionária e a fase móvel (gasosa).

2. Técnica
• Vaporização da amostra com altas temperaturas (250 oC)
• A corrente de gás arrasta a amostra
• Conforme as propriedades das substâncias e a FE, elas serão mais ou menos retidas
• chegaram à saída da coluna em tempos diferentes, sendo então registradas

tR2
tR1

Ponto de
injeção
Temperatura da coluna constante – isotérmica
Temperatura variável – programada: melhora a separação e reduz o tempo de análise

3a. Vantagens
• Alta sensibilidade (até pg – 10-12 g)
• Análise rápida

3b. Desvantagens
• As amostras devem ser estáveis termicamente ou voláteis
• Se não forem deve-se formar um derivado
• Não pode ser utilizada em escala preparativa

4. Esquema do equipamento para CG

1- Fonte de gás de arraste 4- Coluna cromatográfica
2- Controlador da vazão e regulador da pressão 5- Sistema de detecção
3- Sistema de injeção da amostra 6- Registrador
4.1 Fonte do gás de arraste
• Cilíndro contendo um gás sob alta pressão serve de fase móvel
• Gases mais utilizados: N2, He, H2 e Ar
• Não deve interagir com o conteúdo da coluna e deve ser barato, disponível e puro
4.2 Controladores de vazão
• Vazão do gás de arraste deve ser constante durante a análise
• Atuam fazendo uma constrição manual do fluxo de gás
4.3 Injeção da amostra
• Quantidade injetada não deve ultrapassar o limite da coluna
• A injeção deve ser uniforme (microseringas) ou pode-se utilizar um injetor automático
4.4 Coluna cromatográfica
• Tubo longo de aço inox; as mais utilizadas são as colunas capilares (30 m)
• A fase estacionária pode ser líquida ou sólida
• Substâncias com a mesma capacidade de serem adsorvidas podem ser separadas, se
apresentarem volatilidades diferentes.
• Líquida: líquido pouco volátil recobre o suporte sólido (metil silicone)
• Sólida: sólido finamente dividido (sílica ou alumina)
4.5 Sistemas de detecção
• O mais utilizado é o detector de ionização de chama (FID)
• Quando as moléculas chegam ao detector elas são queimadas em uma chama,
ocorrendo a formação de íons (detectados pelo eletrodo), a corrente gerada é
ampliada e captada pelo registrador.

5. Principais usos
• Separação e quantificação de produtos diversos
• Técnica de identificação (quando acoplada a um espectrômetro de massas)
• Análise ambiental: determinação de vários poluentes do ar atmosférico como
aldeídos, cetonas, compostos aromáticos)

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – HPLC

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
1. Definição
Sistema de cromatografia em que a fase estacionária (material especialmente
preparado) está contida em tubos de aço, e a fase móvel é eluída sob altas pressões.

2.a. Vantagens
• Menor tempo de análise: Consegue-se separações em poucos minutos;
• Alta resolução: É possível analisar misturas complexas, como por exemplo a urina
humana, onde se pode detectar até duzentos compostos diferentes;
• Resultados quantitativos: análises quantitativas de fácil execução e grande precisão;
• Boa sensibilidade: É possível detectar nanogramas de substâncias;
• Automação: Há sistemas totalmente automatizados, desde a injeção da amostra à
obtenção do cromatograma.

2.b. Desvantagens
• Alto custo de instrumentação: A aquisição do instrumento representa um alto
investimento, o que só se justifica com uma quantidade razoável de análises;
• Alto custo de operação: Custo elevado da fase móvel (com alto grau de pureza) e das
fases estacionárias (possuem tempo de meia-vida);
• Necessidade de analista experiente: Para se obter o máximo do aparelho, é necessário
um operador experiente.

3. Esquema do equipamento de HPLC

Sistema de manipulação de dados

3.1 Sistemas de solventes
• Ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
• Ter baixa viscosidade ;
• Ser compatível com o tipo de detector utilizado;
• Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes
da amostra.

Sistemas de solventes mais utilizados

Fase reversa: solventes com uma polaridade razoável (geralmente MeOH/H 2O, ACN:H2O)
Substâncias mais polares eluem primeiro
Obs. Pode-se adicionar em pequena proporção AcOH na água para melhorar a resolução.
Fase normal: solventes com uma polaridade menor (geralmente hexano: AcOEt, hexano: DCM,
hexano:clorofórmio, ou tolueno ou benzeno no lugar do hexano)
Substâncias menos polares eluem primeiro.

Vazão da fase móvel

Pode-se utilizar um fluxo constante da fase móvel – isocrático ou um fluxo variável durante a
corrida - gradiente.
3.2 Sistema de Bombeamento
• A coluna apresenta resistência à vazão da fase móvel
• Há a necessidade de sistemas de bombas de alta pressão (400 Bars), para a fase móvel
migrar através da coluna
 • Há um fluxo da fase móvel definido (1 mL/ min) – precisão
• Pressão máxima na faixa de 600 bars.
• Vazão contínua sem pulsos, ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos
• Intervalo de vazões entre 0,01 e 10 ml/min para aplicações analíticas e até 100 ml/min
para aplicações preparativas.
• Inércia química a solventes comuns.

3.3 Sistema de injeção

• Microseringas – quantidades definidas
• Injetores automáticos

3.4 Sistema de separação (coluna)

• Coluna fechada, reaproveitável (pode-se fazer mais de cem análises seguidas na
mesma coluna);
• Tubos de aço inoxidável, com superfícies internas finamente polidas;
• Diâmetro interno de 3 a 5mm para colunas analíticas e maior ou igual a 10mm para
colunas preparativas. (comprimento em geral fica entre 10 e 50cm)
• Colunas sempre retas.
• Os dois tipos mais utilizados são:

- Fase normal (fase estacionária, geralmente SiO2)

grupos funcionais apolares não serão retidos
grupos funcionais polares serão fortemente retidos
grupos polarizáveis (aromáticos), apresentam interações dipolo-dipolo e também
serão retidos
As substâncias muito polares ficam muito retidas na coluna, então é necessário
aumentar a polaridade da fase móvel (gradiente).

-Fase reversa (fase estacionária de natureza apolar)

Geralmente modifica-se a estrutura da sílica, ligando-se uma molécula apolar (cadeia
de hidrocarboneto)
octil – C8H17, octadecil – C18H37, fenil C6H5

- Fase quiral (fase estacionária – polissacarídeo)

Utilizada para a separação de enantiômeros.

3.5 Sistemas de detecção

Na saída da coluna a substância é detectada pelos detectores. Há vários tipos que
podem ser utilizados, e devem ter os seguintes pré- requisitos:

• Alta sensibilidade e baixo limite de detecção

• Insensibilidade a mudanças na temperatura e na vazão da fase móvel
• Resposta independente da fase móvel
• Resposta que aumente linearmente com a quantidade de soluto
• Não destruição do soluto

Tipos de detectores
- Espectrofotométrico: por absorbância no ultravioleta e no visível: mais utilizado, a substância
deve absorver no comprimento de onda utilizado (geralmente 254 e 280 nm): onde a maioria
das substâncias orgânicas absorvem
- Fluorescência: para compostos fluorescentes (maior sensibilidade)
- Índice de Refração: segundo mais utilizado em HPLC, acompanha a diferença do índice de
refração da FM pura e da FM que arrasta as substâncias (utilizado para substâncias que não
absorvem no uv)
- Eletroquímico: análise de traços (as moléculas devem ser espécies oxidáveis)

3.6 Sistema de manipulação de dados

• Pode-se utilizar um simples registrador
• Os mais sofisticados possuem um computador acoplado
• O cromatograma é representado graficamente

4. Principais aplicações

Identificação, isolamento e quantificação

Exercícios - Cromatografia

(1) Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi analisada pela
técnica de cromatografia em camada fina
 O

I II III

A mistura foi aplicada em uma cromatoplaca de sílica com indicador de fluoresceína. Após a
eluição com hexano-éter etílico (4:1) e revelação sob luz de ultravioleta (254 nm), a
cromatoplaca apresentou o seguinte aspecto:

Rf=0,34

Quando a cromatoplaca foi revelada com iodo, foram reveladas três manchas. A quais
estruturas correspondem as manchas obtidas nos Rf 0,34 e 0,77?

(2) Uma mistura contendo os compostos abaixo, foi submetida à cromatografia em coluna,
utilizando-se sílica como fase estacionária, e um sistema de solventes com polaridade
crescente. Essa cromatografia foi monitorada por cromatografia em camada delgada.

OH
HO
HO

I II III

Sobre esta análise é correto afirmar que:

 
(a) As primeiras frações a eluirem da coluna, continham a substância I
(b) As últimas frações a eluirem da coluna, ao serem analisadas por cromatografia em camada
delgada, e visualizadas sob luz ultravioleta (254 nm), não mostraram o aparecimento de
nenhuma mancha
(c) As substâncias I e II eluiram juntas durante a cromatografia em coluna
(d) A substância I foi eluída somente quando a proporção do solvente polar, no sistema de
eluição, foi aumentada
(e) Durante o monitoramento por cromatografia em camada delgada, todas as substâncias
foram visualizadas sob luz ultravioleta (254 nm).

(3) Um químico deseja separar os compostos abaixo por cromatografia em coluna, utilizando
sílica com adsorvente.
CH2CH3 CH2CH3 CH2CH3

N
X Y Z

Para tal, percolou a coluna seqüencialmente com os solventes I, II e III, que formam uma série
eluotrópica. A primeira fração continha o composto X, a segunda fração, o composto Y, e a
 última fração, o composto Z. Qual dos sistemas de solventes abaixo serve como fase líquida
para justificar a ordem de eluição encontrada?

(4) A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é um dos métodos cromatográficos mais
modernos utilizados em análise (CLAE analítica) e separação/purificação de misturas (CLAE
preparativa). Abaixo estão representados os cromatogramas X, Y e Z de uma mistura de
compostos presentes em analgésicos: aspirina (A), cafeína (B), fenacetina (C) e paracetamol
(D), utilizando três fases móveis diferentes, no modo isocrático, em uma mesma coluna.
Analisando estes cromatogramas, responda as perguntas abaixo:
(a) Qual a fase móvel mais apropriada para ser utilizada em escala
preparativa, e a fase móvel mais indicada para a utilização em escala
analítica, considerando um grande número de amostras a serem
analisadas? Justifique sua resposta.
(b) Que tipo de coluna (fase reversa ou fase normal) utilizada nesses três
experimentos? Justifique sua resposta.
(c) Sabendo-se que o composto polar elui primeiro, qual o composto de
maior tempo de retenção? Justifique sua resposta.