HPLC 原理及應用 TODAY’S TOPICS

„ HPLC THEORY
(HPLC分析原理)

主講人:蕭碧蓮
„ HPLC INSTRUMENTS
工研院能源與環境研究所
(HPLC分析儀器)

中華民國九十九年六月十九日
„ CONCLUSION (總結)

Separation Techniques Why Use Liquid Chromatography

„ Fractional Distillation „ Wide range
g of molecular weight
g
„ GC „ Variety of separation mechanism
„ TLC „ N
Non-destructive
d t ti and d good
d mass capacity
it
„ LC(IC,GPC,HPLC…etc)
( ) „ Non-volatile sample
p without derivatization
„ Electrophoresis „ Ionized or ionic compound
„ Filt ti
Filtration „ Near ambient
i temperature
„ Centrifugation
g „ Large historical database
TOPICS 1 HPLC THEORY

„ HPLC THEORY „ chromatography簡稱層析。

(HPLC分析原理) „ chromatography之發展：
GC→HPLC →IC →超臨界流體層析(SFC)
„ HPLC INSTRUMENTS „ — 係一種分離技術。
係一種分離技術
(HPLC分析儀器) „ — 操作過程：利用含混合物之移動相(mobile
phase)流經固定相(stationary phase) 。
„ CONCLUSION (總結)

HPLC THEORY HPLC THEORY

„ — 分離機制： „ HPLC - HIGH PERFORMANCE LIQUID
„ o 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分 CHROMATOGRAPHY, 高效能液相層析儀
配係數不同(即親和力不同) 。 (利用高壓推動的方式加速層析)
„ o 各成分移動速率不同，而達到分離之目的。
„ — 化合物與固定相親和力較強，則沖提較慢 „ HPLC的應用
C的應用 : 胺基酸
胺基酸、蛋白質、核酸、碳氫
蛋白質 核酸 碳氫
(即滯留時間長) 化合物、農藥、藥物、殺蟲劑、食品、抗生素、
„ — 化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快
化合物與移動相的親和力較強 則沖提較快 膽固醇 有機金屬 無機物 致癌物 有機合
膽固醇、有機金屬、無機物、致癌物、有機合
(即滯留時間短)。 成物 ……分析
HPLC THEORY HPLC THEORY
HPLC 的數種分離方式 :
„ 分配層析法

„ 吸附層析法

„ 離子層析法

„ 大小排除層析法

TOPICS 2 HPLC INSTRUMENTS

HPLC分析儀器 所包含的元件 :
„ HPLC THEORY
(HPLC分析原理) „ 1. DEGASSING SYSTEM
(脫氣系統)
„ HPLC INSTRUMENTS „ 2 PUMP (幫浦)
2.
(HPLC分析儀器) „ 3. INJECTOR (注入系統)
„ 4. COLUMN OVEN (管柱恆溫器)
„ CONCLUSION (總結)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ HPLC分析儀器 所包含的元件 :

„ 5. COLUMN (分析管柱)
„ 6. DETECTOR (偵檢器)
„ 7 DATA STATION (資料收集器)
7.
„ 8. 其他週邊配備

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

„ DEGASSING SYSTEM (脫氣系統)

„ 為什麼移動相會產生氣泡?
„ 要如將氣泡排除?
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ PUMP (幫浦) „ PUMP (幫浦)

„ 功能 : 抽取移動相 „ 1. Isocratic elution (等位流洗)

→ 使移動相能充滿、 2. Gradient elution (梯度流洗)
移動於整個HPLC系統

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

Isocratic elution (等位流洗) Gradient elution (梯度流洗)

HPLC
H

HPLC
H
幫浦

幫浦
 HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ Gradient Systems
-Multi-pump gradient system
one mobile
bil phase
h reservoiri per pump
solvent blending
g is after pump
p p heads
(high pressure gradient)

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

Gradient Systems
-Single-pump gradient system
t
two tto four
f mobile
bil phase
h reservoirs
i
solvent blendingg is before p
pumpp heads
(low pressure gradient)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ COLUMN OVEN (管柱恆溫器 (烘箱) ) „ INJECTOR (注入系統)

„ 功能 : 使移動相 HPLC分析管柱達恆
使移動相、HPLC分析管柱達恆 „ 功能 : 注射樣品
溫狀態
→ 恆溫狀態使分析圖譜穩定
→ 縮短分析物滯留時間

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

„ INJECTOR (注入系統) „ INJECTOR (注入系統)
„ 原理
„ 何謂SAMPLE LOOP ?

„ SAMPLE LOOP的功能 ?
→ 準確的控制樣品的
注射量 (volume)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ INJECTOR (注入系統) „ COLUMN (HPLC分析管柱)

„ 分類 : 1. 手動注射器 „ 功能 : 以不同的 PHASES (充填材)

(充填材)，提
提
2. 自動取樣機 供多樣化的樣品分析

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

„ COLUMN (HPLC分析管柱) „ COLUMN (HPLC分析管柱)
規格 :
1. 長度 „ 充填材料 (COLUMN PACKING
2. 內徑 MATERIALS) :
3. 充填材
→ 固定相、粒徑 „ 材質 : C18(ODS)、C8、Silica、
孔徑 支持
、孔徑、支持
Phenyl、NH2、CN、SAX、
體……
SCX、C1 、C6………
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
„ COLUMN (HPLC分析管柱) „ COLUMN (HPLC分析管柱)

„ 充填材料 (COLUMN PACKING „ 充填材料 (COLUMN PACKING

MATERIALS) : MATERIALS) :

„ 粒徑 : 3μm、4μm、5μm、8μm、 „ 孔徑 : 60Å(6nm)、100Å、120Å、150Å、
10μm、12μm、15μm ……… 200Å 300Å …
200Å、300Å

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

„ COLUMN (HPLC分析管柱) „ COLUMN (HPLC分析管柱)

„ 充填材料 (COLUMN PACKING „ 充填材料 (COLUMN PACKING

MATERIALS) : MATERIALS) :

★ 充填材的 材質、粒徑、孔徑和支
„ 支持體 : SILICA GEL BASED、
持體…
持體 …等的不同，對於分析效果
POLYMER BASED、 有很大的差異 !
CAPSULE TYPE ………
 HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
• COLUMN (HPLC分析管柱
(HPLC分析管柱))
„

• 結構 :
„ 功能 : 檢測由分離管柱分出之待測化合物

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

„ DETECTOR (偵檢器) „ DETECTOR (偵檢器)
„ UV/VIS DETECTOR (紫外光/可見光偵檢器) :
„ 分類 : UV/VIS (紫外光/可見光)
(紫外光/可見光)、螢光、
螢光
電化學、折射率、電導度、質譜、 ★ 適用於具有 UV/Vis 吸光性之結構體
FT IR 光散射 光學活性
FT-IR、光散射、光學活性 ★ 不同化合物具有不同的波長吸收度
(物性)
 HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
■ UV/VIS DETECTOR原理： „ DETECTOR (偵檢器)
利用可見光及紫外光之燈管 (Lamp)
(L )
做為光源，通過濾光鏡調整色調後 „ FLUORESCENE DETECTOR (螢光偵檢器) :
，經聚焦後通過單色光分光稜鏡，
再經過狹縫選擇波長，使成單一且
特定波長之光線，而後射入樣品管 ★ 僅適用於具有 螢光性之結構體
中之水樣中，最後射入光電管中將 ★ 敏感度極高
光能轉換為電器訊號，藉由樣本及
空白水樣間所吸收之光能量差，與
標準液之能量吸收值相比較，便可
律定樣本中之待測物濃度。

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

■ FLUORESCENE DETECTOR 原理 : „ DETECTOR (偵檢器)
利用一強光(氙燈)照射樣品 „ REFRACTIVE INDEX DETECTOR
管 ，其波長短足以激發樣品 (曲折率偵檢器) :
中各成分放出螢光 ，再用光
再用光
電管和分光濾光設備測定所
發螢光強度；由螢光強度可
★ 分析化合物之折光率 (物性)
決定該成分的含量 ，同時由
螢光的波長，又可確認該成 ★ 常用於醣類分析
分是什麼物質。
分是什麼物質
 HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
■REFRACTIVE INDEX DETECTOR原理 :
„ DETECTOR (偵檢器)
„ MASS SPECTROMETER DETECTOR

利用稜鏡使光線穿過樣本後色 (質譜儀偵檢器) :
散；入射光是單一波長光線，
其色散折射角與樣本的折射率
有關；將光電管放在一定的角 ★ 測量各個成分的質量以及它們的相對含量以及
度上，樣本的折射率不同，則 其分子結構的能力
折射到光電管的光線強度就不
同。

HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS

在相對的電極棒以電線相連接，施加直流電
■MASS SPECTROMETER DETECTOR原理:
„
壓(dc)及射頻電壓(rf)於其上，故在Y軸方向
由於物質的分子，在高能射線的照射後
由於物質的分子 在高能射線的照射後 上電極棒電壓為負電
上電極棒電壓為負電，X軸方向上電極棒電
軸方向上電極棒電
會離子化，同時也會分解成為一些碎片， 壓為正電，且射頻電壓(rf)與Y軸電壓的相位
質譜即是由離子化碎片造成；而質譜儀 差180 直流電壓與射頻壓在四極矩中間會
差180°。直流電壓與射頻壓在四極矩中間會
是使一群碎片離子通過磁場或電場後, 形成一電場，使得離子在其中產生一定規則
帶電體同時會在電場中運動，且受到電 之振動軌跡，而不同質荷比（m/z）遵循不
場吸引或排斥 再利用一些特殊安排
場吸引或排斥，再利用一些特殊安排 同之振動軌跡 唯有呈穩定振動之離子才可
同之振動軌跡，唯有呈穩定振動之離子才可
(EX:四極體式)的電場，使碎片離子在運 通過四極矩而到達偵檢器被偵測到，其他呈
動時，因質量不同而分開。 不穩定振動之離子則撞擊到四極矩上而被中
四極矩式分析器(Quadrupole Mass 和。不同質荷比之離子在場中的解析能力（
Spectromater)主要是由四支圓柱形的 mass resolution）決定於加在電極棒上的dc
電 極棒所組成，以四方形之對角線形 及rf電壓的比值 固定dc/rf的比值 並同時
及rf電壓的比值，固定dc/rf的比值，並同時
成雙曲 面排列，使其在棒中央形成一 改變dc及rf的電壓，可使不同質荷比的離子
個靜電場。 被偵測到。
HPLC INSTRUMENTS TOPICS 3
„ DATA STATION (資料收集器)
„ HPLC THEORY
數據接收 / 處理軟體 /軟體應用 (HPLC分析原理)

„ HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)

„ CONCLUSION ((總結)

CONCLUSION END
„ HPLC 包含４種分離模式(分配、吸附、離子、大小
排除)
Thanks For Your Attention
„ HPLC 以分析管柱(column) 將化合物分離，再經由
偵檢器及積分器，準確定性
偵檢器及積分器 準確定性 / 定量待測化合物
定量待測化合物。
Any
„ 不同phase的分析管柱，對單一種化合物的分析效果
有顯著的差異。 question ?
„ 選擇適當的column&偵檢器方能有效分離及偵測待
測物。
„ column&moble
l & bl phase&compounds之間,是必擇選
h & d 之間 是必擇選
其適切的搭配較能達到預期的分析效果。