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高效能液相層析儀

高效能液相層析儀

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HPLC

主講人:蕭碧蓮
工研院能源與環境研究所
中華民國九十九年六月十九日
TODAY’S TOPICS
HPLC THEORY
(HPLC分析原理)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)
CONCLUSION (總結) (總結)
Separation Techniques
Fractional Distillation
GC
TLC TLC
LC(IC,GPC,HPLC…etc) ( )
Electrophoresis
Filt ti Filtration
Centrifugation g
Why Use Liquid Chromatography
Wide range of molecular weight g g
Variety of separation mechanism
N d t ti d d it Non-destructive and good mass capacity
Non-volatile sample without derivatization p
Ionized or ionic compound
i Near ambient temperature
Large historical database Large historical database
TOPICS 1
HPLC THEORY
(HPLC分析原理)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)
CONCLUSION (總結)
HPLC THEORY
chromatography簡稱層析。
chromatography之發展: chromatography之發展:
GC→HPLC →IC →超臨界流體層析(SFC)
係一種分離技術 —係一種分離技術。
—操作過程:利用含混合物之移動相(mobile
phase)流經固定相(stationary phase) 。
HPLC THEORY
—分離機制:
o 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分
配係數不同(即親和力不同) 。
o 各成分移動速率不同,而達到分離之目的。
—化合物與固定相親和力較強,則沖提較慢 —化合物與固定相親和力較強,則沖提較慢
(即滯留時間長)
化合物與移動相的親和力較強 則沖提較快 —化合物與移動相的親和力較強,則沖提較快
(即滯留時間短)。
HPLC THEORY
HPLC - HIGH PERFORMANCE LIQUID
高效能液相層析儀 CHROMATOGRAPHY, 高效能液相層析儀
(利用高壓推動的方式加速層析)
HPLC的應用: 胺基酸、蛋白質、核酸、碳氫 C的應用: 胺基酸 蛋白質 核酸 碳氫
化合物、農藥、藥物、殺蟲劑、食品、抗生素、
膽固醇、有機金屬、無機物、致癌物、有機合 膽固醇 有機金屬 無機物 致癌物 有機合
成物……分析
HPLC THEORY
HPLC 的數種分離方式:
分配層析法
吸附層析法 吸附層析法
離子層析法
大小排除層析法 大小排除層析法
HPLC THEORY
TOPICS 2
HPLC THEORY
(HPLC分析原理)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)
CONCLUSION (總結)
HPLC INSTRUMENTS
HPLC分析儀器 所包含的元件:
1. DEGASSING SYSTEM
(脫氣系統)
2 PUMP (幫浦) 2. PUMP (幫浦)
3. INJECTOR (注入系統)
4. COLUMN OVEN (管柱恆溫器)
HPLC INSTRUMENTS
HPLC分析儀器 所包含的元件:
5. COLUMN (分析管柱) 5. COLUMN (分析管柱)
6. DETECTOR (偵檢器)
7 DATA STATION (資料收集器) 7. DATA STATION (資料收集器)
8. 其他週邊配備
HPLC INSTRUMENTS
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
DEGASSING SYSTEM (脫氣系統)
為什麼移動相會產生氣泡?
要如將氣泡排除?
HPLC INSTRUMENTS
PUMP (幫浦)
功能: 抽取移動相 功能: 抽取移動相
→使移動相能充滿、
移動於整個HPLC系統 移動於整個HPLC系統
HPLC INSTRUMENTS
PUMP (幫浦)
1. Isocratic elution (等位流洗) 1. Isocratic elution (等位流洗)
2. Gradient elution (梯度流洗)
HPLC INSTRUMENTS
H
Isocraticelution(等位流洗)
H
P
L
C
Isocratic elution (等位流洗)


HPLC INSTRUMENTS
H
Gradient elution(梯度流洗)
H
P
L
C
Gradient elution (梯度流洗)


HPLC INSTRUMENTS
Gradient Systems
-Multi-pump gradient system
bil h i one mobile phase reservoir per pump
solvent blending is after pump heads g p p
(high pressure gradient)
HPLC INSTRUMENTS
HPLC INSTRUMENTS
Gradient Systems
-Single-pump gradient system
t t f bil h i two to four mobile phase reservoirs
solvent blending is before pump heads g p p
(low pressure gradient)
HPLC INSTRUMENTS
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN OVEN (管柱恆溫器(烘箱) )
功能: 使移動相、HPLC分析管柱達恆 功能: 使移動相 HPLC分析管柱達恆
溫狀態
恆溫狀態使分析圖譜穩定 →恆溫狀態使分析圖譜穩定
→縮短分析物滯留時間
HPLC INSTRUMENTS
INJECTOR (注入系統)
功能: 注射樣品 功能: 注射樣品
HPLC INSTRUMENTS
INJECTOR (注入系統)
原理
HPLC INSTRUMENTS
INJECTOR (注入系統)
何謂SAMPLE LOOP ? 何謂SAMPLE LOOP ?
SAMPLE LOOP的功能? SAMPLE LOOP的功能?
→準確的控制樣品的
注射量(volume)
HPLC INSTRUMENTS
INJECTOR (注入系統)
分類: 1. 手動注射器 分類: 1. 手動注射器
2. 自動取樣機
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
功能: 以不同的PHASES (充填材),提 功能: 以不同的PHASES (充填材) 提
供多樣化的樣品分析
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
規格 規格:
1. 長度
2. 內徑
3. 充填材
→固定相、粒徑
、孔徑、支持 孔徑 支持
體……
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
充填材料(COLUMN PACKING 充填材料(COLUMN PACKING
MATERIALS) :
材質: C18(ODS)、C8、Silica、
Phenyl、NH2、CN、SAX、
SCX、C1 、C6………
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
充填材料(COLUMN PACKING 充填材料(COLUMN PACKING
MATERIALS) :
粒徑: 3μm、4μm、5μm、8μm、
10μm、12μm、15μm ………
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
充填材料(COLUMN PACKING 充填材料(COLUMN PACKING
MATERIALS) :
孔徑: 60Å(6nm)、100Å、120Å、150Å、
200Å 300Å 200Å、300Å …
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
充填材料(COLUMN PACKING 充填材料(COLUMN PACKING
MATERIALS) :
支持體: SILICA GEL BASED、
POLYMER BASED、
CAPSULE TYPE ………
HPLC INSTRUMENTS
COLUMN (HPLC分析管柱)
充填材料(COLUMN PACKING 充填材料(COLUMN PACKING
MATERIALS) :
充填材的 充填材的材質、粒徑、孔徑和支 材質、粒徑、孔徑和支
持體 持體……等的不同,對於分析效果 等的不同,對於分析效果

有很大的差異 有很大的差異!!
HPLC INSTRUMENTS
•• COLUMN (HPLC COLUMN (HPLC分析管柱 分析管柱)) COLUMN (HPLC COLUMN (HPLC分析管柱 分析管柱))
•• 結構 結構::
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
功能: 檢測由分離管柱分出之待測化合物 功能 檢測由分離管柱分出之待測化合物
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
分類: UV/VIS (紫外光/可見光)、螢光、 分類: UV/VIS (紫外光/可見光) 螢光
電化學、折射率、電導度、質譜、
FT IR 光散射 光學活性 FT-IR、光散射、光學活性
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
UV/VIS DETECTOR (紫外光/可見光偵檢器) :
★適用於具有UV/Vis 吸光性之結構體
★不同化合物具有不同的波長吸收度 ★不同化合物具有不同的波長吸收度
(物性)
HPLC INSTRUMENTS
利用可見光及紫外光之燈管(L )
■UV/VIS DETECTOR原理:
利用可見光及紫外光之燈管(Lamp)
做為光源,通過濾光鏡調整色調後
,經聚焦後通過單色光分光稜鏡,
再經過狹縫選擇波長,使成單一且
特定波長之光線,而後射入樣品管
中之水樣中,最後射入光電管中將 中之水樣中,最後射入光電管中將
光能轉換為電器訊號,藉由樣本及
空白水樣間所吸收之光能量差,與
標準液之能量吸收值相比較,便可
律定樣本中之待測物濃度。
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
FLUORESCENE DETECTOR (螢光偵檢器) :
★僅適用於具有螢光性之結構體
★敏感度極高 ★敏感度極高
HPLC INSTRUMENTS
■FLUORESCENE DETECTOR 原理:
利用一強光(氙燈)照射樣品
管,其波長短足以激發樣品
中各成分放出螢光 再用光 中各成分放出螢光,再用光
電管和分光濾光設備測定所
發螢光強度;由螢光強度可 發螢光強度;由螢光強度可
決定該成分的含量,同時由
螢光的波長,又可確認該成
分是什麼物質 分是什麼物質。
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
REFRACTIVE INDEX DETECTOR
(曲折率偵檢器) : (曲折率偵檢器) :
★分析化合物之折光率(物性) ★分析化合物之折光率(物性)
★常用於醣類分析
HPLC INSTRUMENTS
■REFRACTIVE INDEX DETECTOR原理: ■REFRACTIVE INDEX DETECTOR原理:
利用稜鏡使光線穿過樣本後色
散;入射光是單一波長光線,
其色散折射角與樣本的折射率
有關;將光電管放在一定的角 有關;將光電管放在一定的角
度上,樣本的折射率不同,則
折射到光電管的光線強度就不 折射到光電管的光線強度就不
同。
HPLC INSTRUMENTS
DETECTOR (偵檢器)
MASS SPECTROMETER DETECTOR
(質譜儀偵檢器) : (質譜儀偵檢器) :
★測量各個成分的質量以及它們的相對含量以及 ★測量各個成分的質量以及它們的相對含量以及
其分子結構的能力
HPLC INSTRUMENTS
■MASS SPECTROMETER DETECTOR原理:
由於物質的分子 在高能射線的照射後 由於物質的分子,在高能射線的照射後
會離子化,同時也會分解成為一些碎片,
質譜即是由離子化碎片造成;而質譜儀
是使一群碎片離子通過磁場或電場後,
帶電體同時會在電場中運動,且受到電
場吸引或排斥 再利用一些特殊安排 場吸引或排斥,再利用一些特殊安排
(EX:四極體式)的電場,使碎片離子在運
動時,因質量不同而分開。
四極矩式分析器(Quadrupole Mass
Spectromater)主要是由四支圓柱形的
電極棒所組成,以四方形之對角線形 電極棒所組成,以四方形之對角線形
成雙曲面排列,使其在棒中央形成一
個靜電場。
HPLC INSTRUMENTS
在相對的電極棒以電線相連接,施加直流電
壓(dc)及射頻電壓(rf)於其上,故在Y軸方向
上電極棒電壓為負電 軸方向上電極棒電 上電極棒電壓為負電,X軸方向上電極棒電
壓為正電,且射頻電壓(rf)與Y軸電壓的相位
差180°。直流電壓與射頻壓在四極矩中間會 差180 直流電壓與射頻壓在四極矩中間會
形成一電場,使得離子在其中產生一定規則
之振動軌跡,而不同質荷比(m/z)遵循不
同之振動軌跡 唯有呈穩定振動之離子才可 同之振動軌跡,唯有呈穩定振動之離子才可
通過四極矩而到達偵檢器被偵測到,其他呈
不穩定振動之離子則撞擊到四極矩上而被中
和。不同質荷比之離子在場中的解析能力(
mass resolution)決定於加在電極棒上的dc
及rf電壓的比值 固定dc/rf的比值 並同時 及rf電壓的比值,固定dc/rf的比值,並同時
改變dc及rf的電壓,可使不同質荷比的離子
被偵測到。
HPLC INSTRUMENTS
DATA STATION (資料收集器)
數據接收/ 處理軟體/軟體應用 數據接收/ 處理軟體/軟體應用
TOPICS 3
HPLC THEORY
(HPLC分析原理)
HPLC INSTRUMENTS HPLC INSTRUMENTS
(HPLC分析儀器)
CONCLUSION (總結) ( )
CONCLUSION
HPLC 包含4種分離模式(分配、吸附、離子、大小
排除) 排除)
HPLC 以分析管柱(column) 將化合物分離,再經由
偵檢器及積分器,準確定性/ 定量待測化合物。 偵檢器及積分器 準確定性/ 定量待測化合物
不同phase的分析管柱,對單一種化合物的分析效果
有顯著的差異。
選擇適當的column&偵檢器方能有效分離及偵測待
測物。
l & bl h & d 之間是必擇選 column&moble phase&compounds之間,是必擇選
其適切的搭配較能達到預期的分析效果。
END
Thanks For Your Attention
AAny
question ?

高效能液相層析儀 (利用高壓推動的方式加速層析) HPLC的應用 : 胺基酸、蛋白質、核酸、碳氫 C的應用 胺基酸 蛋白質 核酸 碳氫 化合物、農藥、藥物、殺蟲劑、食品、抗生素、 膽固醇 有機金屬 無機物 致癌物 有機合 膽固醇、有機金屬、無機物、致癌物、有機合 成物 ……分析 .HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY.TOPICS 1 HPLC THEORY (HPLC分析原理) HPLC INSTRUMENTS (HPLC分析儀器) CONCLUSION (總結) HPLC THEORY chromatography簡稱層析。 chromatography之發展: GC→HPLC →IC →超臨界流體層析(SFC) — 係一種分離技術 係一種分離技術。 — 操作過程:利用含混合物之移動相(mobile phase)流經固定相(stationary phase) 。 HPLC THEORY — 分離機制: o 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分 配係數不同(即親和力不同) 。 o 各成分移動速率不同,而達到分離之目的。 — 化合物與固定相親和力較強,則沖提較慢 (即滯留時間長) — 化合物與移動相的親和力較強 則沖提較快 化合物與移動相的親和力較強,則沖提較快 (即滯留時間短)。 HPLC THEORY HPLC .

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