Res Suc. Quin. Peri, 2003, 69, N"4, (222-228) AISLAMIENTO DE UNA FRACCION PROTEICA DE BAJO PESO MOLECULAR DE SEMILLAS DE MACA. (Lepidium peravianum G. Chacén) CON PROPIEDADES ANTIFUNGICAS. Juan Carlos Alvarez Pizarro', Mario Monteghirfo Gomero' RESUMEN Se ha aisiado una fraccién de bajo peso molecular de semillas de maca (Lipidium peruvianum G. Chacsn) que presenta actividad antifungica. Los péptidos que la componen son globulinas con pesos moleculares comprendidos entre 5.0 y 8.5 kDa, son basicos y forman oligomeros. La fraccién aislada inhibe el crecimiento de Fusarium sp y Verticillium dahliae, Phitoptora infestans, Rhizotocnia solani y Moniliophtora roreri Palabras clave: péptidos basicos, electroforesis, globulinas, actividad antifingica, extension hifal ABSTRACT A low molecular weight fraction of maca seeds (Lepiaium peruvianum G. Chacén) have been isolated. It has antifungal activity. The peptides are globulin-type proteins. The molecular weights of these peptides range from 5.0 to 8.5 kDa, ate highly basic and forms oligomers. The isolated fraction inhibited the growth of Fusarium sp and Verticillium dahliae, Phitoptora infestans, Rhizotocnia solani and Moniliophtora roresi. Key words: basic peptides, electrophoresis, globulins, antifungal activity. 1. INTRODUCCION Estudios bioquimicos y moleculares han revelado que las plantas despliegan diferentes barreras o mecanismos de defensa contra cierlus patégenos, entre los que destaca Ja participacion de numerosas proteinas de defensa que actuan impi- diendo el ingreso o inhibiendo el desarrollo de microorganismos en la planta huésped'. Estas proteinas de defensa incluyen a las enzimas hidroliticas quitinasas y gluconasas, inhibidores de amilasas y péptidos antimicrobianos. Este ultimo grupo comprende un conjunto de proteinas que tienen una longitud aproximada de 50 residuos de aminodcidos e inhiben el desarrollo de microorganismos in vitro®. Se han aislado de diferentes tejidos vegetales como: hojas, flores, tubér- culos y principalmente semilas, y muestran una actividad antifingica y antibacteriana sobre diferentes especies fitopatogenas. Asi, en Raphanus sativis se han aislado los péptidos antifiingicos RsAFP! y RsAFP2 de naturaleza basica y oligomérica’. Asimismo, en Brassica rapa. B. napus. Sinapsis alba y Arabidopsis thaliana sc han aislado también péptides con propiedades bioquimicas y antiftingicas similares*. (1) Centro de Investigacién en Bioquimica y Nutricién. Universidad Nacional Mayorde San Marcos. Av. Grau 755, Lima; fax: 3283236; E-mail: mongomma@ec-red.com223 Aistantionto de wna fraccién protetoa ite bajo peso molecular de semitlas de maca No existiendo antecedentes que reporten el estudio de péptidos antifiingicas en cultivos ancinos, en el presente trabajo -que fue parte de la tesis para obtener el titulo de bidlogo de Juan Carlos Alvarez Pizarro- describimos el aislamiento y ca- racterizacion de una fraccién proteica de bajo peso molecular de semillas de maca (Lepidium penevianum G. Chacén), cultivo andino de ta familia Brassicaceae. Ti. MATERIAL Y METODOS. Material biolégico. Las semillas de maca (Lepidium peruvianum) fueron adquiridas en una casa comercial del Departamento de Junin. Las cepas de hon- gos fitopatdgenos Fusarium sp. Rhizotocnia solani, Phitophtora infestans y Verticillium dahliae fueron propotcionadas por el Centro Internacional de la Papa (CIP), en La Molina, Lima, Peri, y Moniliophtora roreri por el Servicio Nacio- nal de Sanidad Agraria (SENASA). Extraccién de Proteinas Totales, Se tomé una alicuota de 15 mg de semillas molidas de maca so homogenizaron con 600 ull de un buffer de cxtraccién de proteinas (SDS 2%, 2-mercaptoetanol 1%, Tris-HCI 0.05M pH 8.8) durante } hora, La muestra se centrifugé a 10,000 rpm por $ minutos. El sobrenadante colectado se precipité con 4 volimenes de acetona helada durante | hora a -20 °C. Las proteinas precipitadas fueron centrifugadas a 10,000 rpm durante 2 mi- autos. Se eliminé el sobrenadante y el precipitado se secé al vacio. Extraccién de albuminas, globulinas, prolaminas y glutelinas, Se utilizé una alfeuota de 15 mg de semillas molidas de maca pare la extraccidn secuencial de las fracciones siguiendo el método descrito por Lei y ReeckS. Las fracciones se precipitaron con 4 volimenes de acetona helada durante | hora y se centrifugaron 9 10,000 rpm por 2 minutos. E! precipitado se secé al vacio. Fracciéa de Bajo Peso Molecular (FBPM) Alicuotas de 15 mg de semillas molidas de maca se homogenizaron secuencialmente con un volumen de 600 jt] de los siguientes solventes: H,O,4 acido acético al 1%, H,O ys y NaCl 0.5 M. Cada paso de extraccién se repitié 2 veces a excepcién de Ia extraccién con NaCl 0,5 M, que solamente se hizo una vez. Entre cada paso de extraccién Js muestra fue centrifugada 2 10,000 rpm por 5 minutos, los sobrenadantes fueron colectados y el precipitado fue resuspendido en la solucién siguiente. Cada sobrenadante se precipité con 4 voliimenes de acetona helada a -20 °C durante 1 hora. Las proteinas precipitadas fueron concentradas por centrifugacion y luego secadas al vacio, Parte del sobrenadante de {a extraccién salina se empleé en los bioensayos. Cuantificacién de Proteinas. La cuantificacién de proteinas se realizé se- gin ej método descrito por Bradford M.° Electroforesis unidimensional. Las diferentes muestras de proteinas se ana- lizaron utilizando el sistema discontinuo Bicina/Tris SDS/PAGE descrito por Kiafki et al’. La concentracién del gel de apilamiento fue 5% y del gel de sepa- racién 15%,nan C Aba corm, Mario Momteghinfr Gomoro 22, Electroforesis bidimensional. Los péptidos de semitlas de maca se anali: ron siguiendo el método de electroforesis en gel con gradiente de pH no equili- brado (NEPHGE) deserito por O° Farrell *. Bioensayos (inhibicién de crecimiento de hongos). La actividad antifingica fue determinada bajo condiciones estériles empleando un ensayo de inhibicién de extensidn hifal (9), en placas Petri conteniendo agar dextrosa papa (PDA), como medio de crecimiento. Se realizaron controles negatives en medios de cul- tivo con proteasa pronasa E y fracciones dializadas contra Tris HCl 0.05M pH 6.8, NaC] 0.05M en membrana de didlisis de corte de 1000 Da. Por cada trata- miento se hicieron tres repeticioncs. UL. RESULTADOS: Anilisis electroforético de las proteinas de bajo peso molecular de semi: Has de maca. E] patron electroforético de las proteinas totales muestra la exis- tencia de un grupo de bajo peso molecular (entre 5,0 - 8,5 kDa) conformando la fraceién de bajo peso molecular (FBPM) o péptidos de semillas de maca. Se observa que la mayorfa de las proteinas pertenecen a las fracciones albimina y globulina con ausencia de proteinas tipo prolamina y glutelina y que las protei nas de bajo peso molecular estan presentes en la fraccién globulina (figura 1). En el patrén electroforético unidimensional de la FBPM, en condiciones reductoras, destacan 3 bandas polipeptidicas de 5.0, 6.2 y 7.0 kDa aproximada- mente (figura 2). En condiciones no reductoras esta fraccién proteica forma oligémeros, que se distribuyen entre los 12.5 - 20.5 kDa siendo los mas abun- dante los de peso molecular de 13.7 y 16.7 kDa (figura 2). 1 2 3 4 5 6 Figura 1. Bicina/Tris SDS/PAGE de fracciones proteicas de semilias de maca: 1, proteinas totales; 2, marcador de peso molecular; 3, albUminas; 4, globulinas; ‘5, prolaminas y 6, glutelinas.225 Aislamiento de una fraccidn proteica de bajo peso molecular de semillas de maca PM (kDa) - 66.0 ~ 45.0 - 34.7 -24.0 -2L.5 = -14.3 o -65 12345678 Figura 2. Bicina/Tris SDS/PAGE que muestra el resultado del fraccionamiento por solubilidad do las proteinas de semillas de maca: 1, proteinas totales; 2 y 8, marcador de peso molecular; 8, extr. acuosa; 4, extr, Acida; 5, exlr. acuosa; 6, extr. salina (FBPM reducida); 7, ext. salina (FBPM no reducica). Los patrones electoforéticos bidimensionales, segin el sistema NEPHGE- SDS/PAGE de la FBPM, muestra el cardcter basico de los péptidos que confor- man estra fraccién. Se observa también diferencias de carga entre péptidos de peso molecular similar o isofermas (figura 3). Figura 3. NEPHGE - SDS/PAGE de |a fraceidn de bajo peso molecular {péptidos) de ‘semillas de maca. Las flechas indican 2 péptidos de similar peso molecular, pero con diferencias en su punto isoeléctrico (isoformas). Actividad antifingiea (bioensayos). Al evaluar le actividad antifiingica de la FBPM, las cepas de Fusarium sp. y V. dahliae mostraron mayor susceptibili- dad 2 concentraciones equivalentes a 30 yigr, mientras que la actividad fue mo- derada frente a R. solani y M. roreri, y nula frente a P. infestans (figura 4). LosJuan C. Alvares Picarro. Mario Momteghrfo Gomera 226 ensayos posteriores se realizaron con Fusarium sp. como organismo de prueba. Para confirmar que la inhibicién de crecimiento de honges se debe a la presen- cia de péptidos antifingicos en la FBPM, se realizaron ensayos adicionales con la finalidad de descartar primero, la presencia de metabolitos secundarios coaislados con la fraccién que tengan un efecto similar sobre el crecimiento de hongos: y segundo, confirmar la naturaleza quimica de la molécula responsable de la actividad observada. Los resultados indican, primero que la FBPM dializada conserva la actividad de inhibicién de crecimiento sobre Fusarium sp, y segun- do, que la actividad es eliminada cuando la FBPM es ensayada en medios de cultivo suplementados con pronasa E, en donde se observa una desaparicién de las zonas de inhibiciénn de crecimiento hifal (figura 5). Figura 4. Ensayos de innibicion de extension hifal sobre el crecimiento de Fusarium sp (1); Verticilium dahliae (2); Ahizotocnia solani(3) y Moniliophiora roreri(4) con muestras de la fraccién de bajo peso molecular de semillas de maca: A) Control (0.5 M NaC), B) FBPM. Figura 5. Ensayos de inhibicién de extensién hilal sobre el crecimiento de Fusarium sp.: A) Control (0.8 M NaCl), B) 30 ygr de FBPM, C) 30 gr de FBPM dializada, D) FBPM en medio supiementado con Pronasa E.27 Aistamienta de una fraccién proteica de bajo peso molectilar de semillas de maca IV. DISCUSION En el presente trabajo, realizado con semillas maduras de maca (Lepidium peruvianum G. Chacén), se reporta el aislamiento y caracterizacién de una frac- cién de bajo peso molecular, conformada por péptidos basicos de tipo globulina que inhiben el crecimiento de hongos fitopatégenos y que formarian parte de los mecanismos defensivos que estas plantas poseen para detener el ataque de microorganismos patégenos. Introduciendo modificaciones al método de Lei y Reeck 5, se ha estandarizado un procedimiento que tiene la ventaja de asegurar una extraccién rapida, estéril y con alto rendimiento 10-12 mg/g de los péptidos antifingicos. Nuestro método se distingue de otros métodos descritos para el aislamiento de péptidos antifangicos por ser rapido, simple y de alto rendimien- to al compararlo con otros procedimientos que incluyen pasos de precipitacion con sales, desnaturalizaci6n selectiva por temperatura, cromatrografia de inter- cambio idnico ?*"°, Los péptidos antifiingicos de maca presentan caracteristicas bioquimicas ob- servadas también en péptidos de otras especies vegetales, como son; un punto isoeléctrico alto y una estructura nativa oligomérica * '"-!?, La demostracién de la inhibicién del crecimiento de hongos fitopatégenos como, Verticillium dahliae, que causa enfermedades en numerosos cultivos vegetales, como la papa, presen- ta-a los péptidos de maca como candidatos potenciales en trabajos de biotecnologia a través del empleo de sus secuencias codificadoras para transfor- mar cultivos de importancia econémica, con la finalidad de incrementar sus ni- veles de resistencia frente a enfermedades provocadas por hongos fitopatégenos. Nuestro trabajo busca contribuir con este objetivo. V. CONCLUSIONES . Se ha aislado una fraccién de bajo peso molecular de semillas de maca (Lepidium peruvianum G. Chacén) compuesta de péptidos tipo giobulina de cardeter basico con pesos moleculares comprendidos entre 5.0 y 8.5 kDa. . La péptido de la fraccidn aislada inhiben el crecimiento de los hongos fitopatégenos Fusarium sp, Verticillium dahliae, Phithoptora infestans, Rhizotocnia solani y Monilliophtora roreri. NJuan C. Ahares Picarre, Mesto Montegharfo Gomere VI. REFERENCIAS Bowles Dianna. (1990). Annual Review of Biochemical, Vol. 59, 873 - 907. Rao Gururaj A. (1995), Antimicrobial Peptides, Molecular Plant-Microbe jateractions, Vol. 8.NPL, 6-13, Terras F., et, al. (1992), Journal of Biological Chemistry, Vol. 267, N° 22, 15301 - 15309. Terras F., et, al. Torrekens (993). FEBS Lest, Vol. 316, N° 3, 233 - 240.4 Lei M. & Reeck G, (1986). Cereal Chemical, Vol. 62, N° 2. 11 - 116. Bradtord M, (1976). Analitical Biochemistry. Vol. 72, 248 = 254. Klatky H,, Wiltfang J., Staufenbiel M. (1996). Analvtical Biochemistry, Vol, 237, 24 - 29. ‘Ovfarrell P. (1977). Celf, Vol, 12, 1133 ~ 1142. Roberts W., Selitrennikoff C, (1986). Biochimica ex Biophysica Acta, Vol. 880, 161 - 170. 0. Bloch C., Richardson M. (1991). FEBS Lert, Vol. 279, N® 1, 101 = 104. L Kragh K., Niclsen J., Nielsen K., Dreboldt S., Mikkelsen J. (1995). Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol, 8, 424 - 434, 12. Duvick J., et. al. (1992). Journal Biological Chemistry, Vol. 267, 18814 - 18820. ee a