JURNAL ILMIAH

IDENTIFIKASI PROTEIN MEMBRAN

SEL SPERMATOZOA MONYET EKOR PANJANG
(Macaca fascicularis) YANG DIINFEKSI VIRUS
AVIAN INFLUENZA SUBTIPE H5N1

Oleh :

ANDIK PRASTIAWAN
NIM 060610200

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2010
 IDENTIFICATION of SPERM MEMBRANE PROTEINS

of Macaca fascicularis INFECTED WITH H5N1 SUBTYPE

AVIAN INFLUENZA VIRUS

1)
Andik Prastiawan, 2)
Chairul Anwar Nidom, 3)
Nusdianto Triakoso,
4)
Rr. Sri Pantja Madyawati
1)
Mahasiswa, 2) Departemen Ilmu Kedokteran Dasar Veteriner,
3)
Departemen Klinik Veteriner, 4) Departemen Reproduksi Veteriner
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga

Abstract

The study aimed to finding out of membrane protein of sperm cell from
infected H5N1 of Macaca fascicularis. SDS-PAGE was the method of this study. The
sample of the study was taken through several stages. Use of electroejaculator, at
this stage the Macaca fascicularis was still alive. Subsequently, using centrifugation
technique, the spermatozoa protein had been separated and identificated by SDS-
PAGE method. The obtained protein bands were read based on their molecular
weights. The result of the protein molecular weight of spermatozoa cell membrane
from the control of Macaca fascicularis were 159,36 kDa, 128,29 kDa, 95,16 kDa, 70,58
kDa, 48,27 kDa, 29,62 kDa, 21,38 kDa, and 11,38 kDa. The result of the protein
molecular weight of sperm cell membrane from the infected H5N1 of Macaca
fascicularis were 128,29 kDa, 70,58 kDa, and 29,62 kDa. It showed that there were
differences protein of sperm cell membrane between the control of Macaca fascicularis
and the infected H5N1 of Macaca fascicularis that were seen on the molecular weight
of 159,36 kDa, 95,16 kDa, 48,27 kDa, 21,38 kDa dan 11,14 kDa. The main possibility
of the loss of five proteins had been caused by the infected of H5N1 virus to the
Macaca fascicularis.

Key word: Macaca fascicularis, membrane protein of sperm cell, Avian Influenza, SDS-
PAGE.

Pendahuluan
 Berdasarkan data dari Departemen Kesehatan RI, penyakit avian influenza bukan

hanya menginfeksi hewan, melainkan sudah menginfeksi manusia. Sejak 1 Januari

hingga 28 Desember 2009, terdapat 20 kasus H5N1 menyerang manusia di

Indonesia, 19 diantaranya meninggal dunia. Kasus H5N1 pertama terjadi pada

tanggal 9 Januari 2009 di Bogor, sementara kasus terakhir ditemukan tanggal 23

September 2009 di Jakarta Selatan. Dengan demikian secara kumulatif, total kasus

H5N1 di Indonesia sejak tahun 2005 – 2009 berjumlah 161 kasus, 134 diantaranya

meninggal dunia (Depkes, 2009).

Proses infeksi virus avian influenza terdiri dari dua tahap. Tahap pertama infeksi

virus avian influenza terjadi secara inhalasi. Pada tahap kedua, virion masuk ke

submukosa melalui kapiler. Kemudian virus mengalami replikasi didalam sel

endotel dan menyebar melalui sistem peredaran darah dan sistem limfatik,

selanjutnya menginfeksi sel organ visceral, otak dan kulit. Gejala klinis dan

kematian disebabkan karena kegagalan fungsi multiorgan (Radji, 2006). Disamping

itu, virus H5N1 telah menyebar ke saluran pencernaan. Virus ini juga ditemukan di

otak dan saluran reproduksi (Lipkin, 2009).

Salah satu organ reproduksi adalah testes. Testes adalah alat reproduksi jantan

yang mempunyai dua fungsi utama yaitu sebagai penghasil hormon testosteron

dan penghasil sel spermatozoa (Hardjopranjoto, 1995). Sel spermatozoa terdiri dari

kepala, leher, bagian tengah dan ekor (Hafez, 2000). Spermatozoa ditutup oleh

membran sel dari kepala sampai ekor, mempunyai struktur sangat komplek dalam

susunan mozaik yang teratur dan mempunyai peran biologik spesifik pada
permukaannya (Jones, 1989). Bagian luar membran sel spermatozoa banyak

mengandung reseptor spesifik untuk mengenali isyarat molekuler tertentu dari sel

lain, sehingga memungkinkan komunikasi antar sel (Aulanni’am, 2004). Pablo et al.

(1995) mengatakan bahwa membran sel spermatozoa mengandung beberapa

molekul yang berperan dalam fertilisasi, molekul tersebut adalah lipid dan protein.

Membran sel spermatozoa memiliki beberapa macam protein yang spesifik,

sehingga mengakibatkan fungsi berbeda tiap protein. Misalnya protein yang berada

di permukaan membran sel spermatozoa memiliki kemampuan untuk pengenalan

dan berikatan dengan zona pelusida (ZP) serta melaksanakan fusi dengan membran

sel telur (Serano and Dorles, 2003). Penentuan berat molekul protein merupakan

salah satu metode untuk mengidentifikasi protein. Salah satu metode yang

digunakan untuk mengidentifikasi protein adalah SDS-PAGE. Metode SDS-PAGE

dapat digunakan untuk identifikasi protein antigen berdasarkan berat molekulnya

(Rantam, 2003).

Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) telah digunakan sebagai hewan model

dalam banyak penelitian bidang kesehatan. Beberapa penelitian berkaitan dengan

penyakit zoonosis banyak dilakukan mengunakan monyet ekor panjang (Macaca

fascicularis), hal itu disebabkan hewan ini lebih dekat dengan manusia secara

fungsional dan anatomi daripada hewan pengerat. Penggunaan monyet ekor

panjang (Macaca fascicularis) sebagai hewan coba diharapkan dapat memberikan

informasi yang dapat diekstrapolasikan kepada manusia (Groves, 2005).

 Berdasarkan latar belakang diatas maka perlu dilakukan penelitian untuk

identifikasi protein membran sel spermatozoa monyet ekor panjang (Macaca

fascicularis) diinfeksi dengan virus avian influenza subtipe H5N1.

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Animal BSL3, Laboratorium Avian

Influenza Institute of Tropical Disease Universitas Airlangga (Surabaya) yang

dilaksanakan pada bulan Februari 2010 sampai Juli 2010.

Hewan percobaan yang digunakan adalah monyet ekor panjang jantan 2 ekor

yang telah dewasa kelamin dengan tanda skrotum besar dan sudah berumur 5-6

tahun dengan berat badan 4-6 kg dari PT. Inquitex Bogor. Bahan yang digunakan

antara lain : ketamin HCL, atropin, virus subtipe H5N1, BO-cafein, PBS,

phenylmethenesulfonyl fluorid (PMSF), etanol, tris-HCL, separating gel, aquadest,

stacking gel, coomasie blue, cairan destaining, running buffer, alkohol. Alat yang

digunakan antara lain : sarung tangan, objek glass, cover glass, elektroejakulator,

probe kids, tabung berskala, tabung reaksi, mikroskop, sentifus, yellow tip, mikro

pipet, tissue, elektroforesis, comb atau pencetak sumuran dari gel, chamber, biorad,

peralatan bedah mikro.

Pengambilan Spermatozoa Menggunakan Elektroejakulator

Pada monyet ekor panjang yang tidak diinfeksi. Cara pengambilan spermatozoa

sebagai berikut. Monyet ekor panjang dianastesi menggunakan ketamin HCL

dengan dosis 2-4 mg/kgbb dan atropin 0,02-0,04 mg/kgbb intramuskuler.

Selanjutnya dilakukan koleksi spermatozoa dengan elektroejakulator melalui anal,

memasukkan probe kids ke anus monyet ekor panjang. mengalirkan sejumlah arus

dengan voltage 15 volt. Spermatozoa ditampung dalam tabung berskala. Pada

monyet ekor panjang yang diinfeksi dengan virus avian influenza subtipe H5N1,

pengambilan spermatozoa sama dengan langkah yang tidak diinfeksi dengan pada

monyet ekor panjang. Langkah yang membedakan adalah pemberian virus avian

influenza secara intranasal sebanyak 500 µl dengan konsentrasi 10 6 TCID50 dan secara

intubasi trakea sebayak 500 µl dengan konsentrasi 106 TCID50 (Ruat et al, 2007).

Pemisahan Protein Sel Spermatozoa

Pengambilan spermatozoa pada monyet ekor panjang yang diinfeksi dan tidak

diinfeksi dengan virus avian influenza subtipe H5N1 yaitu pada saat hari ke 4 setelah

waktu infeksi berlangsung. Sampel spermatozoa sejumlah 0,15 ml ditambah PBS

dengan perbandingan 1:3 ditampung dalam tabung reaksi disentrifugasi dengan

kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk menghasilkan pellet dan plasma

seminalis. Pellet ditambah dengan medium BO-cafein 1 ml dan diinkubasi dalam

waterbath 20 menit pada suhu 37 0C, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan

3500 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, endapan ditambah dengan PBS 5

kali volume, ditambah Phenylmethenesulfonyl fluorid (PMSF) sebagai inhibitor enzim

protease sebanyak 5 kali volume, selanjutnya divortex selama 10 menit, dilanjutkan

dengan sonikasi selama 20 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama

10 menit. Endapan dibuang, supernatan ditambah dengan etanol dingin 1:1,

disimpan dalam refrigerator selama 1 jam sampai terbentuk bintik-bintik putih,

sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit. Supernatan dimasukkan

ke refrigerator selama 5 menit, kemudian etanol dibuang dan ektrak dikeringkan

menggunakan tissue, biarkan sampai bau etanol hilang. Selanjutnya ditambah

dengan Tris-HCL. Hasil akhir berupa isolat protein membran sel spermatozoa

(Aulanni’am, 2004).

Melakukan Identifikasi Protein Membran Sel Spermatozoa dengan SDS-PAGE

Memasukkan separating gel kedalam alat Elektroforesis melalui dinding sampai

bawah batas atas. Selanjutnya tambahkan akuades sampai batas atas supaya

separating gel rata. Selanjutnya akuades diserap dengan tissue dan tambahkan

stacking gel melewati dinding sampai penuh, masukkan comb atau pencetak sumuran

dari gel dan ditunggu terbentuk gel. Selanjutnya comb diambil dan dibersihkan dari

sisa gel dengan tissue. Cetakan gel yang sudah jadi dipindahkan dan dimasukan ke

dalam chamber, kemudian direndam dalam running buffer. Selanjutnya diletakkan

cetakan penuntun sampel yang akan di running. Sampel penelitian berupa isolat

protein membran spermatozoa sebanyak 35 µl dimasukkan ke dalam lubang cetakan

dengan tip 200 µl. Langkah berikutnya chamber dihubungkan dengan alat Biorad,

power supply dinyalakan dengan kekuatan 130 V, 30 mA selama 1,5 jam. Jika reaksi

gel sudah sampai bawah kemudian dimatikan dan plate dibuka dan dipisahkan.

Selanjutnya hasil berupa lembaran berbentuk gel diwarnai dengan coomasie blue dan

di sacker (digoyang) selama 30 menit. Kemudian dikeluarkan dan ditambah dengan

cairan destaining dan di sacker lagi selama 30 menit. Jika cairan tersebut sudah

terlihat biru diganti dengan cairan destaining yang baru begitu seterusnya sampai

cairan berwarna putih dan hasilnya berupa beberapa pita protein. Pita protein akan

dapat terlihat pada cetakan gel SDS-PAGE (Rantam, 2003).

Rancangan Penelitian dan Analisa Data

Rancangan penelitian adalah rancangan penelitian kualitatif.

Hasil dan Pembahasan

Pita protein membran sel spermatozoa monyet ekor panjang terdapat 8 pita yang

teridentifikasi: 159,36 kDa, 128,29 kDa, 95,16 kDa, 70,58 kDa, 48,27 kDa, 29,62 kDa,

21,38 kDa, 11,38 kDa. Hasil selengkapnya dapat dilihat gambar berikut :

Gambar 1. Hasil identifikasi protein membran sel spermatozoa monyet ekor panjang
dengan SDS-PAGE 10% perwarnaan Comassie Blue R-250.

Pita protein membran sel spermatozoa yang diinfeksi dengan virus avian influenza

subtipe H5N1 terdapat 3 pita yang teridentifikasi :128,29 kDa, 95,16 kDa, 29,62 kDa.

Hasil selengkapnya dapat dilihat gambar berikut :

Gambar 2. Hasil identifikasi protein membran sel spermatozoa monyet ekor panjang
yang diinfeksi virus avian influenza subtipe H5N1 dengan SDS-PAGE 10%
perwarnaan Comassie Blue R-250.

Jumlah pita protein presipitasi memiliki daya antigenitas yang berbeda. Menurut

Tizard (1982), salah satu faktor yang menentukan antigenitas suatu zat adalah

beratnya molekul. Molekul yang mempunyai berat molekul besar lebih antigenik

dibandingkan dengan molekul yang mempunyai berat molekul yang lebih kecil

walaupun antigenitasnya juga ditentukan dari kompleksitas fisiokimiawi suatu zat

(Natalia,2005).

Apabila dibandingkan hasil identifikasi protein membran sel spermatozoa monyet

ekor panjang yang tidak diinfeksi dengan virus avian influenza dengan hasil

identifikasi protein membran sel pada manusia didapatkan kesamaan satu berat

molekul protein membran sel spermatozoa yaitu pada berat molekul 48,27 kDa.
 Dari hasil penelitian ini terdapat perbedaaan berat molekul protein antara monyet

ekor panjang yang diinfeksi virus avian influenza subtipe H5N1. Perbedaan yang

nyata tersebut dikarenakan hilangnya 5 pita protein yaitu 159,36 kDa, 95,16 kDa,

48,27 kDa, 21,38 kDa dan 11,14 kDa. Diduga hilangnya lima protein tersebut

dikarenakan infeksi virus avian influenza subtipe H5N1 pada monyet ekor kera

panjang. Hilangnya lima protein tersebut diduga karena protein PB1 dan PB2 yang

terdapat pada virus avian influenza subtipe H5N1. Protein PB1 mengganggu fungsi

pada membran dalam maupun luar mitokondria spermatozoa, sedangkan PB2

mengganggu signal targetting pada mitokondria. Akibat gangguan virus avian

influenza subtipe H5N1, maka akan terjadi gangguan produksi ATP dan hambatan

pembentukan energi pada mitokondria. Diduga gangguan tersebut mengakibatkan

terganggunya metabolisme pada sel, salah satunya gagalnya pembentukan asam

amino yang merupakan senyawa pembentukan protein.

Kesimpulan

Kesimpulan pada penelitian ini terdapat pengaruh infeksi virus avian

influenza subtipe H5N1 terhadap protein membran sel spermatozoa monyet ekor

panjang dengan hilangnya 5 protein yaitu 159,36 kDa, 95,16 kDa, 48,27 kDa, 21,38

kDa dan 11,14 kDa.

Daftar pustaka

Aulanni’am, 2004. Prinsip dan Tehnik Analisis Biomolekul. Cetakan pertama.

Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya Press. Malang. Hal 16-22

Groves, C, Wilson DE & Reeder D M ed. . 2005. Mammal Species of the World (3rd
ed.). Baltimore: johns Hopkins University. Pp161-162. ISBN -0801-88221-4.
Hafez, E.S.E., 2000. Reproduction in Farm Animals. 7th .edition. Lea &Febiger.
Philadelphia.

Hardjopranjoto. 1995. Ilmu Kemajiran pada Ternak. Edisi I. Airlangga University

Press. Surabaya.

Jones, R.T. and Sherins, R.J .1989. Association of Fertility with Temporal Changes in
Ovarian Fungtion of Domestic Ruminants.
http://www.ccochrane/revabstr/ab002864.htm [20 Juli 2009]

Lipkin, Ian. 2009. Researches Discover Why Bird So Deadly. Voice of America.
United State of America (www.VoANews.com,2009)

Natalia. 2005. Isoalsi dan Identifikasi Protein. Jakarta

Pablo, EV., JL.Baile, GD.Moore, Dieyun Pan, PO. Clarke and GS.Kopf. 1995.
Capatitation of Mouse Spermatozoa : Correlation Between The Capatitation
State and Protein Tyrosine Phosphorylation. Development. 121. 1129-1137.

Radji, M. 2006. Avian Influenza A (H5N1) : Patogenesis, pencegahan, dan

Penyebaran pada Manusia. Majalah Ilmu Kefarmasian. Edisi Bulan Agustus,
3 (2) : 55-56 Depok. [22 maret 2007]

Rantam, F. A. 2003. Metode Imunologi. Airlangga University Press. Surabaya. Hal

145-162.
Serano, H and G.S Dorles. 2003. Molecular aspects of Mammalian Fertilization.
Asian journal of Andrology. 234-9.

Tizzard, . 1982 . Pengantar Imunologi Veteriner. Edisi ke dua. Airlangga University

Press. Surabaya. Hal 10-12, 846