60 estudo dos tecidos do corpoe de como estes os se organizam para constituir orgaos. HA quatro os fundamentais: tecido epitelil, teeido conjuntivo, jo muscular e tecido nervoso. tecidos sio constituidos por células e por matriz, lular (MEC). A MEC 6 composta por muitos tipos léculas, algumas das quais sao altamente orga- das formando estruturas complexas como fibrilas olgeno e membranas basais. As principais fungDes mente atribuidas a matriz. extracelular eram for- er apoio mecénico para as células e ser um meio para portar nutrientes as células e levar de volta cata- 0s e produtos de secrecao. Antigamente as células, {C eram consideradas entidades separadas. Os des progressos da pesquisa biomédica mostraram células produzem a MEC e séo a0 mesmo tempo enciadas ¢ controladas por moléculas da matriz. Hi, to, uma intensa interacdo entre células e MEC. xs moléculas da matriz sao reconhecidas e se ligam ptores presentes na superficie de células. A maioria receptores so moléculas que cruzam a membra- fa célula e que se conectam a moléculas presentes itoplasma. Assim, pode-se considerar que células € extracelular formam uma entidade continua que a conjuntamente e responde de modo coordenado ncias do organismo, la um dos tecidos fundamentais ¢ formado por tipos de células caracteristicas daquele tecido e iagdes e arranjos caracteristicos entre células e extracelular. Estas associagGes 580, geralmente, peculiares e failitam o reconhecimento dos muitos 3 de tecidos pelos estudantes. Por outro lado, ana- agora um nivel de organizacao acima dos tecidos, ‘a organizacao dos érgios, observamos que estes S50 sempre formados por uma associagio muito precisa ios tecidos. Esta associacao de tecidos resulta no smento adequado de cada 6ngao e do organismo Jum todo, O sistema nervoso € uma excesio, pois é tuido quase somente por tecido nervoso. Tistologia e Seus Métodos de Estudo PREPARACAO DE TECIDOS PARA EXAME MICROSCOPICO ‘Opequeno tamanho das étulas e dos componentes dama- tri tema ahistlogia dependente do uso de microscOpios. Além disso, pesquisas em quimica, fisiologia, imunologia ‘e patologia sao funcamentais para um conhecimento ade- ‘quado da biologia dos tecidos e dos Grgaos ede como seus varios componentes interagem na satide ena doenca. O.co- nnhecimento das ferramentas e dos métodos de investigagso ‘éessencial para uma compreensio adequada da estruturae funcionamento das cstulas, tecidos e 6rgaos. Neste capitulo sero apresentados alguns dos métodos mais comuns € 08, prineipios que fundamentam estes métodos. O procedimento mais usado no estudo de tecidos a0 ‘microscépio consiste na preparagdo de cortes histolbgicos. ‘No microsc6pio de luz (também chamado de microsc6pio 6ptico ou foténico) a imagem se forma apds um feixe de luz atravessar alguma estrutura, Células vivas, camadas muito delgadas de células ou de tecidos, membranas trans- parentes de animais vivos (por exemplo, o mesentério, a cauda de um girino, a parede de uma bolsa existente na bochecha de hamsters) podem ser observadas diretamente ‘a0 microsc6pio. Desta maneira, é possivel estudar essas, ‘estruturas por longos periodos sob diferentes condicdes fisiolégicas ou experimentais. No entanto, na maioria dos ‘casos 05 tecidos ¢ Srgaos so espessos e nao permitem a passagem adequada da luz:para formacao de uma imagem; antes de serem examinados no microscopio eles devem ser fatiados em secgoes ou cortes histol6gicos muito delgados que sio colocados sobre laminas de vidro. Os cortes 880 obtidos por meio de instrumentos de grande precisio chamados micrétomos, mas antes os tecidos e érgios ne- cessitam passar por uma série de tratamentos que sera deseritos a seguir. Fixagao, Logo apés sua remogio do corpo, células ou fragmentos de tecidos e érgaos devem ser submetidos a um proceso2 HISTOLOGIA BASICA chamado fixagio. A fixacdo tem varias finalidades: evitar a digestdo dos tecidos por enzimas presentes nas propria, céluias (aut6lise) ou em bactérias; endurecer os fragmen- tos; preservar em grande parte a estrutura ea composi¢a0, molecular dos tecidos. A fixagdo pode ser feita por métodos, ‘quimicos ou, menos freqiientemente, por métodos fisicos (veja mais adiante). Na fixacdo quimica os tecicos sao imer- 508 em solugdes deagentes cesnaturantes ou de agentes que estabilizam as moléculas formando pontes com moléculas vizinhas, Estas solugdes sio chamadas de fixadores. Como as células, roteina. Se como timi- -e quantas, ara dividir 1.1 Radioautogramas de glinduls salvar submandibulares de um camundongo que fol injtado com 3E-fucose 8 horas mic. tin cima mrp de a observa snes de prt Gta), nica a rei clare ‘alioatva’A maior porte daradiotvidade ests localzada no gros choplamaticos das clus dos ducts glandulares. toned. Embaina cdo preparedo para observarSo em icroscpioeetznico de tansmiselo, Observe os gris de pata parecen cone etruturas enovcadas (tas) localizadas picipalment sobre os grSnulascltoplasmticos (G) eno kimen (L) fibuls. Gand aumento, (Corteia deT.G. Lima e A. added.)10 MISTOLOGIA BASICA Fig. 1.12 Radioautogramas de cortes de Orgios de um rato que foi injetado com 3H-timidina. Os radioautogramas foram expostos durante um tempo muito 1ongo e por esta azo os nicleos ra- dioativos se tornaram fortemente marcados e aparecem cobertos por uma grande quantidade de granulos escuros, A: Muitas ‘élulas epiteliais estavam se dividindo na base das glandulas intestinais (setas), mas nenhuma no festante das vilosidades, B: Umorte de linfonodo mostra quea divisto de suas células ocorre principalmente nos centros germinativos desta estrutura (seta), (Cortesia de Telma M.T. Zor, Mauricio Soto-Suazo, Cleusa MR, Pellegrini e W.E. Stumpf) CULTURA DE CELULAS E TECIDOS Em um organismo complexo as eélulas so banhadas pelo plasma sanguineo que contém centenas de subs- tancias diferentes. Células podem ser mantidas vivas e estudadas fora do corpo, o que é muito ttil para estudar 0 efeito isolado de moléculas sobre um tipo de célula ou tecido, A cultura de células permite também a andlise direta do comportamento de células vivas por meio de um microscépio, e além disso varias experiéncias que nao podem ser executadas em um animal vivo podem ser feitas in vitro, ig. 1.13 Fotomicrografia de fibroblastos de galinha que foram cultivados e infectados com Trypanosoma criti, que 0 38 pe {quenas particulas espalhadas pelo citoplasma (setas). Emborae Separagio entre as células nao seja visivel, 0s seus niicleos so facilmente observados (N). Coloragao pelo método Médio aumento. (Cortesia de S. Yoneda.) As células e 0s tecidos sao cultivados em solucies de composi¢ao conhecida (sais, aminoacidos, vitaminas) 3s quais sio freqilentemente adicionados components do soro. Para preparar culturas de um tecido ou 6rgéo, 8 células devem ser inicialmente separadas mecanicament ‘ou por meio de tratamento enzimatico. Uma vez isoladis, as células podem ser cultivadas em suspensao ou podem ser colocadas sobre uma placa de Petr (leita de vidro ou pléstico) ou sobre uma laminula de vidro, superficies sobre as quais elas costumam aderire crescer sob forma de wma tinica camada de células (Fig, 1.3). Culturas feitas desta maneira sao chamadas culturas primérias. A maioria das células obtidas de tecidos normais tem uma duragdo de vvidafinita, programada geneticamente. Muitos tipos de c& lulas originalmenteisolados a partir de tecidos normais ou patol6gicos e mantidos in vitro constituem agora linhagens permanentes de células. Para permitir a "imortalidade™ de células normais in vitro hé necessidade de submetéls a um processo chamado de transformagio. Todos 0s proHISTOLOGIA ESEUS METODOS DEESTUDO 11 ecimentos com células e tecidos vivos devem obviamente er executaclos em uma drea estéril e usando-se solugoes € quipamento estéreis Acultura ce células tem sido extensamente usada para o ‘estudo do metabolismo de estulas normais ecancerosas, te para o desenvolvimento de novos farmacos. Esta téc- nea também é itil para o estudo de microorganismos ‘que 56 crescem no interior de oshulas, como os virus, 0 Mycoplasma e alguns protozodtios (Fig, 1.13) Em citogenctica, a determinacio do cariotipo (o ni- ‘mero a morfologia dos cromossamos de um individuo) Fesleserreizada pelo clive nfocos do singe ‘ude fbroblastos da pele. Examinando células durante 1 divisio mitética podem-se descobrir anomalias, no 1orfologia dos cromossomos, que podem tadas com numerosas doencas genética. ‘Alem disso, a cultura de células € essencial para a apli ‘eaglo de técnicas modiernas de biologia molecular u IONAMENTO CELULAR las e outros componentes das células e tecidos po- ser purificados e isolados por meio de uma técnica B da fracionamento celular. Este é um processo fisico elo qual é usada forca centrifuga para separar organelas componentes celulares em fungao de seus coeficientes sedimentago. O coeficiente de sedimentacéo de uma sticula depende de seu tamanho, forma, densidade e 3 cosidade do meio em que esté suspensa (Fig, 1.14). A snposicio quimica e fungdes das organelas e moléculas dem entio ser estudadas in vitro. As fragdes obtidas qu foram pr estas téicas podem ser analisadas ao microsc6pio er irnico para verificar sua pureza (Fig. 1.15). 4 nileos 580 STOQUIMICA E CITOQUIMICA termos histoquimica ¢ citoquimica so usados para x métodos que identificam e localizam substancias A corleshistologicos ou em eélulas cultivadas. Ha varios 5 de Giemsa. clugdes de imentos para obter estas informagies, a maioria ba- aminas) as da em reacoes quimicas especificas ouem interacoes de mentes do alfinidade entre moléculas. Estes métodos normaimente 1 Srgio, as sm substnciasinsoliveis coloridas ou elétron-den- nicamente que permitem a localizacao de stomos ou moléculas 6 zisoladas, pr microscopia de luz ou eletronica ‘ou podem le vidro ou ‘Membranas- sce urs made uma ea Bs st IN 0pm ln conporcc ned previs e cerita ial Ac do sada ges iain ci cs unde Secs ae ne spor Aes ee ee ees ae eee iposde cé- normais ou linhagens rtalidade” ibmeté-las Hos os pro- bear ott com tesoura e depois dissociado com um homogeneizador ou por ultra-som. (2) O tecido dissociado permanece em 0 durante cerca de 20 min para que grumos no dissociados e fibras ca matriz extracelular precipitem. (3) O sobrenadante é 1do a 1.000 g por 20 min. Os niicleos sio precipitados no fundo do tubo. 4) O sobrenadante é centrifugado a 10.000 g por rcindrias e lisossomos precipitam. (5) © sobrenaclante é centrifugado a 105,000 g por 120 min. Os microssomos precipi- 16) Seo sobrenadante é tratado com desoxicolato de s6dio antes da centrifagacio, os microssomos se dissociam e precipitam rdamente como ribossomos e membranas do reticulo encioplasmatico granuloso. (Redesenhado e reproduzido, com permissio, sm W, Faweett DW: A Textbook of Histology, 9th ed, Saunders, 1968.)12 HISTOLOGIA BASICA Fig. 1.15 Micrografias letnica de ts fragdes clularesisolada por centrifugagdo em gradiente de densidade, A: Frac del alin cortaminada com retculoendepasindc, Bs Fag Se miceaons CBee ha a (Cortesia de P. Baudhuin) Varios ions (por exemplo, célcio, erro, fosfato) podem ser localizados em tecidos com estes métodos, usando reacGes quimicas que produzem produtos insoliveis escuros ou coloridos (Fig. 1.16) Acidos Nucléicos © DNA pode ser identificado ¢ quantificado nos niicleos das élulas por meio da reagio de Feulgen, que produz uma cor vermelha no DNA. O DNA e o RNA também podem ser evidenciados pela coloragao de células ou cortes de tecidos com corante basicos. Proteinas Embora haja métodos gerais para detectar proteinas em células e cortes de tecidos, os métodos histoquimicos rnormalmente nao permitem localizagao de proteinas es- pecificas, o que pode ser feito pela imunocitoquimica (ver mais adiante neste capitulo). Hii, porém, varios métodos histoquimicos que revelam com maior out menor especificidade um grupo grande de protefnas, as enzimas. Estes métodos normalmente apro- vveitam a capacidade das enzimas para reagir com ligacoes, quimicas especificas. A maioria dos métodos histoenzi- maticos funciona do seguinte modo: 1) cortes de tecidos ‘io imersos em uma solugo que contém o substrato da cenzima cuja presenca se quer verificar, e desta maneira se permite que a enzima presente nas células ou matriz inte- aja com seu substrato; 2) em seguida o corte € posto em contato com uma substancia marcadora que reage com uma ‘molécula resultante da degradacio ou da transformacao do substrato; 3) o produto final da reacio, que deve ser insoltivel, precipita sobre o local que contém a enzima, denunciando-a; este produto final deve ser colorido ou elétron-denso para ser visivel por microscopia de luz ou. eletrénica. Ao examinar um destes cortes ao microscépio, € possivel observar as células (ou organelas) cobertas com ‘um material colorido ou elétron-denso. Alguns exemplos de enzimas que podem ser detectadas Fosfatases sio enzimas amplamente encontradas no organismo. Elas clivam a ligagio entre um grupo fosfatoe uum residuo de élcool de moléculas fosforiladas. O produto final da reacio € insolivel e colorido, geralmente fosfato, ou sulfeto de chumbo. Por estas téenicas podem-se detec {ar fosfatases alcalinas que tém sua atividade maxima em, um pH alcalino (Fig. 1.17). Freqiientemente se usa uma Fig. 1.16 Fotomicrografia de um corte de osso tratado por uma técnica histoquimica para demonstrar ions cio. O precipitado cescuro indica a presenca de fosfato de efilio no oss0 ¢ na cat lagem calcificada. Tecido cartilaginoso nao calcifieado (eorade ‘em marrom) esta na metade superior da figura. Médio aumento (Fotomicrografia obtida por P.A. Abrahamsohin): Fragio de le aumento. Oproduto nte fosfato n-sedetec- néxima em eusa uma ca!" Jo por uma recipitado ena carti- do (corado > aumento. 1117 Fotomicrografia de corte de rim tratado pelo método de ori para demonstrar a enzima fosfatase alcalina. Os locais de esta enzima esta presente esti escuros devide ao precipi- do de sis de chumbo (setas). Médio aumento. clo de deteccio de fosfatases écidas para demonstrar ossomos, organelas citoplasmaticas que contém grande itidade destas enzimas (Fig. 1.18). Deidirogenases removem hidrogénio de um substrato fo transferem a outro. Ha muitas deidrogenases nas Gélulas, onde clas tém um papel importante em varios Bcessos metabélicos. A demonstracao histoquimica ideidrogenases consiste em incubar cortes de tecidos o fixados em uma solugéo que contém uma molécu- que, 20 receber hidrogenio, precipita sob forma de substancia colorida insoltivel. Por este método, a ecinodeidrogenase — enzima fundamental do ciclo do Rido citrco (ciclo de Krebs) — pode ser localizada nas, itocdndrias. “Aperoxidase, presente em varios tipos celulares, é uma que promove a oxidacdo de certos substratos e a ansferéncia de ions de hidrogénio para peréxido de hidro- i, produzindo ao mesmo tempo moléculas de égua. Para a deteccao de peroxidase, células ou cortes de Kido sdo incubados em uma solugao que contém pe- io de hidrogénio e 3,3-diaminoazobenzidina. Esta fima substancia é oxidada na presenca de peroxidase, jultando em um precipitado insolivel marrom ou ron-denso que permite a localizacio da atividade de Broxicase em microscopios de luz e eletronicos. A ativi- ide de peroxidase em células de sangue, que é impor- te no diagndstico de leucemias, pode ser evidenciada Breste método, Pelo fato da peroxidase ser uma enzima extremamente jae produzir rapidamente uma quantidade aprecivel HISTOLOGIA ESEUS METODOS DEESTUDO 13 de precipitado insolivel, ela tem uma importante aplicacio ppratica: er usada para marcar outras moléculas. Moléculas, de peroxidase podem ser extraidas de vegetais, isoladas e acopladas com outras moléculas. Mais adiante neste capitulo serao estudadas varias aplicagoes da marcacao de moléculas com peroxidase. Polissacarideos e Oligossacarideos s polissacarideos do nosso organismo existem livres ou combinadios com proteinase lipidios. Quando combinados eles constituem um grupo heterogéneo e extremamente complexo. Eles podem ser demonstrados pela reagio de 4cido periédico-Schiff (PAS), que se baseia na transfor- ‘magio de radicais 1,2-glicol presentes nos agticares em residuos de aldefdo. Estes residuos sao, em seguida, reve- Iados pelo reagente de Schiff, que produ uma coloracdo pptirpura ou magenta nos locais do corte em que hé muitos lissacaricieos. Um polisacareo livre muito encontrado noorganismo 6 0 glicogenio, que pode ser demonstrado pela reagéo de PASem figado, miisculo estriado e outros tecidos onde se acumula. Glicoproteinas sio moléculas de proteinas associadas com cadeias pequenas e ramificadas de acticares (oligossa- carideos). A cadeia protéica predomina em peso e volume sobre a cadeia de oligossacarideo, Enquanto algumas glico- protefnas ndo contém nenhum grupo écido (glicoproteinas neutras) e so PAS-positivas, outras possuem radicais, carboxila ou sulfato. Como tanto o glicogenio como as glicoproteinas neutras so PAS-positivos, a especificidade da reacio de PAS pode ser melhorada comparando.acolo- ago de cortes submetidos a esta técnica com outros que foram pré-tratados com uma enzima que digere glicogénio, (por exemplo, amilase salivar). Estruturas que se coram intensamente por PAS mas que perdem esta capacidade quando pré-tratadas com amilase contém glicogénio. AFig. 1.19 mostra exemplos de estruturas coradas pela reagio de PAS. Glicosaminoglicanos sio polissacarfdeos nao ramifica- dos, fortemente aniénicos, que contém monossacarideos aminados (aminoagticares). Quando um grande niimero de cadeias de glicosaminoglicanos se prende ao longo de um eixo protéico elas constituem 0s proteoglicanos. Alguns dos componentes mais importantes da matriz extracelular do tecido conjuntivo sao proteoglicanos (ver Caps. 5 e 7). Diferentemente das glicoproteinas, nos proteoglicanos as cadeias de carboidrato constituem o componente principal da molécula. Glicosaminoglicanos e glicoproteinas dcidas slo fortemente aninicas por causa do seu alto contetido de grupos carboxila e de sulfato. Por esta razao, eles reagem intensamente com o corante Alcian blue. Lipidios A melhor maneira de revelar os lipidios ¢ por meio de corantes que so soliiveis em lipidios. Cortes obtidos por congelacio so imersos em soluges alcodlicas saturadas com esses corantes (os corantes Sudan IV e Sudan black sio os mais usados). O corante se dissolve nas goticulas de lipidios, as quais adquirem a cor do corante. Métodos adicionais usados para a localizacio de colesterol e seus14 HISTOLOGIA BASICA Fig. 1.18 Detecgio de fosfatase dcida. Micrografia eletrinica de uma célula de rim de rato que mostra tres lisossomos (L) junto de ‘cida, Grande aumento. (Cortesia de E. Katchburian.) ésteres, de fosfolipidios e de glicolipidios so titeis para diagnosticar doencas metabolicas em que ha acimulo intracelular de diferentes tipos de li Fig. 1.19 Fotomicrografia de uma vilosidade intestinal corada pela técnica de dcido periddico-Schiff. A intensa coloragio na bordadura em escova da superficie celular (setas eurtas) © n0 produto de secrecio das eélulas caliciformes (setas longas) & de-. Vida ao alto contetdo de polissacarideos nestas estruturas. Corte contracorado com hematoxilina. Grande aumento, ileo (N)- O deposito escuro no interior dos lisossomos € fosfato de chumbo que precipitou nos locais onde havia fosfatase Muitos procedimentos histoquimicos s0 usados em. dliagndstico laboratorial, A reagio de Perls para ferro, as reagoes de PAS-amilase para glicogénio e Aleian blue para glicosaminoglicanos sio habitualmente aplicadas a biopsias de tecidos de pacientes em que se guer diagnosticar doencas em que se acumulam nos tecidos quantidades elevadas de ferro (por exemplo, hemocromatose, hemossicerose), glicogenio (glicoge- hoses), glicosarninoglicanos (mucopolissacaridoses) € eslingolipidios eslingolipidoses) DETECCAO DE MOLECULAS EM CORTES HISTOLOGICOS POR MEIO DE INTERAGOES MOLECULARES DE ALTA AFINIDADE Uma molécula presente em uma célula ou em um corte de tecido pode ser percebida por meio de compostos que interagem especificamente e ligam-se com a molécula ‘que queremos detectar. Os compostos capazes de fazer © reconhecimento devem ser previamente acoplados « um mareador, para que o conjunto molécula-composto- ‘marcador possa ser visto por meio de um microscOpio de luz ou eletronico (Fig. 1.20). Os marcadores mais usados io: substancias fluorescentes (para serem visualizadas com um microscépio de fluorescencia ou de laser, tomas radioativos (para serem detectados por radioautogratia, moléculas de enzimas como a peroxidase (que pode set detectada pela demonstracao da enzima com perdxido de hidrogénio e DAB), metais (geralmente particulas de(L)junto de ia fosfatase a ferro, ‘lan mente Bos enplo, ree je ES cOEs num corte postos que jmolécula s de fazer oplados a composto- oscipio de ais usados sualizadas 2) Stom0s utografia), © pode ser i perdxido riculas de 1120 Substincias que tém grande afinidade por uma molécula jem ser marcadas e usadas para identificar esta molécula. (1) jolécula A tem uma afinidade intensa e especifica por uma ieio da molécula B. (2) Se A e B sio colocadas em contato, A ga com a porgio de B que ela reconhece. (3) Um marcador, fem microscopia de luz ou eletr6nica, pode ser ligado 3 ula A. O marcador pode ser um composto fluorescente, ferzima como a peroxidase, uma particula de ouro ou um radioatvo, (4) A molécula B pode ser detectada se estiver ente em uma célula ow na matriz extracelular que forem das com a molécula A. 9} que podem ser observados por microscopia de luz ica, Estes métodos se destinam principalmente para agicares, proteinas e acidos nucléicos. ina, roteina A, lectinase anticorpos sa0 exemplos posts queinferagem expecfcaments com outs las. faloidina, que é extraida de um cogumelo (Amanita ides), interage fortemente com actina e é geralmente gada com substancias fluorescentes para demonstrat 3 de actina proteina A é uma prote{na extrafda de Staphylococcus is que se liga a regido Fe de moléculas de imunoglo- (anticorpos). Quando a proteina A é ligada a um dor, podemos detectar imunoglobulinas com grande Tectinas sio proteinas ou glicoproteinas derivadas almente de sementes de vegetais que se ligam com dade e especificidade a carboidratos. Diferentes HISTOLOGIA ESEUS METODOS DEESTUDO 15 lectinas interagem com diferentes agticares ou seqiiéncias de agticares. Flas, portanto, se ligam a glicoproteinas, proteoglicanos e glicolipidios e sio muito usadas para ca- Tacterizar moléculas de membranas celulares que contém seqtiéncias espectfcas de acticares. Imunocitoquimica ‘Uma interacao altamente especifica entre moléculas & aqutela que ocorre entre uma molécula e um anticorpo que ‘a reconhece. Por esta razio, métodos que usam anticorpos marcados so de grande utilidade para identificar e loca- lizar proteinas e glicoproteinas. A imunocitoquimica ¢ a ‘metodologia que permite identificar moléculas em cortes, ‘ou camadas de eélulas por meio de anticorpos. Em uma reagio imunocitoquimica, culas em cultura ou tum corte de tecido que se supde conter uma determinada proteina séo incubados em uma solucio que contém um Anticorpo que reconhece esta protefna. O anticorpo se liga ‘especificamente a proteina e sua localizagao pode entio ser ‘evidenciada por microscopia de luz ou eletrOnica, depen- dendo do marcador que foi acoplado ao anticorpo. ‘Uma das exigencias mais importantes da imunocitoqui- mica € a disponibilidade de um anticorpo contra a protei- na que se pretende detectar. Isto significa que a protefna deve ter sido previamente purificada e isolada de forma {que anticorpos possam ser produzidos contra ela. Alguns ‘métodos para isolamento de proteinas sao mostrados nas, Figs. 121 € 1.22, AANTICORPOS MONOCLONA POLICLONAIS Suponhamos quese quer produzitanticorps contra pro- teina X de uma certa espécie animal (um rato, um humano). Se% jt etd clea es ¢inella Gunn outa optic (um Coelho, uma eabra), Se a proteina é suficientemente ‘iferente pera este animal reconhece-la como estranha, antenal rodugied rigors coher apres hte corpo de Coeihg conta prota X deta on entenrpo de debra conte proteina X humana). Estes anticorpos sao coletados do plasma do animal e usados para imu- pest Soe CieNeei eee tert gech aarnirean aaa ‘grupos (clones) de linfécitos deste animal podem reconhe- aerporgees diferentes de X eos grupos podem produit xtoapen dierntes confiagy via ponies wlan tim uma mistura de anicorpos, Esta misturaconstitl 0 gar umn anico yeagl till Ws peenivall por une cena a psec x pa linfébtos mates em cultura (na verdade eto lifes que foram fundidos com celulas de um tumor) Os dif rrentes grupos (clones) de linfécitos produzirao anticorpos ‘press cui 0 plea mycelia X. Cad clone pode ser isolado e cultivado isoladamente, de forma {ue of diferentes antiesrpoo entra X podem scrcoletade Te cparadon Cada un destes ancorpos consta dm ‘longo sauna FU eee vance sar oobi srvicorPesnemoclonal ty taaiparaso suet anton Por liclonal; por exemplo, eles costumam ser mais especificos (¢-portano, mais press ao reconhocimenta da protein SG Foresta acto, haverd menosligagoes nespectica com uit ppt blparialtd dae oneal mee oe16 HISTOLOGIA BASICA Fa tundamentalmente duas técnicas usadas em im nocitoquimica. Na técnica direta de imunocitoquimicad anticorpo contra a proteina X (monoclonal ou policlonal € ligado a um marcador apropriado. Um corte de tecidd € incubado com 0 anticorpo durante algum tempo, forma que oantcompo inteage ee liga aX, e, a segui corte é lavado para remover 0 anticorpo nao ligado (Fig 1.23), O corte pode entao ser observado por microscopi de luz ou eletrOnica, dependendo do marcador utilizada (uma substancia fiuorescente, uma enzima, particula de ouro). Se o marcador foi peroxidase ou outra enzim © corte deve ser colocado em contato com o substrata citoquimica). Os locais do corte que contém a proteina ficardo fluorescentes, ou serao cobertos por um precip tado escuro ou colorido devido a presenca da enzima ou particulas de ouro. necessétio inicialmente produzir dois anticorpos diferen tes: (1) anticorpos (monoclonais ou policlonais) contra proteina X de rato feitos, por exemplo, por um coelha @) em um procedimento paralelo, imunoglobulina de ‘um outro coelho (normal, nao imunizado) € injetada en uma terceira espécie (por exemplo, uma ovelha ou uma cabra). Imunoglobulina de coelho é considerada estranka por ovelhas ou cabras, que respondem produzindo un} ‘anticorpo contra a imunoglobulina— um antianticorpo ou antiimunoglobulina. Este anticorpo , em seguida, ligado a um marcador adequado. Na primeira etapa da técnica indireta, um corte de te ido de rato que se supe conter a protefna X é incubado| inicialmente com anticorpo de eoelho antiproteina X de} rato. Depois de lavar 0s cortes, estes sao incubados com © antianticorpo marcado que reconhecerd e se ligard ao sine de coco que sebavi ligadoproteinaX (ig 1.24). Em seguida o corte é observado ao microscépio luz.ou eletr6nico apés tratamento adequado, dependendo| do marcador utilizado. Apesar de ser mais complexa, i técnica de imunocitoquimica indireta é mais sensivel, respondendo com um sinal maior que a técnica diet como pode ser observado pela comparagao das Figs. 1.23 121 Alguns métodos de separacio de proteinas:ultrace | ‘rifugagio (A) e cromatografia (B). A: Uma mistura de proteins obtida de células ou de tecidos homogeneizados & submetida centrifugagao em alta velocidade por varias horas. As proteins ‘se separam em bandas, de acordo com o tamanho e a densidade| ‘das moléculas. Em seguida, o meio em que foi feta a centrifuzacio| 6 drenado e dividido em varias fracbes que contém as diferentes proteinas, que podem entao ser analisadas separadamente.B Uma solugao contendo uma mistura de proteinas é colocads | {em uma coluna preenchida por particulas dotadas de diferent propriedades. As particulas podem, por exemplo, ter diferentes ‘cargas eletrostticas (atraindlo protefnas de acordo com suas car 'g25) ou podem ter poros (agindo como peneiras para moléculs, de diferentes tamanhos). Durante a migragao das proteinas pel. coluna, seu movimento € retardado pela interac3o com as part culas. Quando o iquido da coluna 6 recolhido, diferentes grupos de proveinas podem ser coletados separadamente.HISTOLOGIA F SEUS METODOS DEESTUDO 17 = liiii/ =< oquimica 0 policlonal) ede tecido, tempo, de saseguit, 0 igado (Fig, pcroscopia rullizado, particulas fra enzima, substrato foquimica € proteina X am precipi- enzima ou s) contra a um coelho; obulina de njelada em ha ou uma jaestranha uzindo um ida, ligado corte de te- éincubado ateina X de ficm eval Fig. 1.23 Técnica direta de imunocitoquimica. (1) Molécula de eligard a0 imunoglobulina (Ig). 2) Produgao de anticorpo policlonal. A eina X (Fig, ‘proteina X de um rato éinjetada em um animal de outra espécie, PanRA ‘por exemplo, um coelho. Varias Igs de coelho sao produzidas Eontra a proteina X. (3) Marcacio do anticorpo. As Igs de coelho ene Sto acopladas a um marcador Visivel por microscopia. (4) Reaclo omplexa, a winocitoquimica. As Igs marcadas reconhecem e se ligam a s sensivel, ferentes porgdes da proteina X presentes em um corte. Em um nica direta, jcroscOplo, os locas do corte que contém a proteina X podem 8 Figs. 1.23 ser recomhecidos. as ultracen- agora et aks o ‘Fig. 1.22 Separacio de proteinas por eletroforese em gel. A: Icolamento das proteinas. ae (D Misturas de proteinas so obtidas de clas etecidos homogeneizados, Elas so 4 freqiientementetratadas com um detergente (dodecil sulfato de sido) e com mer- eae captoctanol para desenovelar e epararascadcias e subunidades de protein. (2) As Botstogaci amtostras s40colocadas na porgao superior de uma placa de gel de poliacrilamida, a mee Gual @submetida a uma corrente eletrica continua. 0) As proteinas migram ao longo do gel de acordo com seu tamanhoe forma. Uma mstura de proteins conhecidas face = ee ee pa en eee nares Dae dtc See ere ee eee tae eens singe in ens eS a eee ‘lgumas proteinas forem radioativas, elas pocerio ser reconhecidas por radioauto- mola " alia Pere isto, um flme de rigs 6 coceado sobre o gel durante algum tempo i Srdepol revelato, Protenas radioativas sero denunciadas por manchas esculas mas Pa fo flme de ralcs XG) Immunoblotting. As proteinas podem sr Wansferias do eTupos fe para uma membrana de nitroceulose. Esta incubada com mn antcorpo que Feconhece proteinas que podem estar presentes nas amostras.18 HISTOLOGIA BASICA 1.24. Hé métodos indiretos que envolvem o uso de ou- tras moléculas intermediarias, como a técnica que utiliza biotina-avidina, APLICACAO MEDICA A imunocitoquimica contribuiu significativamente para a pesquisa em biologia celular e para a melhoria de procedimentos diagndsticos. As Figs. 1.25 a 1.28, ‘ontém exemplos de deteccao imunocitoquimica de ‘moléculas. A Tabela 1.1 mostra algumas das aplicagbes, rotineiras de procedimentos de imunocitoguimica na pritica clinica me. ."s< e i =. 5 Proteina x ce 8 Fig. 1.24 Técnica indireta de imunocitoguimica, (1) Produgao dde um anticorpo policlonal primario. A proteina X de um rato € injetada em um animal de outra especie, por exemplo, um coelho. Varias Igs de coelho sio produzidas contra a proteina X. (2) Produgio de um anticorpo secundario, Ig de um outro coelho, normal e nao imunizado, ¢ isolada e injetada em um animal de uma terceira espécie, por exemplo, uma cabra, S40 produzidas Igs de cabra contra Igs de coelho. As Igs de cabra 80 purificadas e acopladas a um marcador. () Primeira etapa dda reagio imunocitoquimica. As Igs de coelho reconhecem e se ligam a diferentes porgdes da proteina X. 4) Segunda etapa da reagio imunocitoguimica. As igs ce cabra marcadas reconhecem se ligam as Ips de coelho, indicando a presenca da proteina X. Em.um microse6pio, os locais do corte que contém a proteina X poster ser reconhecidos. Odesafio central da moderna biologia celular é entender © funcionamento das células em seus detalhes molec lates. Este objetivo requer técnicas que permitem ané lise das moléculas envolvidas no processo de fluxo de informagio do DNA para proteina e no controle dest fluxo, Muitas técnicas sio baseadas em hibridizacio (ou hibridagdo), Hibridizacao 6a ligagio entre duas moléci las de cadeia tinica de écidos nucléicos (DNA com DNA, RNA com RNA ou RNA com DNA) que se reconhecem um ao outro se suas seqiiéncias forem complementares formando moléculas de cadeia dupla. A hibridizacia permite a identificacao de seqiiéncias especificas de DNA ou RNA HIBRIDIZACAO IN SITU Quando aplicada diretamente a células e cortes de tecdos, ‘esfregagos ou cromossomos de células mit6ticas, a técnice chamada de hibridizacao in situ. Esta técnica é excelente para averiguar se uma célula tem uma seqiiéncia espect fica de DNA (como um gene ou parte de um gene), pa definir a localizagao de um gene em um cromossomo ¢ para identificar a5 oélulas nas quais um gene especifca esta sendo transcrito. O DNA deve ser inicialmente des- naturado por calor ou agentes desnaturantes, fazendo com que as suas duas cadeias se separem. As cadeins estdo agora prontas para serem ligadas a. um segment) de cadeia simples de DNA ou a um segmento de RNAI que sejam complementares 4 seqiiéncia que desejamas| analisar. Esta sequiéncia € chamada de sonda. A sonda pode ser obtida por clonagem, por amplificacao da se giiencia por meio de PCR (polymerase chain reaction) ox por sintese se a seqiiéncia desejada for curta. A sonda deve ser ligada a um marcador, normalmente um isétopo) radioativo (que pode ser localizado por radioautografa) ou um nucleotideo modificado (digoxigenina) que pode. ser identificado por imunocitoquimica. Na hibridizacao in situ as laminas contendo os cortes de tecido, células ou cromossomos sao inicialmente aquecidas para separar as cadeias duplas de DNA. Em seguida, uma solugao contendo a sonda ¢ colocada sobre 0 espécime por um periodo de tempo necessério para hibridizacéo, Depois de lavar a lamina, a localizagao da sonda ligadaa ‘sua seqiiéncia complementar é denunciada pelo marcador utilizado Fig. 129). Hibridizacao pode também ser executada com DNA ou RNA purificados, colocados em apoios sélidos. Trechos de moléculas de DNA ou de RNA sao separados por tamanho através de eletroforese em gel de agarose ou. ‘em gel de poliacrilamida. Em seguida sao transferidosa ‘uma folha de nailon ou de nitrocelulose por meio de um solvente onde os dcidos nucléicos podem ser analisados por hibridizacao. A técnica de identificagio de DNAé chamada de Southern blotting; quando a eletroforese é feita com moléculas de RNA a técnica é chamada Nor thern blotting. ‘As técnicas de hibridizacao sio altamente especifcas habitualmente usadas em pesquisa, diagnéstico clinica e ~ medicina forense,éentender es molecu- nitem and le fluxo de trole deste lizacto (ou asmolécu- comDNA, conhecem ementares, pridizacao cificas de detecidos, s,a técnica éexcelente cia espec ene), para especitico nente des- s, fazendo As cadeias segmento ode RNA desejamos 1A sonda 10 da se. tion) ow A sonda mis6topo «ttografia) jque pode scortes de aquecidas ida, uma espécime idizacao, laligada a marcador nDNAou s. Trechos rados por garose ou sferidos a eio de um nalisados je DNA é roforese ada Nor- pecificas © nelinico & HISTOLOGIA E SEUS METODOS DEFSTUDO 19 Hig. 125 Fotomicrografia de uma eélula decidual de camundongo cultivada in vitro. A proteina desmina, que forma filamentos in- ics us azem pare do oes quo fol detectada om uma nia de imanoureccis Gmelin imalha de filamentos intermedirios fluorescentes ¢ visivel na maior parte do citoplasma, O niicleo (N) esta corado em azul IGrande aumento, (Cortesia de Fabiano G. Costa e P.A. Abrahamsoh.) Fig, 1.26 Fotomicrografia de um corte de intestino delgado no qual um anticorpo contra a enzima li sozima fo aplicado para demonstrar lisossomos em mmacréfagos.e em células de Paneth. A cor marrom Go resultado da reagfo feita para demonstrat a encima peroxidase, que foi o marcador acoplado a0 anticorpo secundario, Niicleos contracorados com hematowilina. Médio aumento.20 HISTOLOGIA RASICA Fig. 1.27 Antigeno carcinoembridnico ¢ un proteina presente em varios tumores maligna pprincipalmente da mama e intestinos. Esta tomicrografia é uma demonstrago imunoc _quimica de antigene carcinoembridnico em uni seoggo de um adenocarcinoma de intestno gor so. O anticorpo estava marcado com peroxide levidenciada pela cor marrom. Contracolorag hhematosilina. Medio aumento, Fig. 128 Seogio de uma célula acinosa do pincreas que fol incubada com anticorpo antiamilase e em seguida incubada com protein ‘Amarcada com particulas de ouro. A proteina A tem uma alta afinidade por moléculasde anticorpo. As particulas de ouro sto vss ‘como pequenos pontos pretos sobre os grinulos de secregao. Eletromicrografia. Grande aumento. (Cortesia de M. Bendayan)dnico é uma es malignos, nos. Esta fo > imunocito- nico em uma estino gros peroxidase, racoloragaor om proteina ) HISTOLOGIA & SEUS METODOS DEESTUDO 21 ‘Tabela 1.1 los de importantes di ticoe a hon cde oe algumas Finalidade Diagnéstica ‘Tumores de origem epitelial ‘Tumores de certas células da neur6glia ‘Tumores de tecido conjuntivo ‘Tumores de tecido muscular ‘Tumoresprodutores de hormnos pottcos ou polipepidicos Tlmores de glinduls; prncpalnente as do tube digestivo e mamérias ‘Tumores das cdlulas dos ductos das glindulas mamérias Infecgdes virais| PROBLEMAS NA INTERPRETACAO DE CORTES Distorges e Artefatos Causados pelo Processamento dos Tecidos ‘Ao estudar e interpretar cortes de tecidos ¢ importante Jembrar-se de que © que est sendo observado é o resul- tado final de uma série de processos que comecam com a fixagio e terminam com a coloracao do corte. As varias tapas deste procedimento podem distorcer os tecidos, fornecendo uma imagem que pode diferir da queos tecidos apresentavam quando vivos. Uma causa de distorgao ¢ a retracio produzida pelo fixador, pelo etanol e pelo calor da parafina usada para incluso, A retragdo é atenuada ‘quando 0s tecidos séo incluidos em resina. ‘Uma conseqiiéncia da retracao é o aparecimento de espacos artificiais nas células e entre as células e outros, ‘componentes de tecido. Outra fonte de espacos artificiais, €a perda de moléculas que nao foram mantidas correta- mente nos tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas solugses de desidratagao e clareamento. Exemplos de moléculas nao preservadas so 0 glicogenio e lipidios. ‘Todos estes espacos artificiais e outras distorcdes causa- das pelo procedimento de preparacio dos cortes so cha- ‘mados artefatos de tenia. Outros artefatos podem incluir ppregas do corte (que podem ser confundidas com capilares sanguineos), precipitados de corantes ou de sujeira (que podem ser confundidos com granulos citoplasméticos) € muitos mais, Os estudantes devem estar atentos para a existéncia de artefatos e precisam tentar reconhecé-los para nao serem enganados por eles. A Totalidade do Tecido Uma grande dificuldade apresentada por cortes de B ci i tama epi benign (otis) sub uldade ag 2 Cr dum tumor ciel benigo conten) sh microscopia de lz € a impossibilidade dese cora dite virus de papiloma humano tipo 2 (HPVI) esta presente. oloragSo: hematoxilina, Médio aumento. (Cortesia de rencialmente todos os componentes das células e tecidos em um s6 preparado. Seria muito desejavel, mas quase impossivel, observar células por um microsc6pio de luz e22 HISTOLOGIA BASICA A Fig. 1.30 Como diferentes estruturas tridimensionais sao obser: vvatlas ap6s serem cortadas em secgoes delgadas. A: Diferentes seegBes de uma esfera oca e de um tubo oco. B: Um corte a0 longo de um tinico tubo enovelado pode ser visto como cortes de Varios tubos. C: Cortes através de uma esfera sélida e através de um cilindro s6lido podem ser semelhantes. ‘enxergar os seus micleos, as mitocéndrias, os lisossoma ‘5 peroxissomos, todos envolvidos por uma membr: celular e, externamente, por uma membrana basal e pa matriz extracelular contendo fibras colgenas, elastics reticulares. Para se ter esta imagem, é necessério exami nar varias preparagOes diferentes, cada qual corada pl meétodos diferentes, e assim obter uma visto completad composigao e estrutura de um tecido. Por outro lado, microsc6pio eletrénico de transmissao permite a obse vacao de células com todas suas organelas e inclusd envolvidas pela membrana e pelos componentes da mat extracelular. Duas Dimensées e Trés Dimensées ‘Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secyis ‘muito delgadas, as seccdes parecem ter s6 duas dimensbes comprimento e langura. Isto freqtientemente conduz observador a erros se ele nao se conscientizar de que un cesfera seccionada é vista como um circulo e que um tub seccionado ¢ visto como um anel (Fig, 1.30). Quando un corte € observado ao microsc6pio, oestudante sempre d imaginar que algo pode estar faltando & frente ou at daquele corte, porque muitas estruturas so mais espe que 0 corte. Além disso, deve lembrar-se também de qu 08 componentes de um tecido ou érgdo sio geralme seccionados ao acaso, Para entender a anquitetura de um 6rgao, é necessiri estudar secgdes feitas em planos diferentes, As vezs somente a andlise de secces consecutivas e a sua reco trusio em um volume tridimensional tornam possiel compreender a organizacao de um érgao complexo. BIBLIOGRAFIA Alberts Bet: Molecular Biology ofthe Cl, nd ed. 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