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Protocolo Teste de atividade antimicrobiana

Materiais:

• Placas de Petri tipo pizza

• Meio BHI ágar (1200 m p/ 24 placas)

• Tubos de ensaio contendo 2 ml de caldo BHI

• Alça estéril

• Pipetas automáticas de 20 e 100 microlitros

• Ponteiras estéreis (novas (extratos) e usadas (bactérias)

• Descarte para ponteiras e tubos de ensaio

• Caneta retro projetor

• Régua

• Tubos de ensaio contendo 7,0 ml de BHI semi-sólido

• Banho Maria

• Clorofórmio

• Amostras bactérias reveladoras: S. aureus (ATCC e isolado clinico), S.


epidermidis (ATCC e isolado clinico) e P. acnes (ATCC e isolado clinico).

Procedimentos:

Identificar os tubos de ensaio contendo BHI de acordo com as amostras a


serem testadas. Inocular as amostras em seu respectivo tubo e aguardar o
crescimento (24h para S. aureus e S. epidermidis e 48h para P. acnes).

Obs.: Após 24h repicar as amostras de S. aureus e S. epidermidis e colocar


novamente para crescer.

Antes de iniciar o experimento realizar um teste de Gram para verificar se as


amostras estão puras (sem outros microrganismos contaminantes).

Dividir a placa de Petri contendo BHI de acordo com o número de amostras


que serão testadas.

Identificar a placa de Petri quanto ás amostras a serem aplicadas.


Fundir o meio de cultura BHI semi-sólido e manter em banho-maria a 50°C (um
para cada placa de Petri).

Utilizando a capela de fluxo laminar, e uma pipeta automática com ponteiras


estéreis novas retirar 10µ l da substancia a ser testada e adicionar sobre a
placa de Petri no local identificado para esta amostra. Fazer o mesmo
procedimento para todas as placas.

Esperar as amostras secarem.

Adicionar sobre o papel filtro (presente nas tampas das placas de Petri) 500µ l
de clorofórmio.

Manter as placas de Petri fechadas e as tampas vertidas para baixo. Aguardar


30 min. Após este procedimento abrir as placas de Petri dentro da capela de
fluxo laminar e aguardar 30 min. para que o clorofórmio residual evapore.

Utilizando bico de Bunsen, pipeta automática e ponteira estéril (usadas)


adicionar 20µ l da bactéria reveladora presente no caldo BHI no meio de
cultura BHI semi-sólido. Homogeneizar e verter o BHI semi-sólido sobre a placa
contendo as amostras de forma a cobrir toda a placa de Petri.

Esperar solidificar.

Incubar a 37°C por 24 h S. aureus e S. epidermidis e por 48h P acnes.

Analisar os resultados quanto à presença ou ausência de halo de inibição.