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Fisiologia de fungos GRD (1)

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FISIOLOGIA DE FUNGOS

Prof. Sidney T.G. Bastos Dept. de Micologia/CCB/UFPE

Fungos filamentosos são organismos cuja parede celular é constituída por celulose ou quitina. Constituem um grupo de organismos a parte, Reino Fungi, uma vez que não ingerem alimentos (como os animais) e nem produzem o seu próprio alimento através de pigmentos fotossintéticos (como as plantas). Os fungos secretam enzimas sobre seus substratos que atuam sobre moléculas grandes e complexas quebrando-as em substâncias menores prontamente assimiláveis através da parede celular. Fisiologicamente os fungos se adaptam a condições mais severas do que a maioria dos microorganismos: a. podem crescer em substratos com concentração de açúcar intolerável para as bactérias, uma vez que não são muito sensíveis as altas pressões osmóticas; b. podem tolerar e crescer em altas concentrações de ácidos, suportando variações de pH entre 2 e 9, embora o ótimo para a maioria esteja situado em torno de 5,6; c. podem sobreviver em ambientes bastante secos que inibiriam as bactérias não esporuladas. Quando ocorre condição adversa de umidade (ambiente seca), os fungos produzem esporos ou entram em estado de vida latente; d. podem desenvolver-se em uma ampla faixa de temperatura (0 a 62°C), embora o ótimo esteja entre 22 a 30°C, para a grande maioria. NUTRIÇÃO As necessidades nutricionais por elementos essenciais podem ser divididos em duas grandes categorias: a. macronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-3 M, aproximadamente. b. micronutrientes: nutrientes que são requeridos na concentração de 10-6 M ou menos. Entre os macronutrientes (C, H, O, N, P, K, N, S, Mg e Ca) o carbono é o principal elemento requerido uma vez que este elemento faz parte de substâncias estruturais dos fungos em combinação, principalmente, com hidrogênio, oxigênio e nitrogênio. Os elementos minerais essenciais aos fungos estão resumidos nas tabelas a seguir (Tabelas 1 e 2).

Uma outra forma utilizável de nitrogênio é a amônia (NH 3). Contudo. utilizam carbono e energia de uma grande variedade de compostos produzidos por organismos vivos. atuação na síntese de ácidos nuclêicos ativação enzimática. Macronutrientes minerais essenciais aos fungos(Griffin. elemento K P Mg N S Ca forma utilizada KCl K2HPO4 KH2PO4 MgCl2 MgSO4 NaNO3 NH4Cl K2SO4 CaCl2 concentração função requerida (M) 10-3 atividade enzimática. quando sais de amônia (NH4NO3. (NH4)2SO4 ou NH4Cl) são adicionados ao meio de cultura ocorre. Este fato. por exemplo). metabolismo de nitratos 1. Micronutrientes minerais essenciais aos fungos (Griffin. decorre da utilização preferencial do cátion amônia. balanço iônico 10-3 composição de ácidos nuclêicos. uma queda acentuada do pH. o que pode refletir no crescimento fúngico (redução do crescimento. metabolismo de ATP 10-3 10-4 10-4 a 10-3 constituinte de aminoácidos. elemento Fe Cu Mn Zn Mo forma utilizada FeCl3 Fe citrato CuSO4 MnCl2 ZnCl2 Na2MoO4 concentração requerida (M) 10-6 10-6 a 10-7 10-7 10-8 10-9 função constituinte de citocromos. A capacidade dos fungos em utilizar estes compostos depende de três processos diferentes: . 1994). CARBONO Os fungos. não Tabela 2. portanto o seu crescimento é estimulado pelo fornecimento de oxigênio. metabolismo intermediário dos ácidos orgânicos ativação enzimática. nucleotídeos e vitaminas constituinte de aminoácidos (metionina. patogênicos ou saprófitas. A maioria dos fungos são aeróbicos ou microaerófilos e. atuação no ciclo dos ácidos tricarboxílicos. transferência de energia. muitos fungos não podem utilizá-lo. biossíntese de pigmentos ativador de enzimas. entretanto.2 Tabela 1. pigmentos e apoenzimas ativação enzimática. metabolismo intermediário 10-3 ativação enzimática. estrutura universalmente requerido de membranas. cisteína e cistina) ativador enzimático. metabolismo de carboidratos. NITROGÊNIO E OXIGÊNIO Nitrogênio na forma de nitrato é a fonte mais utilizada. 1994). 2. geralmente.

não existe um período de adaptação para o crescimento fúngico iniciar. portanto. particularmente. A glicose é a principal fonte de carbono para praticamente todas as espécies fúngicas. portanto. Deste modo. etc. substâncias de reserva. Isto. A sacarose pode ser hidrolisada em pH levemente ácido enquanto que a inulina. Entretanto.3 a. a fim de iniciar o crescimento. seguidos da galactose. A utilização de manose e frutose segue claramente o modelo de formação de enzimas indutivas (sistema indutivo: enzimas que são sintetizadas somente em resposta a presença de certos substratos). Experimentos monofatoriais não são naturais. durante a fase de adaptação. Experimentos sobre a utilização de compostos como única fonte de carbono e energia são geralmente monofatoriais. b.) e. a taxa de crescimento foi aproximadamente igual que com glicose. mas após este período o crescimento é. aminoácidos. ocorre crescimento rápido sem a existência de uma fase de adaptação longa e irregular observada na ausência de glicose. O crescimento. existe um período de adaptação antes do crescimento iniciar.4) e de outros carboidratos. Os açúcares frutose e manose. oligossacarídeos e polissacarídeos para o seu crescimento requerem a síntese de enzimas indutivas e. Ao iniciar um estudo com um determinado fungo sobre o qual não há nenhuma informação nutricional. é degradada durante a autoclavagem. fosforilação dos carboidratos. Até certo ponto. portanto. amido (glicose alfa-1. a glicose deve ser escolhida como a fonte mais provável de utilização de carbono pelo fungo. um polímero de frutose. tão rápido e extenso quanto com glicose (ver curva de crescimento fúngico). devem ser esterilizadas separadamente. uma vez iniciado. geralmente. contudo. podem ser. diminuiu a fase de adaptação permitindo o início do crescimento e proporcionando material e energia suficientes para a indução de enzimas que assimilam a manose. isto não surpreende pois muitos açúcares comuns são a base da celulose (glicose beta-1. os compostos são testados separadamente.6 e alfa-1. significativamente. Os compostos de carbono tem duas funções essenciais no metabolismo fúngico: a. proporcionar quantidades apreciáveis de energia através do processo de oxidação dos compostos de carbono. alteradas por reações com outras substâncias que entram na composição do meio de cultura e. Muitas fontes de carbono são estáveis ao calor. O sistema enzimático para assimilação da glicose é do tipo constitutivo (sistema constitutivo: enzimas que estão sempre presentes em quantidades quase constantes em uma célula) e.4). isto é. digestão de materiais oligo e poliméricos. após a glicose. os fungos no ambiente vivem sobre uma mistura de substratos potencialmente fornecedores de carbono e energia. contudo. b. proporcionar o carbono necessário para a síntese de compostos celulares (proteínas. transporte de monômeros através da plasmalema e c. a curva de crescimento mostrará um período de adaptação antes do crescimento ser iniciado. Fungos que utilizam dissacarídeos. foi retardado com manose e frutose. Existe uma controvérsia sobre a capacidade de utilização da glicose por Leptomitus lacteus e Araiospora spp (Ordem Leptomitales). pode ser observado durante a fase de adaptação de Allomyces macrogynus. ácidos nuclêicos. A adição de uma pequena quantidade de glicose. A habilidade de um fungo utilizar um composto como única fonte de carbono e energia pode di- . são os mais utilizados pelos fungos.

expresso em %. a glicose tem efeito repressivo e inibidor sobre a utilização de outras fontes de carbono (a glicose é utilizada em primeiro lugar sendo que a utilização do segundo composto é retardada até a glicose ser totalmente consumida). 3. quando o fungo cresce em meio com celobiose. contudo. c. VITAMINAS E FATORES DE CRESCIMENTO Compostos orgânicos que são requeridos em quantidades diminutas para o crescimento fúngico podem ser denominados de vitaminas ou fatores de crescimento. A habilidade para metabolizar um composto somente na presença de outro é conhecida como cometabolismo. d. Substrato consumido pode ser convertido em micélio. entre o peso seco do micélio e o peso da fonte de carbono consumida. fatores de crescimento são requeridos em concentrações mais altas. muitos fungos sejam capazes de degradar as ligninas a CO2. Em estudos envolvendo a utilização de uma mistura de compostos foram observados que: a. concluiu-se que: a. celulose e celobiose. Por outro lado. acima de 100 µ M e atuam como elementos estruturais (aminoácidos. Eficiência sintética é o quociente. atuam como verdadeiros indutores resultando em atividade celulase 100 vezes maior quando presentes como única fonte de carbono. polissacarídeos extracelulares e outros metabólitos secundários). ácidos orgânicos. onde o principal interesse está na produção de metabólitos fúngicos de uso comercial. bases púricas e pirimídicas). Alguns autores fazem distinção entre estas duas categorias. o fungo crescendo em meio com glicose apresenta um baixo nível de atividade celulase. celobiose ou glicose. b. a adição de glicose resulta em uma parada imediata da utilização de celobiose (o efeito da glicose na repressão da síntese enzimática é geralmente denominada de repressão catabólica). podem degradar a lignina somente na presença de uma outra fonte de carboidrato como a celulose. Em um estudo realizado com Sporotrichum termophile sobre a utilização de glicose e de outros substratos. o fungo crescendo em substrato que não celulose ou celobiose. Entretanto. compostos que são pouco utilizados ou não utilizados como única fonte de carbono podem ser usados quando misturados com outros. . são incapazes de utilizá-las como única fonte de carbono e energia. As vitaminas (Tabela 3) são geralmente requeridas em concentrações micromolares a nanomolares e atuam como coenzimas enquanto que.4 ferir de sua habilidade para usar este mesmo composto quando em conjunto com outro. as ligninas parecem ser usadas somente na presença de outros compostos. Um outro ponto de grande interesse na assimilação de carbono é a eficiência de conversão do substrato em micélio. sugerindo um certo grau de desrepressão na ausência de glicose. Eficiência sintética tem grande importância para a indústria de fermentação. apresentou atividade celulase 2 a 10 vezes maior. CO2 e vários produtos metabólicos de interesse industrial (álcool. Embora. b.

Algumas vitaminas requeridas por fungos (Griffin. O movimento da água dentro e fora da hifa ocorre por difusão. c. . mas é prototrófico sob condições aeróbicas. potencial osmótico e atividade de água). b. Alguns mutantes de Neurospora crassa quando cultivados em temperaturas inferiores à 25°C são prototróficos. A água é utilizada como solvente (as enzimas não apresentam atividade na ausência de água. Este processo é denominado de osmose. Alguns fungos apresentam um requerimento absoluto por uma determinada vitamina sob condições específicas: a. A temperatura. mas o micélio é prototrófico. por exemplo). geralmente. quando cultivados em temperaturas superiores a 28°C requerem riboflavina.5 Tabela 3. requerem água em alta quantidade. nicotinamida e niacina ácido p-amino benzóico (PABA) ácido pantotênico (B5) cianocobalamina (B12) concentração requerida (M) 10-9 a 10-6 10-9 a 10-7 10-7 a 10-5 10-8 a 10-7 10-8 a 10-6 10-7 10-12 a 10-6 função cocarboxilase coenzima para transaminações coenzima para dehidrogenases forma ativa tiamina pirofosfato piridoxal e piridoxamina fosfato flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD) nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) e NAD fosfato (NADP) ácido tetrahidrofólico coenzima para dehidrogenases coenzima na transferência de 1 C coenzima na coenzima A transferência de 2 C coenzima na vários derivados da cobalamina transferência de CH3 Um fungo é chamado de auxotrófico quando requer uma determinada substância para o seu crescimento e de prototrófico quando o próprio fungo pode sintetizar a substância necessária para o seu crescimento. contudo. Pythium sp torna-se auxotrófico para tiamina quando a concentração de sal alcança um certo nível no meio de cultura. contudo. d. através da plasmalema que é semipermeável. 4. mas na fase micelial é prototrófico. o requerimento por água não é nutricional. Histoplasma sp requer tiamina e biotina na fase leveduriforme. de modo semelhante a todos os organismos. 1994). Vários pesquisadores têm utilizado uma série de termos para descrever as forças que estão envolvidas no movimento da água (pressão osmótica. afeta o requerimento por vitamina. ÁGUA Os fungos. Myrothecium sp requer biotina para germinação do esporo. vitaminas tiamina (B1) piridoxina (B6) riboflavina (B2) ácido nicotínico (B3). Mucor rouxii requer tiamina e ácido nicotínico sob condições anaeróbicas. em resposta a gradientes físicoquímicos.

55 5. os fungos alteram o pH do meio de cultura de forma drástica durante o seu crescimento.60 0. P é a pressão de vapor da água em solução e Po é a pressão de vapor da água pura.80 0. bactérias Caulobacter.75 0. Xeromyces bisporus abaixo deste valor ocorre desnaturação do DNA fungos filamentosos Mastigomycota Fusarium Penicillium Aspergillus - . onde UR é a umidade relativa da atmosfera em equilíbrio com a solução. Tabela 4. Fungos que tem a capacidade de crescer em Aw (Tabela 4) baixo são denominados de xerotolerantes. A despeito destas limitações. tornando-o básico. Spirillum Lactobacillus. Valores de Aw para crescimento de alguns microorganismos. portanto. normalmente pK = ± 0. O uso de tampões para controlar o pH é geralmente dificultado devido à limitada efetividade do tampão. onde Aw é a atividade de água (water activity). Estas alterações de pH podem ser causadas pela assimilação diferencial de cátions e ânions do meio de cultura ou mesmo através da produção de ácidos orgânicos que são liberados para o meio de cultura. os fungos crescem adequadamente quando o pH inicial é ajustado para uma faixa de 4 a 7. o íon NH4+ é assimilado como NH3 liberando H+ para o meio de cultura tornando-o ácido ou.para o meio. tornando difícil o controle do pH. Agregando-se as duas fórmulas temos: UR = 100 Aw ou Aw = UR/100. ânions de sais orgânicos são assimilados como ácidos livres tomando um próton da água e liberando um OH. os resultados são freqüentemente analisados com base em um único ponto durante o período de incubação. Bacillus bactérias halofílicas leveduras Ascomycetes Debaryomyces Saccharomyces rouxii. Por outro lado. Aw 1. Em vários experimentos o pH é ajustado inicialmente e o pH final é ou não relatado.6 A umidade relativa e a atividade de água estão relacionadas com a pressão de vapor da água em solução e água pura através das fórmulas: UR = 100 P/Po.5 pH. HIDROGÊNIO Não há muito o que comentar sobre os efeitos do íon hidrogênio sobre o crescimento de fungos devido aos experimentos serem realizados de forma inadequada.0 0.90 0. Estes fungos são extremamente importantes na indústria de alimentos como agentes de deterioração. Aw = P/Po. Por exemplo.

TEMPERATURA Geralmente são utilizados três parâmetros para descrever a influência da temperatura sobre o crescimento dos fungos: mínimo. CRESCIMENTO FÚNGICO A curva hipotética de crescimento dos fungos pode ser vista na figura abaixo (Figura 1). o êxito no processo de crescimento de uma cultura fúngica requer uma combinação adequada de nutrientes e fatores físicos. Em outras palavras. psicrófilos: não crescem acima de 20°C. também demonstram os mais diferentes tipos de respostas às condições físicas do ambiente. Assim como os fungos variam amplamente quanto às exigências nutricionais. gravidade. o mais estudado ao longo dos anos e o que tem maior quantidade de dados é a temperatura. pressão hidrostática e viscosidade. de 0 a 62°C. têm um mínimo abaixo de 0°C e um ótimo entre 0 e 17°C.7 AMBIENTE FÍSICO E CRESCIMENTO Além do conhecimento sobre os nutrientes apropriados para os fungos. luz e outras formas de radiação. máximo abaixo de 50°C e um ótimo entre 15 e 40°C. há necessidade de se conhecer em que condições físicas ambientais ocorre o crescimento fúngico mais adequado. 1. A luz tem mais efeito sobre a reprodução dos fungos do que sobre o crescimento. c. X e ultravioleta). . Aspergillus fumigatus que cresce numa faixa de 12 a 52°C é classificado como mesófilo termotolerante. mesófilos: têm um mínimo acima de 0°C. Por exemplo. com um ótimo variando entre 22 e 30°C. ótimo e máximo. 2. Fatores físicos ambientais que afetam o crescimento fúngico são temperatura. Alguns fungos podem situar-se entre uma classe e outra de acordo com suas exigências em termos de temperatura. b. A maioria dos fungos crescem numa ampla faixa de temperatura. O fator mais importante em determinadas condições. termófilos: têm um mínimo de ou acima de 20°C e um máximo de ou acima de 50°C. Outras formas de radiação tem a sua utilização em condições específicas e o interesse maior reside nas radiações mutagênicas (raios gama. Existem pouquíssimos estudos sobre os três últimos fatores. Existem muitos estudos sobre o ótimo de temperatura para o crescimento fúngico e pouco interesse para as condições extremas de temperatura (mínima e máxima) Os fungos podem ser classificados de acordo com a temperatura para o seu crescimento em: a.

8 Figura 1. FASE LOG (fase exponencial ou logarítmica – exponential or logarithmic phase) Esta fase é marcada por uma taxa de crescimento acelerado na qual o logaritmo do peso seco fornece uma reta com o tempo de incubação.1.2. contudo. o crescimento não ocorre imediatamente. com a natureza do inóculo e com as condições nutricionais do meio de cultura. esta fase é o período necessário para ocorrer a germinação dos esporos. apesar de estimular o crescimento tem como efeito principal a redução do comprimento da fase lag. Temperatura abaixo do ótimo aumenta o período de duração da fase lag. A fase log é fortemente afetada pelo suprimento de nutrientes. Entre os fatores físicos. Quando o inóculo consiste de esporos. por estarem. geralmente. . não ocorre crescimento visível. a temperatura também pode atuar na duração da fase lag. Quando são utilizados fragmentos de hifas como inóculo. Em Allomyces sp a concentração baixa de ácido glutâmico no meio de cultura. Existe. há necessidade de um período de tempo para que o crescimento possa iniciar. danificadas. Por outro lado. FASE LAG (fase de adaptação – lag phase) Quando o inóculo (esporos ou fragmentos de hifas) é transferido para um novo meio de cultura e incubado em condições favoráveis. peso seco (mg) fase log fase de declínio fase lag fase estacionária fase de morte (autólise) tempo (h) 2. Os fatores nutricionais podem afetar a duração da fase lag. que varia com as espécies fúngicas. Outros fatores podem também afetar a taxa de crescimento nesta fase (culturas fúngicas agitadas em agitador crescem significativamente mais rápido que culturas estacionárias). a utilização de acetato de amônia como fonte de nitrogênio ou alta concentração de glicose provoca o aparecimento da fase lag. Nesta fase. Curva típica de crescimento fúngico. geralmente. um período denominado de fase lag. 2. Giberella sp não apresenta a fase lag.

4. John Wiley & Sons. A. pelo acúmulo de substâncias tóxicas produzidas pelo fungo durante a fase log. morte da cultura. J. 1976. 2002. GRIFFIN. John Wiley & Sons. principalmente.L. Worth Publishers. FASE DE DECLÍNIO (decline phase) A fase de declínio é provocada pela exaustão de alguns nutrientes que se tornam limitantes ou. 1994.3. ainda. 458 p LEHNINGER. ao acúmulo de carboidratos e lipídeos. Em Giberella fujikuroi foi observado que a exaustão de nitrogênio marcou o fim da fase log e. 2. A paralisação completa da utilização de glicose resulta em autólise e. embora continue ocorrendo utilização de glicose pelo fungo.9 2. 1978. FASE ESTACIONÁRIA E DE MORTE (stationary and death phase) Nesta fase cessa o aumento de peso seco. New York. consequentemente. Microbiologia – Fundamentos e Perspectivas. P. que o aumento de peso seco foi devido. 123 p . New York. LITERATURA RECOMENDADA BLACK. Practical Fungal Physiology.M. New York. Guanabara Koogan.G. Biochemistry. ROBINSON. Rio de Janeiro. 1104 p. D. Fungal Physiology.H.

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