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UNIVERSIDADE DE CUIABÁ-UNIC
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Diagnóstico Laboratorial em Microbiologia Clínica

BACTERIOLOGIA

Profa. Evelin Rodrigues Martins Profa. Ana Caroline A. Yamamoto Profa. Rosane Christine Hahn

Cuiabá – 2011

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Apresentação
Esta apostila se destina a complementar as atividades de estágio supervisionado em Bacteriologia Clínica ministrado aos alunos do curso de Farmácia da Universidade de Cuiabá, UNIC. A prática da Bacteriologia Clínica é parte importante da formação do farmacêutico para proporcionar ao aluno concluinte do curso um alicerce de conhecimentos básicos necessários para:   Aplicar, na prática diária do laboratório, os princípios de biosegurança; Conhecer e aplicar corretamente técnicas de coleta, semeadura e processamento de materiais biológicos diversos; Isolar e identificar microrganismos presentes em um material biológico, relacionando-os com a microbiota (quando houver) e possíveis contaminantes, para que seja diagnosticada a real etiologia de uma infecção; Realizar teste de sensibilidade a antibacterianos, segundo técnicas adequadas, para que seja garantido um resultado fidedigno que oriente a terapêutica aplicada ao paciente e garantindo a qualidade dos resultados.

Todas as informações contidas nesta apostila foram adaptadas conforme rotina do setor de microbiologia do Laboratório Escola de Análises Clínicas do Hospital Geral Universitário (LEACHGU) como guia teórico-prático. Entretanto vale ressaltar que outros laboratórios de análises clínicas do Mato Grosso e de diferentes Estados brasileiro adotam rotinas microbiológicas diversificadas. Desse modo, no decorrer dos anos e décadas, novas informações teórico-prático do mundo microbiológico nos enriqueceram durante nossa vida profissional, para que possamos contribuir com a saúde e o bem estar da população. As autoras.

“Considerem a diferença de tamanho entre algumas das menores e das maiores criaturas existente na terra. Uma pequena bactéria pesa 0, 000 000 01 grama. A baleia azul pesa cerca de 100 000 000 grama. Mas mesmo assim uma bactéria é capaz de matar uma baleia. São tão grandes a capacidade de adaptação e a versatilidade dos microorganismos, comparados aos seres humanos e outros organismos tidos como “superiores”, que eles sem dúvida continuarão a colonizar e alterar a superfície da Terra logo depois que nós e o resto de nossos cohabitantes deixarmos a cena para sempre . Os micróbios, e não os macróbios, dominarão o mundo.” Bernard Dixon, 1994.

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Índice
1- Microbiota Corpo Humano 2-Biosegurança em Microbiologia 3-Meios de Cultura 3.1- Controle de qualidade dos meios de cultura. 4- Tipos de Semeadura 01 02 06 10 15

5- Processamento das Amostras Biológicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia. 17 6- Interpretação Macroscópica das Bactérias em Meios de Cultura. 6.1- Interpretação do crescimento microbiológico nos meios de cultura. 7- Preparo e Fixação do Esfregaço Bacteriológico. 8- Principais Colorações em Bacteriologia 9- Identificação Bioquímica de Bactérias de Importância Médica. 9.1- Cocos Gram Positivos (CGP) 9.2- Bacilos Gram Negativos (BGN) 9.2.1- Fermentadores de Glicose (Enterobactérias) 9.2.2- Não Fermentadores de Glicose 9.3- Bacilos Álcool Ácido Resistente (BAAR) 9.4- Diplococos Gram Negativos 9.5- Bacilos Gram Negativos Pleomórficos 9.6- Chlamydia spp. e Treponema spp. 9.7- Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. 10- Diagnóstico laboratorial das Infecções Genitais. 11- Teste de Susceptibilidade Antibacteriana (TSA). 11.1- Métodos Utilizados na Execução do TSA. 11.2- Procedimentos de Execução do TSA por Disco-Difusão. 11.3- Mecanismo de Ação dos Antibióticos. 12- Resistência Bacteriana aos Antibióticos. 12.1- Principais Mecanismos de Resistência Bacteriana. 12.2- Resistência dos CGP e BGN Alguns Antibióticos. 12.3- Triagem Fenotípica de Resistência Bacteriana Rotina Laboratorial. 13-Referências Bibliográficas 14- Anexos 26 29 32 35 37 37 46 46 51 51 53 54 56 57 58 61 61 62 63 65 65 67 68 72 73

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1-Microbiota Corpo Humano
O corpo humano é habitado por um grande número de microrganismo, que, juntos, são chamados microbiota ou flora normal. A maioria dos membros da flora normal são bactérias, mas fungos e protozoários também são encontrados. No corpo humano sadio, os órgãos internos como sangue, cérebro, músculos e outros, são normalmente livres de microrganismos. De modo contrário, os tecidos superficiais como a pele e membranas mucosas estão constantemente em contato com os microrganismos do meio ambiente e são normalmente colonizados por certas espécies microbianas, conforme tabela abaixo.

Bactérias comumente encontradas no corpo humano. Bactérias
Pele Conjuntiva Nariz Faringe Boca Intestinos Uretra anterior Vagina

Staphylococcus aureus ● ± ● ● S. epidermidis ♦♦ ● ♦♦ ● Streptococcus mitis ● Streptococcus salivarius ♦♦ Streptococcus pneumoniae ± ± ● Streptococcus pyogenes ± ± ● Enterococcus faecalis ± Neisseria spp. ● ● ♦♦ Neisseria meningitidis ● ● Escherichia coli ± ± ± Proteus mirabilis ± ● ● Pseudomonas aeruginosa ± Haemophilus influenzae ± ● ● Bacterioides ● Lactobacilos ± Clostridium tetani Corynebacterium ♦♦ ● ♦♦ ● Micoplasmas ● Legenda: ●comum; ± irregular ou incerto; ♦♦ proeminente.

● ♦♦ ♦♦ ♦♦ ● ● ● ● ♦♦ ● ● ± ● ● ♦♦ ● ●

♦♦ ● ±

± ♦♦ ●

● ● ● ± ● ● ● ● ● ●

± ♦♦

● ● ● ● ± ●

♦♦ ● ● ♦♦ ● ± ● ●

± ♦♦ ● ●

● ±

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. Revinter: Rio Janeiro. 2006. p70.

Os microrganismos da microbiota ou flora normal não causam doenças. Eles são residentes de um corpo saudável e são ocupantes permanentes. Já aqueles que são transitórios do corpo humano saudável podem estabelecer-se brevemente, mas tendem a ser excluídos por competição com os residentes ou pelos mecanismos de defesa imunológicos do hospedeiro. Os microrganismos transitórios não são considerados como parte da flora ou microbiota normal. Alguns organismos da microbiota normal podem ser patógenos oportunistas, causam infecções se ocorrer danos teciduais em sítios corpóreos específicos ou se a resistência do corpo à infecção é diminuída. Deste modo, é importante conhecer os tipos de microrganismos que habitam o corpo saudável. Este conhecimento fornece discernimento dos tipos de infecções que podem ocorrer, após um trauma tecidual, em vários sítios, bem como, a função desempenhada pela flora normal de prevenir a colonização do nosso corpo pelos micróbios.

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2-Biosegurança
A segurança da rotina laboratorial é de suma importância na organização do ambiente de trabalho, bem como para nossa proteção pessoal. Portanto, devemos usar corretamente os equipamentos proteção individual (EPIs) e equipamentos de proteção coletivos (EPCs). Isso se deve aos diferentes tipos de níveis de segurança classificados conforme a atividade e o microrganismo de maior risco que venham ser manipulados por diferentes profissionais da área de saúde. Classificação dos laboratórios segundo os níveis de biosegurança Resumo dos níveis de segurança recomendados para agentes infecciosos Agentes Condutas EPI e EPC Outros Nível 1
Não causam doenças ao homem Associados com doença infecciosa -Boas práticas de laboratório -Jaleco, luva*, óculos de proteção (qdo necessário) -Cabine de segurança (classe II) -Jaleco, luvas e óculos de proteção -Pia -Lava olhos

Nível 2

Nível 3

Associados com danos potencialmente letais

-Condutas do nível 1 -Acesso limitado -Sinalização de infectante -Cuidados com perfurocortantes -Normas para descontaminação -Condutas do nível 2 –Acesso controlado com ante-sala –Descontaminação de todo o lixo (ex.: autoclavação)

-Necessidades do nível 1 -Descontaminação antes do descarte de resíduos (ex.: autoclavação)

-EPI do nível 2 -Jaleco adicional (descartável) -Máscara apropriada (N95)

-Necessidades do nível 2 -Sistema de exaustão controlado e exclusivo de pressão negativa -Porta com fechamento automático -Necessidades do nível 3 -Laboratório em edifício isolado

Nível 4

Associados a agentes de risco de transmissão desconhecida

-Condutas do nível 3 -Troca de roupa na entrada -Ducha na saída –Descontaminação de todo o material antes de sair das instalações

-EPI do nível 3 -Cabine de segurança classe II B3 ou B2 -Roupas especiais com sistema individual de pressão positiva

*O uso de luvas é indicado quando existem lesões em pele Fonte: OPLUSTIL, C. P.; et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2º Edição. São Paulo. 2004. Pág. 02.

Equipamentos de Proteção Os equipamentos de proteção incluem cabine de segurança biológica combinada com o uso de EPIs (luvas, jalecos, gorros, pró-pés, máscaras ou óculos de proteção), dependendo do nível de segurança necessário.

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Cabine de Segurança Biológica São três os tipos de cabine de segurança biológica: Classe I O fluxo de ar ocorre de fora para dentro, pela abertura frontal, sem recirculação do ar. O ar da cabine passa por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratório. Classe II Cabine de abertura frontal na qual uma parte do ar é recirculado. Este tipo de cabine se subdivide em:  AII 30% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 70% é recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA; 30% são exauridos para dentro ou fora do laboratório através de outro filtro HEPA.  B3 70% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 30% é recirculado para o interior da cabine passando por um filtro HEPA; 70% são exauridos para fora do laboratório através de outro filtro HEPA e por um sistema de exaustão.  B2 100% de exaustão. Sem circulação do ar protegendo o operador, o material manipulado e o ambiente. Classe III Cabine hermeticamente fechada, impermeável a gases, e todo o trabalho é realizado com luvas de borracha que estão presas à câmara. O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo exaustor passa por outros filtros HEPA dispostos sequencialmente.

Vias de Infecção Existem diversas vias pelas quais podem ocorrer infecções no laboratório de microbiologia. Dentre elas podemos citar:  Inalação: provocada pela formação de aerossóis.  Ingestão: provocada devido à pipetagem da amostra com a boca e não lavar as mãos antes da refeição, de beber ou fumar.  Inoculação Direta: provocada por um acidente  Contato com membrana mucosa: contaminação com certos organismos através da mucosa oral, ocular, etc. Limpeza Uma das atividades mais importantes para manter a área física e os equipamentos em condições adequadas é a limpeza geral do laboratório. A limpeza inclui o cuidado com as superfícies e com o resíduo gerado dentro do laboratório. Para descontaminação de artigos e superfícies do laboratório podem ser utilizados alguns procedimentos e produtos, tais como:  Autoclave: Concentração – Vapor saturado 121ºC por 15 minutos Tempo total de contato – 50-90 minutos Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, esporos, fungos e vírus. Características Importantes – Risco de queimadura se operado inadequadamente.

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Aplicação – resíduos infectantes, líquidos e vidrarias.  Fenóis Concentração – 0,2-2% Tempo de contato – 10-30 minutos Atividade Contra – Bactérias, fungos, micobactérias, vírus hidrofílico variável) e vírus lipofílicos.

(germicida

Características Importantes – Efeito residual, corrosivo, efeito irritante da pele e olhos e tóxico se absorvido ou ingerido. Aplicação – Descontaminação ambiental, de bancadas, pisos e superfícies contaminados com material infectante.  Cloro e compostos clorados Concentração – 0,1-2% (1000 a 20000 ppm) Tempo de contato – 10-30 minutos Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, fungos, esporos (germicida variável) e vírus. Características Importantes – inativado por matéria orgânica; efeito residual; corrosivos; efeito irritante de pele, olhos e trato respiratório; tóxico se absorvido ou ingerido. Aplicação – Descontaminação ambiental de bancadas, pisos e superfícies contaminados com material infectante.  Álcool etílico Concentração – 70-85% Tempo de contato – 10-30 minutos Atividade Contra – Bactérias, micobactérias, fungos, vírus hidrofílicos (germicida variável) e vírus lipofílicos Características Importantes – inativado por matéria orgânica, efeito irritante da pele e dos olhos, tóxico se absorvido ou ingerido. Aplicação – Superfícies de equipamentos e anti-sepsia de pele

Considerações Gerais  Toda amostra biológica deve ser considerada potencialmente contaminada.  Toda manipulação de material biológico deve ser realizada com o uso de luvas e, ao término desta, desinfetá-las com ácido fênico 5% antes de descarta-las e quando necessário utilizar também óculos de proteção.  Usar máscara para evitar a inalação de esporos fúngicos, pois, além das espécies que podem infectar pulmões, várias outras são responsáveis por fenômenos alérgicos, que se manifestam também nas vias respiratórias.  Trabalhar com o bico de Bunsen aceso e interposto entre o técnico e o material (clínico ou cultura).  Todo procedimento em que houver risco de respingos ou formação de aerossóis deve ser manipulado dentro de uma cabine de segurança biológica.  Não pipetar nenhum tipo de solução ou material com a boca.  Não reencapar agulhas e descartar material perfurocortantes em recipiente apropriado. Reduzir ao máximo a utilização de materiais perfurocortantes.  O material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte.  Determinar áreas limpas e contaminadas.  Os equipamentos devem ser descontaminado antes de ser transportados.

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     

Limpar e desinfetar todas as superfícies de trabalho após respingos e ao início e final de cada jornada. Manter organizadas todas as áreas de trabalho. Não estocar grandes quantidades de itens contaminados em áreas de trabalho (por exemplo, placas com crescimento bacteriano). Tirar o jaleco quando sair do setor e colocar em local designado. Lavar as mãos e/ou superfície da pele imediatamente após contato com amostra biológica, após remover as luvas e ao completar qualquer atividade. Segregar todo resíduo infectante gerado e descarta-lo em embalagens próprias para autoclavação (por exemplo, caixa de descarte, ou saco autoclavável de polietileno de alta densidade)

Cuidados com gases comprimidos  Posicionar os cilindros em local apropriado e de maneira segura.  Manter distante de fogo e fontes de calor.  Usar os reguladores de pressão corretamente

Cuidados com agentes químicos  Usar EPI quando da utilização de produtos químicos.  Rotular todos os reagentes com seu nome químico ou técnico e indicação de “risco químico” apropriado, como: inflamável, corrosivo, tóxico, nocivo, e irritante.  Ter um manual de procedimentos em caso de acidente para todos os reagentes químicos.  Estocar líquidos inflamáveis e combustíveis em áreas apropriadas e ventiladas.  Deixar na bancada somente o volume necessário para uso diário.  Manter no laboratório disponível a todos os colaboradores as fichas contendo informações de segurança dos produtos químicos utilizados.

Orientações para descontaminação em caso de acidentes  Usar luvas e jalecos  Colocar sobre o sangue, fluido ou material contaminado papel absorvente (como papel toalha)  Saturar o papel-toalha com hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos.  Remover os resíduos e descarta-los em caixa apropriada ou em saco autoclavável (polietileno de alta densidade).  Fazer nova descontaminação de área com hipoclorito de sódio a 1%.  Todo material utilizado na limpeza deverá ser descartado em local apropriado (fragmentos de vidro e outros materiais cortantes).

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3-Meios de Cultura
O meio de cultura é uma mistura de nutrientes necessários ao crescimento microbiano. Basicamente deve conter a fonte de energia e de todos os elementos imprescindíveis à vida dos microrganismos. O meio de cultura deve ainda atender às necessidades específicas do grupo, da família, do gênero ou da espécie que se deseja cultivar. Assim, é imprescindível acrescentar ao meio de cultura vitaminas, cofatores, aminoácidos etc.; quando estes compostos não são sintetizados por microrganismos que se deseja cultivar.

Principais Componentes dos Meios de Cultura
Ágar Agente gelificante para preparação de meios de cultura microbiológicos, substância obtida de determinadas espécies de algas vermelhas marinhas, é um poligalactosídeo em que a maioria dos microrganismos é incapaz de degradá-lo. Bile de boi dessecada Trata-se da bile natural purificada que foi submetida a um processo de dessecação. Caseína Hidrolisada Esta substância é obtida pela hidrólise com ácido clorídrico (HCL). Extrato de Carne É preparado a partir de carne desprovida de tendões e gordura. Extrato de Levedura É obtida por extração aquosa de levedo de cerveja autolisado. Devido ao seu elevado conteúdo em nitrogênio amínico e vitaminas, oferece excelentes condições de crescimento a uma gama de microrganismos. Peptona de Carne É obtida pela degradação proteolítica da carne por enzimas (pepsina, tripsina). É um excelente substrato nutritivo. Proteose-Peptona É uma peptona, com uma elevada proporção de peptídeos, aminoácidos livres e fatores de crescimento. Constitui-se de uma excelente base nutritiva para o cultivo de Neisseria spp, Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Salmonella spp, Pasteurella spp e Corynebacterium spp. Triptona É um digerido pancreático de caseína. A caseína, proteína principal do leite, é uma rica fonte de nitrogênio amínico. Tem um alto teor de triptofano e, consequentemente, pode ser usada em meios para testar a reação de indol. **Para o aprimoramento dos isolados bacterianos patogênicos atualmente inúmeros são os meios de cultura produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que serão descritos apenas os utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.

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Meios de Cultura para Transporte
 Meio Stuart - Princípio: Meio semi-sólido comercial que impede consideravelmente a multiplicação dos microrganismos pela carência de fonte de nitrogênio e ao mesmo tempo garante a sobrevivência através de sua composição nutritiva. - Utilidade: Transportar diversas amostras biológicas, principalmente secreções e conservação de microrganismos patogênicos.  Ágar Nutriente ou Nutritivo - Princípio: Meio sólido relativamente simples, composto de extrato de carne, peptona, ágarágar e outras substâncias. Muito utilizado nos procedimentos do laboratório de bacteriologia. - Utilidade: Conservação e manutenção de culturas bacterianas.  Salina 0,85% estéril Substância que mantém a bactéria viável e utilizada como meio de transporte para exame a fresco de secreções genitais.

Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento
O crescimento do microrganismo nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.  Ágar Chocolate (AC) Meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas. - Princípio: à base do meio, é adicionado sangue de carneiro, coelho ou cavalo em temperatura alta. Ocorre lise das hemácias, a partir do aquecimento da mistura meio cultura+sangue de carneiro. Utilidade: Crescimento de microrganismos exigentes como por ex.: Neisseria spp e Haemophilus spp. - Atmosfera de incubação: Anaerobiose facultativa - CO2

 Ágar Sangue (AS) Meio rico, não seletivo e diferencial para hemólise. Permite o crescimento da maioria das bactérias Gram negativos e Gram positivos, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies. - Princípio: A base do meio é composta exclusivamente de sangue de carneiro, coelho, desfibrinado. Oferece ótimas condições ao crescimento a maioria dos microrganismos. - Utilidade: Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos. Verificação de hemólise dos Streptococcus spp e Staphylococcus spp; bem como empregado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp). - Atmosfera de incubação: Anaerobiose facultativa - CO2  Ágar MacConkey (MC) Meio seletivo para bactérias Gram negativa, e diferencial para a utilização da lactose.

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- Princípio: O cristal de violeta que compõe o meio de cultura inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente estafilococos e enterococos. - Utilidade: Isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose. As colônias lactose positiva, apresentam coloração róseo intenso e as colônias lactose negativas apresentam coloração inalterada. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Ágar Salmonella Shigella (SS) Meio seletivo para Salmonella spp e Shigella spp e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra). Atenção: Outros bacilos entéricos Gram negativos também crescem no meio SS. - Princípio: Possui componentes tais como: sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio que inibem bactérias Gram positivos. A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positivo (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultam na formação de colônias róseas e bactérias que não fermentam a lactose formam colônias inalteradas). O tiosulfato se sódio presente permitem a detecção de H2S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. - Utilidade: Selecionar e isolar espécies de Salmonella spp e Shigella spp, em amostras de fezes, alimentos e água. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Ágar CLED (Cystine Lactose Eletrolyte Deficient) - Princípio: Devido a sua composição deficiente em eletrólitos inibe a formação do véu de Proteus spp. É um meio de cultura não seletivo e diferencial para a utilização de lactose. Cepas lactose positiva apresentam colônias de coloração amarela; já bactérias lactose negativas apresentam-se inalteradas quanto à coloração. - Utilidade: Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Ágar Cromogênico Meio de cultura que utilizam substratos cromogênicos, sobre uma base nutricional rica. -Princípio: Após a clivagem dos substratos cromogênicos combinados presentes no meio de cultura por enzimas bacterianas, tais como: beta-glicosidade, beta-galactosidade (grupo KlebsiellaEnterobacter-Serratia) e triptofano-desaminase (grupo Proteus-Providencia-Morganella) ocorrem à liberação de radicais coloridos. - Utilidade: Para facilitar o reconhecimento precoce de vários grupos e espécies de microrganismos (bactérias e fungos), tais como os uropatógenos. -Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Ágar Lowenstein-Jensen (LJ) Meio seletivo para bactérias álcool ácido resistente. - Princípio: Possui incorporado ao meio de cultura uma grande quantidade de proteína, favorecendo no crescimento do BAAR. - Utilidade: Isolamento e testes de identificação de micobactérias. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

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 Ágar Thayer Martin - Princípio: Possui incorporado ao meio de cultura os suplementos V e X, importantes para o crescimento dos diplococos Gram negativos. - Utilidade: Isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis em amostras clínicas que podem conter uma microbiota mista. - Atmosfera de incubação: Anaerobiose facultativa - CO2

 Caldo Tetrationato (TETRA) - Princípio: Os sais de bile contidos no meio tetrationato inibem microrganismos Gram positivos. Com a adição da solução de iodo ocorre inibição da microbiota intestinal de espécies fecais. - Utilidade: Meio de enriquecimento para Salmonella spp. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Caldo Todd-Hewitt Meio líquido seletivo para o isolamento de estreptococos beta-hemolíticos de amostras clínicas contendo flora mista. - Princípio: Tem em sua formulação a adição de alguns antibióticos que tornam o caldo seletivo para o isolamento de estreptococos do grupo B. - Utilidade: Meio de enriquecimento para o isolamento de Streptococcus agalactiae. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

 Caldo BHI (Brain Heart Infusion) - Princípio: Meio derivado do nutriente do cérebro e coração, peptona e dextrose. A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas; já a dextrose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação. - Utilidades: Auxilia no crescimento e motilidade bacteriana. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2

Meios para Provas Bioquímicas
Serão discutidos nos itens de identificação para cocos Gram positivos e bacilos Gram negativos. **Para o aprimoramento da identificação de bactérias patogênicas, atualmente inúmeros são os meios de cultura e kits produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que serão descritos apenas os utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.

Meios para Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos
 Ágar HTM (Haemophilus Test Medium) Princípio: Apresentam incorporados ao meio de cultura os suplementos V e X, importantes para o crescimento da bactéria em questão. - Utilidades: Realização do antibiograma ou teste de sensibilidade aos antimicrobianos em espécies de Haemophilus. - Atmosfera de incubação: Anaerobiose facultativa – CO2

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 Ágar Mueller Hinton - Princípio: Oferece condições de crescimento às principais bactérias, padronizada por Kirby e Bauer e CLSI. - Utilidade: Para realizar teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e fitas de E–Test para enterobactérias, não fermentadores e Staphylococcus spp. - Atmosfera de incubação: Aerobiose – O2  Ágar Muller Hinton Sangue - Princípio: Idêntico ao item acima. - Utilidade: Meio utilizado para realização do teste de resistência aos antimicrobianos pelos métodos de disco difusão e fitas de E-Test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos dos grupos A, B, C e G de Lancefield. - Atmosfera de incubação: Anaerobiose facultativa - CO2

3.1-Controle de Qualidade dos Meios de Cultura
Os meios de cultura produzidos em média e grande escala pelo setor de microbiologia clínica dos laboratórios de análises clínicas devem realizar o controle de qualidade para garantir e monitorar a integridade dos mesmos, bem como para manter de forma contínua a qualidade dos resultados microbiológicos. O programa de controle qualidade para meios de cultura deve garantir:

 Esterilidade
Todo novo lote de meio de cultura preparado no laboratório de microbiologia deve ser testado para prova em questão. Procedimento: Incubar em estufa de cultura microbiológica a 35°±2°C, 5% do lote de meio de cultivo por 18 às 24h e mais 24h em temperatura ambiente. Resultado: Adequado: Ausência de microrganismos contaminantes nos meios de cultura. Inadequado: Aparecimento de contaminantes nos meios de cultura. Causas prováveis resultados inadequados: Processo de autoclavação comprometida, contaminação do ambiente, do sangue ou outro complemento adicionado contaminado. Ação corretiva: O lote de meio de cultivo é desprezado e novo lote é produzido antes da liberação para uso. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

 Viabilidade (crescimento) A habilidade do meio de cultura de permitir crescimento de microrganismos definidos deve ser determinada pela inoculação do meio com isolados específico de microrganismo estoque, de acordo com as características esperadas da cepa teste frente a cada tipo de meio de cultura. Procedimento: Preparar uma suspensão a 0,5 da escala de McFarland com solução salina 0,95%; Diluir a suspensão 1:10;

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Homogeneizar e usar uma alça de 0, 001 mL (1µL) para semeadura, equivalente a 1,5 X 104 unidades formadoras de colônias (UFC); Semear a suspensão por esgotamento em quatro quadrantes; Incubar em estufa microbiológica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade. Resultado: Adequado: crescimento bom em todos os quadrantes, colônias bacterianas típicas. Inadequado: Ausência de crescimento ou crescimento de bactérias escassas em somente 01 ou 02 quadrantes. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada. Causas prováveis resultados inadequados: Preparação do inóculo bacteriano na escala 0,5 de McFarland pouco carregado para este propósito. Ação corretiva: Realizar uma nova suspensão a 0,5 McFarland e repetir o procedimento de crescimento bacteriano.

 Inibição (meios seletivos)
Os meios seletivos são designados não apenas para permitir crescimento de alguns microrganismos, mas também para inibir o crescimento de outros. Procedimento: O meio deve ser inoculado com bactérias representativas de ambos os grupos (bactéria para o meio de cultura específico e outra para controle seletivo de inibição). Por ex: no meio MacConkey semear cepa padrão de Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923). Preparar uma suspensão a 0,5 da escala de McFarland com solução salina 0,95%; Diluir a suspensão 1:10; Homogeneizar, usar alça 0,01 mL (10µL) para semeadura, equivalente a 1,5 X 10 5 UFC; Semear a suspensão por esgotamento em quatro quadrantes; Incubar em estufa microbiológica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade. Resultado: Adequado: Inibição do crescimento do microrganismo. Inadequado: Crescimento abundante do microrganismo seletivo de inibição. Causas prováveis resultados inadequados: Contaminação dos complementos adicionados de meios de cultura vencidos. Processo de autoclavação de meios de cultura que não devem ser autoclavados. Ação corretiva: Verificar data de validade dos meios de culturas. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

 Resposta bioquímica
Verifica se os meios de cultura produzidos para reações específicas de identificação microbiológica produzem mesmo essa reação. Procedimento: Utilizar cepas que produzam reações específicas para sua identificação em nível de gênero ou espécie. Por exemplo:

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Inocular na superfície do meio FENIL (Fenilalanina) uma cepa de Proteus spp ou Morganella spp. ou Providencia spp. Incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por 18 às 24h. Em seguida adicionar 20 gotas do cloreto férrico 10%. Aguardar a reação. Resultado do exemplo acima citado: Adequado: Formação de coloração VERDE na superfície do meio FENIL. Esta reação ocorre devido produção de uma enzima específica (fenilalanina desaminase) presente nos gêneros bacterianos citados acima para o consumo do aminoácido fenilalanina, que é revelada pela adição de um reagente químico. Inadequado: Ausência de coloração verde na superfície do meio fenil. Causas prováveis resultado inadequado no exemplo acima citado: Reagente químico e meio de cultura vencidos. Ação corretiva: Verificar data de validade do meio de cultura e cloreto férrico. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

## Para os meios de cultura e kits de identificação comerciais, o certificado do controle de qualidade é fornecido pelo fabricante.

Atenção!
Todos os meios de cultura devem ser armazenados em geladeira em temperatura entre 2 - 8°C e condicionados em embalagens para manter a umidade do meio. Em todas as placas de meio de cultura produzidas deve conter número do lote, datas de fabricação e validade e inicial do meio de cultura. Desprezar meios de cultura sólidos que apresentem sinais de ressecamento e meios líquidos que apresentem diminuição do volume original e qualquer sinal de contaminação, mesmo que estejam dentro da data de validade.

 Cepas bacterianas para teste dos meios de cultura Para realização dos testes de meio de cultura pode-se utilizar tipos diferentes de cepas: o Cepas congeladas a partir de cepas padrão (ATCC), adquiridas comercialmente. o Cepas isoladas de pacientes no laboratório para controle de crescimento de meios de cultura, após terem suas identificações confirmadas.

 Controle de qualidade do Ágar Mueller-Hinton (MH) Provas de controle de qualidade devem ser realizadas no ágar Mueller-Hinton para viabilizar a utilização deste meio de cultura, responsável pela avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos. Devem ser realizada a cada nova produção de MH, os seguintes testes de controle de qualidade:

Dosagem do pH
O pH do meio Mueller-Hinton deve estar entre 7,2 e 7,4. Procedimento: Separar uma porção pequena do ágar Mueller-Hinton em becker após esterilização; Após gelificação em temperatura ambiente, macerar o ágar e colocar o eletrodo de superfície do pHmetro para medir o pH;

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Resultado: O pH do meio de cultura MH deve estar entre 7,2 e 7,4.

Espessura do meio MH em placas
Para ter halos de inibição de forma fidedignos a espessura do ágar Mueller-Hinton deve ser mensurada com paquímetro ou régua. Procedimento: Após esterilização do ágar Mueller-Hinton deve-se distribuir em placas de petri sobre superfície absolutamente plana para obter profundidade uniforme de aproximadamente quatro milímetro (04 mm), com auxílio de pipeta graduada estéril. 0 Em placas de 150 mm o volume ideal de meio MH é cerca de 60 mL. Já em placas de 90 mm o volume ideal de meio é de 25 mL. Com uma régua ou paquímetro mensurar 04 mm de espessura de ágar MH na placa petri. Resultado: A espessura do ágar MH deve ser de 04 mm.

Dosagem dos níveis de Ca2+ e Mg2+ em água destilada para preparação do meio de cultura Mueller-Hinton
A dosagem de Cálcio e Magnésio na água potável que passa por processos de purificação como destilação e deionização são de suma importância na qualidade da produção dos meios de culturas, principalmente do Mueller-Hinton; bem como no resultado final do antibiograma (leitura e interpretação dos halos de inibição). Procedimento: # Dosagem de Ca2+ na água destilada Colocar 02 ml de água destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NaOH 03 mol/L e 05 gotas (NH4)2C2O4 1% agitar. Aguardar reação. # Dosagem de Mg2+ na água destilada Colocar 02 ml de água destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NH4OH 05 mol/L e 05 gotas Na2HPO4 0,2 mol/L agitar. Aguardar reação. Resultado: → Dosagem de Cálcio Resultado positivo: Formação Precipitado Branco. Resultado negativo: Não há formação de precipitado. → Dosagem de Magnésio Resultado positivo: Formação Precipitado Branco. Resultado negativo: Não há formação de precipitado.

Importante!
Variáveis que podem interferir no resultado do antibiograma pelo ágar Mueller-Hinton. *Níveis de Ca2+ e Mg2+ Altas concentrações levam à diminuição na atividade de aminoglicosídeos diante de bactérias como Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactérias. Concentrações diminuídas levam a resultados contrários. *pH Em pH baixo se observa halos de inibição reduzidos para aminoglicosídeos, quinolonas, macrolídeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibióticos por ex: penicilina e tetraciclinas. O aumento do pH leva a resultados opostos ao anteriores. *Espessura do meio MH Menor que 03 mm leva à falsa sensibilidade geral, e maior que 04 mm à falsa resistência.

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Causas de alteração nas características e qualidade dos meios de cultura A B C D E F G Outras Causas Problema
Cor anormal meio pH incorreto do x x x x x x x x Armazenamento em alta temperatura. Hidrólise dos componentes. pH determinado à temperatura incorreta. Aquecimento inadequado. Conservação inadequada em frasco muito pequeno.

Precipitado atípico Solubilidade incompleta

x

x

x

x x

Escurecimento ou x caramelização Perda capacidade de gelificar Perda capacidade x nutritiva

x x

x x x Hidrólise do ágar por desvio no pH. Meio de cultura que não deve ser fervido. x Presença de eletrólitos fortes açucares, detergentes, antisépticos, metais venenosos, materiais protéicos ou outras substâncias que podem inibir o inóculo. Superaquecimento. Esterilização ineficaz. Técnica inadequada de adicionar enriquecimento e distribuição nas placas.

x

x

x

x

Contaminação

x

x

soluções

de

Legenda: A : meio deteriorado ou desidratado, B: vidro mal lavado, C : erro de pesagem, D: mistura incompleta, E: reaquecimento repetido, F: diluição excessiva, G: qualidade água.

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4-Tipos de Semeadura em Bacteriologia Clínica
Semeadura Qualitativa Permite o isolamento de todas as colônias microbiológicas diferentes, através do decrescente gradiente de concentração do inóculo (amostra biológica). Utiliza-se alça microbiológica de 0,01mL (10µL), conforme figura abaixo.

Procedimento da semeadura qualitativa:  Homogeneizar a amostra biológica;  Flambar a alça microbiológica (10µL), deixar esfriar;  Introduzir alça microbiológica 10µL na amostra biológica;  Observar a integridade da película de amostra formada na alça até descarregar o inóculo em um canto da placa;  Estriar partindo da ponta da primeira semeadura;  Repetir o procedimento anterior por duas vezes.

Não Esquecer
Semear seguindo a sequência dos meios de cultura mais ricos para os mais seletivos.

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p120.

Semeadura por Rolagem (Técnica de Maki) A técnica de semeadura por rolagem é utilizada para semear cateteres. Procedimento da semeadura:  Retirar o cateter do tubo estéril com auxílio de uma pinça estéril;  Colocar na superfície do AS;  Com o auxílio da pinça, rolar o cateter por toda a superfície do meio para frente e para trás, duas vezes. Conforme ilustração abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2004. p80.

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Semeadura Quantitativa A semeadura quantitativa se baseia na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do número de UFC (Unidades Formadoras de Colônias) obtidas após incubação. Utilizam-se dois artifícios para o efeito de diluição do material: # Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100µL. O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1ml, relativo ao volume inoculado; 1000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por alça calibrada. #Técnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluição seriada do material em escala decimal, isto é 1:10, 1: 100, 1: 1000. O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 01 ml, relativo à diluição utilizada: 10, 100, 1000, respectivamente. Utiliza-se alça microbiológica calibrada 0,001mL (1µL), conforme figura abaixo.

Procedimento semeadura quantitativa:  Homogeneizar a amostra biológica;  Flambar a alça microbiológica (1µL), deixar esfriar;  Introduzir alça microbiológica 1µL na amostra biológica;  Observar a integridade da película de amostra formada na alça até descarregar o inóculo em um único sentido;  Estriar o inóculo inicial de forma perpendicular e paralelo a este.

Fonte: Apostila ANVISA - Procedimentos Laboratoriais.

Fonte: LEACHGU/UNIC – 2010

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5-Processamento das Amostras Biológicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia
Os procedimentos as serem realizados em diferentes materiais clínicos e a cada situação específica é de fundamental importância para o sucesso final do exame microbiológico.

 Cateter
As infecções relacionadas a cateteres são em geral importantes, pois auxilia no diagnóstico para detecção de bacteremia, fungemia e complicações no local da inserção do cateter. →Amostras inaceitáveis para processamento De cateter encaminhado em meios de cultura em caldo ou em meio de transporte; Ponta de cateter vesical (Foley), uma vez que o crescimento de microrganismos representa a microbiota da uretra distal. De cateteres maiores que cinco (05) cm.

→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme já descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meio de cultura utilizado: Ágar Sangue (AS) Para semeadura de cateteres, deve ser utilizada pinça estéril para fazer o processo de rolagem. É importante observar, no momento da semeadura, que o cateter está rolando na placa e não sendo esfregado. Isso é fundamental para obter colônias isoladas. Após realização da semeadura por rolagem em AS do cateter colocar a placa de AS invertida imediatamente na jarra de vela (microaerofilia) e incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por até 72h.

 Escarro
A cultura de escarro é importante para detecção de patologias pulmonares, pois cerca de 30 a 50% das infecções são atualmente causadas por outras espécies que não as bactérias álcool ácido resistente (micobactérias). →Amostras inaceitáveis para processamento Quantidade muito pequena e/ou saliva. Amostras em temperatura ambiente por mais de 24 horas, mantidas refrigeradas por mais de sete (07) dias e expostas à luz solar. Utilização da porção não purulenta do escarro.

→Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
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Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme já descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC) e quando solicitado em Ágar Lowenstein-Jensen (LJ). Utilizar a porção mais purulenta do escarro e semear por esgotamento (Técnica qualitativa) com alça bacteriológica de 10µL nos meios de Ágar sangue (AS), Chocolate (AC) e Mac Conkey (MC). As placas de AS e AC devem ser colocadas invertida imediatamente na jarra de microaerofilia com a vela acesa e incubadas em estufa microbiológica a 35°±2°C por até 72h. Já a placa de MC em aerobiose em estufa microbiológica a 35°±2°C também por até 72h. O ágar Lowenstein-Jensen (LJ) deve ser semeado por estriamento na superfície inclinada do meio, em seguida fechar o frasco. Incubar em estufa microbiológica a 35°±2°C por 30 dias ou mais.

 Fezes
O cultivo de fezes é fundamental para o isolamento de microrganismos causadores de gastroenterites agudas e/ou crônicas de origem bacteriana. →Amostras inaceitáveis para processamento Sem conservantes que foram obtidas e armazenadas há mais de 3 horas; Mistura de várias amostras colhidas no mesmo dia; Fezes líquidas colhidas ou enviadas em fralda; Amostras de fezes contaminadas com urina; Amostras coletadas há mais de três dias; Fezes de pacientes fazendo uso de antimicrobianos;

→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme já descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Caldo Tetrationato (CT), Ágar Mac Conkey (MC) e Ágar Salmonella/Shigella (SS). *Amostra obtida de swab: Introduzir swab no tubo com o meio de cultura em caldo Tetrationato e esgotar o algodão molhado nas paredes internas do tubo. Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriológica á 35± 2ºC por 18 a 24 horas. Decorrido o período de incubação primaria do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento (Técnica qualitativa) com alça bacteriológica de 10µL nos meios de Ágar MacConkey (MC) e Ágar Salmonella/Shigella (SS). Incubar as placas semeadas em aerobiose, estufa bacteriológica a 35± 2ºC por 18 – 24h.

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*Amostra obtida in natura: Primeira etapa Inocula-se uma porção da amostra biológica com auxílio alça bacteriológica de 10µL no tubo contendo salina estéril 0,95%. Incubar a salina com fezes estufa bacteriológica a 35± 2ºC por 15 minutos. Após 15 minutos semear por esgotamento (Técnica qualitativa) com alça bacteriológica de 10µL nos meios de Ágar MacConkey (MC) e Ágar Salmonella/Shigella (SS). Incubar as placas semeadas em aerobiose, estufa bacteriológica a 35± 1ºC por 18 – 24h. Segunda etapa Inocular outra porção da amostra biológica com auxílio alça bacteriológica de 10µL em caldo tetrationato com 02 gotas de solução de iodo. Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriológica á 35± 2ºC por 18 a 24 horas. Decorrido o período de incubação do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento (Técnica qualitativa) com alça bacteriológica de 10µL nos meios de Ágar MacConkey (MC) e Ágar Salmonella/Shigella (SS). Incubar as placas semeadas em aerobiose, estufa bacteriológica a 35± 2ºC por 18 – 24h. Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado.

 Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal
As infecções do trato respiratório inferior são em geral importantes, pois auxilia no diagnóstico para detecção de um grande número de etiologias principalmente: pneumonia adquirida na comunidade e as hospitalares.

→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme já descrito; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC). Homogeneizar o material (LBA ou aspirado traqueal) e imergir a alça bacteriológica calibrada de 1µL na amostra de forma vertical. Semear por Técnica quantitativa utilizando alça calibrada de 1µL em placa de ágar AS, AC e MC. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com leituras diárias.

Líquidos Cavitários Estéreis (Ascítico, Amniótico, Líquido Cefalorraquidiano-LCR ou Líquor, Pleural, Peritoneal, Pericárdico e Sinovial).
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Qualquer fluido estéril do corpo pode ser infectado por bactérias ocasionando patologias graves. Apesar de esses materiais clínicos serem de diferentes áreas do corpo humano, são processados de forma semelhante. →Amostras inaceitáveis para processamento Frascos com conservantes, por ex: Formal ou Soro fisiológico; Amostras colhidas e enviadas em frascos não estéreis ou, congelados.

→Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Antes de semear é necessário realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de boa qualidade, conforme já descrito; Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC) e Caldo BHI.
*Amostras purulentas Não há necessidade de centrifugar. *Amostras pouco ou não purulentas Separar parte do material em tubo estéril. Centrifugar por 15 minutos a 3.000- 5.000 rpm. Remover o sobrenadante, suspender o sedimento para semear. Em ambos os casos deve ser semear em meios de culturas sólidos padronizados AS, AC, MC pela Técnica qualitativa por esgotamento, utilizando alça bacteriológica de 10µL. Uma pequena porção do material biológico a ser processado deve ser coloca em meio de cultivo líquido o caldo BHI. Em seguida colocar as placas de meios AS e AC em estufa microbiológica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC e caldo BHI em aerobiose na estufa microbiológica por até 72h, com leituras diárias. Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado.

 Sangue A cultura de sangue ou hemocultura é de fundamental importância para detecção de septicemia. Principal causa de morbidade e mortalidade no âmbito hospital mundialmente. →Procedimento Em frascos de hemocultura manual Após coleta do sangue em frascos específicos para hemocultura manual, o(s) frasco(s) deve ser colocado em estufa por 24 horas. Após 24h de incubação, realizar o primeiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça de 10µL. Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Como proceder? Identificar as placas com números de identificação do paciente(s).

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Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool 70%, hipoclorito ou ácido fênico). 1° Etapa: Transferir até 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para seringa e colocar 01 ou 2 gotas nos meios de cultura acima citados. 2° Etapa: Desfazer a gota com auxílio de alça bacteriológica de 10µL, após flambagem. Conforme figura abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.

3° Etapa: Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada até que o sangue seja absorvido no meio de cultura. 4° Etapa: Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiológica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC em aerobiose na estufa microbiológica. Verificar crescimento ou não de colônias microbianas no dia seguinte. 5° Etapa: Retornar os frascos de hemocultura em estufa. Após 48h de incubação, realizar o segundo repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça de 10µL. Identificar as placas com números de identificação do paciente(s). Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool 70%, hipoclorito ou ácido fênico). Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas. Após 04 dias da segunda semeadura, realizar o terceiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura: AS, AC e MC com auxílio de agulha, seringa estéreis e alça microbiológica de 10µL. Identificar as placas com números de identificação do paciente(s). Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool 70%, hipoclorito ou ácido fênico). Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas.

Em frascos de hemocultura automatizados OBS: Será descrita apenas a metodologia implantada pelo LEAC-HGU. Vale ressaltar que existem outras metodologias de hemocultura, utilizando equipamentos automatizados. Após detecção de positividade do(s) frasco(s) de hemocultura cadastrados no equipamento BacTAlert 3D (Biomerieux®), realizar o repique da amostra de sangue. com auxílio de seringa e agulha estéreis. - Identificar as placas de meio de cultura com números de identificação do paciente(s). - Realizar descontaminação da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (álcool 70%, hipoclorito ou ácido fênico).

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- Transferir até 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura com auxílio de seringa e agulha estéreis e colocar 01 ou 2 gotas do sangue em uma das extremidades dos meios de cultura AS, AC e MC. -Em seguida realizar técnica de semeadura qualitativa por esgotamento utilizando alça microbiológica de 10µL. - Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada até que o sangue seja absorvido no meio de cultura. - Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiológica com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e o MC em aerobiose na estufa microbiológica. Verificar crescimento ou não de colônias microbianas no dia seguinte.  Secreções Genitais: Masculina e Feminina No trato genital feminino e masculino podem ocorrer diversas doenças, de etiologia bacteriana, fúngica, parasitária e viral. Portanto devido à grande variedade de agentes possíveis de serem pesquisados, é importante que a suspeita clínica seja bem direcionada para que os exames laboratoriais mais indicados sejam realizados através de coletas específicas (dependendo microrganismo) em meios de cultura líquidos e sólidos padronizados pelo serviço de saúde que se trabalha.

→Procedimento para secreção vaginal
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biológica em uma pequena área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando alça bacteriológica 10µL. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com leituras diárias.

Para processar o caldo Todd-Hewitt indicado para pesquisa de estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) em gestantes deve-se: Após o caldo Todd ter sido incubado por 18-24h em estufa microbiológica a temperatura de 24h a 35± 1ºC, semear o mesmo em AS pela técnica qualitativa por esgotamento utilizando alça 10µL. Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Incubar por 24h a 35± 2ºC em estufa microbiológica com 5 a 10% de CO2 – jarra vela.

→Procedimento para secreção uretral masculina
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%;

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Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC). Rolar o swab uretral masculino contendo a amostra biológica em uma pequena área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando alça bacteriológica 10µL. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com leituras diárias. Em caso de: → Procedimento para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secreções vaginal e uretral. Realizar procedimento do Kit comercial adotado por padronização de cada laboratório.  Secreções em Geral (Feridas cirúrgicas, Fístulas, Úlceras, Abscessos e Exsudatos). É importante cultivar secreções oriundas de feridas, úlceras, abscessos entre outras, pois inúmeros são os microrganismos patogênicos causadores de infecções cutâneas, subcutâneas e profundas da pele que acometem pacientes que realizam procedimentos cirúrgicos ou que estão hospitalizados há algum tempo.

→Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a secreção em uma pequena área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando alça bacteriológica 10µL. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com leituras diárias.

Secreção Ocular

Várias são as patologias responsáveis por infecções nos olhos, dentre elas vale ressaltar por exemplo a conjuntivite e ceratite.

→Procedimento
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Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meios de cultura utilizados: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (AC), Ágar MacConkey (MC). Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biológica em uma pequena área das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela técnica qualitativa utilizando alça bacteriológica 10µL. Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35± 2ºC e MC em aerobiose na estufa microbiológica por 24 a 48 horas, com leituras diárias.

 Urina Atualmente o aumento do número de casos de infecções do trato urinário complicados vem alarmando o âmbito hospitalar nacional e mundial, devido ao isolamento de bactérias com alto grau de resistência as diferentes classes de antibióticos através do cultivo em meios de cultura. →Amostras inaceitáveis para processamento Jato primário (exceto se houver pedido específico do médico); Amostra colhida com menos de 4 horas antes da última micção (segunda micção da manhã); Amostra colhida sem higiene prévia; Amostra em frasco não estéril; Amostra colhida com coletor e contaminada com fezes; Amostra de coletores auto aderente que permaneceram por mais de uma hora aderidos à criança; Amostra colhida da bolsa coletora de pacientes com sonda; Amostra sem refrigeração e cujo prazo entre a coleta e o transporte ao laboratório for superior a 2 horas. Amostra com conservantes como o formol

→Procedimento Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sódio 2% ou ácido fênico 2% ou álcool 70%; Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen ou cabine de segurança; Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso; Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biológico semeado. Meio de cultura utilizado: Ágar CLED Homogeneizar a urina. Introduzir a alça calibrada de 0,001ml ou 1µl após flambagem, verticalmente na amostra biológica e realizar a semeadura quantitativa. Incubar por 18 a 24 horas a 35± 2ºC em estufa microbiológica. Este procedimento permite que se distribua o material de maneira uniforme na placa de meio de cultura para auxiliar na contagem de colônias microbiológicas.
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Interessante!
A urocultura também pode ser realizada através de outros procedimentos, tais como:  Pour plate Realiza a diluição da urina para obtenção de um fator a ser utilizado na interpretação. Por exemplo: diluir 9,9 ml de salina estéril + 0,1ml de urina (10-2); diluir 9,9 ml de salina estéril + 0,1 ml da 1ª diluição (10-4). Adicionar 01 ml da última diluição em placa de petri estéril (150 mm). Acrescentar o ágar Mueller-Hinton (fundido), homogeneizando e incubando a 35-37°C em estufa, incubado em aerobiose durante 24 horas. A leitura é feita multiplicando o número de colônias obtido, pelo fator de diluição.  Lamino-Cultivo Consiste de um recipiente plástico cilíndrico com uma tampa ligada a um suporte plástico com duas faces contendo meios de cultura como CLED e MacConkey ou outras combinações. A leitura é feita contando o número de unidades formadoras de colônias e o resultado interpretado seguindo as orientações do fabricante, conforme figuras abaixo.

Laninocultivo contendo ágar CLED e ágar MacConkey (direita).

A contagem de colônias é estimada e dada em Unidades Formadoras Colônias-UFC/ml.

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6-Interpretação Macroscópica das Colônias Bacterianas e seu crescimento nos Meios de Cultura
Após 18 a 24 horas de incubação (estufa microbiológica) em temperatura adequada, ou em prazos maiores para determinados microrganismos, as placas onde o material clínico foi semeado devem ser examinadas para verificar se existe crescimento de algum microrganismo. Deve ser levada em consideração a presença de microbiota quando existente. A primeira etapa para interpretação do crescimento na cultura primária é a identificação macroscópica das colônias, como: ♦ TAMANHO O tamanho das colônias bacterianas deverá ser considerado na placa como um todo; uma mesma cepa pode formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa de meio de cultura. Colônias Pequenas Até 02 mm de diâmetro, bem característico de alguns gêneros: # Enterococcus spp.; # Alguns estafilococos coagulase negativa (ECN); # Streptococcus spp.; # Stenotrophomonas maltophilia; # Shigella spp. Colônias Médias Até 03 mm de diâmetro, como por exemplo: # Escherichia coli; # Bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose (alguns). Colônias Grandes Mais de 04 mm de diâmetro, bem característico dos gêneros: # Proteus spp pela formação do véu. # Pseudomonas spp; # Klebsiella spp.; # Enterobacter spp.,

Colônias Pequenas ECN-Ágar Chocolate

Colônias Pequenas ECN-Ágar Sangue

Colônias Médias Escherichia coli/Ágar MacConkey

Colônias Grandes Pseudomonas spp / Ágar CLED

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♦ FORMA As colônias bacterianas também apresentam formas variadas. Redonda A forma redonda das colônias bacterianas são sugestivas dos gêneros Klebsiella, Serratia, Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos e da espécie Escherichia coli. Irregular A forma irregular das colônias bacterianas são sugestivas dos gêneros Pseudomonas e Proteus (formação de véu). Elevada A forma elevada é sugestiva do gênero Klebsiella. Chata Esta forma é observada nas colônias de Enterobacter spp. e Pseudomonas spp.

Colônias redondas e elevadas Klebsiella spp./ Ágar MacConkey

Ágar MH- Colônias redondas E. coli e Irregulares de Proteus spp.(formação véu)

♦ COR A coloração das colônias bacterianas dependerá do meio de cultura utilizado. → Meios não seletivos, pode-se identificar a coloração características de alguns microrganismos. Por exemplo: - Staphylococcus aureus e Micrococcus spp. Cor Amarela. - Serratia spp. Cor Vermelha. - Pseudomonas spp. Diferentes tons de verde e castanho. → Meios seletivos, a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com substratos dos meios de cultura. - Utilização da lactose no ágar MacConkey, colônias bacterianas róseas. - Utilização da lactose no ágar CLED, colônias bacterianas amarelas. - Utilização do Ágar Manitol Salgado pelas bactérias, cor amarela. - Produção de H2S (gás sulfídrico) no ágar Salmonella/Shigella, colônias negras.

Colônias H2S+ em ágar SS

Diferentes isolados de Pseudomonas spp. Ágar MH Variações de pigmentação dependendo espécies.

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♦ CONSISTÊNCIA e DENSIDADE As bactérias quando manuseadas podem apresentar uma consistência mucóide como ocorre com os gêneros Klebsiella e Pseudomonas; bem como serem secas, casos este evidência em colônias de Escherichia coli, Staphylococcus aureus ou Citrobacter spp. As colônias bacterianas também podem ser opacas ou com brilhantes.

♦ PRODUÇÃO de ODOR O odor produzido por muitas bactérias em determinados meios de cultura é característico e utilizado em bacteriologia para sugerir algumas espécies, por exemplo: » Odor adocicado – Pseudomonas aeruginosa; » Odor de água sanitária – Shigella spp; » Odor de queijo – Staphylococcus spp; » Odor de vinagre – Escherichia coli; » Odor de fermento de pão – Klebsiella pneumoniae;

♦ PRODUÇÃO de HEMÓLISE Baseada na lise de hemácias contidas no ágar sangue (AS), conforme figura abaixo. Lise Total → ocorre formação de halo de transparência ao redor e/ou sob as colônias, denominada Beta-Hemólise (β-hemólise). Lise Parcial → há formação de halo com coloração esverdeada ao redor das colônias, denominada Alfa-Hemólise (α-hemólise). Ausência de lise → meio de cultura AS inalterado, definido como Gama-Hemólise (γ-hemólise).

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p472.

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6.1- Interpretação do Crescimento Microbiológico nos Meios de Cultura.
E agora? Infecção ou Contaminação? É importante lembrar que a presença de microrganismos na cultura não significa necessariamente que eles sejam causadores da infecção. Deve ser observado atenciosamente o isolado bacteriano, a amostra clínica em questão e o número de colônias presentes na placa de meio de cultura. Ϟ Amostras geralmente estéreis A presença de bactérias nesses materiais clínicos (sangue, líquor, pleural, sinovial, pericárdico, medula óssea e biópsias) geralmente indica presença de infecção. Ϟ Amostras que apresentam microbiota normal Geralmente amostras do trato respiratório, de fezes, secreções genitais e “swabs” de sítios anatomicamente infectados apresentam uma colonização, Portanto devem ser analisadas todas as colônias bacterianas que cresceram. Ϟ Número de colônias As culturas semi-quantitativas e quantitativas são importantes para determinar uma possível infecção ou contaminação em diferentes amostras biológicas, através de números pré-estabelecidos pela literatura. ϞϞ Interpretação do crescimento bacteriano em diferentes materiais clínicos ϞϞ ASPIRADO TRAQUEAL e LBA A cultura quantitativa do aspirado traqueal e lavado bronco alveolar-LBA em AS, AC e MC com semeadura por alça de 0,001mL (1µl) deve ser valorizada, quando a contagem de colônias bacterianas for maior ou igual 20.000 Unidade Formadora de Colônias (UFC). Isso se deve a alça de 0,001 ml; pois 01 colônia = 20.000 ou 2 x 104 UFC/ml
Amostra biológica Lavado bronco alveolar Aspirado traqueal Significativo se contagem for maior ou igual a (UFC) ≥ 20.000 UFC/ml ≥ 20.000 UFC/ml

UFC = Unidades Formadoras de Colônias OBS 01: Qualquer número de colônias crescidas no meio específico para micobactérias deve ser valorizado laboratorialmente. OBS 02: Se o aspirado traqueal estiver muito espesso, deve-se realizar uma diluição de 1:10 com agente mucolítico, ou seja: Diluir 100µL do aspirado traqueal ---------------- 900µL agente mucolítico. Homogeneizar e semear com alça de 0,001mL (1µL) em meios de AS, AC e MC.

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ϞϞ CATETER A cultura semi-quantitativa dos cateteres com pinça estéril deve ser valorizada, quando a contagem de colônias bacterianas apresentarem um número maior ou igual a 15 unidades formadora de colônias de um único tipo de microrganismo; desse modo sugere-se que a ponta de cateter pode ser fonte de infecção (critério de Maki). Com uma contagem menor, o cateter tem baixa probabilidade de ser fonte de infecção. Crescimento de um número ≥ 15 UFC/ placa = CULTURA POSITIVA. ϞϞ ESCARRO A cultura qualitativa do escarro com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colônias bacterianas puras, ou seja, mesmas características macroscópicas em grande quantidade e em todos os meios de cultura acima citados em 24, 48 até 72h = Cultura Positiva. Crescimento de colônias bacterianas mistas, ou seja, diferentes características macroscópicas, em pouca ou em grande quantidade das mesmas nos meios de cultura citados acima em 24 até 72h. Cultura Sem Valor Diagnóstico. Provável contaminação de flora de orofaringe. ϞϞ FEZES A cultura qualitativa das fezes com alça de 0,01mL (10µL) nos meios de cultura SS e MC devem ser valorizadas se houver: # Colônias lactose negativa no meio SS; # Colônias H2S positivas (negras) no SS; # Colônias lactose positiva e/ou negativa no meio de cultura MacConkey. O crescimento de diferentes colônias bacterianas = Cultura positiva. A ausência de crescimento de colônias bacterianas = Cultura negativa**. **Caso incomum, pois é sabido que a distribuição da microbiota do intestino grosso por ex: é de 10.000.000.000.000 (dez trilhões). Deste modo deve-se verificar o quadro patológico do paciente, ou possíveis erros pré-analíticos. ϞϞ LÍQUIDOS CAVITÁRIOS ESTÉREIS A cultura qualitativa do líquor e líquidos (ascítico, amniótico, pleural, peritoneal, pericárdico e sinovial), com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: → Crescimento no AS, AC e MC de um único tipo de colônia. Caso haja pouco crescimento microbiológico insuficiente para prosseguir a identificação deve ser realizado o reisolamento. Reisolamento é o procedimento de semear o microrganismo que se deseja isolar em outra placa de meio de cultura, com a finalidade de obter o microrganismo em quantidade de crescimento suficiente para que possam ser realizados, todos os testes de identificação e sensibilidade a antimicrobianos.

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ϞϞ SANGUE A presença de microrganismos viáveis no sangue do paciente representa, em algumas situações, um agravamento do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame crítico e de grande importância. Portanto deve-se valorizar a presença de crescimento bacteriano nos meios de cultura AS, AC e MC; através da semeadura qualitativa pela alça de 10µL. Após detecção de positividade da amostra em questão pelo equipamento automatizado.

ϞϞ SECREÇÕES GENITAIS ♀ E ♂ A microbiota normal da uretra feminina e masculina é constituída por vários microrganismos. Assim, a interpretação dos resultados microbiológicos deve ser feita com cautela, certeza de ausência de outros patógenos potenciais e com ênfase na sintomatologia descrita pelos dados clínico do paciente. A cultura qualitativa das secreções genitais com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: # Colônias pequenas β-Hemolíticas no AS sugestivas do microrganismo Streptococcus agalactiae (cocos Gram positivos). # Colônias pequenas translúcidas ou amarelas no AC sugestiva dos microrganismos Haemophilus spp. e Neisseria spp. OBS: Para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secreções vaginal e uretral, a interpretação do crescimento bacteriano dependerá do Kit adotado por padronização de cada laboratório.

ϞϞ SECREÇÕES em GERAL A cultura qualitativa de feridas, úlceras, abscessos entre outras com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colônias bacterianas, exceto colônias bacterianas identificadas como microbiota de pele; proveniente de uma coleta superficial das diferentes amostras biológicas acima citadas.

ϞϞ SECREÇÃO OCULAR A cultura qualitativa da secreção ocular com alça de 0,01ml (10µl) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver: Crescimento de colônias bacterianas, exceto colônias bacterianas identificadas como microbiota de pele; proveniente de uma coleta superficial.

ϞϞ URINA A cultura quantitativa da urina em CLED com semeadura por alça de 0,001mL (1µl) de ser valoriza se houver: Crescimento de colônias de mesma forma e característica macroscópica. Crescimento de colônias diferentes em quantidades e que reflitam a presença de microbiota uretral na amostra biológica, deve solicitar nova coleta.

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#Cultura Positiva: número de colônias bacterianas significativa, por exemplo: →11 a 100.000 UFC/ml: suspeita de infecção urinária deve ser associado à piúria e sintomatologia do paciente. →Acima de 100.000 UFC/ml: infecção urinária instalada. #Cultura Negativa: ausência ou número insignificante de colônias bacterianas. → 0 a 10.000 UFC/ml: não se considera infecção urinária.

7-Preparo do Esfregaço Bacteriológico
A confecção do esfregaço dependerá do tipo de material biológico e a partir de amostras com consistência diversas. Materiais líquidos estéreis Para os líquidos estéreis ascítico, amniótico, líquor, pleural, peritoneal, pericárdico e sinovial:  Pouco Turvo Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cônico estéril; Centrifugar a 2.500 – 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL) caso o volume dos líquidos estéreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas homogeneizada em agitador mecânico por alguns segundos. Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estéril, reservando de 0,5 a 1 mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioquímicos (caso for coletado apenas um frasco do líquido estéril). Ressuspender o sedimento (não deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas alçadas do material, colocar sobre lâmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador químico ou físico. Realizar coloração conforme solicitação médica.  Turvo Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a consistência da turvação.  Purulento Não há necessidade de centrifugação da amostra biológica estéril. Com auxílio de alça bacteriológica estéril de 10µL pegar a amostra, colocar sobre lâmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador químico ou físico. Realizar coloração conforme solicitação médica. Para amostra de sangue proveniente das hemoculturas positivas, deve-se: *Etapa A: Transferir até 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para a seringa e colocar 01 ou 2 gotas em uma lâmina de vidro limpa. *Etapa B: Colocar uma segunda lâmina a um ângulo de 45° tocando a gota. *Etapa C e D: Com um movimento leve, espalhe a gota ao longo da lâmina. Deixar secar a temperatura ambiente, fixar e realizar a coloração conforme solicitação médica.

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Passos para realização do esfregaço em sangue.

Material líquido (URINA) # Homogeneizar a urina contida no frasco estéril. # Colocar 10µL de urina não centrifugada, sobre uma lâmina limpa e espalhar realizando movimentos ovais de forma concentrada. # Deixar secar a temperatura ambiente e fixar o material biológico. # Realizar coloração conforme solicitação médica. OBS: Não é recomendado pela literatura realizar esfregaço do sedimento urinário.

Materiais Serosos e Purulentos Para secreções genitais, oculares, abscessos, fístulas, úlceras e feridas cirúrgicas. O esfregaço deve ser preparado após coleta da amostra biológica com swab estéril. Com o auxílio do swab estéril, realizar movimentos circular e oval sobre a lâmina (limpa e desengordurada). A lâmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor. Realizar coloração conforme solicitação médica. Materiais Mucóides Escarro Expectorado  Separar os grumos purulentos ou com sangue da saliva com auxílio de haste de madeira e placa de petri estéril (ao arrastar o grumo de pus, o excesso de saliva fica aderido à superfície, e o material purulento deve ser preferencial para o esfregaço).  Com o auxílio de haste de madeira (palito de picolé), realizar movimento em uma única direção sobre uma lâmina nova, limpa e desengordurada, repetir o movimento.  A lâmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor.  Realizar coloração conforme solicitação médica. Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal  Pouco Turvo Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cônico estéril; Centrifugar a 2.500 – 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL) caso o volume dos líquidos estéreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas homogeneizada em agitador mecânico por alguns segundos.

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Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estéril, reservando de 0,5 a 1 mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioquímicos (caso for coletado apenas um frasco do líquido estéril). Ressuspender o sedimento (não deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas alçadas do material, colocar sobre lâmina limpa e desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais. Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador químico ou físico. Realizar coloração conforme solicitação médica.  Turvo Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a consistência da turvação.

 Fixação do Material Biológico
Fixação pelo calor Após o esfregaço secar ao ar, passar duas a 3 vezes pela chama do bico de bunsen, tomando cuidado para evitar distorções pelo superaquecimento; deixar esfriar o esfregaço antes de corar.

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratório Clínico. 2006. p76.

Fixação por Substância Química O esfregaço pode ser fixado por substâncias químicas, tais como: metanol, albumina ou propilenoglicol (fixadores comerciais). Previne a lise de eritrócitos, bem como a retirada do material biológico (esfregaço) pouco espesso presente na lâmina. Procedimento de fixação por Metanol ou Albumina.  Deixar o(s) esfregaço(s) secarem a temperatura ambiente;  Cobrir o esfregaço com metanol ou albumina, por aproximadamente 1 minuto;  Retirar o excesso destas substâncias químicas, sem lavar a lâmina e deixar secar ao ar;  Não usar calor antes de corar.

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8-Principais Colorações em Bacteriologia
As colorações em bacteriologia clínica são de suma importância, pois:  Classificam os microrganismos com base em suas características tintoriais, tamanho, forma e arranjo;  Auxilia no diagnóstico presuntivo rápido do processo infeccioso;  Indica uma terapia antimicrobiana direcionada;  Quantificam relativamente os microrganismos visualizados no esfregaço podendo avaliar o equilíbrio da microbiota;  Auxilia na seleção de meios de cultura mais apropriados para semeadura inicial;  A presença de microbiota anaeróbia pode ser suspeitada justificando assim a falta de crescimento microbiano em culturas, com bacterioscopia positiva;  Avaliação quantitativa de elementos figurados (células epiteliais, eritrócitos, leucócitos...) que podem auxiliar na interpretação da resposta inflamatória.

COLORAÇÃO de GRAM Descoberto por Hans Cristian Joaquim Gram, bacteriologista dinamarquês, a coloração de Gram tem importância crucial na microbiologia de urgência. A técnica se baseia na composição da parede celular bacteriana para diferenciá-las e classificá-las. Utilizam-se dois corantes neste método: violeta de genciana e fucsina diluída. Ainda é empregado um mordente (ou fixador): lugol e uma solução diferenciadora (descorante): álcool-acetona. Esta diferença é devido à composição da parede celular: nos microrganismos Gram positivos, a parede é rica em peptideoglicano, formando uma espessa camada que retém o complexo VioletaLugol dentro da célula e é pouco permeável ao álcool-acetona. Ao contrário, a parede celular de microrganismos Gram negativos apresenta uma camada mais delgada de peptideoglicano, que são mais permeáveis ao álcool e permitem a remoção do corante do interior da bactéria. Para evidenciar estas características, utiliza-se um corante de contraste, a fucsina diluída que vai corar as células Gram negativas. ** Técnica  Confeccionar o esfregaço, com auxílio de alça bacteriológica ou swab;  Aguardar a secagem natural do esfregaço e fixar o mesmo pelo calor;  Colocar a lâmina sobre o suporte na cuba de coloração e cobrir com violeta de genciana por 1 minuto;  Desprezar o excesso de violeta e cobrir a lâmina com lugol por 1 minuto;  Lavar com água corrente;  Descorar com álcool-acetona rapidamente;  Lavar novamente com água corrente;  Cobrir com fucsina de Gram por 30 segundos;  Lavar, aguardar a secagem da lâmina e examinar ao microscópio com objetiva de imersão.

COLORAÇÃO de ZIEHL-NEELSEN É utilizada para detecção das micobactérias de interesse clínico. A técnica se baseia na composição da parede celular bacteriana composta com alto teor de lipídeos (cerca de 60%, principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante Fucsina fenicada E AQUECIMENTO (chama do bico de bulsen) coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subsequente por uma solução de Álcool-Ácido forte (diferenciador). As outras

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bactérias, que não possuem a mesma composição da parede bacteriana, têm a sua coloração pela fucsina descorada pela solução de álcool-ácido e coram-se de Azul pela ação do corante Azul de metileno (contra-corante).

** Técnica - Ziehl-Neelsen (Coloração à Quente)  Preparar um esfregaço homogêneo, delgado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;  Deixar secar a temperatura ambiente;  Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;  Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada;  Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três emissões sucessivas.  Lavar em água corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que não se desprenda;  Descorar com álcool-ácido e lavar o esfregaço com água, até obter-se total retirada da fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessário;  Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a temperatura ambiente.

COLORAÇÃO de KINYOUN É uma técnica de coloração similar a coloração de Ziehl Neelsen, mas realizada a frio para detecção micobactérias de interesse clínico. ** Técnica - Coloração de Kinyoun (Coloração à Frio) Preparar um esfregaço homogêneo, delgado em uma lâmina nova desengordurada, limpa e seca;  Deixar secar a temperatura ambiente;  Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;  Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada, deixando agir por 05 minutos;  Lavar em água corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato d’água de baixa pressão sobre a película corada, de maneira que não se desprenda;  Descorar com álcool-ácido e lavar o esfregaço com água, até obter-se total retirada da fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessário; Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a temperatura ambiente. 

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9-Identificação Bioquímica de Bactérias de Importância Médica
9.1-COCOS GRAM POSITIVOS (CGP) Dentre os cocos Gram positivos serão enfatizados alguns gêneros: estafilococos, estreptococos e enterococos. Após avaliação preliminar da característica macroscópica e crescimento da colônia microbiológica, bem como realização do esfregaço e coloração de Gram confirmando a presença de CGP em microscópio óptico (objetiva 1000X – imersão). A identificação e diferenciação dos gêneros dos cocos Gram positivos se inicia com a prova da catalase. PROVA DA CATALASE Finalidade Verificar a presença da enzima catalase que decompõe H2O2 em H2O e O2, dessa forma, distinguir os grupos estafilococos dos estreptococos e enterococos. Procedimento Com alça bacteriológica, retirar duas ou três colônias do meio de cultura. Colocar a colônia sobre a lâmina de vidro ou de fundo escuro e adicionar uma gota de H2O2. Leitura Observar a formação de bolhas Interpretação  Formação de bolhas indica ser o gênero Staphylococcus spp.  Sem formação de bolhas indica serem os gêneros Streptococcus spp. e Enterococcus spp.

COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE POSITIVA ◘ PROVA DA COAGULASE em Tubo Finalidade Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada que, reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina. Procedimento Colocar 0,5 mL de plasma comercial em tubo de ensaio. Adicionar um alçada de colônia diretamente no plasma comercial (plasma de coelho liofilizado). Identificar e incubar por 4 h a 35±2°C em estufa ou banho-maria; caso não haja formação de coágulo, incubar por 24h. Leitura Formação de coágulo observada pela inclinação suave do tubo. Interpretação  Formação de coágulo inteira ou parcial identifica o Staphylococcus aureus.  Não formação de coágulo identifica os estafilococos coagulase negativa (ECN).

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◘ TESTE da DNase (Azul de toluidina O) Finalidade Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). Procedimento Fazer um inóculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio DNase; Identificar a placa e incubar a 35±2°C por 18 – 24h. Na placa pode ser inoculada com várias cepas. Leitura Formação de um halo cor-de-rosa ao redor do crescimento bacteriano. Interpretação Formação de halo cor-de-rosa identifica Staphylococcus aureus. Crescimento bacteriano sem formação de halo cor-de-rosa identifica os estafilococos coagulase negativa. OBS: este teste pode também ser usado para identificação dos bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose. ◘ TESTE fermentação do MANITOL Finalidade Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio. Procedimento Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) na superfície do ágar manitol. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h. Leitura Formação de superfície amarela produzida pelas colônias no ágar manitol. Interpretação  Formação de superfície amarela pelas colônias identifica Staphylococcus aureus.  Meio permanece inalterado na superfície, identifica estafilococos coagulase negativa (ECN). OBS: outras espécies de estafilococos, com pouca frequência, também podem produzir ácido a partir do manitol, portanto também devem ser testados quanto à produção de coagulase. ◘ TESTE de resistência NOVOBIOCINA Finalidade Verificar se o microrganismo é resistente à novobiocina. Procedimento Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma. Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de novobiocina 5µg/mL. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h.

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Leitura Formação de halo de inibição, que deve ser medido. Interpretação  Formação de halo ≤ 16 mm identifica Staphylococcus saprophyticus. ◘ TESTE de resistência POLIMIXINA B Finalidade Verificar se o microrganismo é sensível ou resistente a polimixina B. Procedimento Semear a colônia em ágar Mueller-Hinton, através da técnica de execução do antibiograma. Com auxílio de pinça estéril, colocar um disco de polimixina B. Identificar a placa e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h. Leitura Formação ou ausência de halo de inibição. Interpretação  Formação de halo, Staphylococcus haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius e S. hominis.  Ausência de halo, Staphylococcus aureus e S. epidermidis. OBS: Para espécie Staphylococcus lugdunensis a sensibilidade ou resistência a polimixina B é variável. ◘ TESTE de PYR (pyrrolidonil arilamidase) Finalidade O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida também por alguns estafilococos coagulase negativa (ECN). Procedimento Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia. Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa). Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recémisolada, sobre o disco de PYR umedecido. Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto. Interpretação  Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha. Os Staphylococcus lugdunensis, S. haemoliticus e S. intermedius são PYR (+).  O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo. ◘ PROVA CONPLEMENTAR para Staphylococcus lugdunensis e S. haemoliticus. Finalidade

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Avalia a habilidade enzimática dos S. lugdunensis e S. haemoliticus em degradar o aminoácido ornitina, resultando em uma alcalinização do meio. Procedimento Com auxílio da alça ou agulha de repique microbiológica, introduzir com uma picada central no ágar ornitina 03 a 04 colônias do ECN a ser testado. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h. Leitura Formação de cor amarela ou roxa no tubo contendo ornitina. Interpretação  Teste (+): Meio com coloração roxa  Teste (-): Meio com coloração amarela
Quadro. Identificação resumida das principais espécies de importância clínica de Estafilococos. Coagulase DNAse Manitol Novobiocina Polimixina S. aureus S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. intermedius S. lugdunensis + − − − − − + − − − + − + − − − + − PYR Outras provas − − + − + + ---Ornitina Pos. ---------Ornitina Neg.

S S S S S S

R R S S S V

R S S. saprophyticus − − + − Legenda: + = positivo; − = negativo; S= sensível; R= resistente; V= variação.

OBS: A identificação completa até espécies, utilizando-se procedimento manual ou sistema comercial, deve ser realizada para isolados clinicamente significativos como: hemocultura, cateter endovenoso, amostras de sítios estéreis ou quando o mesmo ECG for isolado repetidas vezes. Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Staphylococcus spp. Pneumonias, Bacteremias, Infecções de pele e tecidos moles, Meningites. Infecções relacionadas ao uso de próteses e cateteres venosos. *Staphylococcus aureus: É o CGP mais importante entre os estafilococos. Coloniza 20 a 40% dos adultos, sendo encontrados principalmente em narinas anteriores. *S. epidermidis: Relacionado com infecções associadas ao uso de cateteres endovenoso, endocardites, entre outras. *S. saprophyticus: Causa infecções urinárias agudas, sobretudo em mulheres jovens, saudáveis e sexualmente ativas. *S. haemolyticus: Presente na microbiota humana normal da pele. Sendo relatada resistência aos glicopeptídeos. *S. hominis: É encontrado na pele humana e relacionado à bacteremia em pacientes imunodeprimidos. *S. lugdunensis: Associado a casos de endocardite.

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COCOS GRAM POSITIVO / CATALASE NEGATIVA A classificação do tipo de hemólise é fator primordial para indicar quais as provas de identificação devem ser realizadas a fim de chegar a espécies de cocos Gram positivo, catalase negativa. ◘ TESTE de sensibilidade à BACITRACINA Finalidade Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A) de outras espécies de CGP catalase negativa. Procedimento Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas da placa primária ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do AS um disco de bacitracina 10mcg. I identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h. Leitura Formação de halo de inibição. Interpretação A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretada como sensível a bacitracina e indicando a espécie S. pyogenes. ◘ TESTE de CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) Finalidade O teste visa identificação de cepas de Streptococcus agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue. Procedimento Semear um inóculo na horizontal de S. aureus ATCC 25923 (ou cepa de S. aureus com duplo halo de hemólise) de um ponto a outro da placa de AS (ágar sangue). Semear perpendicularmente (90°) a colônia de estreptococo beta-hemolítico a ser testada, sem que haja contato com a estria de S. aureus. Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h. Leitura Visualizar a imagem de uma seta ou meia-lua no AS. Interpretação  A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e indica a espécie de Streptococcus agalactiae.  Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.

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◘ TESTE de PYR (pyrrolidonil arilamidase) Finalidade O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo Streptococcus pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste. Procedimento Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia. Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa). Realizar um esfregaço (de preferência com palito de madeira) com bactéria a ser testada, recémisolada, sobre o disco de PYR umedecido. Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorre em até um minuto. Interpretação  Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha. Os Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. são PYR positivo.  O aparecimento de coloração amarela ou laranjada indica resultado negativo. ◘ TESTE ágar BILE-ESCULINA Finalidade Diferencia os Enterococcus spp de outros Streptococcus spp., tendo como princípio a hidrólise da esculetina presente no meio de cultura bile-esculina pela bactéria; formando esculetina e dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presente no meio bile-esculina tornando-o enegrecido. Procedimento Semear com auxílio de alça bacteriológica as colônias (3-4 colônias) do ágar sangue na superfície do ágar Bile-esculina. Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 18-24h. Interpretação Presença de cor enegrecida na superfície do meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp. Meio permanece inalterado na superfície do meio bile-esculina, identifica outros Streptococcus spp. ◘ TESTE de crescimento em NaCl 6,5% Finalidade Determinar a capacidade do microrganismo de crescer em altas concentrações de sal. Procedimento Com auxílio de alça inocular 03 a 04 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador). Identificar o tubo e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica por 24h. Interpretação

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A turvação ou mudança de cor (no caso adição indicador) indica crescimento de Enterococcus spp. ◘ PROVA da OPTOQUINA Finalidade Fármaco utilizado para indicar se o estreptococos alfa-hemolítico é um pneumococo. A optoquina é uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido. Procedimento Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras alfa-hemolíticas da placa primária ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do AS um disco de optoquina 5µg. Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h. Interpretação Presença de halo de inibição ≥ 14 mm = Sensível a optoquina → Streptococcus pneumoniae. O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os estreptococos grupo viridans. Deve-se então ser realizado o teste de bile solubilidade. ◘ TESTE de BILE-SOLUBILIDADE (desoxicolato de sódio 2%) Finalidade Capacidade do desoxicolato de sódio (sal biliar) de lisar seletivamente o Streptococcus pneumoniae em fase logarítmica do crescimento. Este sal ativa as enzimas autolíticas (autolisinas) produzidas pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria. Procedimento Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente. Utilizar 02 tubos de ensaio transparentes, para o teste: Tubo controle “C” e Tubo teste “T”. Adicionar solução de desoxicolato de sódio 2% ao tubo ”T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”. Os volumes em cada tubo devem ser iguais 0,5ml (500µL). Adicionar a cada tubo o mesmo volume da suspensão bacteriana. Homogeneizar e incubar a 35±2°C em estufa microbiológica. Fazer a leitura imediatamente, após 1h e até 2h de incubação. Interpretação  Reação Positiva = Tubo“T” límpido ou turvação visivelmente menor que o Tubo “C”, confirma a espécie Streptococcus pneumoniae.  Reação Negativa = Tubo “T” com turvação igual ao tubo “C”. ◘ TESTE SULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM (STX) Finalidade Verificar se os estreptococos não pertencem ao grupo A, B ou D de Lancefield. Procedimento

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Com auxílio do swab umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras beta-hemolíticas da placa primária ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar sangue com movimentos retilíneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do AS um disco de STX. Identificar e incubar em jarra de vela, a 35±2°C por 18-24h. Interpretação  Ausência de halo (Resistente), Streptococcus pyogenes; S. agalactiae e Enterococcus spp.  Presença de halo (Sensível), estreptococos não A, B ou D.

Quadro. Identificação resumida dos Streptococcus spp. de importância Clínica Identificação
S. agalactiae S. pyogenes S. pneumoniae S. grupo Viridans S. grupo C, F e G Enterococcus spp. Hemólise Bacitracina CAMP PYR Bile Esculina NaCl 6,5% Optoquina Bile Solub. STX

β β, γ α α, γ β α,β,γ

R S V V V R

+ − − − − −

− + − − − +

− − − V − +

V − − − − +

R R S R R R

− − + − − −

R R S S S R

Legenda: R= resistente; S= sensível; V= variável; + = positivo; − = negativo.

Quadro. Identificação dos estreptococos alfa-hemolítico Optoquina / zona de inibição Bile Solubil. Interpretação ≥ 14 mm →S + S. pneumoniae 8 a 13 mm → R + S. pneumoniae 8 a 13 mm → R − S. grupo viridans < 8 mm → R − S. grupo viridans Legenda: S= sensível; R= resistente; + = positivo; − = negativo.

Os testes padronizados pelo setor de microbiologia do LACHGU para identificação dos enterococos em nível de espécie (Kit-Enterococos-PROBAC®) são baseados em características bioquímicas destes cocos Gram positivos, catalase negativa. Tais testes serão descritos abaixo. ◘ TESTE da ARGININA Finalidade Determinar se o Enterococcus spp em estudo é capaz de hidrolisar o aminoácido arginina. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias, depositando o inóculo na parede do tubo, abaixo do óleo mineral. Incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h.

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Leitura Hidrólise da arginina  Cor púrpura do meio mais acentuado que tubo controle: utilização do aminoácido.  Cor do meio igual ou mais amarelada que tubo controle: não utilização do aminoácido. ◘ TESTE de MANITOL, SORBITOL e ARABINOSE. Finalidade Determinar se o Enterococcus spp. em estudo é capaz de consumir os açucares manitol, sorbitol e arabinose, sendo detectado pela produção de ácido. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos tubos de meio de cultura manitol, sorbitol e arabinose. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Leitura Consumo do manitol/sorbitol/arabinose  Cor rosa intenso dos tubos: Reação Positiva.  Cor rosa claro dos tubos: Reação Negativa. ◘ MOTILIDADE do microrganismo Finalidade Determinar a capacidade de movimentação do enterococos em estudo, distinguindo deste modo, a espécie do microrganismo em questão. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central nos tubo de meio de cultura do teste de motilidade. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24 horas. Leitura  Crescimento além da picada, motilidade POSITIVA.  Crescimento somente na picada, motilidade NEGATIVA. ◘ PIGMENTO da colônia bacteriana Finalidade A identificação da coloração da colônia tem como finalidade auxiliar na diferenciação das espécies de enterococos. Procedimento Com auxílio de swab estéril branco passar o mesmo nas colônias e verificar as cores. Leitura As colônias dos enterococos podem apresentar coloração branca ou amarela.

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Interpretação dos Resultados (identificação espécies dos enterococos) Os resultados são realizados por um sistema número, criado pelo kit comercial (Kit-EnterococosPROBAC®); onde após leitura das provas se coloca valores estabelecidos para as provas positivas e para as provas negativas assume-se o valor zero. Em seguida os valores obtidos em cada série de provas são somados. E aplicado a uma tabela com os valores encontrados e suas respectivas espécies de enterococos em ANEXOS. Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Streptococcus e Enterococcus spp. Os enterococos são causadores de endocardite, infecções no trato urinário (ITU), infecções da corrente sanguínea, e de sítio cirúrgico e intra-abdominal. Mas também infrequentemente podem causar pneumonias e meningites em pacientes debilitados; bem como empiema em portadores de doença hepática. * Streptococcus pyogenes: podem causar faringites, impetigo, erisipela, endocardites, meningites, artrites, infecções respiratórias. Cepas produtoras de toxinas podem causar a febre escarlatina e choque tóxico. * Streptococcus agalactiae: podem causar infecções graves em neonatologia, como meningite e sepse. Em adultos com neoplasias, imunodeficiências e diabetes mellitus podem predispor infecções como endocardite, bacteremia, infecções de pele e tecidos moles, pneumonia e osteomielites. * Streptococcus pneumoniae: pneumonia, meningite, otite média aguda, artrite séptica, peritonite e derrame pleural. * Streptococcus do grupo viridans: fazem parte da microbiota normal da cavidade oral, trato gastrointestinal e trato genital. Entretanto sua presença pode estar associada à endocardite subaguda, especialmente em portadores de próteses valvulares.

9.2-BACILOS GRAM NEGATIVOS (BGN) Dentre os bacilos Gram negativos serão enfatizados a família Enterobacteriaceae (Fermentadores de Glicose) e os bacilos Gram negativos não fermentadores de glicose (BGNNF). A identificação e diferenciação dos gêneros e espécies de BGN são diferenciadas com base na presença ou não de diferentes enzimas codificadas pelo material genético dos cromossomos bacterianos. Estas enzimas participam do metabolismo bacteriano em diversas vias, que podem ser detectadas por meio de cultura contendo substratos com os quais estas enzimas podem reagir, detectando a utilização do substrato ou a presença de produtos metabólicos em específico, visualizados por substâncias indicadoras.

9.2.1-ENTEROBACTÉRIAS As enterobactérias possuem características em comum que definem a família Enterobacteriaceae, tais como: fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são aeróbios e anaeróbios facultativos, a maioria reduz nitrato a nitrito, são catalase positiva, a maioria é oxidase negativa e podem ser móveis por flagelos peritríqueos ou imóveis. Podem ser utilizadas técnicas de identificação manual, semi-automatizada e automatizada.

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**Provas de identificação manual  CITRATO Finalidade Verificar se as bactérias são capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Interpretação Crescimento bacteriano e/ou mudança de cor para azul intenso → Reação Positiva Ausência de crescimento bacteriano, cor inalterada → Reação Negativa.  FENILALANINA (FENIL) Finalidade Verificar se as bactérias são capazes de degradar o aminoácido fenilalanina através da enzima fenilalanina desaminase, tendo como produto final da reação o ácido fenilpirúvico. O ácido fenilpirúvico é detectado com adição do Cloreto férrico 10% (indicador da reação). Somente os gêneros: Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima fenilalanina desaminase. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril estriar 03 a 04 colônias na superfície do tubo de meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Após 24h de incubação adicionar o cloreto férrico 10%. Interpretação Coloração verde musgo na superfície do fenil, após adição do cloreto férrico → Reação Positiva. Ausência de coloração verde musgo, após adição do cloreto férrico 10% → Reação Negativa.  LISINA Finalidade Verificar a capacidade das bactérias de descarboxilar o aminoácido lisina em amina, resultando em alcalinidade do meio de cultura lisina; bem como verificar a motilidade bacteriana e a visualização do indol (produto final da descarboxilação do aminoácido triptofano) detectado com a adição do reativo de Ehrlich ou Kovacs. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central no tubo do meio lisina. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Após 24h de incubação interpretar as reações metabólicas. Interpretação # Descarboxilação da lisina Teste (+): Lisina com coloração roxa Teste (−): Lisina com coloração amarela # Motilidade bacteriana Crescimento além da picada (turvação do meio lisina). Motilidade POSITIVA. Crescimento somente na picada (meio lisina límpido). Motilidade NEGATIVA.

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# Produção de indol Adicionar o reativo de Ehrlich ou Kovacs e observar a reação. Teste (+): formação de anel róseo na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich. Teste (−): formação de anel amarelado na superfície do meio, após adição do reativo Ehrlich.  RUGAI Finalidade Verificam se as bactérias são capazes de: fermentar glicose e lactose, produzir gás e H2S (gás sulfídrico), degradar uréia e o aminoácido triptofano. Todas estas informações são visualizadas nas bases inferior e superior do tubo Rugai. Procedimento Com auxílio de alça ou agulha de repique estéril inocular 03 a 04 colônias por picada central até o final do tubo e ao chegar à superfície do meio Rugai realizar estrias. Identificar e incubar o tubo a 35±2°C em estufa por 24h. Após 24h de incubação interpretar as reações metabólicas. Interpretação  Na Base Inferior do Tubo Rugai → Fermentação da Glicose Teste (+): base inferior do rugai amarela = bactéria fermentadora de glicose. Teste (−): base inferior do rugai inalterada (verde) = bactéria não fermentadora de glicose. → Produção de Gás Teste (+): bolhas na base inferior do tubo rugai. Teste (-): ausência de bolhas na base inferior do rugai. → Produção de H2S (gás sulfídrico) Teste (+): Base inferior do rugai com coloração negra. Teste (−): Ausência de coloração negra na base inferior do rugai. → Degradação da Uréia Teste (+): base inferior do rugai azul = bactéria degrada uréia pela ação enzima urease. Teste (−): base inferior do rugai sem a coloração azul = bactéria não degrada uréia.  Na Base Superior do Tubo Rugai → Fermentação da sacarose Teste (+): base superior do rugai amarela = bactéria fermentadora de sacarose. Teste (−): base superior do rugai inalterada (verde) = bactéria não fermenta sacarose. → Degradação do aminoácido Triptofano Através da enzima L-triptofano desaminase na base superior do meio de cultura Rugai. Teste (+): coloração verde musgo ou acastanhada no ápice do Rugai. Teste (−): ausência de coloração verde musgo ou acastanhada no ápice do Rugai.

**Provas de identificação semi-automatizada (Kit comercial) Existem atualmente vários painéis comerciais de identificação para as enterobactérias, deste modo será citada apenas o painel padronizado pela rotina do setor de microbiologia do LEAC-HGU. O painel é constituído de 25 provas que estarão descritas em ANEXOS.

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GUIA SIMPLIFICADO
Para Provas Manuais de Identificação Bioquímica de Algumas Enterobactérias.

Proteus spp → H2S (+) / Cor negra na base inferior do Rugai. Fenil (+) Cor base superior tubo Verde musgo. Morganella spp → Uréia (+) / Cor azul na base inferior do Rugai. Providencia spp →Glicose (+)/Cor amarela na base inferior do Rugai.

Salmonella spp Fenil (–) Cor base superior inalterada. H2S (+) Cor base inferior Negra.

Lisina (+) / Cor roxa no tubo do meio lisina. Indol (–) / Ausência halo róseo na lisina.

Edwardsiella tarda

Lisina (+) Indol (+) / Presença de halo rósea na lisina.

Citrobacter spp

Lisina (–) Indol (+)

Fenil (–) H2S (−) Cor da base superior Inalterada.

Citrato (+) Cor Azul base superior do tubo de meio.

Klebsiella spp → Motilidade (–) Enterobacter spp → Motilidade (+)

Escherichia coli Lisina (+) Citrato (−) Indol (+) Cor Verde base superior do tubo de meio. Shigella spp Lisina (–) Indol (–)

OBS: Nos casos em que as provas manuais de identificação não determinam as espécies das enterobactérias deve-se utilizar o painel comercial, descrito em ANEXOS.

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**Provas de identificação automatizada (Equipamentos) Atualmente não são realizadas na rotina do setor de microbiologia clínica do LEAC-HGU.

Importante
Identificação complementar das enterobactérias causadoras de infecções, isoladas na coprocultura. É realizada com sorotipos comerciais (SoroKit-PROBAC®) para Salmonella spp, Shigella spp. e Escherichia coli clássica e invasora. Procedimento Adicionar ao tubo de rugai da bactéria a ser testada 0,5 ml (500µL) de solução de salina estéril, homogeneizando bem para obter uma suspensão bem concentrada. Em placa de fundo escuro, realiza-se a reação: Colocando 50 μl da suspensão bacteriológica a ser testada nas áreas da placa; Adiciona-se, em cada reação, o soro correspondente, homogeneizando com bastão de plástico; Agitar a placa de reação por 2 minutos (agitador de Kline ou manualmente com movimentos giratórios); Após término de 2 minutos, observar se há presença de grumos de aglutinação, o que indica positividade da reação. Não Esquecer Dentro da família Enterobacteriaceae, encontram-se espécies bacterianas relacionadas bioquimicamente, mas divididas em subgrupos por critérios sorológicos, de acordo com a presença de antígenos, tais como:  Ag somático (O)  Ag flagelar (H)  Ag Capsular (K) Em atividades de rotina de bacteriologia clínica a confirmação é feita apenas para bactérias de importância patogênica e epidemiológica em gastroenterites como: # Salmonella spp: utilizando sorotipos para pesquisa de antígeno somático (O) e flagelar (H). #Shigella spp; utilizando sorotipos específicos somente para o antígeno (O) de cada espécie desse microrganismo (S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae e S. boydii). # Escherichia coli Enteropatogênicas (EPEC) e Enteroinvasoras (EIEC) utilizando sorotipos para antígenos (O) e (H). As EPEC são móveis isoladas em coproculturas de crianças até 2 anos de idade e pesquisadas com soro polivalente A, B e C. Já as EIEC são imóveis, isolada de pacientes adultos, com uso de soros polivalentes A e B. Principais Síndromes Infecciosas causadas pelas Enterobactérias Abscessos, Pneumonia, Meningites, Septicemias, infecções de feridas, trato urinário e gastrointestinal. Dentre as enterobactérias as que atualmente predominam nas Infecções Relacionadas Assistência Saúde (IRAS) são: Escherichia coli, Klebsiella spp. e Enterobacter spp.

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9.2.2-BACILOS GRAM NEGATIVOS NÃO FERMENTADORES DE GLICOSE – BGNÑF São bactérias incapazes de utilizar carboidratos (principalmente glicose) como fonte de energia através da fermentação, degradando-os pela via oxidativa. A maioria dos BGNÑF são móveis e oxidase positiva. Possuem como habitat natural o meio ambiente, sendo encontrados na água e solo. As amostras oriundas do meio ambiente hospitalar são frequentemente isoladas de respiradores, cateteres de sucção, antissépticos, soros, etc. Dentre os principais gêneros causadores de infecções em seres humanos, destacam-se:      Pseudomonas spp.; Acinetobacter spp.; Complexo Burkholderia; Stenotrophomonas sp.; Chryseobacterium spp.

Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos BGNÑF Abscessos, Pneumonia por Ventilação Mecânica, Meningites, Septicemias, Infecções de feridas e trato urinário pela utilização de sondas.

Devido à baixa atividade metabólica, em relação às Enterobactérias, a identificação bioquímica torna-se mais complexa, portanto as características morfológicas, macroscópicas e microscópicas são ferramentas auxiliares fundamentais durante o processo de identificação. As provas de identificação das espécies de BGNÑF foram padronizadas de forma manual e semiautomatizada (Kit comercial) pelo setor de microbiologia do LEAC-HGU. Dentre as provas manuais, o Rugai é o teste que presume a não fermentação da glicose pela via fermentativa, pois a base inferior do tubo de rugai apresenta-se inalterado (verde). Então se deve utilizar o kit comercial (Kit NFII-Probac®) para identificar as espécies de BGNÑF, descritas em ANEXOS.

9.3- BACILOS ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTE (BAAR) Os bacilos álcool ácido resistente (BAAR) são causadores da Tuberculose e Hanseníase. O quadro abaixo mostra outros possíveis materiais biológicos que podem ser isolados os BAAR.
Tuberculose Extra pulmonar Urina Líquidos: pleural, sinovial, peritoneal, líquor, etc. Secreções ganglionares e de nódulos mamários Fragmentos tecidos Fragmento de Tecido Pulmonar (biópsia cutânea, de órgãos e de ossos) ------LINFA ------Aspirado gástrico Tuberculose Pulmonar Escarro Lavado Brônquico Lavado bronco-alveolar

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OBS: Para o diagnóstico da tuberculose intestinal recomenda-se a biópsia de fragmento do intestino, pois o material biológico (FEZES) apresenta resultado falso-positivo devido à grande quantidade de outros bacilos Gram negativos. Diagnóstico Laboratorial o Baciloscopia Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun. Deve-se observar o esfregaço em objetiva de imersão. → A quantidade de BAAR existentes nos agrupamentos é variável. O aspecto agregado dos bacilos é devido à produção do “fator corda”. →O aspecto fragmentado é encontrado com frequência nas baciloscopias de controle de tratamento. A fragmentação é decorrente, principalmente pela ação das drogas antituberculosas que agem na parede celular do BAAR. → Já os BAAR na linfa são visualizados de forma arranjados e organizados denominados globias.

BAAR em esfregaço de escarro corado em Ziehl-Neelsen.

“Efeito corda” do BAAR, meio de cultura líquido.

Leitura e Interpretação Em amostras de escarro, quando: ♦ não são encontrados BAAR em 100 campos visualizados, relata-se: Não foram visualizados BAAR na amostra analisada. ♦ são encontrados de 1 a 9 BAAR em 100 campos visualizados, relata-se: Apenas a quantidade de BAAR na amostra encontrada . ♦ São encontrados de 10 a 99 BAAR em 100 campos visualizados, relata-se: Positivo (+). ♦ Encontrada em média de 1 a 10 BAAR por campo visualizado, relata-se: Positivo (++). ♦ Encontrada em média mais de 10 BAAR por campo visualizado, relata-se: Positivo (+++). Em outras amostras, quando: ◙ não são encontrados BAAR, em todo esfregaço, relata-se: Não foram visualizados BAAR na amostra analisada. ◙ Encontrado BAAR em qualquer quantidade, em 100 campos, relata-se: Positivo.

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o Cultura Responsável pelo isolamento e a multiplicação de BAAR. Diferentes meios de cultura tem sido desenvolvidos para o isolamento das micobactérias porém, os mais utilizados nos laboratórios de microbiologia são os meios sólidos e os meios líquidos, como por exemplo: Lowenstein-Jensen, Ogawa-Kudoh, Middlebrook 7H10 e 7H9. O crescimento de colônias de BAAR é de aproximadamente 30 dias. OBS: Quando solicitado, a cultura para BAAR o material biológico é encaminhado ao laboratório de apoio. A tuberculose humana é causada por cinco espécies de bactérias pertencentes ao gênero Mycobacterium: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti e M. canetti. Atualmente essas espécies estão agrupadas e definidas como “complexo M. tuberculosis”. Já a segunda doença mais prevalente no mundo a hanseníase, tem como agente etiológico o Mycobacterium leprae.

9.4- DIPLOCOCOS GRAM NEGATIVO Dentre os diplococos Gram negativos os mais comumente isolados na rotina laboratorial são: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catharralis, estas espécies são analisadas juntas devido à possibilidade de haver confusão na sua identificação. Os diplococos Gram negativos são: achatados nas laterais, dando a forma de rins ou dois grãos de feijão unidos, imóveis, oxidase e catalase positiva e utilizam carboidratos por via oxidativa e não fermentativa. Diagnóstico Laboratorial Vários podem ser as amostras clínicas coletadas para o isolamento dos diplococos Gram negativos, tais como: Secreção uretral, endocervical, orofaringe, conjuntiva, glândula de Bartholin, líquor, líquido sinovial, sangue, entre outros. ▪▪ Bacterioscopia Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Gram. Deve-se observar o esfregaço em objetiva de imersão. → Leitura Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presença ou ausência de diplococos Gram negativos, se estão intracelulares ou extracelulares e quantidades de neutrófilos. ▪▪ Cultura e Identificação O isolamento dos diplococos Gram negativos devem ser realizados em ágar específicos (Chocolate e Thayer-Martin) e ágar não seletivo (ágar Sangue). Identificar e incubar em jarra de vela placa de meio a 35±2°C em estufa por até 72h caso não haja crescimento de colônias. Algumas provas para identificação manual das principais espécies de diplococos Gram negativos podem ser realizadas, conforme descritas no quadro abaixo.

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Quadro de identificação resumida dos Diplococos Gram Negativos de Importância Clínica.
Bactéria N. meningitidis N. gonorrhoeae Neisseria spp. Moraxella catharralis Morf. diplococos diplococos diplococos ou cocobacilos diplococos OXI + + + + CAT + + V + OFGLI não cresce não cresce V não cresce DNAse – – – + AS + – + + MAL + – V – LAC – – V – SAC – – V – FRU – – V –

Legenda: OXI= oxidase; CAT= catalase; AS= crescimento ágar sangue; V= variável; OFGLI= oxidação/fermentação da glicose, + = positivo; − = negativo; MAL= maltose; LAC= lactose; SAC= sacarose; FRU= frutose.

Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Diplococos Gram Negativos. # Neisseria gonorrhoeae No homem causa: uretrite, prostatite e estenose uretral. Na mulher causa: corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, doença inflamatória pélvica entre outras patologias. Em recém-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum. # Neisseria meningitidis Podem causar meningite e infecção sistêmica grave com coagulação intravascular disseminada (CIVD). # Moraxella catarrhalis, pode causar otite, sinusite e pneumonia.

9.5- BACILOS GRAM NEGATIVOS PLEOMÓRFICOS ou COCOBACILOS GRAM NEGATIVOS O gênero Haemophilus é chamado de cocobacilos Gram negativos ou bacilos Gram negativos pleomórficos, são anaeróbios facultativos, necessitam de hemina (fator-X) e/ou nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+, fator-V) para o seu crescimento. Diagnóstico Laboratorial ▬ Bacterioscopia Após realização do esfregaço do material biológico e coloração pelo método de Gram. Deve-se observar o esfregaço em objetiva de imersão. → Leitura Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presença ou ausência de microrganismos visíveis de várias formas = pleomórfico, ou seja, cocobacilos Gram negativos. ▬ Cultura e Identificação O isolamento dos Haemophilus spp. devem ser realizada em ágar chocolate suplementado e para realização do antibiograma o meio de cultura recomendado é o ágar HTM (Haemophilus Test Medium). Identificar e incubar em jarra de vela placa de meio a 35±2°C em estufa por até 72h caso não haja crescimento de colônias.

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Algumas provas para identificação manual das principais espécies de Haemophilus podem ser realizadas, conforme descritas abaixo.

→ FATORES X E V Finalidade Determinar a afinidade dos Hamophilus spp. em crescer utilizando fatores protéicos como hemina e/ou NAD+. Procedimento Com auxílio do swab estéril umedecido com salina estéril, pegar 04 ou 05 colônias puras da placa primária (ágar chocolate suplementado) ou reisolamento. Semear as colônias presentes no swab, em ágar chocolate ou HTM com movimentos retilíneos e uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfície do ágar chocolate os discos comerciais com os fatores X e V com pinça estéril a uma distância de 1,5 cm um disco do outro. Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h. Interpretação  Crescimento bacteriano entre os discos = Haemophilus influenzae.  Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator X = H. parainfluenzae.  Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator V = H. ducrey.

Fonte: Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para Controle Infecção Hospitalar.

→ PROVA DO SATELITISMO Finalidade Determina a capacidade do gênero Haemophilus em crescer ao redor da lise total das hemácias em ágar sangue devido ação do Staphylococcus aureus. Procedimento Com auxílio alça calibrada, pegar colônias puras dos cocobacilos Gram negativos para realização de suspensão bacteriana em salina estéril na escala de 1 a 2 de Mc Farland. Em seguida semear a suspensão em ágar sangue e inocular uma única estria de S. aureus hemolítico (ATCC 23922). Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 35±2°C em estufa por 18-24h. Interpretação

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Após 24 horas de incubação verificar o crescimento de colônias pequenas próximas à zona de hemólise do estafilococo.
Quadro com algumas Provas para Diferenciar as Principais espécies de Haemophilus. Espécies H. influenzae H. parainfluenzae H. ducrey Fator X + – + Fator V + + – GLI – + – SAC – + – LAC – – – Catalase + V –

Legenda: GLI= glicose; SAC= sacarose; LAC= lactose; V= variável; += positivo; – = negativo.

Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Haemophilus spp. ** Haemophilus influenzae, principalmente tipo b na infância: meningite, pericardite, pneumonia, osteomielite e celulite facial. ** Haemophilus parainfluenzae pode causar pneumonias ou endocardites. ** Haemophilus ducrey causa o cancróide ou cancro mole.

9.6- CHLAMYDIA spp. e TREPONEMA spp. As clamídias são bactérias cocóides imóveis, parasitas intracelulares obrigatórios de células eucariontes, incapazes de produzir sua própria energia sendo inteiramente dependentes da célula hospedeira. Entretanto, as clamídias possuem uma parede celular e contêm DNA, RNA e ribossomos, sendo então classificadas como bactérias. O gênero Chlamydia tem apenas três espécies: Chlamydia tracomatis, C. psittaci e C.pneumoniae; todas causam doença no homem. → Diagnóstico laboratorial para Chlamydia spp. ▪Cultura de Células É o método de eleição para o diagnóstico até o momento; porém é pouco utilizada na rotina de laboratórios clínicos, devido às dificuldades técnicas. ▪ Técnica de ELISA Empregam anticorpos mono ou policlonais que detectam o LPS da bactéria. Na sua maioria estes testes não são espécie-específica podendo dar reação falso-positiva para outras bactérias presentes no material biológico como, por exemplo, na secreção vaginal. ▪Imunofluorescência Direta Emprega conjugados de fluoresceína-isotiocianato e anticorpos monoclonais direcionados para proteínas de membrana ou LPS (endotoxina) de C. trachomatis. Comercialmente disponível em forma de Kits. ▪Técnicas Moleculares Hibridização com Sondas de ácidos nucléicos; Amplificação de ácidos nucléicos (PCR-Reação de Cadeia Polimerase). Ambas as técnicas são utilizadas na detecção de Chlamydia trachomatis.

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Já as espiroquetas são helicoidal, móveis através de flagelos, não são coradas pelo método de Gram. Pode ser observada em microscopia de campo escuro das amostras clínicas obtidas a partir de lesões. A espécie Treponema pallidum é o principal agente patogênico humano, causador da sífilis. O Treponema pallidum não cresce fora do hospedeiro humano, deste modo todas as tentativas de cultivar in vitro os treponemas não foram possíveis. → Diagnóstico laboratorial para Treponema pallidum. ▪ Microscopia de Campo Escuro O corante utilizado é o Fontana-Tribondeau onde se observa o microrganismo pela impregnação do mesmo pela prata. Atualmente pouco usado na rotina laboratorial. ▪ Testes Sorológicos (testes sorológicos para Lues) São dependentes de reações antígeno-anticorpo. As técnicas podem utilizar extratos desta bactéria (testes treponêmicos) ou outras substâncias como as reaginas (testes não-treponêmicos).

9.7- MYCOPLASMA spp. e UREAPLASMA spp. Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de subsistir na forma extracelular, são fastidiosos, carecem de parede celular e especificamente, todos necessitam de colesterol para crescer. O Mycoplasma hominis e o Ureaplasma urealyticum são importantes patógenos do trato urogenital humano. Já Mycoplasma pneumoniae causa uma importante enfermidade respiratória denominada pneumonia atípica primária. → Diagnóstico laboratorial para Mycoplasma hominis e o Ureaplasma urealyticum. ♦ Bacterioscopia Devido a sua dimensão e ausência de parede celular, não são corados pelos corantes bacteriológicos, consequentemente não são visualizados com auxílio de microscópios ópticos. ♦ Cultura em Meio Líquidos e Sólidos Atualmente vários são os kits comerciais disponíveis para detecção das colônias destes microrganismos em meios específicos que podem ser líquidos ou sólidos. OBS: A implantação do kit comercial para tais microrganismos estão em fase de adequação pelo setor de microbiologia do LACHGU. Principais Síndromes Infecciosas causadas pelos Mycoplasma e Ureaplasma. * Mycoplasma hominis Pode causar uretrite e cistite, está relacionado também com cervicites e abscessos tubo-ovarianos. * Ureaplasma urealyticum Agente responsável por 20 a 30% dos casos de uretrite não gonocócica. Esta associada com, parto prematuro, septicemia, meningite e pneumonia nos recém-nascidos. Em pacientes imunocomprometidos o U. urealyticum está associado à artrite, osteomielite, pericardite e doença pulmonar progressiva.

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10- DIAGNÓSTICO LABORATORIAL das INFECÇÕES GENITAIS. Os microrganismos que colonizam o trato genital feminino incluem lactobacilos, bacilos difteróides, estafilococos coagulase negativa, estreptococos alfa e gama hemolíticos, enterobactérias e leveduras. A uretra masculina normalmente contém relativamente poucos microrganismos encontrados na pele, tais como: estafilococos, micrococos, estreptococos alfa hemolíticos e bacilos Gram positivos como as corynebactérias. O setor de microbiologia deve estar capacitado para, detectar os principais agentes causadores das síndromes infecciosas do trato genital masculino e feminino, tais como:

 Vaginite Infecciosa Os principais microrganismos envolvidos são leveduras do gênero Candida e Trichomonas vaginalis (protozoário que afeta aproximadamente 180 milhões de mulheres em todo mundo). Manifestações Clínica ** Vaginite infecciosa por Candida spp. Leucorréia vaginal branca e espessa. Prurido vaginal, queimação ou irritação na vulva. São comuns eritemas, edema e escoriações. Os sintomas podem aumentar na semana antes do fluxo menstrual. A Candida albicans é responsável por 80-90% dos episódios de candidíase vulvo-vaginal. Mas atualmente outras espécies também são consideradas patogênicas, tais como C. glabrata e C.krusei. ** Vaginite infecciosa por Tricomoníase. Leucorréia vaginal abundante, podendo ser verde-amarelada e apresentar odor de peixe. São comum o eritema vaginal e disúria. Diagnóstico Laboratorial  Exame direto a fresco

Finalidade Visualizar a presença dos protozoários flagelados e móveis, bem como leveduras em brotamento ou pseudo-hifas. A presença de leucócitos, hemácias e células epiteliais descamativas também devem ser descritas e quantificadas. Procedimento Deve-se colocar a suspensão formada (secreção + salina estéril) em lâmina com auxílio do swab e em seguida colocar lamínula. Observar toda lâmina em microscópio óptico em objetiva de 10X e 40X. Leitura Descrever de forma quantitativa a presença de leucócitos, células descamativas, leveduras e protozoário.  Bacterioscopia Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram. Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de estruturas leveduriformes (pseudo-hifas) que se coram de roxo, leucócitos e células epiteliais corados de róseo.

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 Cultura Conforme padronização do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secreções vaginais e uretrais masculinas são semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de cultura são identificados e avaliados quanto a sua importância clínica. Vale ressaltar que o isolamento do Trichomonas vaginalis ocorre em meios de cultura específicos, não sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.

 Vaginose Bacteriana (polimicrobiana) Os principais microrganismos envolvidos são: Gardnerella vaginalis, Mobilluncus spp. e Mycoplasma homonis. Vários estudos têm demonstrado um aumento de 2 a 7% na taxa de risco de nascimentos prematuros em mulheres com vaginose bacteriana. Manifestações Clínica Leucorréia cinza e fétida, prurido e irritação. O eritema e edema são incomuns na região vaginal. Diagnóstico Laboratorial  Exame direto a fresco

Finalidade Visualizar a presença de bactérias, leucócitos e células epiteliais descamativas. O procedimento já foi descrito anteriormente. Leitura Descrever de forma quantitativa a presença de leucócitos, bactérias e células epiteliais.  Bacterioscopia Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram. Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de: # Cocobacilos Gram variáveis (Cocobacilos Gram positivo e/ou negativo); # Células epiteliais cobertas com cocobacilos Gram variáveis, denominadas de “Clue Cells” é o achado de melhor valor preditivo de vaginose bacteriana. # Presença de bacilos Gram negativos curvos, sugestivos de anaerobiose (Mobilluncus spp.).

Mobilluncus spp.

Cocobacilos Gram Variáveis

Leucócitos Clue Cells

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 Cultura Conforme padronização do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secreções vaginais e uretrais masculinas são semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de cultura ricos são identificados e avaliados quanto a sua importância clínica. Vale ressaltar que o isolamento da Gardnerella vaginalis ocorre em meio de cultura seletivo (Ágar Vaginalis), não sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.

 Uretrite Gonocócica (UG) O principal microrganismo envolvido é o diplococo Gram negativo (Neisseria gonorrhoeae). Manifestações clínicas Secreção purulenta verde amarelada, disúria, polaciúria e urgência miccional. Diagnóstico Laboratorial  Bacterioscopia Após realização do esfregaço bacteriológico, as lâminas devem ser coradas pela coloração de Gram. Observar em microscópio óptico em objetiva de imersão a presença de numerosos leucócitos polimorfonucleados (>10 por campo) e diplococos Gram negativos intracelulares e extracelulares.  Cultura A secreção uretral deve ser semeada em meio de cultura específico como Thayer-Martin, caso não seja possível pode ser semeado em ágar chocolate. Incubar em jarra de vela em estufa a 35±2°C por até 72horas. A identificação da espécie pelo crescimento da colônia ocorre por provas de metabolismo bioquímico da bactéria.

 Uretrite Não Gonocócica (UNG) Os principais microrganismos envolvidos são: Chlamydia trachomatis e Ureaplasma urealyticum. Manifestações clínicas Secreção de cor clara ou turva menos espessa que a desencadeada pela gonorréia e disúria. Diagnóstico Laboratorial → Técnicas moleculares em caso de suspeita de C. trachomatis. Hibridização com Sondas de ácidos nucléicos; Amplificação de ácidos nucléicos (PCR-Reação de Cadeia Polimerase). → Cultura em caso de suspeita de Ureaplasma urealyticum. Kits comerciais disponíveis para detecção das colônias destes microrganismos em meios específicos que podem ser líquidos ou sólidos.

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11- TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIBACTERIANOS (TSA) ou ANTIBIOGRAMA (ATB) O antibiograma é uma das principais tarefas executadas pelo setor de bacteriologia clínica, pois tem como funções avaliar o padrão de resposta da bactéria (padrão de sensibilidade) diante de concentrações preestabelecidas de antibióticos, orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, monitorar a evolução da resistência bacteriana e um método auxiliar na implantação de medidas de controle da disseminação de bactérias multiresistentes. Todas as etapas envolvidas na realização do TSA, desde a seleção dos antibióticos a serem testados até a interpretação dos resultados, são padronizadas por organizações especializadas como:     Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA); British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido); Comité de L’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM, França); European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa).

Estas organizações elaboram documentos de consenso, gerados por diversos especialistas que apresentam recomendações detalhadas sobre a realização e interpretação dos testes de sensibilidade. A maioria dos laboratórios brasileiros segue as padronizações recomendadas pelo CLSI. O TSA deve ser sempre realizado na avaliação das seguintes bactérias: Enterobactérias, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus pneumoniae, Streptococccus do grupo viridans e beta-hemolíticos, Haemophilus influenzae, Complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.

11.1- MÉTODOS UTILIZADOS na EXECUÇÃO do TSA ou ATB Método Qualitativo O teste de difusão de discos foi descrito por Kirby e Bauer em 1966 e fornece resultados em categorias definidas como: sensível, intermediário e resistente. É um dos métodos de sensibilidade mais simples e confiáveis. Métodos Quantitativos Os métodos quantitativos podem ser realizados por várias técnicas, tais como: # Macrodiluição em tubos Envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas (log2) de antimicrobianos em um meio de cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano. # Microdiluição em caldo Utilizam placas plásticas estéreis com vários poços, com fundo em formato de “U”, para permitir melhor visualização do crescimento bacteriano. Nesta placa, um número variável de antibacterianos, é colocado em distintas concentrações. # Etest® É uma fita plástica fina e inerte (5mm de largura x 60mm de comprimento) disponível comercialmente, que se baseia na difusão do gradiente antimicrobiano no ágar para determinação da sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado.

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Um lado desta tira é calibrado com uma escala visual indicando a concentração da droga naquele local. Duas letras no alto da tira indicam o antimicrobiano que está sendo usado, do outro lado desta fita encontra-se impregnada um gradiente exponencial pré-estabelecido do antimicrobiano. Ao aplicar a tira no meio de cultura (com a face escrita voltada para cima), imediatamente a droga começa a se difundir. Deste modo, as tiras não podem ser removidas uma vez aplicadas à superfície do ágar. Após a incubação, uma elipse simétrica de inibição é formada. Portanto, o método quantitativo descrito anteriormente tem como finalidade determinar a Concentração Inibitória Mínima do antimicrobiano, ideal para o tratamento do paciente. Essa medida é conhecida como MIC (Minimum Inibitory Concentration), refletindo a potência do antibiótico e a unidade utilizada, mg/L. Dentre vários métodos descritos, os realizados rotineiramente pelo setor de microbiologia do LEAC-HGU são o de disco-difusão e o E-Test®.

11.2- PROCEDIMENTO de EXECUÇÃO do TSA por DISCO-DIFUSÃO. Preparo da Suspensão bacteriana  Método direto

O método direto é recomendado para culturas com até 24 horas de incubação ou isolados provenientes de meios não seletivos. → Procedimento Com auxílio da alça calibrada pegar colônias puras e isoladas e suspender as mesmas em solução fisiológica estéril. Esta suspensão deve ser comparada com a escala 0,5 de Mc Farland de turvação através de luminosidade intensa (luminária).  Método de crescimento O método de crescimento é recomendado para culturas com mais de 24 horas ou de meios seletivos. → Procedimento Com auxílio da alça calibrada pegar colônias puras e isoladas e suspender as mesmas em caldo TSB ou BHI e incubar em estufa a 35±2°C por 2 a 6 horas. Esta suspensão deve ser comparada com a escala 0,5 de Mc Farland de turvação através de luminosidade intensa (luminária).

O que é Escala de Mc Farland? É um padrão de turvação utilizado em microbiologia clínica. Para determinar a intensidade da multiplicação bacteriana em meios líquidos. Facilitando a obtenção do equilíbrio ideal de microrganismos com as concentrações presentes nos discos de antibióticos e o ágar Mueller-Hinton. Esta multiplicação pode ser observada por um aumento de bactérias se comparadas com concentrações de partículas químicas (BaCl2 e H2 SO4), através da passagem de luz. A escala de Mc Farland está disponível comercialmente ou pode ser realizada manualmente no laboratório de análises clínicas, conforme descrição abaixo. Preparo Escala 0,5 de McFarland  Colocar 0,5ml da solução de 0,048M BaCl2 em 99,5 ml da solução de 0,35N H2SO4.

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   

Agitar constantemente. Medir a densidade da solução preparada em espectrofotometria no comprimento de onda de 652nm. O resultado da absorbância deve estar entre 0,08 e 0,10. Distribuir a solução sob agitação, em tubos com tampa de rosa da mesma espessura dos tubos utilizados para fazer o antibiograma. Vedar ao redor da tampa do tubo para evitar a evaporação e manter protegido da luz à temperatura ambiente.

Inoculação da Suspensão nas Placas Para a semeadura da suspensão, utiliza-se um swab estéril que, mergulhado na suspensão é pressionado na parede do tubo para retirar o excesso. A semeadura é feita passando o swab sobre a superfície da placa de Mueller-Hinton, com ágar de espessura de 0,4cm em três direções.

Colocação dos discos de antibióticos Ao colocar os discos, pressioná-los suavemente com pinça previamente flambada para que permaneça no local em que foi aplicado; Uma vez colocado o disco na placa, não removê-lo mais, pois a difusão da droga é imediata à aplicação do disco; Deve-se colocar, no máximo, 12 discos na placa, para que não haja sobreposição de halos, o que dificulta a leitura e a interpretação do teste. Retirar os discos do freezer ou geladeira por 1 a 2 horas antes do uso. Os discos devem ser conservados em geladeira (4 a 8ºC ) ou freezer para manter alguns antibióticos com substâncias inibidoras de Beta-lactamase. Incubação das placas Incubar as placas em posição invertida por 18 a 24horas, em estufa de 35±2ºC. Importante Para verificar a sensibilidade de bactérias exigentes contra diferentes antibióticos deve-se verificar qual atmosfera de incubação e meios de culturas ideais para o seu crescimento, facilitando a visualização dos halos formados. Leitura e Interpretação dos resultados Efetuar a leitura pela observação, a olho nu, do halo de inibição com uma boa fonte de iluminação e com auxílio de uma régua milimetrada, medir o maior diâmetro do halo (passar pelo centro do disco). Classificar o resultado da leitura obtida, para cada antibiótico, como: Sensível, Resistente ou Intermediário, através de consulta em tabelas baseadas na CLSI.

11.3- MECANISMO de AÇÃO dos ANTIBIÓTICOS. Os antibióticos são substâncias químicas produzidas por microrganismos ou de forma sintética, com a capacidade de inibir ou matar bactérias. São agrupados em classe, de acordo com sua estrutura química e mecanismo de ação, conforme descrito abaixo.

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 Antibióticos que atuam na Inibição da Síntese Protéica. Penetram pela membrana bacteriana através das porinas, interagem com alvos específicos localizados no ribossomo, interferindo diretamente na síntese Protéica, provocando efeito bacteriostático. As principais classes de antibióticos que atuam na síntese de proteínas são: # Macrolídeos (Eritromicina, Claritromicina, Azitromicina); #Aminoglicosídeos (Gentamicina, Tobramicina, Amicacina, etc..); #lincosaminas (Clindamicina); #Tetraciclinas (Tetraciclinas, Doxicilina, Minociclina); #Estreptogramina (Quinopristina/Dalfopristina); #Oxazolidinona (Linezolida).  Antibióticos que atuam na Síntese dos Ácidos Nucléicos Inibem a síntese do ácido nucléico por ligação ao RNA polimerase ou inibição do DNA-girase, provocando efeito bactericida. As principais classes de antibióticos que atuam na síntese dos ácidos nucléicos são: #Quinolonas e Fluorquinolonas (Ácido nalidíxico, Ácido pipemídico, Ciprofloxacina, Norfloxacina, Levofloxacina, Gatifloxacina, Ofloxacina, etc.)  Antibióticos que atuam sobre a Parede Bacteriana Impedem a formação da parede celular durante o estágio de replicação bacteriana pela ação em nível enzimático. As principais classes de antibióticos que atuam sobre a parede bacteriana são: #Penicilinas ( Amoxicilina, Ampicilina, Oxacilina, Meticilina, etc.); # Cefalosporinas; Cefens 1° geração (Cefalotina, Cefalexina e Cefazolina) Cefens 2° geração (Cefaclor, Cefoxitina, Cefuroxima, etc.) Cefens 3° geração (Ceftriaxona, Ceftazidima, Cefotaxima, etc.) Cefens 4° geração (Cefepime e Cefpiroma) #Betalactâmicos associados a inibidores de beta-lactamase (Amoxicilina/Ácido clavulônico, Ampicilina/Sulbactam, Piperacilina/Tazobactam); #Monobactâmico (Aztreonam); #Carbapenêmicos (Imipenem, Meropenem e Ertapenem); #Glicopeptídeos (Vancomicina e Teicoplanina);  Antibióticos que atuam sobre a Membrana Citoplasmática Possuem atividade detergente, penetrando da membrana externa para membrana interna da bactéria. Como consequência se tem a diminuição da integridade da membrana, por lise de lipoproteínas. A principal classe de antibiótico que atua na membrana celular das bactérias é: # Polimixinas (Colistina e Polimixina B).

O uso indiscriminado, errôneo ou desnecessário de antibióticos ao longo dos anos, é apontado como um dos maiores agentes potenciais da aparição de bactérias resistentes aos antibióticos mais comumente usados, devido à pressão seletiva, ou seja, as bactérias se adaptam e sobrevivem a mudanças das condições ambientais gerando descendentes mais resistentes aos antimicrobianos.

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12- RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIBIÓTICOS No início da era dos antibióticos, o fenômeno da resistência bacteriana não parecia ser um problema tão grave. Essa resistência era resolvida com introdução de novos agentes bacterianos. Atualmente bactérias multiresistentes vem aumentando no âmbito hospitalar, diminuindo a sobrevivência dos pacientes. Deste modo, é de fundamental importância compreender tais mecanismos de resistência bacteriana para que se possa adotar medidas de controle e prevenção no ambiente hospitalar.

Como as bactérias adquirem resistência? Resistência Intrínseca É uma característica natural de determinados grupos de bactérias, sendo espécie ou gênerosespecíficos, e delimita o espectro de atividade dos antimicrobianos. Muitas vezes, confirmam a correta identificação de uma bactéria, ou são considerados como marcador no monitoramento de procedimentos padronizados. Resistência Adquirida  Mutação Cromossômica

Ocorre durante o processo de replicação das bactérias. Pode ocorrer erros que modificam a sequência da codificação do DNA e, consequentemente alteração da informação contida no DNA original, produzindo células com mutação especifica, que será transferida as futuras gerações. As mutações são consideradas a forma menos frequente da resistência adquirida.  Transferência de Genes de resistência por:

Conjugação Ocorre transferência dos genes de resistência através do plasmídeo havendo necessariamente, contato entre as células bacterianas. Transdução A transferência dos genes de resistência é realizada por intermédio de um vírus (bacteriófago). Transformação Transferência de genes de resistência da célula doadora para a receptora sem contato entre as células. Transposição Genes determinantes de resistência podem transferir-se de um plasmídeo a outro, para o cromossomo ou para um bacteriófago. O elemento responsável pela transferência é o transposon.

12.1-PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA DAS BACTÉRIAS Inativação Enzimática Certas bactérias produzem enzimas que neutralizam a droga ou seus efeitos antimicrobianos. As enzimas podem ser:

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Ϟ Constitutivas Produzidas independentemente da presença do antibiótico, que quando presente passa e exercer um efeito seletivo. Ϟ Induzíveis Determinados antibióticos, quando em contato com a bactéria, desencadeiam ou estimulam a produção enzimática que protegerá a bactéria dos efeitos dos antibióticos. Alteração da permeabilidade da membrana A alteração na expressão dos canais de porina modifica a penetração e consequentemente ação de diferentes antibióticos. Efluxo ativo de antibióticos Propriedades de expulsar ativamente os antibióticos para fora da célula, contribuindo para uma concentração inadequada da droga e, consequentemente, ação não efetiva (bomba de efluxo). Alteração do sítio ligação do antibiótico (alvo) Os antibióticos se ligam a sítios específicos na parede celular da bactéria. Se esse sítio for alterado, o antibiótico não pode efetivar a ligação e torna-se ineficiente contra a bactéria.

Produção pelas bactérias de enzimas que inativam o antibiótico. Exemplos de enzimas: Penicilinase (presente nos estafilococos). ESBL-Beta Lactamase Espectro Estendido ( presente enterobactérias). AMP-C (Beta Lactamase cromossômica, presente em algumas enterobactérias e BGNÑF).
Enzima / Antibiótico.

Impermeabilidade da membrana bacteriana externa pela alteração ou pela diminuição quantitativa das porinas. Exemplo: Pseudomonas aeruginosa imipenem-resistentes. Estafilococos macrolídeos-resistentes. Enterococos vancomicina-resistente.
Antibiótico. Porina.

Efluxo de antibióticos. Ocorre expulsão da molécula pelo transporte ativo. Exemplo: Estafilococos tetraciclina-resistentes.
Porinas.

Modificação do alvo dos antibióticos. Exemplo: Estafilococos oxacilina-resistentes (modificação da proteína de ligação da Penicilina – PBP). Streptococcus pneumoniae penicilina-resistentes.
Alvo Modificado.

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12.2- RESISTÊNCIA dos CGP e BGN ALGUNS ANTIBIÓTICOS.  Resistência dos Staphylococcus spp. contra: OXACILINA Algumas cepas de Staphylococcus aureus e os ECN possuem a capacidade de modificar o sítio de ação deste antibiótico, por meio da produção alterada da proteína ligadora à penicilina (PBP). Esta PBP é codificada pelo gene cromossomal mecA, fazendo com que a oxacilina e os outros compostos β-lactâmicos não reconheçam o seu alvo na célula bacteriana. Por esta razão, os Staphylococcus spp., resistentes à oxacilina são resistentes a todos os β-lactâmicos independentemente dos resultados in vitro. Os Staphylococcus aureus resistentes a oxacilina são chamados ORSA. GLICOPEPTÍDEOS - Vancomicina Algumas cepas de S. aureus com sensibilidade reduzida à vancomicina (classe dos glicopeptídeos) apresentam um espessamento da parede celular bacteriana, pois agem inibindo a síntese da parede (peptideoglicano) através do seu precursor a D-alanil-D-alanina alteradas. Os S. aureus com sensibilidade intermediária aos glicopeptídeos são chamados GISA. MACROLÍDEOS, LINCOSAMIDAS e ESTREPTOGRAMINA (GRUPO MLS). Algumas cepas de Staphylococcus spp., produzem a enzima 23S RNAadenil-metilase que modifica o sítio de ação dos macrolídeos e lincosaminas (subunidades 23S e 50S dos ribossomos) impedindo-os de agir. A resistência ao MLS pode ser constitutiva ou induzível.  Resistência do Streptococcus pneumoniae contra: PENICILINA Algumas cepas de S. pneumoniae modificam o sítio (alvo) de ligação do antibiótico. Outros antibióticos como os macrolídeos e sulfametoxazol também apresentam resistência o que faz dessas drogas uma escolha empírica arriscada.  Resistência dos Enterococcus spp. contra: CEFALOSPORINAS Os enterococos apresentam uma resistência intrínseca (natural) contra todas as gerações de Cefalosporinas, bem como a Oxacilina, Clindamicina e Sulfametoxazol+Trimetoprim. GLICOPEPTÍDEOS – Vancomicina Algumas cepas de Enterococcus spp. modifica o sítio (alvo) de ligação do antibiótico na parede bacteriana, impedindo o fármaco de agir contra estas cepas. Os Enterococcus spp., resistentes a Vancomicina são chamados VRE.  Resistência dos Bacilos Gram Negativos (BGN) e alguns BGNÑF ΒETA-LACTÂMICOS Os β-lactâmicos representam a classe mais amplamente utilizada de antibacterianos. Esta classe inclui os grupos das penicilinas, das Cefalosporinas, dos monobactâmicos e dos carbapenens.

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Três mecanismos básicos de resistência aos β-lactâmicos têm sido descritos: → Alteração do sítio de ligação dos antibióticos; →Alteração da permeabilidade da membrana externa bacteriana; →Degradação ou inativação da droga através da produção de enzimas chamadas β-lactamases. É o principal mecanismo de resistência dos BGN em especial das enterobactérias. O que são β-lactamases (beta-lactamases)? São enzimas que catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, impossibilitando a atividade dos antibióticos beta-lactâmicos (cefalosporinas, penicilinas, Monobactâmico e carbapenens). As βlactamases podem ser produzidas pelas bactérias por forma plasmidial ou cromossômicas. Os quatro tipos ou grupos de β-lactamases consideradas de maior importância clínica são: ☺β-lactamases cromossômais induzíveis (AmpC); ☺β-lactamases plasmidiais e espectro estendido (ESBL); ☺β-lactamases capazes de degradar os carbapenens (Carbapenemases). ☺Metalo-β-lactamases (MβL) As enterobactérias podem produzir uma ou mais β-lactamases, dentre as principais espécies produtoras de β-lactamases estão: * Klebsiella pneumoniae (KP), K. oxitoca, Escherichia coli, Enterobacter spp., produtoras ESBL. * Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens e Providencia spp. produzem Amp-C. * Enterobacter spp e KP são produtoras de Carbapenemases. Dentre os BGNÑF (bacilos Gram negativos não fermentadores) as principais espécies produtoras de β-lactamases são: ** Acinetobacter baumannii produzem MβL, Carbapenemases. ** Pseudomonas aeruginosa produzem Amp-C e Carbapenemases. ** Stenotrophomonas maltophilia produzem ESBL.

12.3- TRIAGEM FENOTÍPICA de RESISTÊNCIA BACTERIANA ROTINA LABORATORIAL. CGP – Cocos Gram Positivos Triagem com Cefoxitina e Oxacilina por disco-difusão para detecção ORSA. São realizadas para os Staphylococcus aureus e os estafilococos coagulase negativa (ECN). → Procedimento Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de Cefoxitina (CFO) e Oxacilina (OXA) com auxílio de pinça estéril. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas. → Leitura Para os S. aureus e S. lugdunensis com halo de inibição da CFO ≤ 21 mm predizem resistência à Oxacilina.

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Deve-se, então reportar resistência as cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens independentemente do resultado de sensibilidade destas drogas. Já halo de inibição da CFO ≥ 22 mm prediz sensibilidade à Oxacilina e todos β-lactâmico. Para ECN – Estafilococos coagulase negativa com halo de inibição da CFO ≤ 24 mm prediz resistência à Oxacilina. Deve-se, então reportar resistência as cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens independentemente do resultado de sensibilidade destas drogas. Já halo de inibição da CFO ≥ 25 mm prediz sensibilidade à Oxacilina e todos β-lactâmico. OBS: Todos os valores de halo de inibição são seguidos pela padronização da CLSI.

Triagem com vancomicina por E-Test® para detecção GISA e VRE. São realizados para os Staphylococcus aureus e ECN, bem como para os Enterococcus spp. → Procedimento Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar a fita E-Test de vancomicina com a escala numérica do gradiente de concentração para cima em contato com o ágar. Pressionar com auxílio de uma pinça, levemente ao longo da mesma, para retirar bolhas que eventualmente se formem. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas. → Leitura Para S. aureus, ECN e Enterococcus spp., com Concentração Inibitória Mínima (CIM) de ≤ 4.0 µg/mL prediz sensibilidade à vancomicina. Para S. aureus e ECN com CIM de ≥ 4.0µg/mL predizem cepas intermediárias ao glicopeptídeos vancomicina (GISA) e devem ser rapidamente encaminhadas para laboratórios de referência para confirmação genotípica. Enterococcus spp., com CIM de ≥ 4.0µg/mL predizem cepas resistentes à vancomicina (VRE). OBS: Todos os valores de CIM são seguidos pela padronização da CLSI. Como interpretar a leitura da CIM pelo E-Test? Observar o ponto de intersecção do halo de inibição do crescimento do microrganismo com a fita, conforme figura abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.

Triagem para o fenótipo MLS (macrolídeos, lincosaminas e Estreptogramina) ou Teste D. São realizadas para os Staphylococcus aureus e os estafilococos coagulase negativa (ECN).

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→ Procedimento Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de Eritromicina (ERI) e Clindamicina (CL) próximos (03 cm, centro a centro) com auxílio de pinça estéril e incubar em estufa a 35±2°C por 24horas. → Leitura Se houver achatamento do halo de clindamicina e resistência a eritromicina, indica a presença do fenótipo MLS ou Teste D positivo. Se não houver achatamento do halo de Clindamicina, indica ausência do gen causador do fenótipo MLS ou Teste D negativo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.

BGN – Bacilos Gram Negativos Triagem detecção das ESBL pelo método disco-aproximação São realizadas para as enterobactérias. → Procedimento Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton, colocar um disco de Amoxicilina+Ácido clavulônico situado no centro da placa e distante a 25 ou 30 mm (de centro a centro) dos outros discos de β-lactâmicos (Ceftazidima, Ceftriaxone, Cefotaxima e Aztreonam) outras Cefalosporinas de amplo espectro também podem ser usada. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas. → Leitura Aparecimento de um “halo fantasma” ao redor dos discos dos β-lactâmico indica a presença de uma cepa bacteriana produtora de ESBL, conforme figura abaixo.

Halos Fantasmas.

Fonte: LEAC-HGU/UNIC – 2009

Escherichia coli ESBL.

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Triagem detecção das Amp-C pelo método disco-aproximação São realizadas para as algumas enterobactérias do grupo CESP (Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens e Providencia spp., bem como para Pseudomonas aeruginosa. → Procedimento Realizar a suspensão bacteriana, em seguida semear em ágar Mueller-Hinton e colocar os discos de Cefoxitina (CFO) e/ou Ceftazidima ou Cefotaxima próximos (30 mm, centro a centro) com auxílio de pinça estéril e incubar em estufa a 35±2°C por 24horas. → Leitura Se houver achatamento do halo de inibição de Ceftazidima e/ou Cefotaxima e resistência da Cefoxitina, indica à presença de uma cepa bacteriana produtora Amp-C, conforme figura abaixo. Se houver resistência a Cefoxitina, Ceftazidima e Cefotaxima também indica a presença de Amp-C.

Achatamento halo inibição Cefotaxima (CTX)

Fonte: LEAC-HGU/UNIC - 2009

Pseudomonas aeruginosa Amp-C.

Triagem detecção das Carbapenemases pelo método de Hodge São realizadas para as Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. → Procedimento Realizar a suspensão da cepa E. coli (ATCC 25922) a 0,5 da escala de McFarland, semear a mesma no ágar Mueller-Hinton com auxílio de swab estéril. Em seguida colocar um disco de imipenem ou Ertapenem no centro da placa. Com auxílio de uma alça, estriar do centro do disco do β-lactâmico até a periferia da placa de petri cepas de Klebsiella pneumoniae produtora e não produtoras de carbapenemase. Incubar em estufa a 35±2°C por 24horas

→ Leitura Formação de halo de sensibilidade pela ATCC 25922 de E. coli e formação de distorção de halo pela cepa teste que esta produzindo a enzima carbapenemase, capaz de inativar o imipenem. Escherichia coli ATCC 25922 K. pneumoniae não produtora carbapenemase.

K. pneumoniae não produtora de carbapenemase.

K. pneumoniae produtora de cabapenemase – KpC.

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13- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARROS, E. et al. Antimicrobianos. 4a ed. Porto Alegre: Artmed, 2008. BEERS, M.H. et al. Manual Merck: diagnóstico e tratamento. 17a ed. São Paulo: Roca. 2000. OPLUSTIL,C.P.; et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. 2ª ed. São Paulo: Sarvier, 2004. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4ª ed. São Paulo: Atheneu, 2005. ROSSI, F.; ANDREAZZI, D. B. Resistência Bacteriana. São Paulo: Atheneu, 2005. MENEZES E SILVA, C.H.P de; NEUFELD, P.M. Bacteriologia e Micologia para Laboratório Clínico. Rio de Janeiro: Revinter, 2006. MURRAY, P. R.; et al. Microbiologia Médica. 4ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. PELCZAR, M. J. et al. Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2a ed. São Paulo: Pearson Makron Books. 1997. VARIOS AUTORES. Boas Práticas em Microbiologia Clínica (Apostila).

OPAS/ANVISA/Laboratório Central do Hospital São Paulo-UNIFESP. São Paulo. 2008. Home Page cosultadas: www.mcboaspraticas.org.br www.anvisa.org.br

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ANEXOS

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Fluxograma de processamento de cultura do Cateter para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificar a placa de meio cultura AS, com nome completo do paciente, data, hora e material biológico semeado.

Cateter (05 cm)

Semear o cateter em Meio de Cultura Ágar Sangue (AS)

Tipo de Semeadura-Técnica de Maki (Processo Rolagem com pinça estéril).

Incubar em atmosfera de CO2 o AS em estufa a 35±2°C por até 72h. Caso não haja crescimento microbiológico.

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Fluxograma de processamento de cultura do ESCARRO para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

ESCARRO PURULENTO ou ESCARRO por INDUÇÃO.

Meios de Cultura Ágar Sangue (AS), Chocolate (AC) e MacConkey (MC).

Tipo de Semeadura por Esgotamento Técnica Qualitativa com alça 10µL.

Incubar em atmosfera de CO2 AS e AC e aerobiose o MC em estufa a 35±2°C por até 72horas, caso não haja crescimento microbiológico.

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Fluxograma do processamento de cultura de FEZES para exames microbiológicos. LEGENDA:* CT= Caldo Tetrationato; MC= ágar MacConkey e SS= ágar Salmonella-Shigella.
Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado. Identificar a(s) placa(s) meio cultura(s) com nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado.

Fezes obtida de Swab Anal.

Fezes in natura.

2° Etapa
Introduzir Swab no CT*.

1° Etapa
Pegar pequena porção de fezes e inocular no CT* com 02 gotas de solução de iodo.

Incubar o CT* em estufa 35±2°C por 1824horas.

Pegar pequena porção de fezes e inocular na salina estéril 0,95%. Incubar em estufa por 15minutos.

Após 18h, semear o CT* em ágar MC*e SS*

Após 15 min. Semear a salina em ágar MC* e SS*.

Incubar o CT* em estufa 35± 2°C por 18-24 horas.

Tipo de semeadura por Esgotamento. Técnica Qualitativa

Tipo de Semeadura por Esgotamento Técnica Qualitativa com alça 10µL.

com alça 10µL.

Após 24horas. Semear o CT* em ágar SS*.

Tipo de semeadura por Esgotamento. Técnica Qualitativa com alça 10µL.

Incubar as placas de meios de cultura em estufa a 35±2°C por 24h.

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Fluxograma de processamento de cultura do LBA para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

Lavado Bronco Alveolar ou Aspirado Traqueal

Meios de Cultura Ágar Sangue (AS), Chocolate (AC) e MacConkey (MC).

Tipo de Semeadura pela Técnica Quantitativa com alça 01µL.

Incubar em atmosfera de CO2 AS e AC e aerobiose o MC em estufa a 35±2°C por até 72h.

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Fluxograma de processamento de cultura de Líquidos Biológicos Estéreis (Amniótico, Ascítico, LCR, Pleural, Peritoneal, Pericárdico, e Sinovial) para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

Líquidos Biológicos Estéreis.
Amostras pouco purulenta ou límpida. Separar parte do material biológico e CENTRIFUGAR.

Amostras purulentas. Não há necessidade de centrifugar.

Uma porção do líquido estéril a ser processado deve ser colocada no Caldo BHI.

Outra porção do líquido estéril a ser processado deve ser semeada por esgotamento nos Meios de Cultura Ágar Sangue (AS), Chocolate (AC) e MacConkey (MC). Técnica de semeadura qualitativa com alça de 10µL.

Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC e BHI em estufa a 35±2°C por até 72h.

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Fluxograma de processamento de cultura do Sangue (Hemocultura Manual) para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

Frasco(s) de Hemocultura(s) Identificado(s).
Incubar 35 ± 2ºC
Após 24h

Positivo
Semear em AS, AC e MC

Emitir resultado parcial Identificação e TSA do microorganismo

Negativo
Estufa 35 ± 2ºC em CO2 Emitir resultado parcial Identificação e TSA do microrganismo

Positivo
Após 48h

Semear em AS, AC e MC

Negativo

Estufa 35 ± 2ºC em CO2
4º Dia 2°

Emitir resultado parcial Identificação e TSA do microrganismo

Positivo
Semear em AS, AC e MC

Negativo

Liberar Hemocultura Negativa

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Fluxograma de processamento de cultura do Sangue (Hemocultura Automatizada) para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Detecção do frasco hemocultura positiva pelo equipamento automatizado.

Sempre conferir nome do paciente no frasco com a indicação visual fornecida pelo equipamento.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

Realizar descontaminação da tampa do frasco positivo. Transferir 01 mL do sangue contido no frasco com auxílio de seringa e agulha.

Emitir resultado parcial. Característica morfotinturial microrganismo (Gram).

Colocar 01 ou 02 gotas do sangue em uma das extremidades do AS, AC e MC. Realizar técnica qualitativa por esgotamento com alça 10µL.

Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 35±2°C por até 72h.

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Fluxograma de processamento de cultura de Secreções em Geral (Feridas cirúrgicas, úlceras, abscessos, exsudatos, secreção genital e ocular) para exames microbiológicos.

Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura (nome completo paciente, data, hora e material biológico semeado).

Rolar o swab estéril contendo secreção em uma das extremidades do AS, AC e MC. Em seguida semear pela técnica qualitativa por esgotamento com alça 10 µL.

Incubar em atmosfera de CO2 (AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 35±2°C por até 72h.

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Fluxograma de processamento de Urina para exames microbiológicos. Descontaminação do local de trabalho (hipoclorito de sódio, ácido fênico-2% ou álcool 70%).

Trabalhar na área de segurança (Bico Bunsen ou Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatórios.

Sempre conferir nome do paciente e material biológico a ser processado.

Identificação das placas meio de cultura com nome completo paciente, data e hora.

Homogeneizar URINA.

Semear em ágar CLED ou Cromogênico. Pela técnica de semeadura quantitativa com alça de 1µL.

Incubar em estufa a 35±2°C por 24 a 48horas.

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Fluxograma de Identificação das principais espécies de Staphylococcus spp.
Identificação Macroscópica das colônias nos meios de cultura. Coloração de Gram.

Cocos Gram-positivos

(+)

Prova da Catalase

(−)

Streptococcus spp e Enterococcus spp.

Staphylococcus spp.

S. aureus

S. epidermidis

S. haemolyticus

S. hominis

S. intermedius

aemolyticus
Coag. (−) Coag. (+) DNAse (+) Manitol (+) Novob. (S) Pol. B (R)
PYR (−) Coag. (−) DNAse (+) Manitol (−) Novob. (S) Pol. B (R)

Coag. (−) DNAse (−) DNAse (−) Manitol (−) Manitol (−) Novob. (S) Novob. (S) Pol B. (S) Pol. B (S) PYR (+) PYR (−) Ornit. (−)

Coag. (−) DNAse (+) Manitol (+) Novob. (S) Pol. B (S) PYR (+)

PYR (–)

S. lugdunensis

S. saprophyticus

Coag. (−) DNAse (−) Manitol (−) Novob. (S) PYR (+) Ornit. (+)

Coag. (−) DNAse (−) Manitol (+) Novob. (R) Pol B (S) PYR (−)

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Fluxograma para identificação de Streptococcus e Enterococcus spp.

Isolamento de Cocos Gram positivos.

Teste de Catalase Negativo

Alfa-hemólise

Beta-hemólise

Gama-hemólise

Optoquina

e

Bile solubilidade

Bile esculina + NaCl 6,5% + PYR +

Enterococcus spp R: S. grupo viridans S: S. pneumoniae
Bile esculina – NaCl 6,5% – PYR –

+: S. pneumoniae –: S. grupo viridans
Teste de CAMP +: Streptococcus agalactiae –: Outros estreptococos

Outros estreptococos

PYR +: S. pyogenes PYR –: S. β-hemolíticos

Legenda: Resistente (R) / Sensível (S) / Positivo (+) / Negativo (–).

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Fluxograma de Identificação das principais espécies do gênero enterococos.

Catalase (−) NCG** (–) PYR

(+)

NCG**

(+)
Motilidade

(+)

Pigmento

(–)

Arabinose e Sorbitol

(−)

(+)

E. gallinarum

E. casseliflavus

ARA – SOR +

ARA + SOR +

E. faecalis

E. faecium

Legenda: **NCG: Não característico ao gênero enterococos. ARA= arabinose, SOR= sorbitol.

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ANEXOS: BULAS DE KIT COMERCIAL

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Leitura das Provas

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Guia de interpretação positivas e negativas do painel para enterobactérias.

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Citrato Negativo

Citrato Positivo

Fonte: LEAC-HGU 2009.

Prova do Citrato

Fenil Negativo

Fenil Positivo Cloreto Férrico 10%

Fonte: LEAC-HGU 2009.

Prova Fenilalanina

Lisina Positiva

Lisina Negativa

Fonte: LEAC-HGU 2009.

PROVA DA LISINA

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Indol Positivo Formação de halo róseo após adição do Reativo de Ehrlich ou Kovacs.

Fonte: LEAC-HGU 2009.

Prova lisina – detecção do Indol.

Rugai Inalterado Rugai com consumo glicose (+) e Produção de gás (+). BASE do RUGAI= Gli(+) Gás(+)

ÁPICE do RUGAI Sacarose (+) BASE do RUGAI Glicose (+) Produção Bolhas = Gás (+)

Fonte: LEAC-HGU 2009.

Prova Rugai

Fonte: LEAC-HGU 2009.

Provas adicionais para identificação enterobactérias (Kit Comercial).

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Catalase Positiva

Catalase Negativa

Fonte: LEAC-HGU 2010.

Prova da Catalase

Formação de Coágulo.

Fonte: LEAC-HGU 2010.

Prova da Coagulase

DNAse (+)

Formação de halo róseo ao redor colônia bacteriana. DNAse (−). Ausência de halo róseo.

Prova da DNAse.
Fonte LEAC-HGU 2010.

Prova do Manitol
Manitol Negativo Manitol Positivo

Fonte LEAC-HGU2010.

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Fonte: LEAC-HGU 2009.

Prova de CAMP (Positiva).

Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratório Clínico. 2006. p 236.

Prova da Bacitracina (Positiva).

Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratório Clínico. 2006. p 237.

Prova de Optoquina (Positiva).

PYR Negativo
Fonte: LEAC-HGU 2011.

PYR Positivo

PROVA PYR (Pyrrolidonil arilamidase).

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Bile Esculina Positiva Presença de cor negra no tubo. Crescimento bacteriano NaCl 6,5% Positivo Mudança cor para amarelo.

Fonte: LEAC-HGU 2008.

Provas de Bile Esculina e NaCl 6,5%.

Fonte: LEAC-HGU 2008.

Provas comerciais complementares para identificação espécies de enterococos.

Fonte: LEAC-HGU 2008.

Provas comerciais complementares para identificação espécies de BGNÑF.

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Esquema para a colocação dos discos para a detecção fenotípica de ESBL.

Método de Disco-Aproximação

ATM

03 cm

03 cm
AMO+AC CRO

CPM

CAZ

Legenda: ATM= Aztreonam; CPM= Cefepime; AMO+AC= Amoxicilina+Ácido clavulônico; CRO= Ceftriaxone; CAZ= Ceftazidima.

Fonte: LEAC-HGU/UNIC 2008. Halos Fantasmas entre AMO+AC e Cefalosporinas.

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Esquema para a colocação dos discos para a detecção do fenótipo MLS.

TESTE D

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica. Sarvier: São Paulo. 2004.

Teste D NEGATIVO.

Teste D POSITIVO.

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