Moxico 2010

República de Angola
Ministério da Educação
Direcção provincial de educação do Moxico
TREINAMENTO PARA TECNICO DE LABORATORIO BIOLOGIA

Manual para o uso correcto do Microscópio

O microscópio é um aparelho utilizado para visualizar estruturas minúsculas

como as células.

Acredita-se que o microscópio tenha sido inventado em 1590 por Hans

Janssen e seu filho Zacharias, dois neerlandeses fabricantes de óculos. Tudo
indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de
materiais biológicos foi o neerlandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 -
1723).

Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente,

pequena e quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente
diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas, os glóbulos
vermelhos do sangue e os espermatozóides presentes no sêmen dos
animais. Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos
“micróbios”, como eram antigamente chamados os seres microscópicos,
hoje conhecidos como microrganismos.

Dividem-se basicamente em duas categorias:

Microscópio Ótico: Funciona com um conjunto de lentes (ocular e objectiva)

que ampliam a imagem transpassada por um feixe de luz

Microscópio Electrónico: Amplia a imagem por meio de feixes de electrões,

estes dividem-se em duas categorias: Microscópio de Varredura e de
Transmissão.

MICROSCÓPIO

O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1 mm ou

100 µm. Isto significa que se você olhar dois pontos separados por uma

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distância menor que 100 µm, esses pontos aparecerão como um ponto
único. Para distinguir estruturas separadas uma das outras por menos de
100 µm, há necessidade de instrumentos ópticos que tenham poder de
resolução aumentada. É importante salientar a diferença entre poder de
resolução e poder de aumento. Se você ampliar várias vezes uma mesma
fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos
de 100 µm continuarão a aparecer como um ponto só, borrado. É possível,
portanto, aumentar a ampliação, sem contudo melhorar a resolução. Os
microscópios permitiram ao homem observar estruturas com ampliação
maior e maior resolução.

O limite de resolução dos microscópios ópticos, que são aqueles que

utilizam a luz para iluminar o objecto que está sendo analisado, é de cerca
de 0,2 µm (ou 200 nm ou 2 000 Aº ); é melhor que o olho humano cerca de
500 vezes. Não se consegue construir microscópios ópticos com
desempenho melhor que este, pois o factor limitante é o comprimento de
onda da luz.

Com o advento do microscópio electrónico, o poder de resolução foi

aumentado cerca de 1000 vezes em relação ao microscópio óptico. Para
isso, em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de electrões para
"iluminar" objecto a ser analisado. As áreas do material que permitem
melhor transmissão de electrões (regiões transparentes aos electrões)
aparecem como áreas claras; as áreas que absorvem ou deflectem os
electrões (regiões densas aos electrões) aparecem como áreas escuras. Os
microscópios electrónicos têm limite de resolução próximo de 2 Aº, cerca de
500 000 vezes maior que o do olho humano.

O microscópio óptico (MO)

Os primeiros microscópios de luz ou microscópios ópticos (MO) surgiram no

século XVII, principalmente com o holandês Anton van Leeuwenhoek (1632-
1723) e o inglês Robert Hooke (1635-1703). Leeuwenhoek construia
microscópios com uma única lente, que chegavam a aumentos de mais de
200 vezes. Esses microscópios com uma lente só são chama os
microscópios simples, e a imagem fornecida não é boa. Hooke construiu seu
microscópio com duas lentes: uma delas era a ocular e a outra, a objectiva.
Esses microscópios são chamados microscópios compostos, e a imagem
fornecida é melhor que a do microscópio composto.

Coloração

A maioria dos tecidos é incolor, o que torna difícil sua observação ao

microscópio óptico. Devido a isso foram introduzidos métodos para a
coloração dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visíveis e
destacados uns dos outros.

A coloração é feita usando-se geralmente misturas de substâncias químicas

denominadas corantes. Maioria dos corantes usados em histologia

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comportam-se como ácidos ou bases e tendem a formar ligações salinas

com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Os componentes dos tecidos
que se coram facilmente com corantes básicos são chamados basófilos,
sendo chamados de acidófilos os que se ligam a corantes ácidos.

O microscópio electrónico (ME)

''... No inicio do século XIX estala definido o limite de resolução do

microscópio óptico. Segundo o físico alemão Ernst Abbe (1840-1905), esse
limite dependia principalmente do comprimento de onda (?) da luz com que
se observa o objeto. O MO não pode ver pontos do objecto mais próximos
do que 0,2 micrómetros (1 µm = 10-3 mm), ou seja, seu aumento máximo
está em torno de mil vezes. (Não muito mais do que Leeuwenhoek
conseguia! )

O conhecimento dos fenómenos ondulatórios permite-nos saber que a

imagem de um ponto luminoso obtida através de uma lente é formada por
um círculo central luminoso cercado de anéis claros, com intensidades
decrescentes (difracção). Quando buscamos aumentos baixos, não
observamos essa figura, mas è ela que determina o limite de aumento para
cada diâmetro da limite e para cada cor da luz de iluminação. Quanto
maior? Mais critica é a situação. Dai concluirmos que já atingimos o
aumento máximo permitido pelo MO, pois as aberrações (distorções) das
lentes já foram suficientemente bem corrigidas, mas o nosso olho
infelizmente não vê a luz com? Menor que o violeta. É então que entramos
com um novo universo que o ME pôde proporcionar.

No inicio do século XX, o físico francês Louis De Broglie (1892-1987) propôs

que partículas quânticas, como o electrão, têm associadas a si ondas cujos
comprimentos variam com o inverso da velocidade. Para electrões
acelerados, por exemplo, por um potencial de 50 quilovolts (um kV = mil
volts), ? é aproximadamente dez mil vezes menor do que o da luz verde.
Portanto, o efeito da difracção para electrões seria extremamente menor do
que para a luz. Esta è a razão teórica da capacidade de aumento do ME.

(...) Na década de 1930, Ernst Ruska (1906-1988), na Alemanha, construiu o

que foi considerado como o primeiro ME. Hoje em dia o ME pode chegar a
aumentos acima de um milhão de vezes (mil vezes mais que o MO), mas
nas primeiras tentativas as imagens eram muito inferiores às do MO, em
qualidade e aumento.

O ME consiste basicamente em:

Canhão electrónico com R fonte de electrões (fio aquecido), que podem ser
acelerados em potenciais em geral de 20 até 100 KV.

Sistema eléctrico para suprir as tensões e correntes do aparelho.

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Lentes magnéticas, que são bobinas (fios enrolados) para produzir um

campo magnético actuante sobre os elétrons, tendem um efeito semelhante
ao de uma lente comum para a luz.

sistema de bombas para produzir alto vácuo (pressão de cerca de 10-6 atm)
e permitir que os electrões migrem pelo tubo do aparelho, além de evitar a
combustão do filamento pelo oxigénio do ar.

tela fluorescente para produzir uma imagem final visível, quando atingida
pelos electrões.

O microscópio acima descrito è chamado microscópio electrónico de

transmissão (MET), pois o que se observa é a projeção de uma fatia muito
fina do material (como no MO, embora muito mais fina). Mais recentemente,
na década de 1960, surgiu o chamado microscópio electrónico de varredura
(MEV), cuja aplicação está na observação da superfície dos materiais. Nesse
aparelho, a superfície do material é varrida ponto a ponto por um feixe de
electrões (...)

O preparo de amostras, particularmente as biológicas, é fundamental para

obtenção de boas imagens. Para o MET, a amostra deve ser fixada com
reagente específico, lavada, desidratada (a água é substituída por acetona)
e imersa numa resina epóxi que endurece após ficar 48 horas numa estufa
a 60°C. Aí então ela é cortada em fatias finíssimas (espessura de 0,05 pm),
corada com sais de metais pesados, como urânio e chumbo, e só depois
disso observado no MET.

No caso do MEU, como desejamos uma superfície bem preservada e que

produza uma boa corrente de electrões secundários para obtenção de uma
boa imagem, o material é fixado como na forma anterior, mas a
desidratação é feita por um método (ponto critico do CO2 - dióxido de
carbono) que praticamente não deforma o material. Após essa desidratação,
a amostra é coberta com fina camada de ouro, por método especial
(sputtering). Depois disso ela está pronta para observação no MEV.

No Brasil temos algumas dezenas de MEs, muitos dedicados à pesquisa

biológica. Uma área que tem sido bastante auxiliada pelos MEs é a
protozoologia, especialmente no estudo de protozoários patogênicos tanto
para os animais quanto para as plantas (...)

A microscopia eletrônica tem se desenvolvido muito nos últimos anos,

culminando com a criação do chamado microscópio de tunelamento
quântico, cujos autores, Gerd Binning e Heinrich Roher, do Zurich Research
Laboratory (IBM), dividiram com Ruska o Prêmio Nobel de Física de 1986".

PRINCIPAIS CORANTES DA MICROSCOPIA ÓPTICA

Quanto à natureza química:

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ÁCIDOS - Coram elementos acidófilos. Eosina, ácido ósmico e P-A-S-

(Periodic Acid Schifft)

BÁSICOS - Tingem as estruturas basófilas. Hematoxilina, orceína, azul-de-

metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de geneciana.

NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam acidofilia

nem basofilia. Vermelho neutro.

Quanto ao papel fisiológico:

VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Verde-janus B, azul de

metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III.

NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina, ácido

òsmico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto às propriedades tintoriais:

ORTOCROMÁTICOS - Conferem á célula a mesma cor que apresentam in

vítro. Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.

METACROMÁTICOS - Dão á célula coloração diferente da que apresentam in

vítro. Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

Cromatofilia celular:

Membrana plasmática - Tetróxido de ósmio (OsO4).

Reticulo endoplasmático - Tetróxido de ósmio.

Ribossomos - Difenilamina, azul de toluidina.

Matriz do hialoplasma - Reactivo de Millon (reactivo nitroso-mercúrico).

Ergastoplasma - Hematoxilina. (Ele é considerado como a substância

basófila do citoplasma).

Mitocôndrias – Verde-janus B, ácido ósmico, hematoxilina férrica.

Complexo de Golgi -Sais de prata.

Centrossomo - Hematoxilina férrica.

Vacúolos - Vermelho neutro

Nucléolos:

Plasmossomos (nucléolos verdadeiros) - Verde de metil-pironina. (São

Feulgen negativo).

Cariossomos (falsos nucléolos) - Hematoxilina, fucsina básica. (São Feulgen

positivo).

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Cromossomos - Feulgen positivo, P-A-S- negativo, hematoxilina, orceína e

demais corantes

básicos.

PRINCIPAIS CORANTES

Componente Celular Corante

DNA Reação de Feulgen

RNA Reação de Galocianina

Proteínas Totais Fast Geen / pH = 2,7

Proteínas Histônicas Fast Geen / pH = 8,1

Lipidios Suudan III ou Sudan IV

Polissacarídeos Reação de PAS

AmidoLogol / Iodo

Núcleo Hematoxina

Citoplasma Eosina

Golgissomo Nitrato de Prata

MitocôndriasHematoxina Férrica

Fonte: infonet.com.br

MICROSCÓPIO

Conceito é a arte de observar atravez, e com o microscópio ou seja um

conjunto de conhecimento que se obtêm no estudo dos objectos
microscópicos

micrólogia = tratado acerca dos seres ou objectos microscópicos.

INTRODUÇÃO

A célula é um micromundo cujas as estruturas só podem ser observadas

com o auxilio de instrumentos e técnicas especializadas que comporta
alguns riscos dos quais é necessário estár consciente. Sendo assim ouve
uma convergençia de várias técnicas que ao longo dos tempos permitio
estabelecer uma verdadeira « Anatomia das células ». Pelo geral o poder
resolvente do olho humano é de 0.1mm, ou seja a menor distançia vista ou
resolvida pelo olho humano é de duas linhas a 1mm de distançia, sendo
evidente, isto prova a nessecidade do aparecimento do microscópio,ex:
duas linhas a 100 um de distançia, veremos uma só linha.

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A descoberta da célula, tal como todo o conhecimento humano, foi

resultado de um longo percurso de investigação envolvendo interacção de
ideias e invenções de técnicas

HISTÓRIA DO MICROSCÓPIO

Cronologicamente até o seculo XVII conhecia-se bastante sobre os orgãos

que constituem os seres vivos, mas não sabiam como eram organizadas e
constituidos(em unidades mais pequenas, as células)isto na época de
Galileu que interessou para esse problema e fez quase um microscópio.

Neste mesmo século um Holandês, vendedor de roupas e especialista em

lentes Anthony Van Leeuwenhoeck(1650-1700)construio o 1º microscópio
simples que concistia, apenas numa única lente montada numa moldura
simples, com um cistema para segurar o objecto à distançia. Van o usava
para examinar tudo desde da água,à sua propria saliva.

Comunicou as descobertas, por carta á Royal Society de Londes onde na

descrição dizia que descobrio pequenos animais(os protozoários ex:
vorticela)e foi o primeiro homem a ver bactérias, e na época considerou-se
a descoberta dum 3º mundo dos microrganismos(x270). Esses animais com
fama(1676)foram designados anímáculos onde havia uma péssima imagem
com lentes defícientes e com uma imagem pouco nitidas e deformadas.

30 anos mais tarde «tecidos fibrosos» «rete mirabile = rede maravinhosa» «

papa» «lodo» e sucos nobres são algumas das designações usadas pelos
cientistas do sec. XVII para descrever matéria viva. Robert Hook(1636-
1703)pública o livro Micrografia onde é o 1º a descrever células. Examinou
uma lámina muito fina de cortiça e coloco-a num dos 1º microscópios
simples construidos, que é constituido por uma única lente e mais tarde
associaram-se duas ou mais lentes até o microscópio composto simples que
permitiram observações mais precisas das estruturas animais e vegetais. O
seu aprofeiçoamento ao longo do sec. XVII iria permitir um avanço no
estudo dos seres vivos. Contribuio tambem um zoológo, Malpighi(1628-
1694).

Da célula Hook vio apenas as paredes esquelécticas, sem intervir na

natureza real e na sua individualidade. Os seus trabalhos no entanto
encorajaram outros cientistas a utilizarem o microscópio na observação de
material bíologico.

A hipótese Hooke admitiu que todos os seres vivos são constituídos por
células(que eram porções de matéria que podiam ou não estar envolvidas
por uma parede, citoplasma, núcleo.

Foi preciso 150 anos para que a noção de célula adquirisse os significados
que têm hoje.

No sec. XVIII em 1838-39 entre uma conversa dos cientistas alemões,

Schleiden o zoológo e Schwan o botânico, nasceu ou foi inuciada uma téoria

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geral da célula(Teoria Celular)que modificou as ideias no tempo e no

espaço; « a celula é a unidade básica do metabolismo que contêm material
hereditário e fisiologica, sob o ponto de vista estrutural e funcional, dos
seres vivos e ou seja todos os organismos são constituidos por células, onde
se desemrolam as reacções da vida ».

Robert Brown(1831-1839)descrobrio o nucleo nas células vegetais,e um

tempo depois o biologista alemão e médico Virchow(1855)acrescentou a
teoria celular com « elas multiplicam-se por divisão dependente duma
continuidade genetica entre célula mãe e células filhas»

A teoria celular constitui um grande marco da ciençia em geral, e da

micróscopia em particular.

Foi decissivo e essencial para tornar compreensível o desenvolvimento

embrionário, e das leis da hereditariedade.

Com o aperfeiçoamento do microscópio, acumularam-se as provas sobre

essa teoria unificadora da biologia, porque se foram observando cada vez
mais estruturas no interior da substância gelatinosa da célula. Foi-se
modificando e evoluindo a mecânica e a óptica do microscópio até os
nossos dias onde existe o Microscópio Composto (Óptico)

Já na antiguidade se observaram, através de lascas de cristal transparente,

com superfícies curvas, dão imagens ampliadas dos objectos.

Desde então a biologia do sec.XVIII progrediu em passos lentos devido à

insuficiência de meios matérias e ópticos para observação dos «
infinitamente pequenos » ou fragmentos dos tecidos e de órgão de seres
superiores.

A invenção do microscópio permitio preencher uma grande lacuna da

ciençia onde hoje é possível decompolos e estuda-los em dois tipos:

--MICROSCÓPIO COMPOSTO OU ÓPTICO

--MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO

MICROSCÓPIO COMPOSTO OU ÓPTICO

Este aparelho fornece imagens ampliadas dos objectos, permitindo portanto

a observação de estruturas invisíveis à vista desarmada. Haviam vários
defeitos nestes microscópio no principio do sec.XIX a nivel do acromatismo
e esfericidade que actualmente já foram corrigidos com uma associação de
lentes fabricados com matérias especiais para esse fim, e as imagens têm
vindo a ser mais nítidas e cada vez mais pormenorizado. A ampliação é feita
através de dois sistemas de lentes de ampliação (objectivas e oculares)
suportados por uma série de peças mecânicos que permitem uma utilização
prática desse aparelho.

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As OBJECTIVAS são formadas por uma associação de lentes inseridas num

suporte metálico e têm uma escritura na parte externa com o seu poder
resolvente e de ampliação. A ampliação proporcionada pelo microscópio
óptico deve-se em geral a uma conjugação do poder de sistemas de
objectivas e do sistema ocular a ser usado; ex: 40xocular,120x objectivas
40x100= 400 vezes

de ampliação. Normalmente a ampliação tem limites, e se usar ampliações

muito grandes as imagens começam a perder qualidade. Falando do poder
resolvente que tínhamos falado anteriormente (ex: duas linhas.), o poder
resolvente é calculado com os parâmetros:

1º o comprimento de ondas electromagnéticas de luz radiada que é

limitado(luz visível entre 400nm a 700nm ou 0.01 um de comprimento)é
limitado para esse microscópio, e que é calculada através da velocidade da
luz 300000 m\s sobre o tempo de uma onda.

2º NA objectivas e NA condensador = que são aberturas numéricas da

objectiva e do condensador, onde NA é uma característica especifica do
sistemas de lentes ex: NA = n. sen #, índice de refracção, # formado pelo
eixo óptico.

Poder Resolvente = comprimento de onda da luz visível

NA objectivas + NA condensador

Sendo assim o poder de resolução máxima é de 200 - 250 nm e o aumento

máximo é de 1500x.

Neste microscópio o tipo de radiação é a LUZ natural ou artificial, daqui que

as amostras podem ter animais vivos ou mortos e de preferência fino e
montado em material transparente, lâminas e lamelas de vidro, sobrepostas
umas nas outras geralmente com amostras finíssimas. LENTES em geral de
vidros

DIAFRAGMA é um dispositivo mecânico que serve para diminuir ou

aumentar e evitar a incidência da luz que dificulta a observação de
amostras muito finas e fica situado debaixo da plataforma e que serve de
mediador entre a luz que vem do espelho ou lâmpada até ás amostras.

A imagem transmitida é geralmente colorida.

O campo do microscópio tem uma certa profundidade, dai a possibilidade

de podermos focar vários planos, ou seja, quando focamos um plano o de
baixo e de cima ficarão desfocados como se fossem pequenas alturas
diferentes e assim sucessivamente para os outros planos.

Para movimentar a imagem para outras posições deve-se deslocar a lamina

sempre no sentido oposto a que queremos ir (mas actualmente à parafusos
especiais na plataforma, e com precisão para esse fim ou seja para
movimentar a amostra)(e ainda existem actualmentente parafusos

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micrómetros para visualizar nitidamente no mesmo plano, e parafuso

micrómetro para focar a imagem).

TIPOS DE MICROSCÓPIO COMPOSTO

MICROSCÓPIO DE CAMPO LUMINOSO as amostras podem ser coradas ou

não, ex: bactérias coradas, serve para determinação de elementos
morfológicos. Aumento 1000-2000 vezes todos os m. Compostos.

MICROSCÓPIO DE CAMPO OBSCURO amostras não coradas e utilizam-se

lentes que desviam raios luminosos onde aparece iluminado as amostras
com fundo escuro e os microrganismos vão exibir alguns dados
morfológicos característicos em estado vivo e em suspensão liquida.

MICROSCÓPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA utiliza como fonte de luz as radiações

ultravioletas onde é vantajoso nas radiações visíveis e de condições de
visibilidade e podem ser em amostras coradas e não coradas e podem ser
fotografadas e referencia-se os componentes e estruturas intra-celulares
com maior ou menor absorção das diferentes partes através da luz ultra
violeta.

MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASES se desvia raios luminosos com uma

grande intensidade, com vários graus de brilho, e fazem-se exames de
estruturas celulares em células vivas de microrganismos maiores:
leveduras, algas, protozoários e bactérias.

MICROSCÓPIO DE FLUORESCENÇIA brilhante a corado por cor fluorescente e

usa-se para técnicas diagnósticas com diferentes organismos e com
diferentes fluorescência onde vai revelar a sua própria identidade como
microrganismo.

A PREPARAÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA M. OPTICO

Deve ser feita temporariamente ou esporadicamente ou de preparação

definitiva, e deve-se ser de pequena espessura e é colocada sobre a lamina,
mergulhando sobre soluções aquosas à ocasião. Ou também « in vivo »
meio normal de vida das células e com solução de Ranger.

Há coloração especificada para ver diferentes e especificados organelos

citoplasmática.

Podem ser os processos: 1º Colheita, 2ºFixação, 3º Desidratação, 4º

Inclusão, 5º Corte, 6º Colagem, 7º Desparafinação, 10º Montagem. E etc....

Vantagens do Microscópio Composto Óptico

Maior poder separador ou de resolução ou seja capacidade de distinguir X

do Y aos pormenores.

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Quanto á luz, menor for o comprimento de onda maior é o poder resolvente

do microscópio e o de luz ultravioleta melhora extraordinariamente as
qualidades da imagem quanto aos pormenores.

MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO

O físico francês De Broglie em 1924 descobriu que os electrões possuíam

uma natureza ondulatória e que as radiações ultravioletas tinham menor
comprimento de onda. Assim sendo na década de 30 o Prof. E. Ruska em
1933 constrói o 1º microscópio electrónico que na sua natureza é bastante
volumoso e complexa tendo uma mesa com todos os comandos incluindo
um monitor e com um tubo metálico com vários metros de comprimento.

Na sua natureza á um emissor de feixes de electrões quanto á radiação, um

conjunto de lentes electromagnéticas, um sistema condensador, de
objectivas, e de projéctil.

O comprimento de ondas usado é variável entre 0.005 nm.

O poder de resolução máxima varia entre 0.5-0.2 nm = 500x m.óptico =10

Angst.

E o poder de ampliação maxima de 250000X -500000X -1000000X de

vezes.

O seu funcionamento, no interior exige uma pressão de vácuo exagerado

de(0.0001 a 0.0000001 mmHg), a uma voltagem de 4000 a 100000 volts,
onde os seres vivos não conseguem suportar vivos(uma desvantagem)por
serem muito delgados(uma prévia preparação), permitirão um nº suficiente
de electrões o atravesse e forme uma imagem observadas de ultra-
estruturas.

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