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PCR PESQUISA

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ DISCIPLINA: Genética Molecular PROFº. Ronan Xavier.

Leonny da Silva Santos - 200811134 Pesquisa complementar O que é a PCR? Em 1985, foi descrita a metodologia da reação em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A sigla como demonstrada, significa "polymerase chain reaction", que em português seria reação em cadeia da polimerase. Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA ´polimerase. Para compreendermos como funciona a técnica, que é na verdade bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a síntese de uma fita nova, a DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e de precursores de síntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs (desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP). A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro, que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os sítios de pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes no tubo, a reação era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida ainda mais, até 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando, assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4 cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria um número de cópias do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2. Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como a maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94oC. Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso, a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o aparecimento de pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema, gerando ao final produtos de PCR inesperados. A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm a Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura ótima de funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram automaticamente resolvidos: a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.

pois são moléculas pequenas e. formando aos poucos um imenso número d fita duplas de comprimento definido. e outra. Esta situação está claramente representada na figura abaixo. As fitas de comprimento definido aumentam de número exponencialmente. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que hibridizaram em fitas previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento definido.b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização. portanto. que é exatamente a e extremidade 5´do primer já incorporado na fita molde. permitindo uma rápida desnaturação ao se iniciar um novo ciclo. já que inicia. Quando a temperatura é reduzida os primers rapidamente alcançam seus sítios de complementariedade. de comprimento determinado. a 94 oC. estão esquematizados na figura abaixo. c) o DNA molde não se renaturava por completo. muito móveis. Observe que a fita estendida a partir de um primer hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo. que é obtida sempre que um DNA previamente copiado é empregado como molde em sua síntese. que permite a extensão das novas fitas a partir dos primers. Os eventos ligados às três temperaturas mencionadas. Por fim. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o primer hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão total. O DNA molde tende a renaturar. 94 oC. O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento variável. enquanto as fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo. evitando hibridizações espúrias. por alvo). Observe que. . sem desparear os primers outra vez. que mostra os três primeiros ciclos de uma PCR. supondo neste caso que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável. Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94 oC. no primer e terminam ao fim do DNA molde. 50 oC e 72 oC. que desnatura todas as fitas. os primers e as fitas simples de DNA alvo estão misturados. a temperatura volta a 94 oC. Figura 1. à temperatura de 72 oC. mas logo a temperatura é novamente elevada para 72 oC. pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC. mas não podem parear. Uma inspeção da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão. e porque estão em concentração muito mais elevada que o DNA alvo. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas com a letra e à sua direita. recomeçando o processo. porque o molde é muito longo. inclusive as recém sintetizadas. obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo ou de um vírus ou plasmídeo). que podia ser mantida acima de 50 oC.

O maior se desloca mais lentamente no gel e produz a banda em verde. as fitas novas são sintetizadas a 72 oC. Pode-se usar um gel de poliacrilamida. Figura 3. evidentemente. O fragmento menor migra mais rápido e produz a banda em vermelho. Visualização de três reações de PCR. A migração das bandas na eletroforese é de cima para baixo. Os dois produtos têm comprimentos de 400 e 360 pb. A coluna c é um controle negativo. Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação. será apenas o comprimento relativo. A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do uso da eletroforese em gel. Esta situação está representada no esquema da figura seguinte. Após hibridização dos primers a 56 oC. e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação UV. Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. no gel. Na transiluminação ou na coloração por prata.Figura 2. "corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se intercala entre as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com cor alaranjada). . dando origem a fragmentos estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados em amarelo). todas as bandas têm a mesma cor. que corre verticalmente. uma escada de DNA .DNA ladder .de 100 pb). Em a e b dois produtos são gerados. a partir de dois pares de primers diferentes. O produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que distingue um do outro. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso. essencial em qualquer reação de PCR.

o pareamento não é aleatório completamente.uma PCR com um primer só. com 10 a 15 bases. As bandas. contudo. obteremos as mesmas bandas mais uma vez. a técnica de PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato é rápida.randomly amplified polymorphic DNA . Na coluna 1 estão os marcadores de peso molecular. Em verdade. Isto.e amplificando qualquer DNA! Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer previamente a sequência que se quer amplificar ou. Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de hibridização (pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera. e estas bandas devem ser polimórficas (isto é. pelo menos. ao menos entr grupos distintos. Se. pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões com complementariedade para o primer escolhido. Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4. muitas vezes.DNA polimórfico amplificado aleatoriamente . não são uma amplificação completamente aleatória de trechos de DNA.. por um lado. O curioso é que. fragmentos de DNA fita dupla de comprimento conhecido.. pequeno. poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em muitos sítios do DNA. através do pareamento com baixa estringência do primer (em geral ele também. suas extremidades.Figura 4. Ainda assim. a técnica é rápida e de baixo custo. não precisamos sequer de dois primers. contudo.dá margem a certa confusão. o que é muito diferente. obtidos por digestão por enzima de restrição de um DNA conhecido ou sintetizados por máquinas. mas o nome . Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes da . Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a produtos de PCR com diferentes comprimentos (número total de pares de bases) (colunas 2 a 5). um número considerável de bandas em muitos diferentes DNAs. Além disso. por outro a existência das sequências com homologia é de fato aleatória. Se. mas sim de trechos flanqueados por sequências que pareiam com o primer com baixa estringência. Apesar disso. com diferentes migrações) para indivíduos diferentes. então. para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. A coluna 6 é um controle negativo e a pequena banda difusa no fim do gel é apenas a fronteira da eletroforese. RAPD . Uso do PCR: Eis os principais! PCR na investigação de Paternidade Uma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade. basta um. o que facilita os pareamentos). nem sempre ocorre. se repetirmos o experimento nas mesmas condições experimentais. o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os marcadores são bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número de primers em cada situação. baixarmos a temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45 oC.

A figura abaixo retrata a situação onde um casal avalia a paternidade de dois meninos. Observe que. A banda materna de cada filho está indicada e a banda paterna de um deles está contornada com uma elipse.1) tem claramente uma banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da banda paterna. mesmo em um estado de conservação. contudo. em muitos casos. As colunas 2. 2).descoberta da PCR. para fins deste exemplo. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho (Fo. bulbo de cabelo. a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a alguma banda paterna. duas bandas serão visíveis se o indivíduo for heterozigoto para aquele STR. para um sistema qualquer. Um caso clássico é a investigação da procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou resto de pele sob as unhas da vítima). Na . o procedimento para análise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo. 4 e 5 mostram o resultado da amplificação de um sistema para o suposto pai. o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da mãe. Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação de paternidade. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão. fragmentos de pele). suficiente DNA para uma análise de STRs como a descrita acima. pela redução dos custos do exame e democratização dos reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties). O primeiro (Fo. Isto que dizer que. o marido não pode ser excluído de ser o pai. Supondo. PCR na investigação de crimes Outro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. A possibilidade de amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite. Fig. o filho terá um STR (e uma banda) materno e outro paterno. a mãe e dois filhos. neste caso. mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos baseados em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com mais abrangência. amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue. 5. Quando um STR . que o material não contivesse restos de células da própria vítima. O teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho.small tandem repeats e sua amplificação por PCR é analisado em gel de agarose. No caso de investigação de paternidade. para cada sistema com duas bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR). 3. Portanto. equivalentes aos marcadores de peso molecular. cada suspeito aparece. No segundo caso.

99999999%. Isto quer dizer que não podemos excluir o suspeito dois com uma margem de acerto de 99. O suspeito um tem apenas uma banda. algumas vezes.htm> Acesso em 31 de abril de 2011. as 17h30min. a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O padrão de duas bandas é idêntico ao do suspeito 2 e exclui os demais. As colunas 2. Três suspeitos estão sendo investigados e uma amostra de sangue está disponível. <http://www. que o outro é o "dono" da amostra. 6. . A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a probabilbidade de não exclusão (como no caso de paternidade) para 99. Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de STR para investigação criminal. 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra. Fig.99999999%. mas não prova. A identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR. Enfim. equivalentes aos marcadores de peso molecular.Uma técnica de mil e uma utilidades. no aconselhamento genético de casais é importante determinar inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão.ufpe. em geral com a manipulação posterior do produto de amplificação. ser difíceis de diagnosticar. Referência Eletrônica: Portal de informação em genética e biologia molecular e áreas afins: PCR .amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. Doenças genéticas podem. UFPE. Adicionalmente. PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de portadores sãos de alelos mutantes. as aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas. O teste exclui dois indivíduos.br/biolmol/aula7_PCRRAPD-aplicar. como na paternidade.

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