Você está na página 1de 40

Guião do professor

VERSÃO A
ÍNDICE:

Introdução……………………………………………………………………...… 3

Parte I – Enquadramento teórico da actividade………………………… 5

Parte II - Planificação da actividade……………………………………….. 12

Parte III – Problematização da actividade….……………………………. 13

Parte IV – Procedimentos protocolares............................................. 16

Parte V – Análise e discussão dos resultados……………………………. 19

Parte VI – Actividades complementares………………………………….. 20

Parte VII – Glossário…………………………………………………………… 29

Apêndices…………………………………………………………………………. 31

Anexo………………………………………………………………………………. 39

Referências Bibliográficas……………………………………………………..40

2
Introdução

O kit “BioExperimentando” é resultado de um trabalho de investigação na área da biotecnologia,


nomeadamente dos testes genéticos, e surgiu da necessidade da criação de actividades laboratoriais
didácticas nesta área do conhecimento em profundo desenvolvimento.
A Biotecnologia surge integrada nos programas de ensino de Ciências, quer do 3º ciclo do Ensino
Básico, quer do Ensino Secundário. Relativamente ao 3º ciclo do Ensino Básico, está apenas presente num
ponto do quarto tema geral “Viver melhor na Terra”. Encontra-se inserida no capítulo “Transmissão da
vida” onde se sugere que “Os alunos devem ter oportunidade para reflectir sobre algumas aplicações e
possíveis consequências da manipulação do material genético. A discussão de notícias veiculadas na
comunicação social (relativas, por exemplo, à clonagem, à reprodução medicamente assistida) pode
contribuir para o reconhecimento de algumas restrições de natureza ética que se colocam à investigação
científica.” (1)
A Biotecnologia assume de facto maior relevância no Ensino Secundário, nomeadamente no
programa de Biologia do 12º ano. É finalidade de aprendizagem para a formação científica dos jovens “o
reconhecimento da relevância da Biologia e da Biotecnologia nos dias de hoje, uma vez que influenciam a
qualidade de vida das pessoas e a organização das sociedades, ao apresentarem alternativas e originarem
questões que exigem tomadas de decisão a nível tecno-científico, político, social e ético”. Segundo o
mesmo programa “pretende-se enfatizar a influência que, actualmente, a Biologia e a Biotecnologia
exercem sobre a vida das pessoas, visando-se, por isso, tanto o conhecimento de exemplos de produtos e
serviços, como a reflexão sobre aspectos de natureza social, económica e ética que contextualizaram a
sua génese e/ou influenciaram”.(2)
Assim, tendo em conta as orientações dadas pelo Ministério da Educação acima referidas, pretende-
se com a implementação deste kit que os alunos atinjam os seguintes objectivos:
estudar a transmissão de determinada característica hereditária, através de técnicas de
Engenharia Genética;
analisar e interpretar casos de mutação, sua génese e consequências;
explorar procedimentos laboratoriais de manipulação do DNA;
compreender a importância e modo de funcionamento das enzimas de restrição;
manipular o material de laboratório de forma autónoma e responsável;
despertar a curiosidade relativa à metodologia desta investigação;
compreender a utilidade de algumas técnicas utilizadas em Engenharia Genética no
quotidiano dos cidadãos;
usar o pensamento crítico para resolver problemas;
discutir algumas questões éticas inerentes à manipulação do DNA.

Este kit foi concebido para alunos do Ensino Secundário do Curso de Ciências e Tecnologias do
12ºano, no âmbito da disciplina de Biologia. No entanto poderá igualmente ser implementando na
disciplina de Área de Projecto, Roteiros/Feiras da Ciência, Clubes de Ciência ou oficinas da Universidade
Júnior, na área da Genética.

3
Kit BioExperimentando

Etapas de implementação Vantagens da utilização Ajuda a ensinar

Introdução aos perfis de Uso de enzimas de restrição reais e Estrutura do DNA


DNA realização de electroforese com Hereditariedade clássica
Restrição das amostras fragmentos de DNA real. Mendeliana (autossómica ou
de DNA A actividade pode ser realizada em três ligada ao sexo)
Electroforese em gel de sessões de 90 minutos (no entanto o Análise de restrição do DNA
agarose professor poderá reajustar o tempo). Preparar um gel de agarose para
Análise e interpretação Material suficiente para 23 alunos. electroforese
de resultados Determinar o tamanho molecular.
Simulação de perfis de DNA
Análise de mapas de restrição
Questões éticas inerentes aos
testes genéticos.

Tabela 1 – Potencialidades pedagógicas do kit BioExperimentando

Estratégia de ensino
O kit “BioExperimentando” é uma actividade prática, de laboratório, que se baseia numa
simulação de uma triagem genética numa família que possui uma doença hereditária fictícia. Nesta
actividade pretende-se que se integre a compreensão de processos genéticos, com as técnicas associadas,
e as respectivas questões éticas.
A escolha de uma doença fictícia para esta análise, deve-se essencialmente ao facto de não se
usar DNA humano na actividade. Assim, embora se possa fazer paralelismo entre a doença fictícia
apresentada e doenças hereditárias reais que apresentem o mesmo padrão de transmissão, evitam-se
constrangimentos de ordem ética, quer referentes à manipulação de DNA humano, quer relativos a testes
genéticos e seus resultados.

Os alunos terão que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente,
através da análise das amostras de DNA, após restrição e separação electroforética.

Medidas de segurança
Não é permitido comer, beber, fumar no laboratório ou área de trabalho.
É recomendado a utilização de luvas e de uma bata de algodão.
Os alunos devem lavar as mãos com água e sabão antes e depois da actividade.
Se alguma solução entrar em contacto com os olhos dos alunos devem ser imediatamente
lavados com água.

Condições de armazenamento
Este kit deve ser guardado à temperatura ambiente, com excepção das amostras de DNA. Após a
chegada do kit, abra-o, retire o saco dos reagentes que inclui as amostras de DNA e guarde-o
imediatamente no congelador a -20ºC.

4
Parte I – Enquadramento teórico da actividade

A análise de DNA humano tem aplicações em duas grandes áreas:


1. Cuidados de saúde – inclui o diagnóstico de doenças hereditárias, mutações cromossómicas e cancro.
2. Sistema judicial – identificação de suspeitos em casos criminais (homicídio, rapto, roubo…) e análise
de relações familiares em casos de disputa da paternidade e de imigração.

Na presente actividade simula-se o diagnóstico de uma doença fictícia, que afecta vários
membros de uma família. São vários os conceitos técnicos e técnicos inerentes à implementação e
compreensão da actividade:

Enzimas de restrição
As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta ácidos nucleicos) são enzimas que
reconhecem sequências específicas de bases no DNA e são capazes de hidrolisar as cadeias de DNA.
Para além da sua função protectora na célula bacteriana, as enzimas de restrição têm também
extrema importância em investigação científica, nomeadamente nos processos de clonagem de genes,
execução de mapas de restrição ou na determinação do tamanho de moléculas de DNA.
Uma enzima de restrição liga-se a uma molécula de DNA e desliza ao longo da hélice até reconhecer
sequências especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta
então quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrição. Se um local de restrição específico
ocorrer em mais do que um local numa molécula de DNA, a enzima de restrição irá cortar em cada um
desses locais, resultando múltiplos fragmentos. Do mesmo modo, se uma sequência linear de DNA é
cortada com uma enzima de restrição cujo local específico de reconhecimento é encontrado em dois locais
diferentes na molécula de DNA, o resultado irá ser de 3 fragmentos de diferentes tamanhos. Se o
fragmento de DNA é circular e é cortado com uma enzima de restrição cujo local específico de
reconhecimento é encontrado em dois locais diferentes na molécula de DNA, o resultado vai ser 2
fragmentos de diferentes tamanhos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localização dos locais
de restrição na molécula de DNA.
Quando as enzimas de restrição são usadas para cortar cadeias de plasmídios circulares de DNA, tal
como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos são produzidos. O DNA que se cortou pode
ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose. Os fragmentos
resultantes podem depois ser usados para criar um mapa do plasmídio.
As enzimas têm uma designação que deriva do nome científico da espécie bacteriana de onde é
extraída, como é o caso da enzima EcoRI, a primeira (I) a ser isolada da estirpe R da bactéria Escherichia
coli.

O gel de agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa solução tampão e
deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose é um políssacarídeo derivado do agar, com
estrutura tridimensional, altamente purificado e livre de cargas (não influencia deste modo a migração das
moléculas) e impurezas (não provoca impedimento da migração das moléculas).

5
A agarose deve ser previamente pesada para a concentração pretendida do gel e deve ser
dissolvida na solução tampão com a ajuda de uma fonte de calor (em banho – maria ou no microondas).
Assim que a solução levantar fervura deve ser retirada da fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha
do gel pode ficar laxa, o que poderá trazer implicações na electroforese e nos resultados que deveremos
obter.
A solução deve ser vertida num molde apropriado quando atinge uma temperatura de cerca de
50ºC (ou seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mão sem nos queimarmos).
Antes de vertermos a solução de agarose no molde, devemos colocar um pente junto da extremidade
orientada para o pólo negativo da tina de electroforese (uma vez que o DNA irá migrar para o pólo
positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poços.
Após solidificação do gel, vertemos tampão de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente
retiramos o pente, tendo o cuidado de não danificar os poços (nunca retirar o pente sem o gel estar
submerso em tampão de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampão de
electroforese sobre os poços para eliminar eventuais resíduos de agarose que não tenha sido
polimerizada.
Dependendo da tina de electroforese que se utilizar, poderá ser necessário colocar fita isoladora
no recipiente onde se vai colocar a solução de agarose, no sentido de limitar a respectiva área de
solidificação da solução de agarose. Noutras tinas, não é necessário o uso de fita isoladora, uma vez que
existem uns adaptadores de borracha que se colocam nas extremidades do recipiente do gel (figura1). Em
qualquer um dos casos, chama-se a atenção para o facto de ser necessário retirar quer a fita isoladora
quer os adaptadores de borracha das extremidades do recipiente molde antes de submeter as amostras
de DNA a electroforese. Caso contrário, a corrente eléctrica não atravessará de forma eficaz o gel de
agarose.

Figura 1 – Gel de agarose

Electroforese
A electroforese consiste em fazer migrar biomoléculas por uma matriz, sob a influência de um
campo eléctrico, permitindo separá-las segundo os seus tamanhos. Podem realizar-se electroforeses de
proteínas, de RNA e de DNA. A electroforese em gel de agarose é um procedimento utilizado em várias
áreas da biotecnologia, em laboratórios de investigação, medicina e de biologia forense. Esta técnica
permite analisar fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.
O DNA antes de ser carregado nos poços tem que ser tratado com tampão de amostra que tem
várias funções: dá cor à amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose
ou glicerol) e mantém o pH alcalino. Os fragmentos de DNA são então descarregados em poços, no gel de
agarose, que é colocado numa tina cheia de tampão de electroforese (TAE ou TBE). O tampão de

6
electroforese fornece condutibilidade eléctrica e mantém o pH que é necessário para a manutenção da
carga e estabilidade das moléculas. O carregamento dos poços é um procedimento que deve ser feito com
muito cuidado para não danificar os poços do gel. Quando procedemos ao carregamento, devemos
adoptar a posição que melhor permita uma total estabilização da mão que segura a pipeta e que vai
carregar as amostras de DNA nos poços (figura 2). Assim pode-se adoptar uma posição em que com os
cotovelos bem pousados na bancada onde está a tina, se segure bem o punho da mão que vai pipetar
com a outra mão, para evitar tremer durante a pipetagem no gel, ou então adoptar uma posição em que
não se apoiem os cotovelos, mas se consiga estabilizar a mão que vai proceder à pipetagem nos poços
com a ajuda da outra mão, pois um simples toque nos limites do poço a carregar pode danificá-lo e
interferir nos resultados a obter pela electroforese (o poço pode furar e a amostra ser perdida). O
conteúdo deve ser expelido da pipeta devagar e continuamente, carregando no êmbolo da pipeta até ao
primeiro ponto de resistência. Quando é sentida esta primeira resistência, deve-se aguardar uns breves
segundos antes de retirar, lentamente, a ponta da pipeta do poço.
Após o carregamento dos poços, ligam-se os eléctrodos à fonte de alimentação, determinando
previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).
A corrente eléctrica é passada entre os eléctrodos que estão nos terminais da tina de
electroforese. Desde que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vão avançar
para o pólo positivo (cátodo) quando estiverem sujeitos a um campo eléctrico. No decorrer da
electroforese, verifica-se junto à extremidade que contém o eléctrodo negativo a libertação de H2. Na
extremidade que contém o pólo positivo observa-se a libertação de O2. Se não estiver a ocorrer a
electroforese não há formação deste gases, pelo que a observação da libertação destes gases sob a forma
de “bolhinhas” é um bom indicador da ocorrência ou não deste processo.
A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular através da qual cada fragmento
pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razão entre o que
cada fragmento de DNA migra através do gel é inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de
bases. Após um determinado período de tempo, os fragmentos menores de DNA vão viajar até mais longe
do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa única banda de DNA.
Estas bandas irão ser vistas posteriormente no gel após o DNA ser corado.

Figura 2 – Carregamento dos poços Figura 3 – A electroforese

7
Visualização do DNA
O DNA é incolor, por isso os fragmentos no gel não podem ser vistos durante a electroforese. Um
tampão de amostra contendo dois corantes azuis é adicionado às amostras de DNA. O tampão de amostra
não cora o DNA, mas torna o processo de carregamento dos poços com o DNA mais fácil, assim como
permite uma monitorização do progresso do DNA durante a electroforese. As frentes do corante migram
em direcção à extremidade positiva do gel, como os fragmentos de DNA. Corando as bandas de DNA é
possível a sua localização no gel.
O corante mais comum para a visualização das bandas de DNA é o brometo de etídio, cuja
visualização só é possível recorrendo a uma transiluminador de raios UV. Contudo este corante não é
usado em trabalhos com alunos uma vez que apresenta propriedades mutagénicas. Em alternativa a este
corante utiliza-se habitualmente um outro corante – o Azure A - 100% inócuo, e com um grau de eficácia
muito elevado, já que permite uma boa visualização do DNA, num espaço de tempo reduzido (figura 4).
Quando o gel é imerso no corante Azure A, as moléculas do corante atacam o
DNA que se encontram na malha do gel de agarose. Quando as bandas ficam
visíveis, é possível comparar os padrões de restrição do DNA em diferentes
amostras de DNA.
Existe no mercado uma nova geração de corantes de qualidade que permitem
obter uma boa visualização das bandas de DNA: Carolina BLU DNA Stain, Fast
Blast DNA Stain, GelRed e GelGreen DNA Stain. As características de
diferentes corantes de DNA, bem como as respectivas vantagens e
desvantagens da sua utilização, encontram-se definidas na tabela 2.

Figura 4 – Corante para o visualização do


DNA - Azure A

Corantes de DNA
Características Vantagens Desvantagens
Muito usado para Grande Tóxico e altamente mutagénico.
visualização do DNA. sensibilidade a
Não deve ser lançado directamente
Corante de fluorescência. baixas
para a rede de saneamento.
Brometo de Etídio concentrações.
(http://www.merck-
chemicals.com/brazil/brometo-de-
etidio/MDA_CHEM-
111615/p_xw.b.s1LJBYAAAEW4eAfVhTl)
Inflamável. Não tóxico A descoloração do gel é um pouco lenta
Adicionado ao gel após nem (tem que se lavar o gel várias vezes com
separação electroforética. carcinogénico. água).
O gel fica todo corado e Pode ser (http://www.ncbe.rdg.ac.uk/NCBE/
para vermos as bandas de eliminado sem PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA14.pdf)
DNA temos que descolorar o prejuízo para o
Azure A
gel. ambiente.
O DNA aparece formando O gel corado
bandas azuis. pode ser
guardado
indefinidamente.

Seguro. Tempo de Pouca sensibilidade.


Sistema de coloração em coloração curto
Carolina BLU DNA Stain (http://www.carolina.com/product/
duas etapas. (15 minutos)
carolinablu+dna+stain.do)

Fast Blast DNA Stain Seguro e de fácil utilização. Não tóxico. Quando utilizado 1x concentrado é
Cora o DNA de azul. Económico. necessário uma noite para visualização das

8
Apresenta-se numa Pode ser bandas.
concentração de 500x. utilizado para
Pode ser utilizado num uma rápida (http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
concentração de 100x ou coloração Bulletin_4110153A.pdf)
numa concentração de 1x. (concentração de
Pode ser utilizado para 100x).
coloração do núcleo. Permite obter
50L de solução 1x
concentrada.
Corante de fluorescência, Não é
sensível. mutagénico nem O tempo de vida do GelRed 3x solução
Solução estável à tóxico para o em água, é de cerca de 6 meses, quando
temperatura ambiente. Homem, nem armazenado devidamente.
Deve evitar-se a exposição para o meio A utilização do GelRed aquando da
do corante à luz. ambiente. preparação do gel pode comprometer a
Permite substituir a Mais sensível resolução das bandas de DNA ou retardar a
GelRed Nucleic Acid Gel coloração com brometo de que o brometo de migração das mesmas.
etídio. etídio. A coloração do DNA demora cerca de
Stain
A coloração das bandas Não é 30 minutos.
pode ser feita terminada a necessário É necessário um transiluminador UV.
electroforese, diluindo a descolorar o gel. O custo por embalagem de 4L é de
solução concentrada em água $168.
e incubando o gel na solução.
A coloração pode ser feita (http://www.biotium.com)
também aquando da
preparação do gel.
Corante de fluorescência, Não é O tempo de vida da solução GelGreen
sensível. mutagénico nem 10000x em água, é de cerca de 6 meses,
Solução estável à tóxico para o quando armazenado devidamente.
temperatura ambiente. Homem, nem A utilização do GelGreen aquando da
Deve evitar-se a exposição para o meio preparação do gel pode comprometer a
do corante à luz. ambiente. resolução das bandas de DNA ou retardar a
Permite substituir a Mais sensível migração das mesmas.
coloração com SYBR ou que o SYBR ou A coloração do DNA demora cerca de
GelStar. GelStar. 30 minutos.
GelGreen Nucleic Acid
A coloração das bandas Não é É necessário um scanner a laser com
Gel Stain pode ser feita terminada a necessário leitor de comprimento de onda na ordem
electroforese, diluindo a descolorar o gel. dos 488nm, ou um “Dark Reader” que
solução concentrada em água utiliza uma luz azul visível para excitação.
e incubando o gel na solução. O custo por embalagem de 0,5mL é de
A coloração pode ser feita $100.
também aquando da
preparação do gel.

(http://www.biotium.com)

Tabela 2 – Propriedades de diferentes corantes de DNA

Dada a relação qualidade/preço/segurança, o corante seleccionado para esta actividade é o Azure


A. No caso da escola possuir transiluminador UV sugere-se a utilização do corante GelRed. No caso da
escola possuir uma fonte de luz azul, pode optar-se pela utilização do GelGreen.

* O corante GelRed e Gel Green pode ser adquirido através do site www.biotium.com

Perfis de DNA
Cada indivíduo apresenta diferenças e semelhanças nas sequências de DNA. Para mostrar que
um determinado fragmento de DNA contém uma sequência específica de nucleótidos, uma sonda
radioactiva complementar pode ser feita para reconhecer e ligar-se a essa sequência. As sondas
radioactivas permitem aos biólogos moleculares localizar, identificar, e comparar o DNA de diferentes

9
indivíduos. Devido à especificidade, a sonda radioactiva pode ser utilizada para demonstrar semelhanças
genotípicas entre indivíduos. Num perfil de DNA, a posição relativa das bandas radioactivas num gel é
determinado pelo tamanho dos fragmentos de DNA em cada banda. O tamanho dos fragmentos reflecte
variações no DNA dos indivíduos.
A evidência necessária para um perfil de DNA pode ser obtida a partir de qualquer material
biológico que contenha DNA: tecidos, fluidos (sangue, esperma), folículos capilares, etc. A análise de DNA
pode inclusive ser feita a partir de material desidratado, como manchas de sangue ou tecidos
mumificados. Se a amostra de DNA for demasiado pequena, pode ser amplificada utilizando a técnica de
PCR. O DNA é então tratado com enzimas de restrição que cortam o DNA em fragmentos de diferentes
tamanhos.

Digestão do DNA pelas enzimas de restrição


As enzimas de restrição são as “tesouras químicas” dos biólogos moleculares. A restrição
enzimática é uma das formas de se detectar um SNP (single nucleotide polymorphism – polimorfismo
nucleotídico simples). Para se proceder à restrição enzimática são utilizadas enzimas de restrição próprias
para a sequência de nucleotídeos que nos interessa.
As enzimas de restrição têm um melhor desempenho sob determinadas condições tamponantes e
de temperatura. O tampão de enzima, juntamente com as amostras de DNA também foi incluído neste kit,
de forma a que quando se misturarem as enzimas com as amostras de DNA, estejam criadas as condições
ideais para uma óptima funcionalidade. As enzimas e os tampões são normalmente adquiridos em firmas
que os comercializam, e são fornecidos em conjunto. Neste caso em concreto o tampão já se encontra
incluído no tubo que contem a enzima liofilizada, a enzima BamHI.

Reacção de Polimerização em Cadeia – PCR


Esta reacção foi descrita por Kary Mullis, em 1985. É uma reacção que permite a amplificação de
porções específicas de DNA que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam
conhecidas as suas extremidades. Em aproximadamente 2 horas podem-se obter milhões de cópias de
DNA, a partir de uma pequena quantidade de DNA. Numa reacção simples, o DNA molde é desnaturado
pelo calor (94ºC) para originar duas cadeias simples. São fornecidos em excesso dois oligonucleótidos
sintéticos, complementares às extremidades 3´das cadeias simples originadas. A temperatura é reduzida
para 50-60ºC, durante 1 minuto, para que os oligonucleótidos em excesso emparelhem por
complementaridade com as extremidades 3´do DNA molde. Os oligonucleótidos funcionam como
iniciadores (primers) de uma nova cadeia de DNA por parte de uma DNA polimerase (Taq DNA
polimerase), que incorpora desoxirribonucleótidos a 3´dos iniciadores por complementaridade com a
cadeia de DNA molde à temperatura de 72ºC. Quando a síntese da segunda cadeia termina, toda a
mistura é aquecida outra vez (94ºC) para desnaturar as novas moléculas de DNA, e deste modo reinicia-
se o ciclo anteriormente descrito. Cada ciclo completo de amplificação consiste pois na desnaturação da
dupla cadeia de DNA a uma temperatura próxima da ebulição de modo a obter cadeias simples de DNA,
ligação dos primers e replicação da cadeia modelo por extensão dos primers mediada pela polimerase
(figura 5). A PCR ocorre num termociclador que permite fazer variar de uma forma rigorosa o tempo e a
temperatura ao longo das três etapas em que se desenvolve um ciclo de amplificação.
A especificidade da PCR é dada pelos primers. Por isso, não é necessário isolar o DNA que se
pretende amplificar.

10
A visualização dos produtos amplificados é feita normalmente após electroforese, através de um
corante de DNA.

Figura 5 – PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia)


Fonte: Hughes (1995) – National academy of science

Testes genéticos
Um teste genético é o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar
alterações genéticas, e envolve a análise directa do DNA. Alguns testes genéticos incluem testes
bioquímicos para produtos de genes como enzimas e outras proteínas e exame microscópico de
cromossomas.
As finalidades dos testes genéticos podem ser o diagnóstico, o rastreio ou a monitorização. Os
testes genéticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doença genética, para determinar se um
indivíduo é portador de uma doença associada a uma mutação, para prever o desenvolvimento de uma
doença genética, para determinar a susceptibilidade de um indivíduo para uma determinada doença, ou
ainda para aplicações na ciência forense.
Os testes genéticos devem ter reproducibilidade, elevada especificidade e sensibilidade e valor
preditivo.
Um teste genético preditivo é o uso dos testes genéticos para prever se um determinado indivíduo irá
desenvolver uma doença genética. Pode apenas ser utilizado se for conhecida a relação mutação – doença
e esta for altamente penetrante. Um exemplo clássico da utilização deste tipo de teste genético é para
prever a doença de Huntington. O gene associado a esta doença foi descoberto em 1993. A doença é
associada com alterações numa parte específica da sequência, que facilmente são detectadas pela análise
do DNA. Como a doença de Huntington só se manifesta tardiamente, um indivíduo que tenha um dos pais
afectado pela doença, não irá saber se a doença foi ou não transmitida, até atingir a meia-idade. Contudo,
o teste de DNA em qualquer idade, até mesmo pré-natal, irá revelar se a mutação está ou não presente,
alterando o risco do indivíduo de 50% para 100% ou 0%.
Idealmente, a utilização de um teste genético de previsão deve ser utilizado conjuntamente com
um tratamento profiláctico, para os indivíduos cujo resultado tenha sido positivo. A doença de Huntington
é incurável e fatal, pelo que o aconselhamento cuidadoso é essencial para qualquer pessoa proveniente de
uma família afectada e que pense realizar um teste genético.
Actualmente são realizados centenas de testes genéticos e muitos outros estão em
desenvolvimento.

11
Parte II - Planificação da actividade

A planificação que se segue foi elaborada para enquadramento no programa de Biologia de


12ºano do Curso de Ciências e Tecnologias, e é apenas uma sugestão, podendo ser reajustados os
tempos de execução das diferentes actividades, com mais ou menos preparação prévia das actividades
laboratoriais feita pelo professor, ou pelo maior ou menor aprofundamento das questões levantadas. Cabe
ao professor, adaptar a planificação ao tempo disponível que possuir e à realidade de cada turma.

Aula Tema Estratégia Duração

Exploração do power-point nº1


sobre:
1 Introdução “Perfis de DNA” - Estrutura do DNA; 45 minutos
- Restrição das amostras de DNA;
- Electroforese.
Actividade laboratorial nº1:
Restrição das amostras de DNA.
2 Restrição das amostras de DNA 90 minutos
Actividade laboratorial nº2:
Preparação do gel de agarose.
Actividade laboratorial nº2 (cont.):
Electroforese em gel de agarose das Electroforese em gel de agarose
3 90 minutos
amostras de DNA das amostras de DNA.
Registo dos resultados
Exploração do power-point nº2
sobre:
- Análise dos resultados obtidos;
4 Análise e discussão dos resultados obtidos 45 minutos
- Discussão da questão problema;
- Questões éticas inerentes ao
trabalho desenvolvido

Tabela 3 – Planificação da actividade

Nota: Existe disponível no site : http://bioexperimentando.blogspot.com uma planificação mais detalhada,


que inclui estratégias, materiais, competências e tempo de execução.

12
Parte III – Problematização da actividade

Inicialmente, e antes da apresentação da questão-problema que vai servir de ponto de partida


para o desenvolver de toda a actividade, sugere-se que o professor explore um power-point de revisão de
alguns conteúdos leccionados em anos anteriores e de apresentação de alguns procedimentos que vão ser
executados aquando da actividade laboratorial, fundamentais para uma profunda e sólida compreensão de
todos os processos envolvidos nesta actividade. A apresentação em powerpoint (ver apêndice I) pode ser
obtido acedendo ao site http://bioexperimentando.blogspot.com.

O problema apresentado à turma é o seguinte:

Transmissão da doença “Raritose”

A família Antunes é afectada há quatro gerações sucessivas pela doença “Raritose”. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,
casou com o André, e pretendem ter um filho. Tendo o André conhecimento de que a família de Ana tem problemas com essa
doença, este sugere a Ana que façam um teste genético para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentes
ou portadores da doença. A árvore genealógica desta família encontra-se disponível na figura 6.

Questão- problema: Será possível pela análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?

Mulher

Homem
D. Maria Sr Joaquim
Sexo
Indefinido
Parte III – Procedimentos protocolares
Parte IV – Análise e discussão dos resultados
Legenda

José Rosa Paulo Elisabete Agostinho Manuel Helena Joana António

Rita Tiago Rui Josefina Serafim Diana Marta

Ana André
Carlos Pedro Vera

Filho A Filho B

Figura 6 – Árvore genealógica da família Antunes

13
Para simplificação de identificação, a cada membro da família será atribuído um número, como mostra a
figura 7.

1 2

Parte III – Procedimentos protocolares


Trabalho laboratorial:

3
- Material/Métodos
4 5 6 7 8 9 10 11
- Notas para o professor
- Informação adicional
Pipetagem
Electroforese
12 13 14 15 16 17 18

Mulher

20 21
19 22 23 Homem

Sexo
Indefinido

Legenda
Filho A Filho B

Figura 7 – Árvore genealógica da família Antunes numerada

Membros da família Antunes:

1 – D. Maria 9 – Helena 17 – Diana


2 – Sr. Joaquim 10 – Joana 18 – Marta
3 – José 11 – António 19 – Carlos
4 – Rosa 12 – Rita 20 – Ana
5 – Paulo 13 – Tiago 21 – André
6 – Elisabete 14 – Rui 22 – Pedro
7 – Agostinho 15 – Josefina 23 – Vera
8 – Manuel 16 - Serafim

No sentido de dar resposta à questão formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de


cada um dos membros da família Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contém parte do
gene responsável pela doença, amplificado previamente por PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia).
Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que está ser investigado. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo dominante (genótipo RR) terá apenas DNA do tipo R. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo responsável pela doença (genótipo rr) terá apenas DNA do tipo r. Por sua vez,

14
um indivíduo que seja heterozigótico (genótipo Rr), terá DNA dos dois tipos. A amplificação da região de
interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.
O objectivo é detectar que formas de DNA estão presentes em cada amostra, e para isso
sujeitam-se as amostras a restrição com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no
gel de electroforese.
A diferença na sequência de DNA dos alelos R e r é tal que, no alelo r existe uma sequência de bases que
pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrição BamHI. O alelo R não possui local de restrição
para a enzima BamHI e assim não vai ser cortada pela enzima.
Os resultados que podem ser observados no gel de agarose, após o tratamento das amostras
com a enzima de restrição e da electroforese são os seguintes:

Genótipo Número de bandas


RR 1
rr 2
Rr 3

Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos, é


sujeito a electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais
pequenos obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).

Nota para o professor 1

As amostras de DNA

Nesta actividade não foi utilizado DNA humano. Usaram-se três plasmídios de diferentes tamanhos para preparar as
amostras (A, B e C) que corresponderão respectivamente a uma, duas ou três bandas no gel.
Os plasmídios são fragmentos circulares de DNA, mas uma preparação de plasmídio pode conter o plasmídio em
diferentes estados: circular (uma cadeia está quebrada), linear (duas cadeias quebradas) e super-enrolado. As
diferentes formas irão correr no gel de agarose a diferentes velocidades, originando diferentes bandas para um único
plasmídio.
Durante esta simulação cada plasmídio é tratado com uma enzima de restrição. Os plasmídios seleccionados tem
apenas um local de restrição para a enzima, por isso a enzima irá apenas cortar o DNA circular para formar um
fragmento linear que originará uma única banda após electroforese (ver anexo I).

15
Parte IV – Procedimentos protocolares
Segue-se o trabalho de laboratório que implica o cumprimento de todas as regras de segurança
já mencionadas na introdução deste guião. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre
em atenção que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular
atenção às pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mãos ou entrar em contacto
com material não esterilizado, para que não haja contaminação do DNA.

1. Distribuição das amostras de DNA


a) No topo de cada um dos tubos que contêm enzima liofilizada, proceder à identificação dos mesmos
com os números de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).
b) Colocar 20 µL de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que
continha já enzima de restrição liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a
amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).
c) Proceder à mistura da solução de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no
fundo do tubo.

Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22

Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23

Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15

Figura 8 – Distribuição das diferentes amostras de DNA

2. Restrição enzimática
a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37ºC,
durante cerca de 40 minutos.

3. Preparação do gel de agarose


a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampão TAE (1x) (ver nota para o
professor 2).
b) Tapar o matraz com película aderente, e furar a película antes de o levar ao microondas (não
utilizar parafilme).
c) Proceder à sua dissolução no microondas durante 2 minutos (ter atenção para a solução não
levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicações na
electroforese).
d) Retirar o matraz do microondas com o auxílio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de
que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.
e) Deixar arrefecer até à temperatura aproximada de 60ºC.
f) Colocar o pente junto ao eléctrodo negativo da tina de electroforese.
g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a
criação de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.

16
h) Aguardar a polimerização da agarose durante cerca de 20 minutos.

Nota para o professor 2

Cálculos a realizar para a preparação do Gel:

o Agarose em tampão TAE (1x) (0,8% p/v) : 0,8 g de agarose para cada 100 mL de TAE (1x)

GEL: Vfinal= 50 mL (o volume final depende do tamanho da tina de electroforese)

0,8 g agarose ---------------------------- 100 mL TAE

X ----------------------------- 50 mL Vfinal

X= (0,8 X 50) / 100

X= 0,4 g agarose

Tampão TAE:

o Tampão de electroforese (tris-ácido acético – EDTA) – Tris é um tampão de pH e o EDTA é um agente quelante, isto é, capta catiões
bivalentes (neste caso Mg2+) necessários à actividade das DNAses evitando assim a destruição do nosso DNA alvo.

4. Carregamento do gel
a) Após a solidificação do gel de agarose, cobrir toda a
sua superfície com TAE (0,25x).
b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como
as placas laterais.
c) Adicionar 2 µL de tampão de amostra que contém azul de
bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.
d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampão de
amostra com a solução de DNA.
Figura 9 – Carregamento do gel de
e) Pipetar 5 µL do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar agarose

2µL de tampão de amostra.


f) Carregar 5 µL da solução anterior no primeiro poço do gel.
g) Pipetar 20 µL de cada amostra de DNA, pela ordem numérica dos tubos, e carregar nos poços do
gel (figura 9) (ver nota para o professor 3).

Nota para o professor 3

Carregamento dos poços

o Por convenção, no 1º poço carregamos o nosso marcador. O marcador de DNA serve para podermos comparar o tamanho dos diferentes
fragmentos de restrição, pois o marcador provém de um DNA já cortado, em que o tamanho dos seus fragmentos são conhecidos (em kb).
Nesta actividade utilizamos o marcador Lambda cortado com a enzima HindIII, comercializado pela Fermentas Life Science.
o Os poços carregam-se da esquerda para a direita.
o No carregamento dos poços do gel com as amostras de DNA, devemos ter o cuidado de estabilizar a pipeta antes de expelir o conteúdo.
Para isso podemos apoiar os cotovelos na bancada e segurar a pipeta com as duas mãos, ou segurar a pipeta com uma das mãos enquanto
a outra estabiliza a mão que segura a pipeta.
o Não se pode introduzir toda a ponta da pipeta no poço, uma vez que se poderá furar o poço e assim perder a amostra de DNA.
o Durante o carregamento das amostras de DNA nos poços, o êmbolo da pipeta deve ser pressionado continuamente, sem interrupções, até
ao primeiro ponto de resistência.
o Retirar a pipeta do poço com o êmbolo ainda pressionado (se se largar o êmbolo antes de retirar a pipeta, a amostra de DNA vai ser
aspirada do poço.

17
5. A electroforese
a) Verificar se os eléctrodos estão bem colocados
(ver nota para o professor 4).
b) Regular a voltagem para os 120 volts.
c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).
d) Interromper a electroforese quando o azul do tampão alcançar o
fim do gel.

Figura 10 - Electroforese

Nota para o professor 4

A electroforese

o Na tina de electroforese, os poços de gel de agarose devem ocupar a posição junto ao pólo negativo (eléctrodo preto), pois o DNA migra
do pólo negativo para o pólo positivo (eléctrodo vermelho).

o Quando a tina de electroforese é ligada à corrente podemos certificarmo-nos da passagem da corrente eléctrica se houver libertação de
bolhas no interior da tina, resultantes da hidrólise da água (há libertação de bolhas de oxigénio e de hidrogénio).

6. Coloração do DNA
a) Remover a solução tampão TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizações (tem que se ter
o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).
b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfície do gel (ver nota para o professor
5).
c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.
d) Retirar o corante da superfície do gel e guarda-lo para posterior reutilização, anotando no frasco o
nº de vezes que este já tinha sido utilizado.
e) Retirar o corante da superfície do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.
f) Eliminar o álcool e lavar o gel com água corrente, durante 3 ou 4 minutos, não deixando água no
gel, para que não seja removido do gel a totalidade do corante.
g) Aguardar até que as bandas se tornem visíveis.
h) Observar os resultados.
i) Registar o número de bandas na respectiva árvore genealógica.

Nota para o professor 5

Se a coloração for feita com GelRed, ou com GelGreen, a quantidade de DNA a pipetar é de 5 µL (passo1 do

procedimento experimental). Deve adicionar-se 5 µL de GelRed/GelGreen ao gel de 50mL antes de este polimerizar. Quando
tiver terminado a electroforese, deverá observar-se as bandas obtidas utilizando um transiluminador UV, ou um leitor com luz
azul, respectivamente.

18
Parte V – Análise e discussão dos resultados

Após a realização dos procedimentos laboratoriais os alunos são convidados a debaterem um


conjunto de questões. Posteriormente será explorado uma apresentação em power-point “Kit
BioExperimentando – Análise e discussão da actividade experimental” (apêndice II), de consolidação e
reflexão de toda a actividade desenvolvida. A apresentação em power-point pode ser obtido acedendo ao
site http://bioexperimentando.blogspot.com.

Questões e explorar:

1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poços devidamente


assinalados.

2. Na árvore genealógica fornecida, registe o número de bandas obtido em cada indivíduo (para
cada amostra de DNA poderá visualizar uma, duas ou três bandas).

3. Indique, justificando, qual o modo de transmissão da doença.

4. Identifique os indivíduos que são portadores da doença.

5. Refira os indivíduos que podem ter falecido devido à doença “Raritose”.

6. Indique o genótipo e o fenótipo dos indivíduos 1, 15 e 22.

7. Comente a seguinte afirmação: A probabilidade de o André e a Ana terem um filho doente é igual
à probabilidade de terem um filho portador. (Sugestão: Faça um xadrez mendeliano).

8. A Ana e o André optaram na realidade pela realização de um teste genético, antes de terem filhos,
para saberem se há a possibilidade de terem um filho doente. Alguns membros da família apoiam a
decisão tomada pelo casal, mas há outros membros que se opõem. Enumera dois argumentos que
possam ter sido referidos a favor da realização do teste genético e dois argumentos que possam ter
sido referidos contra.

9. Complete o “V de Gowin” relativo à actividade experimental desenvolvida.

10. Elabore uma resposta para a questão-problema formulada inicialmente “Será possível pela
análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?”

19
Parte VI – Actividades complementares

Actividade complementar 1 – Mapeamento de plasmídios

Plasmídios e enzimas de restrição


O mapeamento de plasmídios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a
indústria da biotecnologia. Esta técnica permite aos biólogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso
de experiências de clonagem assim como identificar facilmente plasmídios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
genómico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmídico para simular como os verdadeiros perfis de
DNA são analisados.
Após o corte dos plasmídios pelas enzimas de restrição, estes podem ser ligados a um fragmento
de DNA proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrição. O
plasmídio resultante que possui DNA híbrido pode ser incorporado em células bacterianas (transformação).
O plasmídio híbrido replica-se na bactéria da mesma forma que o plasmídio original, incluindo o fragmento
de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmídio híbrido contém uma cópia do DNA estranho
incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi “clonado” e o plasmídio de DNA que o transporta é
designado “vector”.
Os plasmídios podem ser descritos em termos de localização dos locais de restrição usando
simples procedimentos e lógica. O procedimento geral é digerir um plasmídio com duas enzimas de
restrição separadamente e com as duas em simultâneo (digestão dupla). Os tamanhos dos fragmentos de
DNA resultantes são determinados usando a lógica para determinar a localização relativa dos locais de
restrição.
Uma vez que os plasmídios são circulares, o número de fragmentos representam o número de
cortes ou locais de restrição.

Ler um mapa de um plasmídio


Um mapa de um plasmídio contém informações relativas ao tamanho do plasmídio, aos genes
presentes, à origem do local de replicação, e aos locais de restrição para as enzimas de restrição. Os
plasmídios utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmídio pUC 18, o plasmídio pCR2.1.TOPO, e
o plasmídio pCard (resulta da adição de um insert de 1500bp no plasmídio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a
enzima de restrição BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes
plasmídios (exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrição são marcados no mapa com um número
que indica o local de restrição. Uma vez que o plasmídio é circular, existe um local zero arbitrário. Todos
os locais de restrição são indicados com um número entre zero e o número total de pares de base do
plasmídio. O tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtracção (e nalguns casos
adição) entre pontos do plasmídio.

Plasmídios utilizados neste kit


O mapa de um plasmídio mostra as posições (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos
locais onde o plasmídio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrição. O nome do plasmídio e o
seu tamanho em pares de base de DNA é mostrado dentro do círculo, assim como a Origem de Replicação

20
(Ori). Dois dos plasmídios utilizados neste kit são plasmídios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 11 e
12).

Figura 11 – Plasmídio pUC 18


Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

Figura 12: Plasmídio pCR2.1


Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

21
Questões:
1. A partir do mapa do plasmídio pCR2.1 enumere as enzimas de restrição que podem cortar o plasmídio.

2. Qual dos plasmídios, pUC 18 ou pCR2.1, é o maior e qual é o seu tamanho?

3. Utilizando o plasmídio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrição para a enzima AvaII.
Quantos locais de restrição existem? Se a enzima AvaII for usada para restrição deste plasmídio, quantos
fragmentos iremos obter?

4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrição do plasmídio pUC18 com a enzima AvaII.
Confirme que a soma dos fragmentos obtidos é igual ao tamanho total do plasmídio.

Proposta de solução

1. As enzimas que podem cortar o plasmídio são: Hind III; Kpn I; Sac I; BamH I; Spe I; EcoR V; Not I;
Xho I; Nsi I; Xba I; Apa I; Dra III; AspEI; Rsr II; Neo I; MscI; Bgl II; BssH II.

2. O plasmídio maior é o pCRr2.1 que apresenta 3929bp.

3. Existem dois locais de restrição para a enzima AvaII. Iremos obter dois fragmentos.

4.

Tamanho do 1ºfragmento: 2059-1837=222bp

Tamanho do 2ºfragmento: 3900-222=3678bp

3678+222=3900bp

22
Actividade complementar 2 – Restrição e análise do gel, virtual, utilizando o software
pDRAW32

Para se realizar restrições virtuais em plasmídios, e visualizar o padrão de restrição obtido num gel
virtual, pode-se utilizar um software gratuito: o “pDRAW32 DNA analysis software”, AcaClone software.

1. Proceda à instalação do software “pDRAW32 DNA analysis”, acedendo ao site


http://www.acaclone.com/ e seguindo todas as instruções.

Figura 1: Instalação do programa “Pdraw32 DNA analysis software”

2. Abra o programa já instalado “pDRAW32 DNA analysis”. De seguida, clique em “File” (ficheiro),
New (novo) e “Enter new sequence” (introduzir nova sequência).

Figura 2: Menus de abertura do programa pDRAW32

23
3. Acedendo ao site https://www.lablife.org/ escolha a sequência do plasmídio que pretende
analisar (sugere-se que escolha a sequência do plasmídio pCR2.1). De seguida cole a sequência
seleccionada no local indicado no programa pDRAW.

Figura 3: Selecção da sequência de nucleotídios do plasmídio pCR2.1

4. Clique em “Edit” (editar), e seleccione a opção “Edit Sequence”.

Figura 4: Sequência do plasmídio pCR2.1 linearizada, mostrando também os locais de restrição de dezenas de enzimas
de restrição. Está indicado também o comprimento da sequência do DNA.

24
5. Clique em “Edit”, seleccione “DNA name, properties and annotations”, e registe os dados como se
indica no exemplo abaixo:

Figura 5: Designação do nome correcto do plasmídio (pCR2.1), e indicação da forma que se pretende visualizar o DNA
(forma circular)

6. Clique em “Preview, e aparecerá no ecrã o plasmídio pretendido – pCR2.1, com todos os locais de
restrição enzimática.

Figura 6: Mapa do plasmídio pCR2.1, circular, com locais de restrição das respectivas enzimas

25
7. Clique em “Settings” (opções), e seleccione “Enzime selection” (selecção das enzimas).

Figura 7: Menu de opção para selecção das enzimas

8. Introduza a informação que deseja relativamente às enzimas que pretende utilizar para a
restrição do plasmídio.

Figura 8: Selecção das enzimas e das características pretendidas

Nota: no exemplo apresentado foram seleccionadas algumas características, podendo no entanto


serem seleccionadas outras.

26
9. Após ter clicado em “Apply”, vai aparecer no ecrã o plasmídio pCR2.1 apenas com os locais de
restrição para as enzimas que apresentam as características anteriormente definidas.

Figura 9: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas anteriormente definidas

10. Uma vez que aparecem ainda muitos locais de restrição para as enzimas anteriormente
seleccionadas, a melhor opção será seleccionar as enzimas que só cortam duas vezes o
plasmídio.

Figura 10: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas que cortam apenas duas vezes

27
11. Obtido o mapa virtual do plasmídio pCR2.1. com os respectivos locais de restrição para enzimas que
só cortam duas vezes, pode-se agora realizar a restrição virtual e respectiva electroforese em gel virtual.
Clique em “View – agarose gel electrophoresis”.

Figura 11: Mapa de restrição do plasmídio pCR2.1, em gel virtual

Discussão:

Que conclusões se podem retirar, após observação do padrão de restrição do plasmídio pCR2.1,
com enzimas que apenas cortam duas vezes?

28
Parte VII - Glossário

Glossário

Ácido desoxirribonucleico – vulgarmente conhecido por DNA, é um polímero orgânico complexo formado por duas
cadeias de nucleótidos emparelhadas entre si, com uma disposição antiparalela. Cada nucleótido que constitui o DNA é
composto por um açúcar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,
guanina e citosina).

Ácido ribonucleico – vulgarmente conhecido por RNA, é um polímero orgânico formado por uma cadeia simples de
nucleótidos. Cada nucleótido que constitui o RNA é composto por um açúcar, a ribose, um grupo fosfato e uma das
quatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).

Adenina – base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Agarose – polímero constituído por unidades de galactose. Após dissolução em água a ferver, seguido de
arrefecimento, toma uma consistência gelatinosa.

Alelos – formas diferentes de um determinado gene.

Base Azotada – moléculas que entram na constituição dos ácidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro bases
azotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina são bases complementares, emparelhando entre
si. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.
No RNA encontram-se também quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As bases
emparelham do mesmo modo que no DNA à excepção da adenina que vai emparelhar com o uracilo.

Cariótipo – conjunto dos cromossomas presentes nas células de cada ser vivo.

Centrómero – parte central dos cromossomas. O centrómero é importante no processo de mitose e de meiose para a
separação dos cromossomas.

Citosina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Co-dominância – situação em que há expressão individual dos dois alelos de um locus, num heterozigótico.

Cromatídio – componente de um cromossoma contendo uma molécula de DNA.

Cromatina – denso material do núcleo constituído principalmente por DNA e proteínas.

Cromossoma – estrutura filamentosa constituída por DNA associado a proteínas estruturais (histónicas e não
histónicas). Os cromossomas encontram-se no núcleo das células eucarióticas.

Cromossoma homólogo – cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idênticos, que apresenta os
mesmos loci genéticos. Cada cromossoma de um desses pares é homólogo do outro e emparelha com ele durante a
meiose.

DNA – ver ácido desoxirribonucleico.

DNA fingerprinting – técnica de separação de segmentos de DNA que permite a identificação genética dos
indivíduos.

DNA polimerase – enzima presente nas células procarióticas e eucarióticas, responsável pela polimerização das novas
cadeias de DNA.

Dominante – refere-se a um carácter que se exprime quando há heterozigotia para o gene que o determina. A
expressão ocorre na presença de uma cópia normal do alelo.

Enzimas de restrição - enzimas responsáveis por cortar o DNA. Estas enzimas são produzidas por bactérias e
recebem o nome da espécie da bactéria de onde foram extraídas. Enzimas de restrição diferentes reconhecem e cortam
DNA em diferentes sequências de bases.

Electroforese – é uma técnica que permite a separação de moléculas (DNA, proteínas…) de acordo com o tamanho,
carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente eléctrica. As moléculas vão movimentar-se no meio de
suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as características que
apresentam (tamanho, carga e forma).

Engenharia genética – manipulação do material genético.

Feniltiocarbamida – a feniltiocarbamida (PTC) é uma proteína, descoberta na década 30,

29
Fenótipo – características observáveis num organismo. O fenótipo resulta da combinação de factores genéticos e
ambientais.

Gene – é a unidade básica da hereditariedade. Corresponde a uma sequência nucleotídica de DNA que codifica uma
determinada sequência polipeptídica, responsável por determinada característica ou função no organismo. Cada gene
encontra-se num local específico de um cromossoma (locus) e pode apresentar várias variantes (alelos) que
determinam uma forma particular dessa característica (exemplo: a característica “cor dos olhos” pode ter vários alelos:
alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).

Genética – ciência que estuda os genes e a hereditariedade.

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Genótipo – constituição génica de um indivíduo no que diz respeito aos alelos de um locus.

Guanina - base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA

Hereditariedade – mecanismo através do qual as características genéticas passam dos progenitores para os
descendentes.

Heterozigótico – um indivíduo diz-se heterozigótico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.

Histona – proteínas básicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Têm baixo peso molecular, e são ricas nos
aminoácidos lisina ou arginina.

Homozigótico – um indivíduo diz-se homozigótico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.

Locus – localização de um gene num cromossoma.

Primer – pequena sequência específica de oligonucleótidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o início da síntese da
cadeia complementar pela DNA polimerase.

Reacção de polimerização em cadeia (PCR) - reacção que permite a amplificação de porções específicas de DNA
que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.

Recessivo – gene ou carácter que só se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presença de um único alelo no
genoma).

RNA – ver ácido ribonucleico.

SNP (Single nucleotide polymorphism) – variação numa sequência de DNA que envolve uma alteração num único
nucleótido.

Southern blot – método descrito por E.Southern em que fragmentos de restrição são separados num gel de
electroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana é posteriormente
tratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequência de bases conhecida, e complementar ao DNA
contido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA é
marcada radioactivamente para permitir a sua detecção.

Taq polimerase – é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da
técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus. A Taq
polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).

Teste genético – teste que permite detectar a presença, ausência ou alteração, num gene particular, cromossoma ou
num produto genético.

Timina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA (ausente no RNA).

Uracilo – base azotada pirimídica encontrada nos nucleótidos do RNA.

30
Apêndices

Apêndice I

Power-Point nº 1 – “Kit BioExperimentando - Preparando a actividade experimental”

Este documento é uma sugestão de exploração do power-point ”Preparando a actividade


experimental”, a utilizar antes da realização da actividade laboratorial.
O objectivo deste power-point é servir como introdução teórica à actividade, recordando termos e
conceitos já abordados nas aulas de Ciências Naturais do 9ºano, de Biologia-Geologia do 10º e 11º ano e
nas aulas de Biologia do 12ºano. Para além disso, o power-point permitirá fazer uma breve abordagem ao
trabalho laboratorial, fazendo referência às técnicas a utilizar. Por último será levantada a questão-
problema, para a qual os alunos deverão encontrar resposta com a execução da actividade laboratorial.

31
32
33
Apêndice II

Power-Point nº 2 – “kit BioExperimentando – Análise e discussão da actividade experimental”

34
35
36
37
Neste momento, o professor poderá levantar outras questões éticas relacionadas com a realização de testes
genéticos:
Dilemas relacionados com o sigilo médico.
Permanecer na ignorância vs atitude responsável.
Dilemas relacionados com as seguradoras.
Confidencialidade por medo de discriminação.

38
Anexo I
Plamídios utilizados
1) pUC 18

Plasmídio pUC 18
Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

2) pCR 2.1

Plasmídio pCR2.1
Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

39
Referências Bibliográficas

(1) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da Educação


Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

(2) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular


http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Para mais informações consultar:

Bailey J (1995) A Genética – A Nova Enciclopédia das Ciências, Círculo de Leitores.

Regateiro F (2003) Manual de Genética Médica - Imprensa da Universidade de Coimbra.

Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory.

Videira A (2001) Engenharia Genética – Princípios e Aplicações, Lidel.

Corantes
Biotium Plasmídios
www.biotium.com Invitrogen
www.invitrogen.com
Carolina
http://www.carolina.com Source BioScience ImaGenes
http://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml
BioRad
http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
LabLife
https://www.lablife.org/
Biotecnologia – conceitos e técnicas
The European Initiative for Biotechnology Education
http://www.eibe.info/

Learn.Genetics - Science Learning Center


http://learn.genetics.utah.edu/

Roy J. Carver Biotechnology Center


http://www.biotech.uiuc.edu/

Orientações curriculares do Ministério da Educação


Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular
http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da Educação


Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

Kits comerciais
Nature`s dice – Teacher`s guide
http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf

Bio-Rad Laboratories
http://www3.bio-rad.com

Testes genéticos
Understanding Gene Testing
http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php

Software:
pDraw32 DNA Analysis
http://www.acaclone.com/

40