nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. estudos de mobilidade bacteriana (ex. ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. Apresentam no entanto. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. Os meios sintéticos. normalmente o agar.nstituto Superior de Ciências da Saúde. São ainda utilizados para a conservação de culturas. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. auxiliando a sua posterior identificação. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal. não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. Ao contrário dos meios líquidos. de modo a 29 . Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. como os caldos nutritivos de crescimento.

no caso de uma população plurimicrobiana. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. Torna-se útil. compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. triptona sal. gelose nutritiva). uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. Gelose de McConkey . Meios diferenciais . e os meios complexos. Meios selectivos e diferenciais . São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública.nstituto Superior de Ciências da Saúde. vegetal ou microbiana como por exemplo.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. e extracto de levedura. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. Não existe um meio de cultura universal (ex.São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. Drigalsky ou Endo. Meios selectivos . caldo nutritivo. meio de citrato de Simmons).Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. Por exemplo. água peptonada. no caso da gelose sangue. extracto de carne.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. peptonas. de origem animal. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey.É um meio selectivo.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. permitindo o crescimento. apenas das bactérias Gram negativas. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose.

igualmente. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular. diferencial (por ex. b. e este permanece da cor original.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. Meios enriquecidos . originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. Gelose de Drigalsky . Meio de Chapman . lactose. Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. “brain heart infusion” (BHI). se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. colónias incolores (ex. cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). Exemplos: gelose sangue. c. epidermidis). e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo.É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha.(não fermentadoras de lactose).É um meio muito semelhante ao anterior e contém. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio). não acidificam o meio.nstituto Superior de Ciências da Saúde. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro.Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol.É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. S. ovo ou sangue. indicador de pH (azul de bromotimol). o grupo heme é fundamental 31 . é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. gelose chocolate. responsável pelo nome atribuído. proteínas. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar .a manose) é também. As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). Gelose Chocolate .) para Staphylococcus aureus.

• Meios de enriquecimento São meios líquidos.meio sem fonte de carbono adicionada. podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. no caso dos meios sintéticos. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex.Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. dos vários compostos químicos.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae. anos ou décadas. 3. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos .nstituto Superior de Ciências da Saúde. 32 . agentes causadores de intoxicações alimentares). por conseguinte. b) Adição de água destilada. meio de Stuart).permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e.3 . que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras. ex. agente importante de meningites bacterianas em crianças). É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio Clark-Lubs . • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos.1.

a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. simplesmente. d) Esterilização (geralmente em autoclave). aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou.4 . no caso dos meios sintéticos.1). com que se inunda a superfície do meio sólido a usar.1. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. 1.45º C. 3.nstituto Superior de Ciências da Saúde. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas. com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente. 33 .Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias. Figura 3.Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições). f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 . e realiza-se à superfície de meio sólido. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam. neste caso. ou ainda por intermédio de uma zaragatoa. com uma ansa de Henle. e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração.

5 < d < 3 mm • colónias grandes .7 .Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri.Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura.6 .1.1.2) a) Tamanho • colónias pequenas .1.7). isto é.nstituto Superior de Ciências da Saúde. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias . 37ºC/24h.Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio. 3. a presença de odor característico e o aspecto da cultura. ou pipeta de Pasteur fechada.5 . os meios de cultura devem ser incubados.1. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos). a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3. presença de pigmentos solúveis. e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. em condições adequadas de temperatura. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle.1. 3. num meio gelosado em tubo.d > 3 mm b) Forma geral 34 . colocados em estufas próprias para o efeito. 3. 3. e nomeadamente em meio sólido.

Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa. baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.

Representação esquemática da forma. 36 . 2.pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3. Exemplos: Serratia marcescens .nstituto Superior de Ciências da Saúde. elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.colónias verdes azuladas (pigmentos .

dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. usando a ansa de Henle.3 – Resultados e discussão 3.2 . utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. 37 . 4) Na gelose chocolate. inocular Staphylococcus spp. 2) No meio de Drigalsky.nstituto Superior de Ciências da Saúde. e E. coli por estrias. coli por estrias. Proteus spp. tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas.2 . utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.3.3.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA). e realizar para cada uma a coloração de Gram.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade. 3. com a ansa de Henle. 3) No meio de Chapman. e E. e Staphylococcus spp. coli.1 . inocular por espalhamento E. e Proteus spp por picada central. coli. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. usando a ansa de Henle. 3. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose.Sul Manual Prático de Microbiologia 3. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. dividir a placa em três partes e inocular por estrias. fazer esfregaços.

Sul Manual Prático de Microbiologia 3.3 .Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas. 3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.5 .4 .3.3. 3.nstituto Superior de Ciências da Saúde.Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).3. 38 .

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