nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Apresentam no entanto. São ainda utilizados para a conservação de culturas. Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). normalmente o agar. os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. Os meios sintéticos.nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias. Ao contrário dos meios líquidos. estudos de mobilidade bacteriana (ex. auxiliando a sua posterior identificação. de modo a 29 . incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. como os caldos nutritivos de crescimento. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias.

como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. extracto de carne.É um meio selectivo. Torna-se útil. meio de citrato de Simmons). compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. Não existe um meio de cultura universal (ex. gelose nutritiva). Gelose de McConkey . Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. no caso de uma população plurimicrobiana. Por exemplo. vegetal ou microbiana como por exemplo. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. caldo nutritivo.nstituto Superior de Ciências da Saúde. apenas das bactérias Gram negativas. Meios selectivos .Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose. uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. e extracto de levedura. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . Temos como exemplos deste tipo de meio: a. Meios selectivos e diferenciais .São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. água peptonada. no caso da gelose sangue.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. Meios diferenciais . dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. de origem animal. permitindo o crescimento. e os meios complexos. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública. triptona sal. Drigalsky ou Endo. peptonas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam.

nstituto Superior de Ciências da Saúde. responsável pelo nome atribuído. indicador de pH (azul de bromotimol). “brain heart infusion” (BHI). as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio).) para Staphylococcus aureus. proteínas. Exemplos: gelose sangue.É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha.Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. o grupo heme é fundamental 31 . e este permanece da cor original. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular. não acidificam o meio. epidermidis). e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo. lactose.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo.É um meio muito semelhante ao anterior e contém. Meios enriquecidos . gelose chocolate. igualmente. S. cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. Gelose Chocolate .a manose) é também. Gelose de Drigalsky .(não fermentadoras de lactose). uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar . cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. ovo ou sangue. As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). Meio de Chapman . colónias incolores (ex. é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . c. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. diferencial (por ex.É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. b.

ex. agente importante de meningites bacterianas em crianças).3 . • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e. por conseguinte. b) Adição de água destilada. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos .1. 3. que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae.meio sem fonte de carbono adicionada. meio de Stuart). podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses.Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. 32 . É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex.permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). dos vários compostos químicos. no caso dos meios sintéticos. anos ou décadas. meio Clark-Lubs .nstituto Superior de Ciências da Saúde. agentes causadores de intoxicações alimentares). caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. • Meios de enriquecimento São meios líquidos. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos.

d) Esterilização (geralmente em autoclave).4 .1.45º C. a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. 33 . uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam. com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 1.1). O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou.Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições). e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. neste caso. e realiza-se à superfície de meio sólido. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas. f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 . Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias. Figura 3. com uma ansa de Henle. no caso dos meios sintéticos.Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. ou ainda por intermédio de uma zaragatoa. 3. simplesmente. com que se inunda a superfície do meio sólido a usar.

5 < d < 3 mm • colónias grandes . 37ºC/24h.d > 3 mm b) Forma geral 34 .5 . e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo. 3. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica.1.Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri.7).Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura. isto é. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle. os meios de cultura devem ser incubados. 3. num meio gelosado em tubo.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig.1.nstituto Superior de Ciências da Saúde.2) a) Tamanho • colónias pequenas .1. e nomeadamente em meio sólido. ou pipeta de Pasteur fechada.6 .7 . colocados em estufas próprias para o efeito.1. 3. em condições adequadas de temperatura. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos).1. 3. presença de pigmentos solúveis.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias . a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3. a presença de odor característico e o aspecto da cultura.Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio.

Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa.nstituto Superior de Ciências da Saúde. baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .

Exemplos: Serratia marcescens .pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3. elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 36 . Representação esquemática da forma.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .colónias verdes azuladas (pigmentos .Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação. 2.

4) Na gelose chocolate. 2) No meio de Drigalsky. coli por estrias.1 . dividir a placa em três partes e inocular por estrias. coli. coli. 3.Sul Manual Prático de Microbiologia 3. e E. Proteus spp. 3. e E. dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. com a ansa de Henle. usando a ansa de Henle.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA). e realizar para cada uma a coloração de Gram. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. inocular por espalhamento E.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade.2 . inocular Staphylococcus spp. 3) No meio de Chapman. utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. e Staphylococcus spp.3 – Resultados e discussão 3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. coli por estrias. 37 . tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas.3. e Proteus spp por picada central.3. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.2 . fazer esfregaços. usando a ansa de Henle.

Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 3.4 .Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).Sul Manual Prático de Microbiologia 3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.3 . 38 .3. 3.5 .3.3.

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