nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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nstituto Superior de Ciências da Saúde. Ao contrário dos meios líquidos. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. Os meios sintéticos. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. auxiliando a sua posterior identificação. como os caldos nutritivos de crescimento. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. estudos de mobilidade bacteriana (ex. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. normalmente o agar. Apresentam no entanto. ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. São ainda utilizados para a conservação de culturas. de modo a 29 . Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta.

porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . de origem animal. caldo nutritivo. apenas das bactérias Gram negativas.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. Não existe um meio de cultura universal (ex. dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose. triptona sal. e extracto de levedura.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. Gelose de McConkey . dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. gelose nutritiva).Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. peptonas. no caso da gelose sangue. compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. Torna-se útil. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. meio de citrato de Simmons). no caso de uma população plurimicrobiana. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública.É um meio selectivo. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas.Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. extracto de carne. água peptonada. Meios selectivos e diferenciais .São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. vegetal ou microbiana como por exemplo. Por exemplo. Meios diferenciais .nstituto Superior de Ciências da Saúde. Meios selectivos . e os meios complexos. permitindo o crescimento. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. Drigalsky ou Endo. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares.

igualmente. o grupo heme é fundamental 31 . se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. e este permanece da cor original. gelose chocolate. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. responsável pelo nome atribuído. indicador de pH (azul de bromotimol). Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. Meio de Chapman . As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo).) para Staphylococcus aureus. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar . b.É um meio muito semelhante ao anterior e contém. epidermidis). Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . lactose. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. Meios enriquecidos . A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. S. e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo.5 %) que somente aquelas bactérias suportam.a manose) é também. c. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio).Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. ovo ou sangue. é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. colónias incolores (ex.É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha. Gelose Chocolate .(não fermentadoras de lactose). cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). Exemplos: gelose sangue. “brain heart infusion” (BHI). uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. proteínas. não acidificam o meio.nstituto Superior de Ciências da Saúde. Gelose de Drigalsky .É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. diferencial (por ex. originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo.

Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. no caso dos meios sintéticos. agente importante de meningites bacterianas em crianças). meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos . que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras.1. 32 .permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). ex.meio sem fonte de carbono adicionada. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. dos vários compostos químicos. podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. agentes causadores de intoxicações alimentares). 3. meio Clark-Lubs . É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos. por conseguinte. • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e.3 . meio de Stuart). anos ou décadas. • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses. b) Adição de água destilada.nstituto Superior de Ciências da Saúde. • Meios de enriquecimento São meios líquidos.

no caso dos meios sintéticos. 3. ou ainda por intermédio de uma zaragatoa. com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente.nstituto Superior de Ciências da Saúde. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica.45º C. com uma ansa de Henle. simplesmente. com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. 1. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou. d) Esterilização (geralmente em autoclave). 33 .1). f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 .1. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam.Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições). 3. a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. neste caso. e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. e realiza-se à superfície de meio sólido.Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. Figura 3. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias.4 .

nstituto Superior de Ciências da Saúde. ou pipeta de Pasteur fechada. num meio gelosado em tubo.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig.5 . 3. a presença de odor característico e o aspecto da cultura.Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri. e nomeadamente em meio sólido.2) a) Tamanho • colónias pequenas .diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias .1. e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo. a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3. os meios de cultura devem ser incubados. isto é.1. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica.1.7 . 3. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito. 3. presença de pigmentos solúveis. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle.7).1. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos). em condições adequadas de temperatura.1.5 < d < 3 mm • colónias grandes . colocados em estufas próprias para o efeito.Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio. 37ºC/24h. 3.6 .Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura.d > 3 mm b) Forma geral 34 .

baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa.

Representação esquemática da forma.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .colónias verdes azuladas (pigmentos . elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido. Exemplos: Serratia marcescens . 2.pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3. 36 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.

3. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp.2 . coli. dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. 3) No meio de Chapman. e Proteus spp por picada central. e realizar para cada uma a coloração de Gram.nstituto Superior de Ciências da Saúde.3 – Resultados e discussão 3. e Staphylococcus spp. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA). 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. coli. inocular por espalhamento E. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa. dividir a placa em três partes e inocular por estrias. usando a ansa de Henle.3. com a ansa de Henle. usando a ansa de Henle. fazer esfregaços.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade. coli por estrias. utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. coli por estrias.3. e E. 3.Sul Manual Prático de Microbiologia 3. 4) Na gelose chocolate. 37 . tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas. e E.1 .Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. Proteus spp. 2) No meio de Drigalsky. inocular Staphylococcus spp.2 .

4 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia 3.3.3.3 .3. 3.Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).5 .Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol. 38 . 3.Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.