nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. São ainda utilizados para a conservação de culturas. os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. estudos de mobilidade bacteriana (ex. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos.nstituto Superior de Ciências da Saúde. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. auxiliando a sua posterior identificação. incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. normalmente o agar. Ao contrário dos meios líquidos. Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. de modo a 29 . São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. Os meios sintéticos. como os caldos nutritivos de crescimento. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. Apresentam no entanto.

São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública. dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido.São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura.É um meio selectivo. e os meios complexos.nstituto Superior de Ciências da Saúde. de origem animal. gelose nutritiva). porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. Meios diferenciais . Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. vegetal ou microbiana como por exemplo. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . Meios selectivos . Gelose de McConkey . água peptonada. compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. extracto de carne. no caso da gelose sangue.Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Drigalsky ou Endo. Por exemplo. Meios selectivos e diferenciais . Torna-se útil. permitindo o crescimento. Não existe um meio de cultura universal (ex. meio de citrato de Simmons). peptonas. no caso de uma população plurimicrobiana. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . apenas das bactérias Gram negativas. triptona sal.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. caldo nutritivo. e extracto de levedura.

diferencial (por ex. Exemplos: gelose sangue. gelose chocolate. “brain heart infusion” (BHI). cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas).a manose) é também. indicador de pH (azul de bromotimol). Meio de Chapman . ovo ou sangue. proteínas.É um meio muito semelhante ao anterior e contém. originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar .Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. lactose. Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. c. responsável pelo nome atribuído.nstituto Superior de Ciências da Saúde.(não fermentadoras de lactose). se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. e este permanece da cor original.5 %) que somente aquelas bactérias suportam.É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio).) para Staphylococcus aureus. é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. não acidificam o meio. As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). igualmente.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo. Gelose de Drigalsky . o grupo heme é fundamental 31 . colónias incolores (ex. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. Meios enriquecidos . uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. Gelose Chocolate . b. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex.É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular. epidermidis). S.

32 . caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. meio Clark-Lubs . anos ou décadas.meio sem fonte de carbono adicionada. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos . ex. agentes causadores de intoxicações alimentares). b) Adição de água destilada.1. É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex.3 . • Meios de enriquecimento São meios líquidos. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio de Stuart).Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses. que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras.nstituto Superior de Ciências da Saúde. podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. 3.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae.permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). dos vários compostos químicos. agente importante de meningites bacterianas em crianças). no caso dos meios sintéticos. por conseguinte. • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e.

Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias.Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.4 . simplesmente. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam.Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições). a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. Figura 3. f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 .1.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 1. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é.45º C. ou ainda por intermédio de uma zaragatoa. com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. 33 . com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente. e realiza-se à superfície de meio sólido. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou. e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. no caso dos meios sintéticos. neste caso. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. 3.1). com uma ansa de Henle. 3. d) Esterilização (geralmente em autoclave). c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas.

7).Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura. 3.6 .7 . e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo.Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica.1. 3. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. e nomeadamente em meio sólido.1. 37ºC/24h.nstituto Superior de Ciências da Saúde. isto é. num meio gelosado em tubo. 3. a presença de odor característico e o aspecto da cultura.1. ou pipeta de Pasteur fechada.1. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos). em condições adequadas de temperatura. os meios de cultura devem ser incubados. presença de pigmentos solúveis.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias . 3.5 < d < 3 mm • colónias grandes .2) a) Tamanho • colónias pequenas . colocados em estufas próprias para o efeito. a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3.1.5 . no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle.Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri.d > 3 mm b) Forma geral 34 .

baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa.

elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido. Exemplos: Serratia marcescens . 36 . 2. Representação esquemática da forma.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3.colónias verdes azuladas (pigmentos .nstituto Superior de Ciências da Saúde.

Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA).3 – Resultados e discussão 3. e realizar para cada uma a coloração de Gram. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. dividir a placa em três partes e inocular por estrias.3. 3. dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. 3) No meio de Chapman. fazer esfregaços.3. coli por estrias. inocular Staphylococcus spp. 37 . utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. e E. 3.Sul Manual Prático de Microbiologia 3. Proteus spp. com a ansa de Henle.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade. e Proteus spp por picada central. coli. 4) Na gelose chocolate. tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas.2 . coli por estrias. usando a ansa de Henle. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. coli.nstituto Superior de Ciências da Saúde. inocular por espalhamento E. usando a ansa de Henle.1 . 2) No meio de Drigalsky. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.2 . e Staphylococcus spp.

4 .nstituto Superior de Ciências da Saúde. 3.3 .3.5 . 38 .Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol. 3.3.Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.Sul Manual Prático de Microbiologia 3.

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