nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

28

Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal. de modo a 29 . ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. auxiliando a sua posterior identificação. Ao contrário dos meios líquidos. incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. normalmente o agar. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Os meios sintéticos. estudos de mobilidade bacteriana (ex. Apresentam no entanto. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. São ainda utilizados para a conservação de culturas. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais).nstituto Superior de Ciências da Saúde. os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. como os caldos nutritivos de crescimento.

Não existe um meio de cultura universal (ex. dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. vegetal ou microbiana como por exemplo. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . Meios diferenciais .Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. peptonas. extracto de carne. porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. e extracto de levedura. no caso da gelose sangue. Gelose de McConkey . e os meios complexos.nstituto Superior de Ciências da Saúde. de origem animal. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. caldo nutritivo.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. meio de citrato de Simmons). compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. Por exemplo.São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. apenas das bactérias Gram negativas.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex.Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. gelose nutritiva). É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam.É um meio selectivo. Drigalsky ou Endo. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose. Meios selectivos . no caso de uma população plurimicrobiana. permitindo o crescimento. dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública. água peptonada. Meios selectivos e diferenciais . Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. Torna-se útil. triptona sal.

c. indicador de pH (azul de bromotimol). Meios enriquecidos . proteínas. Gelose Chocolate . Exemplos: gelose sangue. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. o grupo heme é fundamental 31 . diferencial (por ex. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular.É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha. e este permanece da cor original.nstituto Superior de Ciências da Saúde. cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). não acidificam o meio.) para Staphylococcus aureus. originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. b. S.a manose) é também. ovo ou sangue. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente.Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho.(não fermentadoras de lactose). Gelose de Drigalsky .É um meio muito semelhante ao anterior e contém. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. “brain heart infusion” (BHI).5 %) que somente aquelas bactérias suportam.É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. Meio de Chapman . colónias incolores (ex. responsável pelo nome atribuído. igualmente. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio). As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). gelose chocolate. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar . Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . lactose. e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo. epidermidis).Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias.

por conseguinte.permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). b) Adição de água destilada. • Meios de enriquecimento São meios líquidos. anos ou décadas.meio sem fonte de carbono adicionada.nstituto Superior de Ciências da Saúde. no caso dos meios sintéticos. agentes causadores de intoxicações alimentares). • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses. que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras. É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex.3 . ex.Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. 3.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. meio Clark-Lubs . • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e. meio de Stuart). • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos. dos vários compostos químicos.1. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. agente importante de meningites bacterianas em crianças). 32 . meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos .

com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. neste caso. com uma ansa de Henle. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam.1. com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente. e realiza-se à superfície de meio sólido. 1. f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 .Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições).45º C. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou. 3. 3.4 . O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. 33 .Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. simplesmente. no caso dos meios sintéticos. ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.1). d) Esterilização (geralmente em autoclave). e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. Figura 3.nstituto Superior de Ciências da Saúde. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas.

7). ou pipeta de Pasteur fechada.2) a) Tamanho • colónias pequenas . a presença de odor característico e o aspecto da cultura.5 . enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito. presença de pigmentos solúveis. 3.1.1.1.d > 3 mm b) Forma geral 34 . num meio gelosado em tubo.6 .Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri. 3. 3. e nomeadamente em meio sólido.Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura. os meios de cultura devem ser incubados. a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3. e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo. isto é.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos).Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias .7 . em condições adequadas de temperatura.nstituto Superior de Ciências da Saúde. colocados em estufas próprias para o efeito. 3. 37ºC/24h.5 < d < 3 mm • colónias grandes .1. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle.1.

nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa. baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .

2.colónias verdes azuladas (pigmentos . Exemplos: Serratia marcescens . elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .nstituto Superior de Ciências da Saúde. 36 .pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3. Representação esquemática da forma.Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.

e E. coli por estrias. usando a ansa de Henle. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. e E.nstituto Superior de Ciências da Saúde.3 – Resultados e discussão 3.2 .Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade. 3) No meio de Chapman. 3. 4) Na gelose chocolate. tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas. dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. fazer esfregaços. usando a ansa de Henle.3. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa.1 .3.2 .Sul Manual Prático de Microbiologia 3. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. Proteus spp. 37 . coli. coli por estrias. e realizar para cada uma a coloração de Gram. coli.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA). e Staphylococcus spp. e Proteus spp por picada central. inocular por espalhamento E. dividir a placa em três partes e inocular por estrias. inocular Staphylococcus spp.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. 2) No meio de Drigalsky. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador. 3. com a ansa de Henle.

3.5 .3 . 3. 3.3.Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.4 .3.nstituto Superior de Ciências da Saúde. 38 .Sul Manual Prático de Microbiologia 3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful