nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. São ainda utilizados para a conservação de culturas. Apresentam no entanto. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal. os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias. b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. normalmente o agar. não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Os meios sintéticos. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. auxiliando a sua posterior identificação. de modo a 29 .nstituto Superior de Ciências da Saúde. incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. Ao contrário dos meios líquidos. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. como os caldos nutritivos de crescimento. estudos de mobilidade bacteriana (ex.

Por exemplo. uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas. dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. de origem animal. e os meios complexos. Torna-se útil. Meios selectivos e diferenciais . caldo nutritivo.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais . Meios selectivos . Gelose de McConkey .Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Meios diferenciais . São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública. vegetal ou microbiana como por exemplo. permitindo o crescimento. no caso da gelose sangue. meio de citrato de Simmons). no caso de uma população plurimicrobiana. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. apenas das bactérias Gram negativas. dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. triptona sal. e extracto de levedura. compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas.É um meio selectivo. Drigalsky ou Endo.nstituto Superior de Ciências da Saúde. gelose nutritiva). extracto de carne. porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose.São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Não existe um meio de cultura universal (ex.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. peptonas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. água peptonada.

nstituto Superior de Ciências da Saúde. S. e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. b.Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular.É um meio muito semelhante ao anterior e contém. gelose chocolate. não acidificam o meio.a manose) é também. Meio de Chapman . c. “brain heart infusion” (BHI). proteínas. Meios enriquecidos . responsável pelo nome atribuído. o grupo heme é fundamental 31 . é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex.É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. igualmente. indicador de pH (azul de bromotimol). Exemplos: gelose sangue. Gelose Chocolate . epidermidis). Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar .É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. diferencial (por ex. uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. ovo ou sangue. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio). e este permanece da cor original.) para Staphylococcus aureus. se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. colónias incolores (ex. As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). lactose. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. Gelose de Drigalsky . A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo.(não fermentadoras de lactose). As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac .

permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e. • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses. podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos.1. ex.nstituto Superior de Ciências da Saúde. agentes causadores de intoxicações alimentares). resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos .meio sem fonte de carbono adicionada. por conseguinte.Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae. agente importante de meningites bacterianas em crianças). 3. b) Adição de água destilada.Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. meio Clark-Lubs . meio de Stuart). É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex. que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras. 32 . anos ou décadas. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. • Meios de enriquecimento São meios líquidos.3 . no caso dos meios sintéticos. dos vários compostos químicos.

ou ainda por intermédio de uma zaragatoa. com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam. 1.4 . e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. 33 . d) Esterilização (geralmente em autoclave). O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. no caso dos meios sintéticos. Figura 3. neste caso. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou.Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.45º C. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas. e realiza-se à superfície de meio sólido. a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. simplesmente.Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições).1). 3. 3.nstituto Superior de Ciências da Saúde. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. com uma ansa de Henle. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias. f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 .1. com que se inunda a superfície do meio sólido a usar.

2) a) Tamanho • colónias pequenas . uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos). 37ºC/24h.Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura.nstituto Superior de Ciências da Saúde. ou pipeta de Pasteur fechada. 3. a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3.6 .1. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle. 3.7).1.d > 3 mm b) Forma geral 34 . num meio gelosado em tubo.1. 3.Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri. em condições adequadas de temperatura.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias . a presença de odor característico e o aspecto da cultura. isto é.5 < d < 3 mm • colónias grandes . humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica.7 . e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. colocados em estufas próprias para o efeito. os meios de cultura devem ser incubados.5 . presença de pigmentos solúveis.Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio.1.1. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito. e nomeadamente em meio sólido. 3.

Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa. baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.

elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido. Representação esquemática da forma.nstituto Superior de Ciências da Saúde.colónias verdes azuladas (pigmentos . Exemplos: Serratia marcescens .colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa . 36 . 2.pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3.Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação.

37 .3. e E.3. 2) No meio de Drigalsky. Proteus spp. coli por estrias. dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp.1 . 3. e Staphylococcus spp. e realizar para cada uma a coloração de Gram.2 . 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. coli. inocular Staphylococcus spp. fazer esfregaços.2 . 3. coli por estrias. 4) Na gelose chocolate. coli.Sul Manual Prático de Microbiologia 3.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade.nstituto Superior de Ciências da Saúde.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. usando a ansa de Henle.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA). dividir a placa em três partes e inocular por estrias. inocular por espalhamento E.3 – Resultados e discussão 3. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa. com a ansa de Henle. tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas. 3) No meio de Chapman. e E. usando a ansa de Henle. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. e Proteus spp por picada central. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.

nstituto Superior de Ciências da Saúde.Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.3 .3. 3.5 . 38 .3.Sul Manual Prático de Microbiologia 3.4 .3. 3.Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

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