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Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias

3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades

A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou

contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes

necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O,

P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por

ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas

características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial

e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura

pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição

e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos:

líquido

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semi-sólido

sólido

Os meios líquidos, como os caldos nutritivos de crescimento, podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. Apresentam no entanto, dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias; 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas.

Ao contrário dos meios líquidos, os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante, normalmente o agar. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal, incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água, não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação, estudos de mobilidade bacteriana (ex.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes, auxiliando a sua posterior identificação. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras. São ainda utilizados para a conservação de culturas, e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais).

Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura.

b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios. Os meios sintéticos, ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas, de modo a

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constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. meio de citrato de Simmons), e os meios complexos, compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas, de origem animal, vegetal ou microbiana como por exemplo, extracto de carne, peptonas, e extracto de levedura, que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey, Drigalsky ou Endo.

c) Tipo de utilização

Meios de isolamento

Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos:

Meios basais - Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes. Não existe um meio de cultura universal (ex. caldo nutritivo, água peptonada, triptona sal, gelose nutritiva). Meios selectivos - Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. Torna-se útil, no caso de uma população plurimicrobiana, porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. Meios diferenciais - São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. Por exemplo, no caso da gelose sangue, dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não; dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. Meios selectivos e diferenciais - Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública, como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares. Temos como exemplos deste tipo de meio:

a. Gelose de McConkey - É um meio selectivo, uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas, permitindo o crescimento, apenas das bactérias Gram negativas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose, tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio

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de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose, não acidificam o meio, e este permanece da cor original. b. Gelose de Drigalsky - É um meio muito semelhante ao anterior e contém, igualmente, lactose, indicador de pH (azul de bromotimol), cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac - (não fermentadoras de lactose). As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo); as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio). c. Meio de Chapman - É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7.5 %) que somente aquelas bactérias suportam. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar - a manose) é também, diferencial (por ex.) para Staphylococcus aureus, uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio, e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo, originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio, colónias incolores (ex. S. epidermidis).

Meios enriquecidos - Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente, se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo, é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro, ovo ou sangue. Exemplos: gelose sangue, gelose chocolate, “brain heart infusion” (BHI).

Gelose Chocolate - É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha, responsável pelo nome atribuído. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular, proteínas, cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. o grupo heme é fundamental

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para o crescimento de Haemophilus influenzae, agente importante de meningites bacterianas em crianças).

Meios de enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando

a sua quantidade relativamente a outras, podendo conduzir depois a culturas puras por

sobreposição de espécies (ex. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos

- meio sem fonte de carbono adicionada; ex. caldo de selenito de sódio para

enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações alimentares).

Meios de transporte

Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos. É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex. meio de Stuart).

Meios de identificação

São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e, por conseguinte, resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio Clark-Lubs - permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose).

Meios de conservação

São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante

meses, anos ou décadas.

3.1.3 - Reconstituição de meios de cultura (esquema geral)

a) Pesagem do meio liofilizado ou, no caso dos meios sintéticos, dos vários compostos

químicos.

b) Adição de água destilada.

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c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente.

d) Esterilização (geralmente em autoclave).

e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração, no caso dos meios sintéticos,

que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam.

f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 - 45º C.

uma

vez

3.1.4 - Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos

a) Inundação

É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições),

com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em

atmosfera asséptica.

b) Espalhamento

É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é, neste caso, aplicado à

superfície de meio sólido com um espalhador em L ou, simplesmente, com uma pipeta

de

Pasteur dobrada a quente, ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.

c)

Estrias

A

inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas, e

realiza-se à superfície de meio sólido, com uma ansa de Henle, a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig. 3.1).

de uma suspensão ou de uma co lónia isolada (Fig. 3.1). Figura 3. 1. Esquema da

Figura 3. 1. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias.

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d) Incorporação

A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no

interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio, enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito.

e) Picada central

Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo, no estudo da mobilidade bacteriana e

realiza-se por picada central com a ansa de Henle, ou pipeta de Pasteur fechada, num meio gelosado em tubo.

3.1.5 - Incubação dos meios de cultura inoculados

Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri, os meios de cultura devem ser incubados, isto é, colocados em estufas próprias para o efeito, em condições adequadas de temperatura, humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica, 37ºC/24h, uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos).

3.1.6 - Leitura dos resultados

A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a

densidade da cultura, presença de pigmentos solúveis, a presença de odor característico

e o aspecto da cultura, e nomeadamente em meio sólido, a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3.1.7).

3.1.7 - Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig. 3.2)

a) Tamanho

colónias pequenas - diâmetro (d) < 1 mm

colónias médias - 1.5 < d < 3 mm

colónias grandes - d > 3 mm

b) Forma geral

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desenho dos contornos:

bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento

forma de relevo:

lisas

convexas

semi-convexas

acuminadas

mamelonadas

umbilicadas

c) Transparência:

transparentes

translúcidas

opacas

lactescentes

d) Aspecto da superfície:

colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas

colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa, baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas

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colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea

e) Pigmentação:

A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação. Exemplos:

Serratia marcescens - colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa - colónias verdes azuladas (pigmentos - pioverdina e piocianina)

Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Filamentosa Irregular Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso
Forma Forma
Ponto Ponto
Circular Circular
Filamentosa Filamentosa
Irregular Irregular
Rizoidal Rizoidal
Fuso Fuso
Elevação Elevação
Achatada Achatada
Elevada Elevada
Convexa Convexa
Pulverulenta Pulverulenta
Umbilical Umbilical
Margem Margem
Inteira Inteira
Ondulada Ondulada
Lobulada Lobulada
Erusionada Erusionada
Filamentosa Filamentosa
Encaracolada Encaracolada

Figura 3. 2. Representação esquemática da forma, elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido.

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3.2 - Protocolos experimentais

Utilizando bactérias em meio líquido:

1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA), inocular por espalhamento E. coli, utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador.

2) No meio de Drigalsky, dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle.

3) No meio de Chapman, dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp.

e E. coli por estrias, usando a ansa de Henle.

4) Na gelose chocolate, dividir a placa em três partes e inocular por estrias, utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. coli, Proteus spp. e Staphylococcus spp.

5) Nos tubos de manitol-mobilidade, com a ansa de Henle, inocular Staphylococcus spp.

e Proteus spp por picada central.

Utilizando bactérias isoladas em meio sólido:

1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias:

de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI

de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI

2) Com a ansa, tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas, fazer esfregaços, e realizar para cada uma a coloração de Gram.

3.3 – Resultados e discussão

3.3.1 - Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitol- mobilidade.

3.3.2 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose.

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3.3.3 - Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol.

3.3.4 - Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.

3.3.5 - Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).

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