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Cultura e Isolamento de bactérias

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nstituto Superior de Ciências da Saúde- Sul

Manual Prático de Microbiologia

CAPÍTULO 3 Cultura e isolamento de bactérias
3.1 - Introdução

3.1.1 - Generalidades A maior parte das técnicas bacteriológicas (conservação, isolamento, identificação, ou contagem de bactérias), exigem a utilização de meios de cultura, sendo a composição dos meios de cultura função dos conhecimentos sobre os princípios de nutrição microbiana. Os meios de cultura devem conter, de uma forma utilizável, os nutrientes necessários ao crescimento das bactérias, nomeadamente, macronutrientes (C, H, N, O, P, S, K, Mg, Na, etc.), micronutrientes (Fe, Cu, Zn, etc.), e factores de crescimento (por ex. vitaminas e aminoácidos). Para que se observe crescimento bacteriano há ainda que incubar os meios em condições adequadas de pH, tensão de oxigénio e temperatura.

Somente em casos excepcionais, se pode identificar uma bactéria pelas suas características morfológicas. É portanto essencial obtê-la em cultura em meio artificial e, na hipótese de estarem presentes diversas espécies, separá-las ou isolá-las em cultura pura, para se poderem efectuar testes de identificação de natureza bioquímica. Para cultivar uma espécie bacteriana deve adicionar-se a um meio de cultura estéril adequado uma pequena amostra contendo células vivas da espécie. A essa amostra chama-se inóculo, e à adição desse inóculo ao meio, chama-se inoculação. O meio inoculado é então incubado em condições convenientes de temperatura, humidade, etc., durante um certo tempo. Durante a incubação, as bactérias multiplicam-se e formam uma cultura, o que se define como uma população de bactérias (organismos) que se desenvolve num meio ou à sua superfície.

3.1.2 - Classificação dos meios de cultura Os meios de cultura podem ser classificados em função da sua consistência, composição e tipo de utilização.

a) Consistência Existem meios de cultura em três estados físicos: • líquido

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Os meios sólidos (aos quais são adicionados geralmente 15 g/l de agar) permitem observar as colónias das diferentes bactérias que se desenvolvem à superfície (e por vezes no interior) do meio e que mostram muitas vezes aspecto e cor diferentes.: meio manitol-mobilidade) e na promoção do crescimento de bactérias anaeróbias. normalmente o agar. Os meios sintéticos. estudos de mobilidade bacteriana (ex. 2) é impossível a separação de espécies bacterianas que se encontrem em misturas. e permitem observar determinadas reacções bioquímicas específicas (ver meios diferenciais). b) Composição Os microrganismos podem ser cultivados utilizando dois tipos diferentes de meios.nstituto Superior de Ciências da Saúde.Sul Manual Prático de Microbiologia • semi-sólido • sólido Os meios líquidos. dois inconvenientes: 1) as culturas desenvolvidas não revelam em geral quaisquer características especiais e portanto o seu valor é limitado na identificação de bactérias. como os caldos nutritivos de crescimento. Ao contrário dos meios líquidos. auxiliando a sua posterior identificação. incluindo ficar transparente no ponto de ebulição da água. podem ser utilizados para a multiplicação de microrganismos em estudos de fermentação e em vários testes bioquímicos. São ainda utilizados para a conservação de culturas. Os meios semi-sólidos (aos quais são adicionados geralmente 5 g/l de agar) podem ser utilizados em estudos de fermentação. não ser um nutriente para a maior parte dos microrganismos e não ser metabolizado durante o crescimento microbiano. Uma colónia é um número elevado de células bacterianas em meio de cultura sólido que é visível a olho nú como uma entidade discreta. de modo a 29 . Apresentam no entanto. Assume-se que uma colónia provém de uma única célula e portanto representa um clone de uma cultura pura. O agar é um polissacárido complexo extraído de uma alga marinha (agar-agar) e tem várias propriedades que o tornam um agente solidificante ideal. os meios sólidos e semi-sólidos contêm um agente solidificante. ou quimicamente definidos que são compostos por produtos químicos bem definidos e dissolvidos em água destilada em proporções determinadas. São praticamente indispensáveis à obtenção de culturas puras.

no caso de uma população plurimicrobiana. Meios selectivos e diferenciais . dado que algumas bactérias produzem enzimas (hemolisinas) que vão lisar os glóbulos vermelhos enquanto outras não. extracto de carne. Como exemplos destes meios têm-se as geloses de McConkey. Drigalsky ou Endo. Temos como exemplos deste tipo de meio: a. meio de citrato de Simmons).Permitem o crescimento de bactérias pouco exigentes.nstituto Superior de Ciências da Saúde. Torna-se útil. Meios selectivos . permitindo o crescimento. Gelose de McConkey . uma vez que contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento das bactérias Gram positivas.Sul Manual Prático de Microbiologia constituir uma solução de nutrientes devidamente tamponada (ex. vegetal ou microbiana como por exemplo. água peptonada. São sobretudo utilizados em microbiologia clínica e na área da saúde pública.Alguns meios de cultura são simultaneamente selectivos e diferenciais. dependendo do padrão de hemólise pode-se distinguir entre bactérias hemolíticas (Streptococcus pyogenes) e não hemolíticas. É diferencial porque a lactose está presente neste meio e permite diferenciar entre as bactérias Gram negativas que utilizam a lactose como substrato fermentativo e as que não utilizam. caldo nutritivo. Não existe um meio de cultura universal (ex. apenas das bactérias Gram negativas. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose. peptonas.Permitem o crescimento só de um tipo de bactérias em detrimento das outras cujo crescimento é inibido. e extracto de levedura. no caso da gelose sangue. tornam o meio ácido e o indicador de pH do meio 30 . compostos por uma variedade de substâncias nutricionalmente indefinidas. de origem animal.É um meio selectivo. e os meios complexos. como por exemplo na determinação da qualidade da água ou num surto de intoxicações alimentares.São utilizados quando se pretende diferenciar entre vários microrganismos presentes no meio de cultura. porque permite favorecer a cultura preferencial de certas bactérias. Por exemplo. que são naturalmente ricos em nutrientes e vitaminas. triptona sal. Meios diferenciais . gelose nutritiva). c) Tipo de utilização • Meios de isolamento Os meios de isolamento permitem a obtenção de culturas puras e podem ser de vários tipos: Meios basais .

As primeiras originam colónias de cor amarela (o pH do meio baixa devido à acumulação de produtos de fermentação e o indicador “vira” para amarelo). cristal violeta (inibidor das bactérias Gram positivas). lactose. As espécies de estafilococos não fermentadoras de manitol apresentam neste meio. gelose chocolate.a manose) é também. Gelose Chocolate . proteínas. b.Os ambientes naturais são geralmente habitados por populações de vários tipos de bactérias. A acumulação dos produtos de fermentação acidifica o meio. originando colónias amarelas rodeadas de um halo também amarelo. cujos cofactores são importantes factores de crescimento para bactérias muito exigentes (ex. o grupo heme é fundamental 31 .É um meio enriquecido com sangue previamente sujeito a aquecimento a 80ºC durante 20 minutos o que promove a lise dos glóbulos vermelhos e lhe confere a cor castanha.) para Staphylococcus aureus. Meios enriquecidos . Meio de Chapman . Permite distinguir também entre bactérias Lac + (fermentadoras de lactose) e Lac . uma vez que as espécies potencialmente patogénicas do género Staphylococcus são fermentadoras de manitol. S.(não fermentadoras de lactose). é fundamental a utilização de um meio muito rico nutricionalmente e em que nenhum agente inibidor se encontre presente. se encontra presente num determinado produto mas em número muito baixo. e este permanece da cor original. c. Quando uma espécie com especial interesse e nutricionalmemte exigente. Exemplos: gelose sangue. Gelose de Drigalsky .5 %) que somente aquelas bactérias suportam. não acidificam o meio. As bactérias Gram negativas que não fermentam a lactose. A lise dos glóbulos vermelhos liberta para o meio extracelular.É um meio muito semelhante ao anterior e contém. Por conter manitol (um poliálcool derivado de um açúcar . diferencial (por ex. e o indicador de pH (vermelho de fenol) “vira” de vermelho (cor original do meio) para amarelo. ovo ou sangue. responsável pelo nome atribuído. epidermidis).É um meio selectivo para os estafilococos devido à elevada concentração de cloreto de sódio (7. indicador de pH (azul de bromotimol).nstituto Superior de Ciências da Saúde. Estes meios enriquecidos são meios basais adicionados de produtos biológicos ricos em nutrientes como o soro. igualmente. as segundas originam colónias azuis (a cor original do meio). “brain heart infusion” (BHI). colónias incolores (ex.Sul Manual Prático de Microbiologia de cultura (vermelho de metilo) em meio ácido fica vermelho.

nstituto Superior de Ciências da Saúde. caldo de selenito de sódio para enriquecimento de fezes em Salmonella e Shigella. resolver os problemas de identificação postos entre espécies (ex. meio de Stuart). • Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses.1. meio de enriquecimento para organismos fotoautotróficos . podendo conduzir depois a culturas puras por sobreposição de espécies (ex. agente importante de meningites bacterianas em crianças). dos vários compostos químicos. agentes causadores de intoxicações alimentares). que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras. 3. ex.3 .Sul Manual Prático de Microbiologia para o crescimento de Haemophilus influenzae. no caso dos meios sintéticos.meio sem fonte de carbono adicionada. • Meios de identificação São meios que permitem pôr em evidência as características bioquímicas das bactérias e. meio Clark-Lubs .Reconstituição de meios de cultura (esquema geral) a) Pesagem do meio liofilizado ou. É então importante manter a viabilidade dos microrganismos nele existentes sem que haja multiplicação dos mesmos (durante um período de 48 a 72 horas) e também a sua quantidade relativa no produto biológico para que depois a inoculação dos meios origine resultados que reflictam a proporção relativa dos microrganismos nesse produto biológico (ex.permite distinguir entre bactérias que fazem a fermentação butanodiólica da glucose e bactérias que fazem a fermentação ácida mista da glucose). • Meios de enriquecimento São meios líquidos. • Meios de transporte Servem para o transporte de um determinado material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais organismos. por conseguinte. anos ou décadas. 32 . b) Adição de água destilada.

1. O excesso de inóculo é removido por sucção a vácuo após agitação e a superfície do meio é deixada secar ao ar em atmosfera asséptica. e) Adição da fonte de carbono esterilizada por filtração. Figura 3.45º C. d) Esterilização (geralmente em autoclave). ou ainda por intermédio de uma zaragatoa.Sul Manual Prático de Microbiologia c) Dissolução completa dos componentes em banho-maria agitando periodicamente. 3.nstituto Superior de Ciências da Saúde. no caso dos meios sintéticos. 1. Esquema da inoculação de meios de cultura sólidos pela técnica das estrias. com que se inunda a superfície do meio sólido a usar. aplicado à superfície de meio sólido com um espalhador em L ou. uma vez que soluções concentradas de glúcidos não devem ser submetidas a temperaturas elevadas porque caramelizam. b) Espalhamento É utilizada para contagem de colónias e o inóculo (suspensão) é. 3. c) Estrias A inoculação por estrias é realizada com a finalidade de obter colónias isoladas. neste caso. com uma ansa de Henle. e realiza-se à superfície de meio sólido. simplesmente. f) Distribuição em tubos ou caixas de Petri após arrefecimento a 40 . com uma pipeta de Pasteur dobrada a quente.4 . 33 .1).Técnicas de inoculação ou sementeira de meios de cultura sólidos a) Inundação É utilizada uma suspensão (que pode previamente ser submetida a várias diluições). a partir de uma suspensão ou de uma colónia isolada (Fig.

Sul Manual Prático de Microbiologia d) Incorporação A inoculação por incorporação é utilizada para contagem de colónias à superfície e no interior de meio sólido e realiza-se por incorporação do inóculo (suspensão) no meio. os meios de cultura devem ser incubados.7 .6 . ou pipeta de Pasteur fechada. e) Picada central Este tipo de inoculação é utilizado por exemplo. 3. 37ºC/24h. humidade e tempo (geralmente em microbiologia clínica. a existência de colónias isoladas e suas características particulares (ver 3. a presença de odor característico e o aspecto da cultura.1. em condições adequadas de temperatura.7). colocados em estufas próprias para o efeito.1.d > 3 mm b) Forma geral 34 .1.1.5 . 3. uma vez que quase todos os agentes patogénicos são organismos mesófilos). num meio gelosado em tubo. e nomeadamente em meio sólido.1.Aspecto das colónias crescidas em meio sólido (Fig.2) a) Tamanho • colónias pequenas .Leitura dos resultados A observação dos resultados deve ser feita tendo em conta alguns aspectos como a densidade da cultura. presença de pigmentos solúveis.nstituto Superior de Ciências da Saúde.Incubação dos meios de cultura inoculados Após a inoculação e a devida identificação dos tubos ou caixas de Petri. 3. isto é. no estudo da mobilidade bacteriana e realiza-se por picada central com a ansa de Henle.diâmetro (d) < 1 mm • colónias médias . 3. enquanto quente (não mais do que 40ºC para não destruir o inóculo) e portanto ainda liquefeito.5 < d < 3 mm • colónias grandes .

Sul Manual Prático de Microbiologia • desenho dos contornos: bordos lisos regulares bordos irregulares bordos dentados bordos com prolongamento • forma de relevo: lisas convexas semi-convexas acuminadas mamelonadas umbilicadas c) Transparência: • transparentes • translúcidas • opacas • lactescentes d) Aspecto da superfície: • colónias lisas bordos regulares superfície lisa e brilhante por vezes consistência cremosa suspensão homogénea muitas vezes semi-convexas • colónias rugosas bordos muitas vezes dentados superfície rugosa. baça consistência pulvurulenta suspensão heterogénea sobretudo lisas 35 .nstituto Superior de Ciências da Saúde.

pioverdina e piocianina) Forma Forma Ponto Ponto Circular Circular Filamentosa Irregular Filamentosa Irregular Rizoidal Rizoidal Fuso Fuso Elevação Elevação Achatada Achatada Elevada Elevada Convexa Convexa Pulverulenta Pulverulenta Umbilical Umbilical Margem Margem Inteira Inteira Ondulada Ondulada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Lobulada Erusionada Filamentosa Encaracolada Figura 3. elevação e margem das colónias bacterianas obtidas em meio sólido.nstituto Superior de Ciências da Saúde. Representação esquemática da forma. Exemplos: Serratia marcescens .colónias verdes azuladas (pigmentos . 2.colónias vermelhas Pseudomonas aeruginosa .Sul Manual Prático de Microbiologia • colónias mucosas bordos lisos e regulares convexas superfície lisa e brilhante suspensão heterogénea e) Pigmentação: A elaboração de um pigmento por certas bactérias pode ser um elemento precioso de identificação. 36 .

3. dividir a placa em duas partes e inocular Proteus spp. utilizando uma pipeta Pasteur como espalhador. usando a ansa de Henle.3 – Resultados e discussão 3. fazer esfregaços. coli. e Staphylococcus spp. dividir a placa em três partes e inocular por estrias. e E.Protocolos experimentais Utilizando bactérias em meio líquido: 1) No meio de tripticase-soja-agar (TSA).Sul Manual Prático de Microbiologia 3.2 . e Proteus spp por picada central. usando a ansa de Henle. 3) No meio de Chapman. utilizando uma zaragatoa as seguintes bactérias: E. inocular por espalhamento E.nstituto Superior de Ciências da Saúde.3.1 . dividir a placa em duas partes e inocular Staphylococcus spp. coli. e E. 37 . tirar 4 ou 5 gotas das suspensões anteriores para lâminas. 4) Na gelose chocolate. Utilizando bactérias isoladas em meio sólido: 1) Com a ansa de Henle retirar 3 ou 4 colónias: • de uma das bactérias inoculadas no meio de Drigalsky e suspender em soro fisiológico (SF) ou meio BHI • de uma das bactérias inoculadas no meio de Chapman e suspender em SF ou BHI 2) Com a ansa.3. coli por estrias.Classifique quanto à mobilidade as bactérias que inoculou no meio manitolmobilidade. inocular Staphylococcus spp. e realizar para cada uma a coloração de Gram.2 .Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. 2) No meio de Drigalsky. 3. Proteus spp. 5) Nos tubos de manitol-mobilidade. com a ansa de Henle. coli por estrias.

nstituto Superior de Ciências da Saúde.3 . 3. 3.3.Identifique a morfologia e o modo de agrupamento das bactérias estudadas.5 .4 .Identifique as bactérias fermentadoras e não fermentadoras de manitol. 38 .3.Classifique as bactérias estudadas como Gram (+) ou Gram (-).3.Sul Manual Prático de Microbiologia 3.

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