TECNOLOGIADAFERMENTAÇÃO

Boas Práticas de Laboratório (BPL)

Good Laboratory Practice (GLP)

TODAS as práticas devem ser realizadas utilizando as BPL.

Como qualquer outra atividade de laboratório, todas as investigações exigem

que o usuário adote as BPL. Aqui são dadas notas resumidas para auxiliar os
envolvidos nas várias atividades práticas a conduzi-las de forma segura.
Lembre que antes de realizar qualquer atividade prática, uma avaliação de
risco deve ser realizada para garantir mínimo perigo para todos envolvidos.
Se existir qualquer dúvida sobre a avaliação de riscos, consultar o professor
ou instrutor.

Microbiologia segura

 As atividades práticas selecionadas e os microrganismos sugeridos

apresentam risco mínimo quando seguida as BPL. Portanto, é essencial
observar as BPL em microbiologia quando trabalhar com qualquer tipo de
microrganismo.

 Existem cinco áreas essenciais que devem ser consideradas para trabalhar
com investigações práticas em microbiológicas:

 Preparo e esterilização de equipamentos e meios de cultura.

 Preparo da cultura microbiológica como cultura estoque para

investigações posteriores e inóculo para a presente investigação.

 Inocular no meio a cultura preparada

 Incubação das culturas e amostragem durante o crescimento

 Esterilização e descarte seguro de todas as culturas e

descontaminação de dos equipamentos

Habilidade de boa organização e conduta disciplinada pode assegurar que

toda atividade é realizada de forma segura e com sucesso.

Proteção

Alimento ou bebida não deve ser armazenado ou consumido em um

laboratório de microbiologia. As mãos devem ser lavadas com sabão
desinfetante depois de manejar culturas microbiológicas e sempre que sair
do laboratório. Para garantir que qualquer ferida, corte ou arranhões não
sejam infectados ou sejam fonte de contaminação, protegê-los com material
a prova de água ou usar luvas cirúrgicas descartáveis. Habilidade de boa
organização e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade é
realizada de forma segura e com sucesso.

Segurança pessoal geral

Cada indivíduo realizando as práticas sugeridas ou qualquer outra

investigação é responsável pela sua própria segurança e também pela
segurança de outros que podem ser afetados pelo seu trabalho (outros
estudantes, técnicos e professores). O indivíduo deve incluir no planejamento
e realização destas investigações uma avaliação de riscos para avaliar
qualquer perigo que a avaliação possa possuir e maneiras de minimizá-los.

Técnica asséptica

Equipamento e meio estéreis devem ser utilizados para transferência e

cultura de microrganismos. Técnica asséptica deve ser observada sempre que
micorganismos são transferidos de um recipiente para outro. Equipamentos
contaminados devem ser preferencialmente esterilizados por calor podendo
ser incinerado ou autoclavado. Um desinfetante químico adequado deve ser
utilizado, mas este não pode garantir a completa esterilização.

Segurança elétrica

Cuidado deve ser tomado para que nenhum líquido entre em contato com a
tomada elétrica. Antes de ligar qualquer equipamento verifique se a corrente
elétrica é adequada ao equipamento.
 PRÁTICA 1
FATORES QUE INTERFEREM NO PROCESSO FERMENTATIVO

EXPERIMENTO 1

Uma das melhores formas de aprender alguma coisa é fazendo esta coisa!
Por isso, os experimentos selecionados o ajudarão a entender melhor os
fenômenos envolvidos no processo de fermentação. Após realizar os
experimentos, responda os questionários propostos. Pois assim, você poderá
identificar quais são as suas dúvidas e procurar solucioná-las.

Experimento n° 1 - Observação Microscópica

Com a realização deste experimento você poderá entender melhor como as

leveduras se desenvolvem, a influência do meio no seu crescimento, entre
outros aspectos importantes envolvidos no processo de fermentação.

Material necessário:

1) 3 Frascos

2) colheres (uma pequena e outra grande)

3) Fermento biológico (fabricação de pão)

4) Açúcar

5) Água morna (20º - 25ºC) e água gelada (5 ºC)

Procedimento:

1) Primeiramente, numere os 3 frascos.

2) Frasco 1: coloque uma colher (pequena) rasa de fermento e 2
colheres (grandes) de água morna
3) Frasco 2: coloque uma colher (pequena) rasa de açúcar , uma
colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de água
morna
4) Frasco 3: coloque uma colher (pequena) rasa de açúcar , uma
colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de água
gelada (5º)

Houve alguma mudança com o decorrer do tempo? O frasco n° 2 apresentou

os mesmos resultados dos outros dois? Você saberia explicar este
comportamento? O que é a fermentação de fato? Que reações ocorrem
durante o processo fermentativo? Quais os responsáveis pelas alterações nos
frascos?

O Que Você Aprendeu com o Experimento 1?

Após a realização deste experimento, você deverá ser capaz de :

1) explicar a importância do açúcar, da água e do fermento na fermentação.

Logo, também saberá explicar a influência do meio no qual a fermentação
se desenvolve.

2) perceber que o processo fermentativo pode ser afetado por diversos

fatores que alteram a velocidade em que este ocorre. Você saberia dizer
quais são estes fatores?
EXPERIMENTO 2:

ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO DE UMA POPULAÇÃO DE LEVEDURA

1. REFERENCIAL TEÓRICO:
Acompanhar a curva de crescimento em meio liquido, em cultura
descontinua, de uma população da levedura Saccharomyces cerevisiae. O
crescimento da cultura de levedura será conduzido em agitador orbital
(agitação constante de 250 rpm - rotações por minuto), à temperatura
constante de 25°C. A curva de crescimento será obtida com base na
determinação espectrofotométrica da Densidade Óptica (DO) da cultura,
medida no comprimento de onda de 640nm (DO640nm), ao longo do tempo de
incubação. Pretende-se determinar a taxa específica de crescimento e o
tempo de duplicaçao da cultura de levedura nas condições ensaiadas.

Curva de crescimento microbiano

O crescimento microbiano é frequentemente acompanhado com base na

curva que representa o crescimento de uma população de um determinado
microrganismo, em sistema fechado ou em “batch” (cultura em
descontínuo). Neste caso, um meio de cultura liquido contendo os nutrientes
necessários ao crescimento celular é inoculado com uma população de
células viáveis do microrganismo e incubado em condições ambientais
favoráveis à sua multiplicação.
Se acompanharmos o crescimento da população de células ao longo do
tempo e representarmos graficamente o logaritmo do número de células por
unidade de volume (ou, da Densidade Óptica da cultura, D.O, ou da
concentração da Biomassa Microbiana, X) em função do tempo, obter-se-á
uma curva característica, como ilustrado na figura abaixo, que exibe as várias
fases do crescimento microbiano em descontínuo e cujo significado é
descrito abaixo.
Fases do crescimento em cultura descontínua

Fase de latência (ou "LAG")

Durante o período de tempo que se segue à inoculação do meio de cultura,

as células dos microrganismos têm normalmente que se adaptar ao novo
meio. Durante este período inicial, pode não ocorrer multiplicação celular.
Durante este período verifica-se, por exemplo, a síntese de novas enzimas.
Estas podem ser necessárias à síntese de compostos essenciais ao
crescimento e que não se encontrem presentes no meio de cultura ou para
a hidrólise ou metabolização dos compostos presentes e que são as únicas
fontes de carbono a que o organismo não se encontra adaptado. Esta fase
dita de latência pode ter uma duração mais ou menos extensa de acordo
com o estado fisiológico da cultura usada como inóculo e as condições de
crescimento. Por exemplo, a presença de um percentual elevado de células
não-viáveis no inóculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial
difícil de metabolizar ou a incubação em condições ambientais de estresse a
que o organismo não se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases
de latência extensas.

Fase exponencial

Após um curto período de aceleração, a taxa de crescimento da população

microbiana torna-se constante, isto é, as células sofrem divisão e o seu
número duplica após um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase,
em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismos
dividem-se e a população cresce com uma taxa específica de crescimento
máxima que depende do potencial genético do microrganismo, da
composição do meio de cultura e das condições de crescimento
(temperatura, pH, disponibilidade de água, etc.).
Fase de desaceleração

Durante esta fase ocorre um declínio da taxa específica máxima de

crescimento, em resultado da diminuição para valores limitantes do
crescimento da concentração de um ou mais nutrientes essenciais ao
metabolismo celular e/ou do aumento da concentração de produtos do
metabolismo tóxicos para as células.

Fase estacionária

Na fase estacionária o esgotamento de um nutriente essencial e/ou

a acumulação de produtos inibidores do metabolismo provoca a parada de
divisão da população. No entanto, em carência de nutrientes, as células
podem manter-se viáveis durante períodos de tempo mais ou menos longos,
à custa das reservas endógenas, que usam em processos de manutenção.
Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declínio da concentração
de células viáveis durante a fase de morte celular.

Fase de morte

Durante a fase de morte ocorre a perda irreversível da capacidade de divisão

celular (morte celular), o que origina um decréscimo da concentração de
células viáveis na população microbiana ao longo do tempo.

Como realizar a curva de crescimento de uma população microbiana

Para acompanhar e traçar a curva de crescimento de uma população

microbiana é necessário fazer a avaliação quantitativa da evolução da
concentração de células ao longo do tempo. Esta avaliação pode basear-se
em métodos diretos ou indiretos.

Métodos Diretos:

contagem de células totais;

contagem de células viáveis;
determinação da biomassa seca.

Métodos indiretos:

Análise espectrofotométrica da Densidade Óptica (D.O.) da cultura

Na prática, o crescimento é geralmente acompanhado com base na

determinação da Densidade Óptica da cultura, da concentração de células
(totais ou viáveis) ou da massa celular (biomassa).
Contagem de células totais

Este método baseia-se no preenchimento de uma cavidade situada entre

uma lâmina e uma lamínula com uma suspensão de células. Esta cavidade,
localizada no centro da lâmina, encontra-se dividida em quadrados de
dimensões bem definidas e, assim, de volume conhecido.

Utilizando o microscópio, é possível contar o número de células presentes em

cada quadrado e, assim, conhecer o número de células por unidade de
volume, como ilustrado na figura acima. A lâmina utilizada para este tipo de
contagem é denominada de Câmara de Neubauer.

A contagem direta ao microscópio permite estimar fácil e rapidamente o

número total de células numa população microbiana. Porém, apresenta
várias limitações,como:

não permite distinguir células viáveis de células mortas;

células muito pequenas, como é o caso das células de muitas bactérias,
são difíceis de distinguir;
é um método pouco preciso;
o fraco contraste entre as células transparentes e o meio circundante,
quando a amostra não é corada, dificulta (ou inviabiliza) a contagem.
Nestes casos, é necessário utilizar um microscópio de contraste de fase;
células móveis devem ser imobilizadas antes de se proceder à contagem.

Contagem de células viáveis

Este método também é conhecido como Contagem de Unidades

Formadoras de Colónias (UFCs).

Na contagem direta ao microscópio mencionada anteriormente são contadas

tanto células viáveis como células mortas. Em muitos casos estamos
interessados somente na contagem do número de células viáveis. O modo
usual de realizar uma contagem de células viáveis consiste em determinar o
número de células capazes de formar colónias num meio de cultura sólido
com composição adequada ao crescimento do microrganismo. Assume-se
que cada colónia é originada a partir de uma única célula viável, o que nem
sempre é verdade (p. ex. duas ou mais células que formam um agregado ,
darão origem a uma única colónia). Por isso, os resultados são normalmente
expressos em Unidades Formadoras de Colónias (UFCs) e o método pode ser
designado por contagem de UFCs.
Estimativa da biomassa seca

Envolve a pesagem das células microbianas. Corresponde frequentemente à

determinação do peso seco das células presentes num determinado volume
de cultura. As células são filtradas ou centrifugadas, lavadas e secas numa
estufa (usualmente a 80ºC) até peso constante. Este processo é muito
demorado. É usado em circunstâncias específicas, como, por exemplo
quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.

Análise espectrofotométrica da Densidade Óptica (D.O.) de uma cultura

microbiana

A avaliação da turbidez de uma cultura microbiana constitui um método

rápido, embora indireto, de estimar a concentração celular. Um feixe de luz
focado numa suspensão microbiana é parcialmente desviado (dispersão da
luz) pelas células, e a percentagem de luz não desviada (transmitância, T) é
medida através de um espectrofotómetro. A quantidade de luz que atravessa
a suspensão celular depende da concentração de células na suspensão e do
tamanho destas, do comprimento de onda e da intensidade (I0) da luz
incidente e do diâmetro do tubo que contém a suspensão celular. A
Densidade Óptica (D.O.) da cultura corresponde à Absorvância, que é
determinada com base na expressão D.O = log (I0/I)), onde Io é a intensidade
da luz incidente e I é a intensidade da luz transmitida através da suspensão de
células.

Comprimentos de onda geralmente usados para medição da Densidade

Óptica de suspensões de células de bactérias ou leveduras incluem 540, 600
ou 640 nm.

Figura: Representação do percurso efetuado pelo feixe de luz emitido pela

fonte num espectrofotómetro (percurso óptico).

A fotocélula (detector) quantifica a luz que não foi desviada pelas células
presentes na suspensão microbiana, I, medindo-se a Densidade Óptica (D.O)
dessa suspensão (com base na Absorvância).
Figura: Para suspensões celulares muito concentradas deixa de haver uma
relação linear entre a D.O. da cultura e o número de células na suspensão
celular (gráfico à esquerda). Exemplo de duas curvas de crescimento reais,
obtidas com base na medição da D.O. da suspensão celular ao longo do
tempo, para dois microrganismos diferentes (gráfico à direita).

Existe, dentro de certos limites, uma relação linear entre a Absorvância

ou D.O. da cultura e o número total de células por mililitro de suspensão, ou
seja a concentração celular. Contudo, para suspensões celulares muito
densas é frequentemente necessário diluir as culturas de modo a que todos
os valores de D.O. medidos estejam incluídos na parte linear da curva
D.O. versus concentração celular (ver gráfico do lado esquerdo).

Este método não permite distinguir entre células viáveis e células mortas e
não permite obter diretamente valores absolutos da concentração de células.

CRESCIMENTO EXPONENCIAL

Caracterização

O crescimento exponencial de uma população microbiana em suspensão em

meio líquido é caracterizado pela duplicação do número de células e, por
conseguinte, da massa (biomassa).

No processo de duplicação de um microrganismo durante a fase de

crescimento exponencial, após a duplicação (ou replicação) do material
genético a célula divide-se para dar uma célula-filha com as mesma
características da célula inicial.

Tempo de geração ou duplicação:

O tempo de geração ou duplicação de um microrganismo é definido como o
tempo necessário para que ocorra uma geração, isto é, para a formação de 2
células a partir de uma.

O tempo de geração ou duplicação varia grandemente entre microrganismos.

Além disso, o tempo de geração/duplicação de um dado microrganismo
depende da composição do meio de crescimento e de condições ambientais,
como a temperatura, pH, disponibilidade de água, etc..

Cinética do crescimento exponencial:

Durante o crescimento exponencial, o número de células aumenta de acordo
com uma exponencial de base 2 (ver Tempo de geração ou duplicação). De
fato, a duplicação de 2 células em 4 pode ser expressa como 21 -> 22, a de 4
em 8 é expressa como 22 -> 23, e por aí adiante. Existe uma relação entre o
número de células presentes no início (tempo zero) do crescimento
exponencial e o número de células presente após um período t desse
crescimento exponencial, dada pela seguinte equação:

N0 é o número de células presentes no início do crescimento exponencial e n

é o número de gerações que ocorreram durante o período t de crescimento
exponencial. É possível exprimir o parâmetro n em função de Nt e N0, numa
população em crescimento exponencial, com base na equação:

N0 = 1 (número de células no inicio do crescimento exponencial)

N5,5 = 1024 (número de células após 5,5 horas de crescimento exponencial)

Portanto, o valor de n, o número médio de gerações que ocorreram durante

as 5,5 horas de crescimento exponencial, é igual a 10.

O tempo de duplicação ou geração, g, pode ser calculado como t/n, onde t é

o tempo de duração (horas ou minutos) do crescimento exponencial e n o
número de gerações ocorridas durante essa fase do crescimento exponencial.
Com base na avaliação quantitativa do crescimento de uma população de
células de um determinado microrganismo, é possível conhecer os valores de
Nt e N0 ao longo do tempo t, (como exemplificado na tabela). O
conhecimento de dados experimentais deste tipo permite, com base na
equação acima, calcular o tempo que a população microbiana demora para
duplicar o numero de células, em condições bem definidas, isto é, o seu
tempo de geração ou duplicação. É também possível, calcular a taxa
específica de crescimento do microrganismo.

Cálculo do tempo de geração (g):

Assim, o tempo médio de uma geração (g) é 0.55 h ou 33 minutos.

A taxa específica de crescimento, μ, e o tempo de geração ou duplicação, g,

de uma população microbiana são parâmetros muito importantes em
Microbiologia. Os valores de μ e g dependem da estirpe(cepa) microbiana e
são fortemente influenciados pelas condições ambientais e pela composição
do meio de cultura. Por um lado, o seu conhecimento permite prever como
evoluirá a concentração de um microrganismo ao longo do tempo de
crescimento exponencial. Por outro lado, são parâmetros que dão indicação
sobre a resposta do microrganismo às diversas condições ambientais
incluindo a modificação do meio de cultura.

O cálculo dos valores de g e μ de um dado microrganismo, em condições de

cultura diferentes, é útil, por exemplo, para:

selecionar as condições de cultura ótimas para o crescimento desse

microrganismo;
estudar o efeito que uma determinada alteração das condições
ambientais exerce sobre o crescimento do microrganismo.

Cálculo da taxa específica de crescimento:

Figura - Comparação entre a curva aritmética (a laranja) e a curva logarítmica

(a azul) do aumento do número total de células ao longo do tempo durante a
fase do crescimento exponencial.
Para uma população de células em crescimento exponencial, se
representarmos graficamente os valores do número de células em função do
tempo de crescimento, obtém-se uma função exponencial (representação
aritmética no gráfico acima). Esta é representada pela equação :

que traduz o caráter exponencial do crescimento microbiano, e onde Nt é a

concentração de células no tempo e N0 é a concentração de células no inicio
do crescimento exponencial.

Se aplicarmos logaritmos naturais de um e do outro lado da equação, obtém-

se:

onde μ é a taxa específica de crescimento do microrganismo, nas condições

de crescimento testadas (as suas unidades são o inverso do tempo; por
exemplo h-1, min-1). Este parâmetro do crescimento, que reflete a sua
cinética, corresponde ao declive da reta que resulta da representação gráfica
do logaritmo natural do número de células em função do tempo
(representação logarítmica no gráfico acima).

A taxa específica de crescimento está relacionada com o número de gerações

(ou o tempo de cada geração) que ocorrem por unidade de tempo numa
cultura em crescimento exponencial. De fato, quanto maior for a taxa
específica de crescimento, mais rapidamente se divide a população, maior é o
número de gerações que ocorrem no mesmo período de tempo e menor é o
tempo de cada geração. A partir dos resultados de uma experiência de
crescimento como os apresentados, é possível calcular o valor da taxa
específica de crescimento da população microbiana.

Assim, se considerarmos os resultados experimentais apresentados na tabela

acima (representados graficamente na figura acima), o valor da taxa
específica de crescimento, μ, pode ser calculado com base numa análise de
regressão linear dos valores de lnNt e t correspondentes à fase de
crescimento exponencial. O valor de μ corresponde ao declive da reta
representada pela equação (não é de esperar que os resultados
experimentais se possam alinhar sobre a reta representada). Uma estimativa
mais grosseira do valor de μ pode ser obtida do seguinte modo:
A taxa específica de crescimento e o tempo de duplicação ou geração de
uma população microbiana estão intimamente relacionados entre si e o valor
de um pode ser calculado a partir do conhecimento do valor do outro, com
base na equação:

Acompanhamento do crescimento em meio líquido de uma população da

levedura Saccharomyces cerevisiae

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

A) Obtenção do inóculo para a experiência de crescimento:

A.1) A partir de uma cultura fresca de Saccharomyces cerevisae em meio

sólido YPD, inocular uma colónia da levedura em 20 ml do meio de cultura
liquido YPD contido em Erlenmeyer de 100 ml.

Composição do meio de cultura YPD: Peptona (10g), Extrato de levedura

(20g), Glicose (10g), Água destilada (1 L). pH em torno de 5.

A.2) Incubar durante a noite a 30°C com agitação constante (250 rpm).

B) Experiência de crescimento:
B.1) Inocular em 50 ml de meio de crescimento líquido YPD (contido num
Erlenmeyer de 100 ml e a temperatura de 30°C) um volume adequado do
inóculo líquido preparado no passo anterior.
 OBS.: O volume de inóculo deverá ser calculado de modo que a
Densidade Óptica (DO640nm) da suspensão celular no início do
crescimento seja aproximadamente igual a 0,3.

Procedimento

Se a DO640nm da cultura de inóculo, após incubação durante a noite, for igual a

5,5:

B.2) Avaliar, imediatamente, a DO640nm da cultura correspondente ao início

(tempo zero) do crescimento, conforme o procedimento seguinte.

Procedimento para avaliar a Densidade Óptica da cultura

Utilizar um espectrofotómetro visível para medir a Densidade Óptica da

suspensão de levedura, no comprimento de onda de 640nm (DO640nm):

1. Ligue o espectrofotómetro e fixe o comprimento de onda a 640 nm, 10 a 15

minutos antes de proceder às leituras.
2. Calibre o espectrofotómetro com um Branco constituído pelo meio de cultura
utilizado no experimento, fixando a absorvância a ZERO (correspondente a
transmitância igual a 100%).
3. Após homogeneização da suspensão celular por agitação em vórtex, proceda
à leitura do valor da Absorvância.

B.3) Incubar, imediatamente, a suspensão celular num incubador orbital a

30°C e com agitação constante (250 rpm).

B.4) Acompanhar o crescimento da população de levedura através da leitura

da Densidade Óptica da cultura, no comprimento de onda de 640 nm, de 30
em 30 minutos.
 OBS.: Diluir todas as amostras em água destilada, de modo a que o valor
da DO640nm das suspensões celulares lida no espectrofotómetro não
ultrapasse 0,4.

Atenção:
Ter o cuidado de homogeneizar a suspensão celular antes da amostragem e
após cada diluição.

Exemplo de resultados experimentais

Exemplo de resultados experimentais que podem ser obtidos:

EXPERIMENTO 3:

EXPERIMENTOS EM FERMENTÔMETRO PARA AVALIAR DIFERENTES

SUBSTRATOS (FRUTOS DA AMAZÔNIA) COMO MATÉRIA-PRIMA PARA A
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA.

Fermentômetro: é um dispositivo que possibilita acompanhar o processo

fermentativo por meio de sucessivas pesagens do conjunto, em intervalos de
tempos regulares, sendo a perda de peso obtida, decorrente do
desprendimento de CO2. Os valores obtidos de CO2 são utilizados para
estimar:

O etanol produzido e consequentemente a concentração de açúcares

fermetecíveis na polpa.

Conhecer previamente o comportamento do microrganismo frentes

as características adversas da matéria-prima.

Procedimento:

1. Adicionar 100 ml de suco e 100 ml de água destilada estéril em um

erlenmeyer de 250 mL

2. Determinar o grau Brix utilizando um refratômetro portátil

3. Adicionar o inóculo

4. Determinar o número de células e viabilidade utilizando uma câmara de

Neubauer
5. Adicionar a vávula de Muller (air lock)

6. Pesar o sistema

7. Monitorar a cada 6 horas: Peso do sistema, Grau Brix e Número de células

Desprendimento de CO2:

O monitoramento é realizado com base na diferença de peso do sistema,

resultante da liberação de CO2, durante a fermentação.

O resultado é expresso em g/L de CO2 desprendidos do sistema de acordo

com a fórmula:

Etanol equivalente:

É obtido com base na estequiometria, levando-se em consideração o CO2

desprendido durante o processo fermentativo.
Determinação do número de células e viabilidade em câmara de Neubauer

1. Adicionar 1 ml da suspensão de células e 1 mL do corante azul de

metileno em um tubo de ensaio.

2. Agitar com vortex

3. Fazer a contagem em câmara de Neubauer

OBS.: as células mortas absorvem o corante e apresentam coloração azul.

O resultado é expresso como células /mL de acordo com a fórmula: