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Dr. Marcelo de Pádula


Departamento de Análises Clínicas
e Toxicológicas
Faculdade de Farmácia - UFRJ
÷ntrodução
‡ Microorganismos
± Pró e eucarióticos: diferenças (núcleo,
organelas, parede celular, tempo de
geração«)

± Formação de colônias (UFC)


‡ Aspecto, cor, sensibilidade à color. Gram.
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p = po. 2n
p ĺno de céls em t 0
po ĺ no de céls inicial
n ĺ no de gerações.
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÷ntrodução
‡ Microorganismo como ferramenta:
‡ Dosagem de antibióticos, bioindicadores, padrões
para validação de crescimento, teste desafio, etc.

‡ Tipos de crescimento
± Germinação x esporulação
± Consumo tolerância a oxigênio
T÷POS DE CRESC÷MEpTO

AERÓB÷CO ApAERÓB÷CO

M÷CROAERÓF÷LO AEROTOLERApTE FACULTAT÷ O


Contaminação de produtos
farmacêuticos
‡ Fontes:
à  
‡ Pós ou material com Ļ ativ. água ĺ baixa carga microbiana
viável
‡ Origem natural (fitoterápicos)!!
‡ · 
2

‡ Área de produção, estocagem, etc...ĺ onde ocorra acúmulo
de resíduos.
‡ equipamentos
Y   
‡ Derivado da perda de pele ĺ flora normal.
‡ Aerossóis
‡ Depende de hábitos higiênicos ĺ flora patogênica.
Fatores moduladores da
sobrevivência e crescimento
‡ Água
± Líquido, creme, pomada, pós e comprimidos
‡ pH
‡ Material nutriente
‡ Oxigênio
‡ Tempo de estocagem
» Condições, embalagem plástica, vidro«
‡ Temperatura
‡ Preservantes
Degradação
‡ Capacidade metabólica de obter nutriente
‡ Fungos predominam em cremes e emulsões
‡ Tipo de nutriente (aa, açúcares, lipídeos..)
‡ Tempo variável
± Geração de odores, alteração de aspecto
aparecimento de pigmentos, toxinas, etc)
Riscos: 
‡ Degradação do produto (Princ. Ativo)
Contaminação do consumidorĺ÷nfc. Hosp.
± Estado imunológico, via de administração
± característica quali quantitativa da infecção
‡ Transmissão por fômites (fomitos), objetos de toilet
‡ Carga Microbiana Efetiva:
± „   : 106-107
± Salmonella sp.: 102-103
» Crianças e idosos: limites menores
Contaminação e Produção
‡ Conceito de a 
(carga microbiana)
± Fitoterápicos 105/g ou ml (MP) e ausência de
patógenos*. (WHO)
‡ Chás/infusões /uso tópico: limite depende do
contaminante.
‡ Uso interno (sem aquecimento): limites ainda
menores.

*caso contrário: descontaminação química ou com


radiação: limite 105 „   /g ou ml
Água!!!!

B÷OF÷LME!!!!!!
Extracellular polymeric substances!
Biofilme: etapas
Água (cont.)!!!!
‡ Água
± Distribuição urbana= CloroĹ Ĺ Ĺ
± Poço artesiano = prob contaminação!
‡ Fossas sépticas!
‡ Produtos não estéreis
‡ Água deionizada (carvão ativo, troca iônica)
‡ Contornar contaminação: U 254 nm, filtração
(0,22 µm) , fluxo constante sem estagnação.
Água - monografias
‡ Purificada:
± diversos métodos ĺ pura e livre de aditivos. pão WF÷!

‡ ÷njetáveis:
± destilação ou OR ĺ Bact. EndoTox free: BET

‡ Purificada estéril:
± Purificada e esterilizada. pão WF÷
± Outros tipos:
» ÷nalação, bacteriostática (WF÷), irrigar

‡ Potável
± Ausência CF em 100 ml e CT em 100 ml
Osmose reversa
BPF no controle de contaminação
‡ Antes restrita a produtos estéreis
‡ Qualidade e consistência
± Processo, compra, equipamento, pessoal...

‡ Pressão do mercado ĺ não estéreis


± Conceitos
Zona Formação de pessoal
Roupa Projeto da planta
Desinfecção/limpeza Documentação
Procedimentos (pontos críticos)
Controle de Produtos pão Estéreis
‡ Objetivo
‡ Contaminação qualitativa quantitativa é controlada
» pão comprometa Eficácia/÷nocuidade (1os limites década de 1930)
» Atenção a debilitados e imunodeprimidos

‡ Microorganismos críticos (proibitivos)


‡ Saprófitas
‡ O 
., „   ,   
.,   


 , O     

‡ |osmetic oiletry and ragrance ssociation


± Bebês 500 µorg/g (ml) (Tipo ÷ - mucosa 102 UFC)*
± Outros 1000 µorg/g (ml) (Tipo ÷÷ ± 103 UFC)*

Ap ÷SA 1999*
Metodologia de Análise
‡ Três etapas
‡ Amostragem (¥n) de diferentes profundidades:
» coleta, transporte, preparação da amostra*
‡ Contagem
‡ ÷solamento e identificação
‡ Contagem
± Pour plate
± Semeadura em superfície
± Membrana filtrante
± púmero mais provável
Atenção: preservantes e homogeneidade: produtos sólidos
Pour Plate
‡ Amostra (1-2 ml) ĺ meio fundido 45-48oC (tween 0,1%?)
(20 ml) (Cuidado c/ amostras turvas)

Fungos e
leveduras
5-7 dias
Bactérias 20-25oC
2-5 dias
30-35oC

j 
Pour Plate (maison)
‡ Amostra (0,1-0,2 ml) ĺ meio fundido 42oC (4 ml)
(c/ágar a 0,75%)

16 ml meio base 20 ml meio


ágar normal total

antagens: menor quant. amostra (diluição?)


menor estresse com calor,
melhor homogeneização na placa,
menor condensação.
Semeadura em superfície
‡ Amostra (0,1-0,5 ml) ĺ placas previamente preparadas

Gotas residuais

Divisão na gota!
pão deve haver resíduo !!!!
Contagem superestimada
Membrana filtrante
Amostra (volumesĹĹĹ) ĺ filtrada (0,22 µm e 47 mm diametro)

MAp÷FOLD

ÁCUO
TRApSFERÊpC÷A
ASSÉPT÷CA

Atenção: fitoterápicos e número de colônias


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púmero mais provável
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Pesquisa dos patógenos
‡ 

±   
 
 : tópicos (olhos)
± O     : tópicos (todos)
± „    O 
: orais

‡ ETAPA CRUC÷AL
± !
*Caseína-soja
**Caldo lactose
ME÷O SELET÷ OS
‡ Destacam metabolismo específico
± Lipólise (gema de ovo), cor negra (redução
de cloretos de telúrio),
± Fermentação, viragem de vermelho de fenol
(pH)
± ÷nibição de crescimento competitivo com azul
de metileno (Gram+)
‡ Testes adicionais
± Aproveitamento de amoníaco, citrato,
atividade peroxidase, coagulase, etc.
Métodos alternativos
‡ Radiometria (14C)
‡ Eletroforese (ptn marcadas 35S-met)
‡ LAL (lisado de amebócitos do LP)
‡ Cromatografia gasosa (perfil de ác. graxos)
‡ Presença de ATP (luciferina/luciferase)
‡ Microcalorimetria
‡ Condutimetria (variação da ddp)
Radiometria 14 C
Eletroforese (ptn marcadas 35S-met)

Katz* and Taichman,1999


LAL (Limulus amebocyte lysate)

LPS de parede celular são característicos de bactérias gram negativas, os quais


Reagem com o lisado de amebócitos de maneira dose-dependente.
Cromatografia gasosa

Perfil de ácidos graxos


(Bae  ., 2001)
Presença de ATP (luciferina/luciferase)

DEPEpDE DE ATP!!
Microcalorimetria
Condutimetria (variação da ddp)

4   

Controle de Água
‡ Potabilidade
± ausência de patógenosĺcontaminação fecal
‡ Dificuldade da pesquisa direta
± ÷
  de contaminação fecal
‡ Características do ÷ndicador
± Presença simultânea a de outros patógenos
± Resistência e sobrevivência equivalentes
± Praticidade de detecção
Controle de Água (cont.)
‡ Coliformes fecais
± Gram-, facultativos, fermentam lactose (gás) a 44,5oC
‡ Amostragem
‡ Frasco estéril, desprezar primeiras porções
‡ Água clorada ĺ tiossulfato de sódio
‡ Análise não é imediata ĺ resfriar a 10oC
‡ Teste
± Presuntivo : tubos com tubo de Durhan
± Confirmatório:Caldo Bile-verde Brilhante
Controle de Produtos Estéreis
‡ Esterilidade
± ausência de microorganismo viável
‡ Aspecto probabilístico
± Análise por método destrutivo
± Como analisar um lote com segurança??
‡ Aspecto Microbiológico
± Qual é o contaminante??
± Existe teste padrão? múltiplas formas
farmacêuticas!! Como recuperar sem contaminar??
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Controle de Produtos Estéreis
(cont.)
‡ Obtenção de Produto Estéril
‡ Manipulação asséptica
‡ Esterilização após envase
‡ Cinética de ÷nativação
‡ pt = po . e-kt
± pt :número de sobreviventes após tempo t
± po: número de µorg no tempo zero
± t: tempo de exposição
± K: constante de inativação ( 
)
‡ Parâmetros de ÷nativação
‡ alor D: tempo de exposição para Ļ 90% da população
‡ alor Z: é o valor de aumento de temperatura capaz de
reduzir em 90% o valor D
1e+0

1e-1

1e-2

1e-3
 

1e-4

1e-5

1e-6
0 2 4 6 8 10

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1e-1

1e-2

1e-3
 

1e-4

1e-5

alor D??

1e-6
0 2 4 6 8 10

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§

-

alor Z= ~ ,§oC

-

-

-
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§    §

?  ?%  &
Processos de esterilização
‡ Padrões para validação de cada processo
± Calor seco (estufa 250oC)
± Calor úmido (autoclave)
± Gasosa (formaldeído , óxido de etileno)
± Radiação (U C, Raio X, Gama, partículas)
± Filtração (membranas e filtros HEPA)
Teste de esterilidade
‡ Métodos
» ÷noculação direta (fluxo horizontal)*
» Filtração em membrana (fluxo vertical)**
‡ Controle e validação dos meios
» Suporta crescimento? (indicadores)
» Esterilidade (7 dias sem crescimento)
» Testar presença fungistáticos e bacteriostáticos

‡ ÷nterpretação
» pão crescimento ĺ satisfatório
» Crescimento ĺ identificação µorg (falha na
manipulação??
» Reteste ĺ crescimento (reprovar)
Controle e assepsia de salas estéreis

‡ Objetivos
‡ Reduzir níveis de contaminação: máx 10 UFC/m2 (envase, produção e sala
de testes.
‡ ÷dentificar contaminantes no ar e superfícies de áreas estéreis

‡ Teste de área (superfície)


‡ Placas de petri abertas em pontos críticos ou SWAB
± Meios: sabouraud (fungos) e casoy (bactérias) incubação 7 dias
± Resultados: até 2 UFC/placa ĺ satisfatório; 3-4 UCF/placaĺaceitável; >5
UFC/placa ĺ não satisfatório (medida de ação)

‡ Teste de ar
‡ Limites (m3) para salas das classes 100, 10.000 e 1.000.000 (respec.)
± < 3 UFC
± < 20 UFC
± < 100 UFC
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‡ Esterilização
± Calor seco e Calor úmido: Cinética de inativação microbiana: mínimo
6D (bioindicadores ou termopares??)
± Radiação ionizante (Rx) e não ionizante (U )
± Óxido de etileno??
‡ Preparo de meios de cultura
± Uso dos reagentes: validade??
± Suporte de crescimento
‡ Material para crescimento celular
± Placas de Petri, material descartável (fornecedor)
± Aderência: debris celular ± biofilme! (tips)
‡ Demais procedimentos
± Balanças
±   
± Estufas de crescimento, etc
Manutenção de estoques de
M.O.

1) Congelamento
2) Liofilização
3) Slants
4) Placas petri (refrigeração)
5) Meio líquido

÷MPORTApTE: ER÷F÷CAÇÃO DE MARCADORES!!!


SURPRESAS