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técnicas básicas de microbiologia

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Departamento Acadêmico de Química

Curso Técnico Integrado Disciplina: Microbiologia Industrial Relatório de Aulas Práticas
Alunos: Maria Luiza Andrade Aquino Mariana Gabriela de Oliveira Ruslam Romaine Eleutério Subturma: T3 Professora: Fernanda Badotti 1. Título

Técnicas básicas de Microbiologia Prática
2. Introdução De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais. Alguns podem crescer com algumas poucas substâncias inorgânicas como sua única exigência nutricional, enquanto outros assemelham-se aos organismos superiores na sua necessidade de compostos orgânicos complexos. A água, também, é extremamente importante para os microrganismos, porque a maioria deles pode absorver nutrientes somente quando as substâncias químicas estão dissolvidas nela. Estas exigências químicas, aliadas à condições físicas adequadas (pH, pressão osmótica, grau de umidade, temperatura, atmosfera gasosa, dentre outras) devem ser fornecidas pelo meio onde o organismo se encontra, permitindo assim o seu desenvolvimento. O cultivo de microrganismos requer meio de cultura apropriados. Os meios são preparações de nutrientes utilizados com a finalidade de cultivar e manter microrganismos viáveis no laboratório. Esses meios devem fornecer os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns microrganismos também necessitam de fatores de crescimento que são substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, etc. Os meios de cultura podem ser quimicamente definidos, nos quais se conhece a composição exata e assim, pode-se saber se determinado constituinte é essencial para o crescimento de certo microrganismo; pode ser complexo, utilizado mais comumente em laboratório, esses meios têm função de simular, até mesmo melhorar o ambiente natural dos microrganismos que estão sendo estudados (geralmente, incluem extratos de carne, peptonas, extrato de levedura, sangue, soro, leite, extrato de solo e fluido de rúmen de bovino); ou podem ser ainda de cultura de células in vitro, nos quais culturas de células animais e de plantas desenvolvidas são utilizadas para cultivar vírus in vitro, uma vez que sua replicação ocorre somente dentro de células hospedeiras vivas.

Os meios de cultura podem ser classificados quanto ao estado que se encontram: - Meio líquido: no qual os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa; - Meio semi-sólido: apresenta em sua composição nutrientes e ágar em uma pequena porcentagem. - Meio sólido: apresenta em sua composição nutrientes e cerca de 15 g de Agar/1000 mL de água destilada. O ágar é um polissacarídeo complexo extraído de uma alga marinha. Ele apresenta muitas propriedades que o tornam um agente solidificante ideal: funde-se em torno do ponto de ebulição da água (100 ºC), formando uma solução transparente, e então permanece no estado líquido até em torno de 40 ºC. Como a maioria dos microrganismos não são mortos a 45 ºC, eles podem ser adicionados a um meio contendo ágar liquefeito antes que o meio seja solidificado em tubos ou placas de Petri. O meio contendo ágar, após se solidificar e resfriar, permanece solidificado a temperaturas de incubação e pode ser inoculado com microrganismos. Existem centenas de meios diferentes disponíveis: - Meio de enriquecimento: aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outrso. - Meio seletivo: aquele que permite o crescimento de um tipo particular de microrganismo e/ou suprimem o crescimento de outro. - Meio de manutenção: aquele que oferece a manutenção adequada da viabilidade e das características fisiológicas de uma cultura. - Meio diferencial: possui substâncias que evidenciam uma característica que permite separar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Quando se prepara meios de cultura é necessário atentar para seu tempo de uso, pois não se pode deixar uma solução não estéril por mais de uma hora, devido à possibilidade de evaporação da água e do crescimento microbiano; não podem também ser mantidas em altas temperaturas antes de serem esterilizadas, uma vez que haverá degradação de vários reagentes do meio.

3. Objetivos Dominar as técnicas apresentadas e compreender sua importância.

4. Materiais necessários 4.1 Reagentes: • Água; • Ágar nutriente; • Caldo Lactosado. 4.2 Materiais • Placa de Petri; • Tubos de ensaio com tampa (de rosca e de algodão hidrofóbico); • Tubo de Durham; • Erlenmeyer. 4.3 Equipamentos • Alça de Drigalsky; • Alça de platina; • Barbante; • Papel Kraft; • Suporte para tubo de ensaio; • Papel alumínio; • Fita de autoclave; • Ponteira de plástico; • Fita crepe; • Autoclave; • Bico de Bunsen; • Capela de fluxo laminar; • Balança analítica; • Contador de colônia;

• Micro-ondas.

5. 1ª etapa: Preparação da atividade prática
5.1 Preenchimento da Ficha Formativa de Reagentes (Tabela 01)

Nomes Meios de cultura/ reagent es

Constituinte s

Composiçã o Químic a
Indefini da

Descrição Físicoquímica

Riscos à saúde/ impacto ambient al

Manuse io

Estocage m

Referên cia bibliogr áfica

Ágar Nutrie nte (500 g)

- Digestão Péptica de Tecido Animal (5 g/L) - Extrato de carne (1,5 g/L) - Extrato de levedura (1,5 g/L) - Cloreto de Sódio (5 g/L) - Ágar (15 g/L)

pH: 7,4 ± 0,2 Aparência do pó: amarelo, homogêneo e livre circulante Solidificação : Firme, comparável com gel de agarose de 1.5% Coloração: Cor âmbar claro. Transparênc ia: Gel levemente opalescente.

O descarte do ágar propicia o crescim ento de microrg anismos em meios aquático s

Uso de jaleco

Deve ser armazenad o no frasco com tampa rosqueável ,a temperatur a ambiente (abaixo de 30 ºC) e após a preparação do meio, de 2-8 ºC. Possui validade de 5 anos (meio não preparado)

-SPLabor. Disponív el em: http://ww w.splabor .com.br/ meiosdecultura/m eios-naoseletivos/ agarnutriente -modelom001.ht ml

- Caseína enzimática (20 g/L) - Hidrolisado (5 g/L) - Lactose (1,5 g/ l )

Indefini da

pH: 6,9 ± 0,2 Aparência do pó: cor amarela, homogêneo e pó livre circulante. Coloração: Cor âmbar claro a médio. Transparênc ia: Solução clara sem precipitado.

Caldo Lactos ado

- Mistura de sais biliares (1,5 g/L) - Fosfato dipotássico - Fosfato monopotássic o (1,5 g/L) - Cloreto de Sódio (5 g/L) Methylumbelli fery β-Dglucaronide (MUC) (0,05 g/L)

O descarte do caldo lactosad o propicia o crescim ento de microrg anismos em meios aquático s

Uso de jaleco

Deve ser armazenad o no frasco com tampa rosqueável ,a temperatur a ambiente (abaixo de 30 ºC) e após a preparação do meio, deve ser conservad oa temperatur as de 2-8 ºC. Possui validade de 5 anos (meio não preparado)

SPLabo r.
Disponív el em: http://ww w.splabor .com.br/ meiosdecultura/m eiosparaanalisedelacticinio s/caldolactosemodelom1003ht ml

5.2 Planejamento de gastos de soluções/meios de cultura e cálculos para o planejamento do(a)s mesmo(a)s (Tabela 02) Meios de cultura / soluçõ es Agar Placa de Petri Agar Tubo inclinad o Caldo lactosad o Quantida de/ Grupo (em g e mL) Quantida de/ Subturma (em g e mL) Total por turm a (em ge mL) 62,16 g ou 2,22 mL 10,36 g ou 370 mL 4,81g ou 370 mL Massa e volume final de reagent e prepara do ____ Massa e volume final de reagen te usado 21,84 ou 780 mL 3,64g ou 130 mL 1,69g ou 130 mL Custo de reagente s forneced ores (2006) Custo da prátic a

5,04g ou 180 mL

21,84g ou 780 mL

R$ 119,95

R$ 7,45

0,84g ou 30 mL

3,64g ou 130 mL

R$ 119,95

____

R$ 1,24

0,39g ou 30 mL

1,69g ou 130 mL

1,95g ou 150 mL

R$ 68,00

R$ 0,32

5.3 Cálculos dos meios de cultura/soluções necessárias à execução das práticas • Caldo Lactosado: Para 1L, precisa-se de 13g do meio de cultura Para cada pessoa, usa-se 10 mL desse meio de cultura pronto São 13 pessoas no T3, para não faltar meio de cultura, faz-se então 150 mL Então, para 150 mL, precisa-se de 1,95g de reagente 13g _______________1L X g _______________0,150L • Agar Nutriente para placa de Petri: Para 1L, precisa-se de 28g de Agar Nutriente Para cada pessoa, usa-se 20 mL desse meio de cultura pronto Foram utilizadas 3 placas de Petri por pessoa São 13 pessoas no T3, faz-se então 780 mL Então, para 780 mL, precisa-se de 21,84 g de reagente 28g _______________1L Y g _______________ 0,78 L • Agar Nutriente para o tubo inclinado: Para 1L, precisa-se de 28g de Agar Nutriente Para cada pessoa, usa-se 10 mL desse meio de cultura pronto São 13 pessoas no T3, para não faltar meio de cultura, faz-se então 130 mL Então, para 130 mL, precisa-se de 3,64g de reagente 28g _______________1L Z g _______________ 0,130L logo Z= 3,64g logo Y= 21,84g logo X = 1,95g

6. 2ª etapa – Execução da atividade principal

6.1 Procedimentos/metodologia

• Preparação de meio sólido em Placa de Petri: Ágar Nutriente

1) Separar os meios que serão utilizados e observar os rótulos quanto à classificação, finalidade de uso, data de validade, instrução de preparo, constituição. 2) Fazer os cálculos necessários, adequando massa e volume de solução a ser utilizado. 3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado. 4) Num Erlenmeyer, dissolver o meio em autoclave, banho Maria ou micro-ondas e misturar utilizando o bastão de vidro até obter uma solução homogênea, tampá-lo com rolha. 5) Esterilizar em autoclave. 6) Aguardar o resfriamento do meio até cerca de 45 ºC. 7) Preparar as placas de Petri, que devem estar embrulhadas em papel Kraft e esterilizadas em autoclave. 8) Destampar o Erlenmeyer na zona estéril de um bico de Bunsen, flambar a boca do frasco. 9) Despejar certo volume do meio de cultura nas placas de Petri (cobrindo o fundo da placa), abrindo-a ao lado da chama do bico de Bunsen. Ao concluir a distribuição, deve-se recolocar a tampa na placa rapidamente. 10) Deixar a placa em posição horizontal, até que o meio de cultura se solidifique completamente. 11) Acondicionar as placas em posição invertida em sacos plásticos identificados e armazenar no refrigerador a 4 ºC.

•Preparação de meio sólido em tubos: Ágar nutriente 1) Separar os meios que serão utilizados e observar os rótulos quanto à classificação, finalidade de uso, data de validade, instrução de preparo, constituição. 2) Fazer os cálculos necessários, adequando massa e volume de solução a ser utilizado. 3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado. 4) Num Erlenmeyer, dissolver o meio em autoclave, banho Maria ou micro-ondas e misturar utilizando o bastão de vidro até obter uma solução homogênea, tampá-lo com rolha.

5) Esterilizar em autoclave. 6) Aguardar o resfriamento do meio até cerca de 45 ºC. 7) Distribuir 10 mL em tubos de ensaio (próximo ao bico de Bunsen, flambar a boca do tubo antes e depois da distribuição), tampar com rolha de gaze e algodão hidrofóbico. 8) Esterilizar em autoclave. 9) Retirar da autoclave e posicionar o tubo de forma a permanecer inclinado. Esperar que ele resfrie até estar solidificado. 10) Acondicionar os tubos num recipiente, envolvê-los em papel Kraft e barbante e armazenar no refrigerador a 4 ºC.

•Preparação de meio líquido: Caldo Lactosado

1) Separar os meios que serão utilizados e observar os rótulos quanto à classificação, finalidade de uso, data de validade, instrução de preparo, constituição. 2) Fazer os cálculos necessários, adequando massa e volume de solução a ser utilizado. 3) Utilizar uma proveta para medir o volume de água destilada a ser pesado e adicionado. 4) Dissolver o meio e homogeneizá-lo utilizando um bastão de vidro. 5) Introduzir nos tubos de ensaio um tubo Durham, que tem como função verificar a produção de gás da cultura a ser inoculada. 6) Distribuir 10 mL do Caldo Lactosado nos tubos, utilizando um pipetador automático. Colocar tampa ou rolha de algodão hidrofóbico em cada tubo. 7) Esterilizar em autoclave a 121 ºC por 15 minutos.

O armazenamento dos meios, após preparação, deve ser em geladeira (após resfriamento à temperatura ambiente) e dentro de sacos plásticos para evitar maior desidratação. Os tubos e

placas devem estar identificados claramente com data de preparação, data de vencimento, preparador e conteúdo.

• Obtenção de colônias isoladas por meio de estrias em placa de Petri – Técnica de Esgotamento

1) Com uma alça esterilizada, retirar uma porção de uma cultura em crescimento em meio sólido. 2) Espalhar a cultura em uma placa com meio sólido estéril, fazendo estrias de modo a dividir a placa em 4 setores, preferencialmente, sempre indo de uma extremidade à outra no setor esgotado.

• Transferência de uma cultura de microorganismos de maio sólido para tubo com meio líquido

1) Identificar o tubo com meio de cultura Caldo Lactosado. 2) Esterilizar a alça de transferência na chama do bico de Bunsen até que ela fique vermelha e esfrie-a num canto da placa com inóculo. 3) Remover uma colônia bacteriana com a alça de uma cultura em crescimento em meio sólido. 4) Remover a tampa de um tubo com meio líquido estéril, flambar a boca e introduzir a alça no meio. 5) Agitar a alça para que as bactérias se desprendam e fiquem em suspensão no meio líquido. 6) Flambar a boca do tubo novamente e recolocar a rolha de gaze com algodão hidrofóbico. 7) Esterilizar a alça de transferência.

• Técnica de inoculação em meio sólido inclinado

1) A partir da mesma cultura em ágar nutriente e utilizando uma alça de platina previamente flambada inocular toda a superfície do meio de cultura Agar nutriente no tubo inclinado, em forma de estria.

• Técnica de espalhamento em superfície

1) Identificar as placas com o meio de cultura Agar nutriente de acordo com as diluições adequadas. 2) Transferir 1,0 mL das diluições selecionadas para a superfície do meio de cultura Agar nutriente. 3) Com uma alça de Drigalski, espalhar a amostra uniformemente na superfície do Agar. 4) Incubar as placas a 37 ºC. • Métodos de incorporação ou “pour plate”

1) Identificar as placas vazias de acordo com as diluições adequadas. 2) Inocular 1,0 mL das diluições selecionadas no centro da placa vazia. 3) Verter sobre o inóculo certo volume do ágar nutriente (cobrindo o fundo da placa) fundido e resfriado a cerca de 55 ºC, e homogeneizar o conteúdo com movimentos rotatórios suaves sem erguer a placa. 4) Aguardar a solidificação dos meios e incubar a placa a 37 ºC.

6.1.1 Leitura e interpretação dos resultados Prática 1 – Preparação dos meios de cultura

40% das placas de Petri apresentaram contaminação; não foi possível identificar os microrganismos em questão.

No meio líquido e no tubo inclinado não houve contaminação.

Prática 2 - Distribuição de microrganismos • Placa de Petri (Ágar nutriente – meio sólido):

Houve êxito no esgotamento da bactéria Enterobacter na maioria das placas. O crescimento da Enterobacter não ocorreu em três placas, pois o ágar utilizado nelas era seletivo para E. coli. • Tubo com meio líquido:

Todos os tubos, ao serem agitados, apresentaram turvação mostrando, assim, que houve crescimento da Enterobacter. Não houve fermentação em nenhum tubo. • Tubo inclinado (Ágar nutriente – meio sólido): Houve crescimento estriado da Enterobacter em todos os tubos inclinados.

Prática 3 – Técnica de Espalhamento e “pour plate” • Espalhamento

Tabela 03. Contagem de colônias para a técnica do espalhamento

Amostra Água da Lagoa da Pampulha Cosmético

Diluição 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

Número de colônias 22 14 21 ~359 35 10

Número de morfologias 11 6 6 4 3 4

Leite Terra

10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3

Incontáveis Incontáveis Incontáveis Incontáveis Incontáveis Incontáveis

2 2 2 Aparentemente 1 3 3

- Água da Lagoa da Pampulha: Como esperado, a diluição 10-1 apresentou um grande número de colônias com grande variedade de morfologias. Isso se deve a pequena fração da diluição da amostra, ou seja, foi espalhado um número maior de bactérias com morfologias variadas pela grande concentração em 1 mL de amostra. Na diluição 10-2 houve um menor número de colônias com, também, menor número de morfologias comparando com a diluição 10-1. Isso era esperado já que a concentração da amostra diminuiu. Já a diluição 10-3 apresentou uma maior contaminação que a diluição 10-2. Isso pode ser explicado pelo fato de, por descuido, a placa ter sido aberta num raio maior que 10 cm da chama do bico de Bunsen; já que as colônias observadas são diferentes das presentes nas diluições anteriores, provavelmente, são provenientes do ar. - Cosmético: Como esperado, a diluição 10-1 apresentou um grande número de colônias, sendo que uma das quatro morfologias foi predominante. Essa placa também possuiu um número de colônias maior de 300, dificultando a contagem. Essa mesma morfologia foi a predominante nas outras diluições, mostrando ser a bactéria presente em maior quantidade na amostra. Observou-se, também, que houve um crescimento maior de um determinado tipo de morfologia em relação às outras, mostrando que a amostra contém fatores físicos e químicos apropriados para essa morfologia em detrimento das outras. Outro fator que poderia explicar o pouco desenvolvimento das outras morfologias seria a competição, pois a morfologia que apresentou maior crescimento poderia ter absorvido mais nutrientes e, portanto, ter restado pouco nutriente para as demais morfologias.

- Leite:

Em todas as diluições não foi possível fazer a contagem das colônias, uma vez que quase não havia nenhuma isolada. A explicação para isso se deve ao fato de que o leite utilizado na prática, ficou exposto 24 horas na própria bancada do laboratório, o que provocou contaminação de microorganismos do ar. Estes microorganismos possuíam uma morfologia branca.

- Terra: Na diluição 10-1 parece existir um fungo filamentoso, pela morfologia que parece algodão. Foi apenas constatada essa morfologia, que ocupou toda a placa. O não aparecimento aparente de bactérias pode ter ocorrido pela produção de enzimas desse fungo. Nas diluições 10-2 e 10-3 foram muitas colônias de bactérias, sendo impossível conta-las. Os microrganismos predominantes nessas placas são diferentes dos demais microrganismos das outras amostras. Alguns são iguais tendo a hipótese de ter sido contaminado com o ar devido a manipulação inadequada.

“Pour Plate”

Tabela 04. Contagem de colônias para a técnica “pour plate”

Amostra Água da Lagoa da Pampulha Cosmético

Diluição 10-1 10-2 10-3 10-1

Número de colônias incontáveis 4 10 -

Número de morfologias 3 morfologias ou mais 3 6 -

Leite Terra

10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-1 10-2 10-3 10-4

Incontáveis Incontáveis Incontáveis Erro na diluição Incontáveis Incontáveis Incontáveis

3 3 1 Erro na diluição Várias 3 3

- Água da Lagoa da Pampulha: A diluição 10-1 apresentou uma contaminação muito grande, com um número incontável de colônias. Esse resultado obtido apresenta grande diferença se comparado às colônias observadas nas outras diluições, tanto para o espalhamento, quanto para o “pour plate”. Esse microrganismo pode ser um fungo ou, mais provavelmente, várias colônias de bactérias juntas que apresentam um tipo distinto de crescimento das encontradas anteriormente. (como chegou a essa conclusão) Já na diluição 10-2 houve quatro colônias com três morfologias diferentes, porém as mesmas encontradas nos espalhamentos e diluição 10-3 no "pour plate". Podemos explicar o fato de observarmos um menor número de colônias e morfologias na diluição 10-2 “pour plate” se comparada com a diluição 10-2 no espalhamento, devido ao número de bactérias anaeróbias tolerantes ou ainda, pelo fato de as bactérias (não serem uniformemente distribuídas em água, logo, a alíquota retirada para utilizar no espalhamento pode possuir um maior número de bactérias que aquela utilizada para o “pour plate”.) Na diluição 10-3 houve um maior número de colônias e morfologias que na diluição 10 -2. Isso pode ser explicado por uma manipulação inadequada, erro na diluição ou, como em 10-2, a alíquota retirada poderia conter um maior número de bactérias que as outras. - Cosmético: Dados não divulgados. - Leite: Na diluição 10 -1 houve predominância de um tipo de colônia, branca. Foi possível perceber outras três morfologias diferentes, que podemos considerar que provavelmente são oriundas do ar. (porq) Na diluição 10
-2

manteve-se a predominância de uma morfologia branca, mas houve colônias

menores e mais dissipadas tornando possível a observação das morfologias. Houve ainda a presença de 2 ou 3 colônias diferentes, de cor amarela.

Na diluição 10

-3

foi impossível contar as colônias, pois estava presente inúmeras colônias

pequenas, além das de tamanho maior. Não foi identificados microorganismos com outra morfologia a não ser a branca predominante das outras duas diluições. - Terra: Na diluição 10 diluição 10
-2 -3 -1

houve erro de diluição, provocando pouco crescimento dos microrganismos. Na

foram, aparentemente, várias morfologias, já que foi impossível contá-las. (Nas

diluições 10 e 10-4 houveram 3 tipos de morfologia, aparentemente, já que também foi muito grande o número de colônias, dificultando a análise.) Esses resultados podem indicar que na amostra de terra analisada existem vários microrganismos anaeróbicos tolerantes.

6.1.2 Caracterização dos resíduos (não existe)

O ágar não utilizado (se descartado sólido), será tratado como lixo hospitalar, já o descartado na forma líquida terá o mesmo tratamento que o esgoto. Os produtos que as bactérias geram ao degradar o meio e metabolizá-lo não recebem tratamento específico, porém, podem ser resíduos tóxicos.

6.1.3 Apresentação de propostas de minimização, reutilização, tratamento e descarte dos resíduos gerados

Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e adubos. Para a produção dos alimentos e adubos seria necessário o tratamento dos produtos gerados pela degradação do meio e pelo metabolismo das bactérias. Porém, não foram encontradas pesquisas nessa área. O tratamento existente consiste na combustão dos meios, o que gera muita poluição por gás carbônico e resíduos sólidos não identificados.

6.1.4

Conclusão

Concluímos que são necessárias pesquisas aprofundadas na área de tratamento dos meios. Aprendemos as técnicas apresentadas e compreendemos sua importância.

6.1.5 Bibliografia

- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG. Microbiologia: Conceitos e Aplicações - vol. 1. 2ª Ed.

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