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CONTROLE IMUNOHEMATOLÓGICO

DAS TRANSFUSÕES SANGUÍNEAS

2009
• Transfusões sanguíneas ABO / Rh(D) compatíveis > ± 98% de sucesso
(elevação da concentração de Hb).

• Anticorpos clinicamente importantes diferentes de anti-A, -B, -AB e -D


presentes em ± 2% dos pacientes > destruição prematura dos glóbulos
transfundidos ou causando DHRN.

• Os anticorpos anti- eritrocitários (IgG e IgM) não produzem diretamente


danos às hemácias.

• A importância clínica dos anticorpos depende de fatores que determinam


o grau, o local e o mecanismo da hemólise imune.
FATORES DETERMINANTES DA HEMÓLISE IMUNE

1- Em relação ao anticorpo:
• Range térmico
• Especificidade
• Concentração plasmática
• Avidez
• Classe e subclasse
• Capacidade de fixar complemento

2- Em relação ao antígeno:
• Natureza e densidade na membrana eritrocitária
• Presença no plasma (solúvel)

3- Atividade de Macrófagos / Monócitos / Linfócitos

4- Quantidade de glóbulos transfundidos


MECANISMOS DE HEMÓLISE IMUNE

1- INTRAVASCULAR:
Exs de Acs: Anti- A, -B, -AB, -PP1Pk

• Ativação do complemento (C1 – C9)


• Liberação de anafilotoxinas (C3a – C5a)
• Hemoglobinemia / Hemoglobinúria

2- EXTRAVASCULAR:
Exs de Acs: Anti-Rh, -K, -Fya, -Fyb, -Jka, -Jkb, -S, -s, etc.

• Fagocitose por macrófagos com receptores de Fc e C3b


• Citotoxidade induzida por hemácias altamente opsonizadas (IgG1 e 3)
ANTICORPOS ANTICORPOS ANTICORPOS POSSIVELMENTE ANTICORPOS
CLINICAMENTE BENÍGNOS IMPORTANTES RARAMENTE
IMPORTANTES (SE REATIVOS A 37 0C) IMPORTANTES

ABO Chido / Rodgers Lewis Yt (Yta)

Rh Xg (Xga) MNS (M, N) Vel

Kell Bg P (P1) Ge

Duffy Knops Lutheran Do (Gya, Hy)

Kidd Csa A1 Sda

Diego JMH

MNS (S, s)
Características Sorológicas dos Fenótipos A
Características Sorológicas dos Fenótipos B
Discrepâncias nas Classificações ABO

4 Grupos Básicos:

1. Anticorpos ABO fracos ou ausentes

2. Anticorpos Irregulares

3. Antígenos Extras

4. Antígenos ABO fracos ou ausentes


Anticorpos ABO fracos ou ausentes

Exemplos Anti-A Anti-B AC Hemácias Hemácias Fenótipos


A1 B Prováveis

1 4+ 0 0 0 0 A

2 0 4+ 0 0 0 B (ou AB *)

3 0 0 0 0 0 O

Causas mais prováveis para as discrepâncias:

1- Recém-nascidos
2- Idosos
3- Hipo ou Agamaglobulinemia

* Antígeno A fraco não detectado


Anticorpos Irregulares

Exemplos Anti-A Anti-B AC Hemácias Hemácias Fenótipos


A1 B Prováveis

1 4+ 0 0/+ 1+ 4+ A

2 4+ 4+ 0 2+ 0 AB

3 0 4+ 0/+ 4+ 1+ B

Causas mais prováveis para as discrepâncias:

1- Anti-A1 em indivíduos A2 e A2B (exs: 1 e 2 com AC negativos)

2- Alo-anticorpos IgM : anti-M, -N, -Lea, -Leb, -P1 (exs: 1, 2 e 3 com AC negativos)

3- Rouleaux ou Auto anti-I (exs: 1 e 3 com AC positivos)


Antígenos Extras

Exemplos Anti-A Anti-B AC Hemácias Hemácias Fenótipos


A1 B Prováveis

1 4+ 1+ 0/+ 0 4+ A

2 2+ 4+ + 4+ 0 B

3 2+ 2+ + 4+ 4+ O

4 2+ 2+ + 2+ 2+ O

Causas mais prováveis para as discrepâncias:


1- Fenômeno B adquirido (ex: 1 com AC negativo)
2- Poliaglutinação por exposição do antígeno T (exs: 1, 2 e 3 com AC positivos)
3- Geléia de Wharton (ex: 4 com AC positivo)
Antígenos ABO fracos ou ausentes

Exemplos Anti-A Anti-B AC Hemácias Hemácias Fenótipos


A1 B Prováveis

1 0 0 0 0 4+ A

2 0 4+ 0 0 0 AB (ou B *)

3 1+ 0 0 0 4+ A

Causas mais prováveis para as discrepâncias:

1- Enfraquecimento ou ausência de A em pacientes com Leucemia (exs: 1, 2 e 3)


2- Antígenos A fracos como: Am, Ay (exs: 1 e 2) e Ax (ex: 3)

* Anticorpo Anti-A não detectado


PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
IRREGULARES

Negativa Ausência de anticorpos irregulares

PROVA CRUZADA / PAI

Validar a identificação, pesquisando os


ESPECIFICIDADE (S)
antígenos correspondentes aos
DETERMINADA (S)
anticorpos identificados

- - Mistura de anticorpos
- Anticorpos anti-público

Positiva AUTOCONTROLE
IDENTIFICAÇÃO

- Auto-anticorpos
TODAS AS REAÇÕES +
POSITIVAS - Erro técnico
Presença de Anti-D somente
identificado com a técnica
enzimática (Papaína).
Presença de Anti-Fya, identificado pela técnica de Coombs.

A técnica enzimática apresenta reações negativas com todas as hemácias-teste, já que os antígenos Fy são destruidos por
enzimas proteolíticas.
Paciente A

Presença de auto-anticorpos que podem estar produzindo uma anemia hemolítica auto-imune (AHAI).
Em caso de necessidade de transfusão sanguínea, pesquisar a possibilidade de alo-anticorpos mascarados
pelos auto-anticorpos.
Paciente A

Presença de auto-anticorpos que podem estar produzindo uma anemia hemolítica auto-imune (AHAI).
Em caso de necessidade de transfusão sanguínea, pesquisar a possibilidade de alo-anticorpos mascarados
pelos auto-anticorpos.
Mecanismos de Auto-Tolerância Imune

Linfócitos Auto-Reativos:

- Genes produtores das imunoglobulinas de superfície dos linfócitos B (Ig) e dos receptores dos linfócitos T
(TCR) são codificados em segmentos que se rearranjam no DNA de precursores dos linfócitos para formar
um gene completo. Este processo possibilita milhares de combinações dos segmentos, criando uma grande
diversidade de genes e uma variedade de linfócitos específicos.
- Impossível prevenir a construção de receptores (Ig, TCR) auto-reativos, mas existem mecanismos de
eliminação ou inativação de linfócitos auto-reativos que chamamos “tolerância central”.
- A tolerância central não é completa. Alguns clones auto-reativos permanecem em órgãos linfoides
periféricos e, possivelmente nunca serão estimulados por auto-antígenos. Além do estímulo de
reconhecimento do auto-antígeno, a resposta imune requer, ainda, uma segunda série de sinais
transmitidos através de pares de moléculas (Ligante  Receptor) conhecidas como co-estimuladoras.
Exs: B7.1 e B7.2 (Linf. B, Macrófagos, Células Dendríticas)  CD28 (Células T).
CD40 (Linf. B)  CD40L (ligante) (Células T).
- Inflamações de qualquer natureza, infecções ou traumas, no entanto, podem produzir respostas auto-
imunes, porque moléculas co-estimuladoras são induzidas não-específicamente.
Ex: Respostas auto-imunes após Glomerulonefrite Estreptocócica ou após Micoplasma podem produzir
anemias hemolíticas auto-imunes.
< 2+ = Fraco positivo
> 2+ = Coombs Monoespecíficos
< 2+ (IgG) = Fraco positivo  Não titular
> 2+ (IgG) = Titulação com ID-cartão IgG - Dilution
< 1:30 = Fraco positivo (IgG)  Baixo risco de hemólise
> 1:30 = Forte positivo (IgG)  Alto risco de hemólise
Positivo 1:1 = Moderado risco de hemólise (IgG1)
Alto risco de hemólise (IgG3)
Positivo 1:100 = Alto risco de hemólise (IgG1 e/ou IgG3)
Coombs Monoespecíficos
Dissociação de Anticorpos IgG pela Cloroquina

Princípio:

Difosfato de Cloroquina dissocia anticorpos de classe IgG


fixados na membrana eritrocitária, sem danos à sua
integridade.

Reagente:

 Difosfato de Cloroquina a 20% em ID-Diluente 2.


 Estocar entre 2 - 6 oC.

Método de Uso:

 Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com


4 volumes de Difosfato de Cloroquina de 22 - 25ºC por no
mínimo 30 minutos e no máximo 2 horas.

 Lavar uma pequena alíquota e fazer teste de Coombs direto


a cada 30 minutos de incubação.

 Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluente


2 e usá-las para fenotipagem e auto-absorções de
anticorpos.

Notas:

 Componentes do Complemento não são dissociados pela


cloroquina.
 Tempos de incubações superiores a 2 horas provocam
hemólise e perda de atividade de antígenos Rh.
 Os antígenos Bg são removidos pela cloroquina.
Tratamento das Hemácias com DTT

Princípio:

DTT é um agente redutor das pontes de dissulfeto da


estrutura terciária das proteinas.

DTT 0.2M, desnatura os antígenos dos sistemas Kell,


Cartwright, LW e Dombrock e a maioria dos antígenos
HTLA.

Baixas concentrações de DTT (0.002M) desnaturam somente


os antígenos Jsa e Jsb.

Reagentes:
DTT 0.2M em PBS: 1,0g de DTT (Dithiothreitol) em 32 ml
de ID-Diluente 2.

Estocar em alíquotas em temperaturas de –20ºC ou


inferiores.

Método de Uso:
Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com
4 volumes de DTT 0,2M a 37ºC por 30 minutos.

Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluent 2


e usá-las para detecção e identificação de anticorpos e auto-
absorções.

Notas:
Usar uma amostra K+ como controle.
Tratamento das Hemácias com ZZAP

Princípio:

 reagente ZZAP é uma mistura de DTT e uma enzima


proteolítica (Papaina).

 ZZAP remove imunoglobulinas e componentes do


complemento da membrana eritrocitária.

Reagentes:

 Preparar diáriamente o ZZAP: 2,5 ml de DTT 0.2M + 0,5 ml


de ID-Papaina + 2,0 ml de ID-Diluent 2.

Método de Uso:

 Incubar 1 volume de concentrado de hemácias lavadas com


2 volumes de ZZAP a 37ºC por 30 minutos.

 Lavar as hemácias 3 vezes em salina e 1 vez em ID-Diluent 2


e usá-las para detecção e identificação de anticorpos e auto-
absorções.

Notas:

 Duas absorções são, normalmente, suficientes para


remoção dos auto-anticorpos.

 tratamento com ZZAP destroi os antígenos dos sistemas


Kell, Cartwright, LW e Dombrock e a maioria dos antígenos
HTLA, além dos antígenos sensíveis ao tratamento por
enzimas proteolíticas ( M, N, S, s, Fya, Fyb e Xga).
Paciente A

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.


Paciente A

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.


Paciente A
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-E mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente A
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-E mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente B

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.


Paciente B

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.


Paciente B
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-C mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente B
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-C mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente C

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.


Paciente C

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.


Paciente C
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-c mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente C
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-c mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente D

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.


Paciente D

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.


Paciente D
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Presença de Anti-Jka mascarado pelo auto-anticorpo


Paciente E

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs, inclusive o autocontrole.


Paciente E

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína, inclusive o autocontrole.


Paciente E

Presença de auto-anticorpos das classes IgG e IgM, além da fração C3d do Complemento,
opsonizando as hemácias do paciente.
Paciente E
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Ausência de alo-anticorpos no soro auto-absorvido


Paciente E
Soro auto-absorvido c/ Hemácias tratadas por ZZAP

Ausência de alo-anticorpos no soro auto-absorvido


Paciente F

Obs:
- A reação muito forte com anti-Rh(D).
- Coombs direto negativo.

Obs:
- Prova reversa discrepante.
- PAI positiva.
- Presença de anticorpo(s) irregular(es)
reagindo em meio salino e em Coombs.
Paciente F

OBS: Todas as reações são fortemente positivas em Coombs e o autocontrole negativo, sugerindo
multiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente F

OBS: Todas as reações fortemente exacerbadas em Papaína e o autocontrole negativo, sugerindo


multiplos alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente F

- Embora a paciente seja Rh(D) positiva (reação forte com o anti-D), os antígenos Rh localizados na
proteína RHCE ( C, Cw, c, E, e) estão todos ausentes.

- Os resultados indicam um fenótipo RhCE nul ( possível “D - -” pela alta reatividade com o anti-D) e o
anticorpo presente é um anti-Rh17, que só não reagirá contra os fenótipos Rh nul e RhCE nul.
Paciente G

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs e o autocontrole negativo, sugerindo múltiplos
alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente G

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína e o autocontrole negativo, sugerindo múltiplos
alo-anticorpos ou alo-anticorpo contra antígeno de alta freqüência.
Paciente G

- Os antígenos de alta freqüência ( k, Kpb e Jsb ) localizados na proteína Kell estão todos ausentes.
- Os resultados indicam um fenótipo KEL nul ( K 0 ) e o anticorpo presente é um anti-Ku, que só não reagirá
contra hemácias do mesmo fenótipo K0.
Paciente G

Contra-prova:
As 11 hemácias-teste do painel de identificação foram tratadas por ZZAP, que é capaz de desnaturar a proteína Kell, pela
quebra das pontes de bissulfeto nos resíduos de cisteína ao longo da cadeia peptídica.

O anticorpo anti-Ku foi confirmado pela ausência de reações contra as hemácias-teste tratadas por ZZAP (painel acima).
Doador A

Obs:
-Doador Grupo O, Rh(D) positivo, Coombs direto negativo.
- PAI positiva contra todas hemácias-teste.
Doador A

OBS: Todas as reações são positivas em Coombs e o autocontrole negativo.


Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo
natural contra antígeno de alta freqüência ausente no doador.
Doador A

OBS: Todas as reações são positivas em Papaína e o autocontrole negativo.


Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo
natural contra antígeno de alta freqüência ausente no doador.
Doador A

OBS: Todas as reações são positivas em meio salino e o autocontrole negativo.


Por se tratar de um doador de sangue, não pensamos em múltiplos anticorpos mas em alo-anticorpo
natural contra um antígeno de alta freqüência ausente no doador.
O painel salino com todas as hemácias-teste fortemente positivas, reforça a possibilidade de um
anticorpo natural.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- Como o doador é Rh(D) positivo e apresenta alguns antígenos relacionados com a proteína RHCE,
descartamos a possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema Rh.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- Como o doador produz os antígenos de alta freqüência k (Cellano) e Kp b, descartamos a possibilidade de


um fenótipo “nul” no sistema Kell.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- Como o doador produz o antígeno de alta freqüência Lub, descartamos a possibilidade de um fenótipo
“nul” no sistema Lutheran.
- Observem que o antígeno P1 está ausente.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- Como o doador produz os antígenos M e N relacionados à GPA e s relacionado à GPB, descartamos a


possibilidade de um fenótipo “nul” no sistema MNS.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- O doador produz o antígeno de alta freqüência Vel da coleção 212, descartando a possibilidade de um
anti-Vel.
Doador A

- Fenotipagem buscando antígenos de alta freqüência que possam estar ausentes no doador.

- O doador não produz o antígeno P1, como vimos em fenotipagem anterior e apresenta reação negativa
contra o anti-Tja. Como o anti-Tja é um anti- P1-P-Pk, isto significa que o doador pertence a um fenótipo
raro que não produz os antígenos do sistema P-relacionados ( ISBT: 003 - P / 028 - GLOB / 209 - GLOB ).
- O anticorpo presente no doador é um anti-Tja (P1-P-Pk) natural e muito hemolítico.