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Prática 6- Análise qualitativa de algumas enzimas

Prática 6- Análise qualitativa de algumas enzimas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA INDUSTRIAL Prof.

Carlos André Veiga Burket

ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE

Aline Araújo, 37240 Fabiane Netto, 38747 Luciana Munhoz, 38752

Rio Grande, Junho de 2010.

........ 5 4..........................................2....... .. ...................2................................................... . ................ Error! Bookmark not defined........................................... 4..................................................................................... ................................... ...... ................................................................... ................................................................. ...2..........................1....................... 5 6. .......... 5 Teste da Catalase: ......... 4..................... .... .................... ........... ................ 2.................. 3................. 1 3.......... .................1............................................................2................. .......................... ................. INTRODUÇÃO ....SUMÁRIO 1........................... ........ ........1....1.................2........................................................................................ ... ...... .. ....... 4 4................ 1 OBJETIVOS............................. .................. .... Prova da urease ............................... ................. ................. 5...........1.......... Teste da Catalase .. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... RESULTADOS E DISCUSSÃO..... Teste da Urease .... 4 4... ........................ ........... ....................... ......................................... 4 Materiais ... ... ............................... ....... ....................... .......1.............. ............ ....................................................................... 3................................... ..................... 4. .............................. .................................................2......................... 4......................................... ............................ ......... .................. 4 Método ................ 1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA................ ... 4 Materiais................ 5 Teste da Urease:..................... ................ CONCLUSÃO ........... ................................ . ................ ................................................................................................. 4 Método ... 3 PROCEDIMENTO ............................... 2 Prova da catalase ... ..........................................

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lipidos. Essas reacções bioquímicas que ocorrem dentro ou fora dos microrganismos são catalisadas por enzimas. proteínas e aminoácidos. portanto. formada principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos dentro dos quais se fixam o substrato. é po ssível demonstrar algumas das a tividades bioquímicas através da observação da capacidade dos microrganismos usarem enzimas para degradar hidratos de carbono. Encontra-se principalmente em sementes. OBJETIVOS Essa prática tem como objetivos analisar qualitativamente as enzimas urease e catalase em amostra de farelo de soja cru e tostado e em uma suspensão enzimática de batata. No laboratório. a metabolização destas moléculas orgânicas origina produtos finais cuja dete ção pode ajudar na c aracterização e identificação dos microrganismos. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Enzimas são proteínas que catalisam uma reação química específica e em sua maioria são conjugadas. pela especificidade do sistema. a união dos íons precedentes da solução podem também cooperar na presença do substrato na catálise da reação. bem como os aminoácidos envolvidos no aspecto catalítico da reação. Nas plantas. estando associadas a grupos não -protéicos. 3. Na maioria dos casos estes resíduos são do tipo iônico e mais reativo. Certos resíduos de aminoác idos que são responsáveis pela interação com o substrato e.Bioquímica Industrial _________________________ ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE 1. estão localizados nesta fenda. Uma característica comum de todas as enzimas é a presença e uma fenda em sua estrutura. microrg anismos e invertebrados. Geralmente. Sua atividade catalítica depende da conservação da sua estrutura original e qualquer variação nessa estrutura altera significativamente sua atividade. 2. a urease é um 1 . A urease catalisa a hidrólise de u reia em dióxido de carbono e amô nia. Além disso. INTRODUÇÃO As enzimas desempenham um papel essencial no metabolismo de todos os organismos. Os microrganismos efetuam as suas variadas actividades bioquímicas utilizando nutrientes obtidos a partir do ambiente que os rodeia.

parece que a própria enzima da planta é um inse ticida. As folhas de soja também contêm urease. os aumentos de temperatura aceleram as reações químicas: a cada 10°C de aumento a velocidade de reação se duplica. O papel da urease nos feijões de soja não é completamente claro. 3. Entretanto.1. proporcionará a perda de alguns aminoácidos diminuindo seu valor nutritivo. Para ser ativada. a urease faz o mesmo durante a germinaç ão. as enzimas encontram -se muito rígidas e quando se supera um valor considerável (maior que 50°C) a atividade cai bruscamente porque. mas nelas a enzima é mil vezes menos ativa que nos feijões. se ndo proteínas a partir de certa temperatura começam a desnaturar -se pelo calor. tornando a lisina indisponível para absorção. Em geral. Acima desta temperatura. o aumento de velocidade da reação devido à temperatura e compensado p ela perda de atividade catalítica devido à desnaturação térmica.05 a 0. indica que o calor foi excessivo. Porém. sendo que faixa na qual se considera um proces samento adequado varia de 0.05). sobretudo a presença dos inibidore s de tripsina.20) indica que o calor aplicado foi insuficiente e índice de urease baixo (<0. A temperatura na qual a atividade catalítica e máxima chama-se temperatura ótima. Com a finalidade de combater os problemas relacionados com os fatores antinutricionais da soja. A temperatura influi na atividade e o ponto étimo representa o máximo de atividade. a urease precisa ligar-se a dois íons níquel por subunidade. Sabe -se que a enzima das folhas ajuda a reciclar o azoto presente nas proteínas (as proteínas são transformadas em ureia). não é um método satisf atório. A intensidade do tratamento térmico é avaliada através da inativação da enzima urease. Prova da urease O objetivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a ureia através da enzima urease. pois se for usado de forma inadequada. A amônia que resulta da rea ção pode também proteger as células da planta de agentes patogénicos . O calor excessivo pode afetar a qualidade das proteínas pela oxi dação do enxofre da cistinae metionona e pela formação de reação de Maillard entre o grupo amino da lisina e carboidratos. Assim. e a atividade enzimática decresce rapidamente até anular se. Em bactérias. Este visa à inativação ou destruição dos fatores antinutricionais de forma a melhorar a digestibilidade da proteína da soja. vários processos são desenvolvidos.20. como proteína. As reações catalisadas por enzimas seguem esta lei geral. é constituída por duas ou três subunidades diferentes. apesar de podermos especular. sendo que o mais utilizado é o tratamento térmico. Nos feijões.Bioquímica Industrial _________________________ ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE hexâmero ± consiste em seis cadeias idênticas ± e localiza-se no citoplasma. 2 . a enzima se desnatura. índice de urease elevado (>0. A temperaturas baixas.

3 . Essas substâncias são produzidas quando aeróbios. Ao adicionar -se um pequeno pedaço de batata ao peróxido de hidrogénio. a enzima catalase aumenta a velocidade d a reação química. mas é especialmente importante para identificar espécies de Proteus relativamente a bactérias entéricas lactose negativa. Durante a respiração aeróbia. o íon superóxido (O 2-). A ausência da coloração rosa indica uma reacção negativa. A acumulação destas substâncias leva à morte das células. anaeróbios facultativos e microaerófilos usam o oxigénio como receptor final de electrões. ou seja. sem fazer parte do sistema reacional. apenas os microrganismos que produzem precocemente urease têm capacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte. forman do o produto final alcalino. pero xidase ou superóxido dismutase é que os tornam intolerantes ao oxigénio. Os microrganismos com capacidade para produzir catálase ou pero xidase degradam o peróxido de hidrogénio a água e oxigénio. A batata contém uma enzima denominada catalase. A urease é uma enzima hidrol ítica que ataca a ligação entre o azoto e o carbono em compostos como a ureia. vermelho de fenol. 3. basta que ocorra o aparecimento de uma zona do mei o rosa para se considerar a rea ção positiva. amô nia.2. Quando a ureia é desdobrada pela urease. A superóxido dismutase é a enzima responsável pela degradação dos iões superóxido nos microrganismos catálase negativo. Este aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a rosa. o peróxido de hidrogénio decompõe -se mais rapidamente em água e oxigénio molecular.Bioquímica Industrial _________________________ ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE A urease é uma enzima produzida por alguns microrganismos. além de CO 2 e H2O. Prova da catalase O objetivo desta prova é determinar a capacidade dos microrganismos de produzir a enzima catalase par a degradar o peróxido de hidrogê nio. a amô nia acumula-se no meio tornando -o alcalino. a não ser que aquelas possam ser enzimaticamente degradadas. os microrganismos produzem peróxido de hidrogénio (H2O2) e. em alguns casos. sendo uma reacção positiva para a prese nça de urease.    No entanto. A incapacidade dos microrganismos anaeróbios para sintetizar catálase. A presença de urease detecta -se quando o microrganismo cresce num meio com ureia (meio de ureia de Christensen) que contém também o indicador de pH.

Materiais  Suspensão enzimática de batata em tampão fosfato pH 7. Se a bactéria produzir esta enzima ( catalase positiva) ocorre o desdobramento do peróxido de hidrogénio com libertação imediata de bolhas de gás (oxigénio).0.  Indicador vermelho de fenol. incubada previamente. 4. a ausência deste borbulhar é uma prova negativa. em tubos de ensaio com tampa contendo 1g de farelo de soja cru ou tostado. PROCEDIMENTO 4.  Água oxigenada 0. Método Adicionou-se. 4. Teste da Catalase 4. 4. Teste da Urease 4.1. Um procedimento alternativo consiste em determinar a produção de catalase adicionando uma porção de bactérias. Foi feito um branco com a adição apenas de tampão.  Solução de uréia 3% em tampão fosfato pH 7. previamente colocadas numa lâmina.1.1M. A ausência de formação de bolhas de gás é uma prova negativa.2. Se a catálase foi produzida pelo microrganismo ocorre libertação de bolhas de gás (oxigénio livre) e a prova é positiva. 4mL da solução de uréia.1.0.1.2. Deixou -se em repouso por 30 minutos a 30°C e após foram adicionadas gotas do indicador vermelho de fenol.Bioquímica Industrial _________________________ ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE A produção de catálase pode ser determinada adicionando o substrato H 2O2 a uma cultura. umas gotas de peróxido de hidrogénio. em meio em rampa.2.1. Materiais  Amostra de farelo de soja cru e tostado. 4 .

A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein -dye binding. New York. in dicando apenas a presença do indicador.150/seer/index. verificou -se umdesprendimento de gás.71. ao adicionar o indicador. Teste da Catalase: Com a aplicação deste teste.145. RESULTADOS E DISCUSSÃO Teste da Urease: Com o teste da urease foi possível verificar na soja crua.2. comprovando a presença de Uréia e indicando positividade ao teste.ind.2.1M.248-254.php/alimentos/article/viewFile/127/135 http://www.Bioquímica Industrial _________________________ ANÁLISE QUALITATIVA DAS ENZIMAS CATALASE E UREASE 4.org/print/957 http://200. O desprendimento de gás foi observado.lucato.scienceinschool.pdf 5 . adicionou -se 5mL de suspensão enzimática de batata. 6..br/Extrusar%20Soja%20VANTAGENS. Analytical Biochemistry.72. Sites acessados: http://www.M. M. a coloração vermelha. v. Método A 10mL de água oxigenada 0. 5. p. Esta reação indica positividade do teste. Já na soja tostada foi possível observar a coloração amarela. CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRADFORD. 1976.

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