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COLORIMETRÍA
Química analítica II
Eliel Rafael Romero Gracia
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
5st SEMESTRE
No control: 09120036
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Contenido
INTRODUCCIÓN....................................................................................................................................................... - 3 -
HISTORIA ................................................................................................................................................................... - 6 -
COLOR.......................................................................................................................................................................... - 7 -
Transmitancia.................................................................................................................................................... - 13 -
Absorción ............................................................................................................................................................ - 13 -
CONCLUSIÓN .......................................................................................................................................................... - 22 -
REFERENCIAS ........................................................................................................................................................ - 22 -
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INTRODUCCIÓN
La colorimetría es una de las técnicas empleadas con mayor asiduidad en los laboratorios de
Bioquímica. Esta técnica suministra información cualitativa y cuantitativa sobre sustancias en
disolución. El colorímetro es un instrumento diseñado para dirigir un haz de luz paralela
monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad del haz luminoso
emergente.
La colorimetría es la ciencia que estudia la medida de los colores y que desarrolla métodos
para la cuantificación del color, es decir la obtención de valores numéricos del color. Se
denomina equipos de colorímetro a aquellos aparatos en los que la longitud de onda con la
que vamos a trabajar se selecciona por medio de filtros ópticos.
En principio, todos los sistemas que cuantifican el color a partir de tres variables poseen
aspectos colorimétricos.
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Un color queda definido por 3 parámetros:
La fracción de luz incidente absorbida por una solución a una longitud de onda está
relacionada con el paso óptico y con la concentración de la especie absorbente. Estas dos
relaciones están combinadas en la ley de Lambert-Beer:
En óptica, la ley de Beer-Lambert, también conocida como ley de Beer o ley de Beer-Lambert-
Bouguer es una relación empírica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del
material atravesado. La ley de Beer-Lambert relaciona la intensidad de luz entrante en un
medio con la intensidad saliente después de que en dicho medio se produzca absorción. La
relación entre ambas intensidades puede expresarse a través de la siguiente relación:
Es el coeficiente de absorción:
Es el coeficiente de extinción.
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La aplicación obvia de la ley de Lambert-Beer es el uso del colorímetro para determinar la
concentración de una gran variedad de moléculas que absorben luz (p. ej. Carotenos, clorofila,
hemoglobina, etc.). La técnica se extiende a sustancias no coloreadas como azúcares o
aminoácidos después de alguna reacción capaz de convertir sustancias incoloras en derivados
coloreados
De esta forma, la colorimetría desarrolla continuamente una serie de métodos, con el objetivo
de realizar una cuantificación de los colores, siempre teniendo en la meta a la obtención de
todos los valores numéricos con los que cuentan los colores.
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HISTORIA
La colorimetría ha tenido una gran expansión debido a la industria cosmética por el estudio
de sombras, tintas, polvos y colores para el cabello. En la actualidad, otra importante
expansión se ha debido a los problemas de gráficos por ordenador y a la reproducción de
colores, así como por el análisis y la documentación de superficies antiguas, como cuadros y
policromados. Utilizando técnicas para el análisis colorimétrico es posible llegar a un análisis
químico del material superficial que se está analizando, como el análisis de la respuesta
espectral.
Cuando la percepción del color fue reconocida hace mucho tiempo, se estableció la correlación
entre la física y la fisiología. En 1704, el físico Isaac Newton ya había hecho una contribución
clave a la espectrofotometría y a la colorimetría con sus tentativas de dividir la luz blanca en
colores espectrales, pero en realidad el efecto sobre el ojo humano se definió 100 años más
tarde por el médico Thomas Young. Él fue, según se informa, el primero en describir cómo el
color es percibido con los tres receptores del ojo para los colores primarios: rojo, verde y azul.
Ahora se sabe que cada impresión en color puede ser totalmente descrita por tres valores.
Antecedentes de la colorimetría:
Si estos principios son tales que a partir de ellos un matemático puede determinar todos los
fenómenos de los colores que puedan ser causados por la refracción, supongo que la ciencia
de los colores se admitirá matemáticamente.
Isaac Newton.
Si nos preguntásemos que significan las palabras "rojo", "azul", "negro", "blanco"... podremos
señalar de forma inmediata y con certeza cosas que tienen esos colores, pero nuestra
capacidad de explicar el significado de estas palabras no va más allá.
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COLOR
¿Qué es el color?
El color es un atributo que percibimos de los objetos cuando hay luz. La luz es constituida por
ondas electromagnéticas que se propagan a unos 300.000 kilómetros por segundo. Esto
significa que nuestros ojos reaccionan a la incidencia de la energía y no a la materia en sí.
Las ondas forman, según su longitud de onda, distintos tipos de luz, como infrarroja, visible,
ultravioleta o blanca. Las ondas visibles son aquellas cuya longitud de onda está comprendida
entre los 380 y 770 nanómetros.
Los objetos devuelven la luz que no absorben hacia su entorno. Nuestro campo visual
interpreta estas radiaciones electromagnéticas que el entorno emite o refleja, como la palabra
"Color".
Tono, matiz o croma es el atributo que diferencia el color y por la cual designamos los
colores: verde, violeta, anaranjado.
Saturación: es la intensidad cromática o pureza de un color Valor (value) es la claridad
u oscuridad de un color, está determinado por la cantidad de luz que un color tiene.
Valor y luminosidad expresan lo mismo.
Brillo: es la cantidad de luz emitida por una fuente lumínica o reflejada por una
superficie. / Luminosidad, es la cantidad de luz reflejada por una superficie en
comparación con la reflejada por una superficie blanca en iguales condiciones de
iluminación.
Los tonos que contienen una mezcla negra y blanca se denominan no coloreados. Todos los
demás tonos se denominan coloreados. La mezcla de tonos coloreados y no coloreados se
expresa con el concepto de saturación (Pureza). Una tonalidad coloreada –por ejemplo, rojo –
se denomina saturada, cuando no contiene mezcla de blanco o negro. Para la evaluación de
una tonalidad se emplean tres criterios: color, brillo y saturación/pureza.
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Dependencia entre y colores coloreados y no coloreados
Mezcla de colores.
En la teoría cromática se distinguen dos tipos de mezclas de colores. Por un lado, la mezcla
aditiva, en la que se basa por ejemplo el principio de funcionamiento de la televisión color.
Este tipo de mezcla consiste en reunir (sumar) luz de diferentes longitudes de onda. Luz roja y
luz verde producen conjuntamente luz amarilla. El otro procedimiento es la mezcla
sustractiva, que forma la base de nuestro método de mezcla de colores en el taller.
Colores primarios (los tres básicos): El método de mezcla sustractiva permite obtener
cualquier tonalidad partiendo de los colores ROJO, AZUL y AMARILLO. Por esta razón,
el rojo, el azul y el amarillo se denominan primarios.
Colores secundarios: Se llaman colores secundarios a los tres colores VERDE, VIOLETA
y NARANJA resultante de la mezcla de los tres colores primarios.
El círculo cromático
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Colores compuestos.
Colorea afines
CIRCULO CROMÁTICO
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Estos colores a su vez pueden ser representados en un círculo de 12 colores, haciendo una
mezcla de un color con el siguiente y así sucesivamente se puede crear un círculo cromático
con millones de colores.
El círculo cromático: Nos sirve para observar la organización básica y la interrelación de los
colores. También lo podemos emplear como forma para hacer la selección de c olor que nos
parezca adecuada a nuestro diseño. Podemos encontrar diversos círculos de color, pero el que
aquí vemos está compuesto de 12 colores básicos.
El matemático alemán Hermann Grassmann enunció unas leyes sobre la mezcla aditiva del
color. Estas muestran que cualquier color puede expresarse como suma de tres colores
primarios, es decir, de tres colores, cada uno de los cuales no puede obtenerse por la mezcla
de los otros dos. Aplicando sus leyes, se obtiene la denominada ecuación unitaria del color,
que representada, da una forma parecida a un triángulo, el triángulo internacional de color. El
área dentro de las tres curvas que se obtienen al fin del procedimiento dan origen a tres
valores: las coordinadas triestímulo X, Y y Z ligadas a las coordinadas de cromaticidad x e y
por relaciones lineales. El paso de un espacio de colores a otro son datos de relaciones de
transformación de coordenadas.
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LEY DE LAMBERT-BEER
Dentro de un fotómetro de óptica, se utiliza un haz de luz enfocado de manera precisa para
penetrar el elemento del procesado. Una célula fotoeléctrica de silicio mide la intensidad
resultante de luz. La alteración de la intensidad de la luz, causada por la absorción y/o
difusión está explicada en la Ley Lambert-Beer.
La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz.
Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres
fenómenos físicos:
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es
absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables
capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del
trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución. La relación entre ambas se
expresa con la fórmula denominada Ley de Beer:
P =P0 10-abc
P = potencia radiante transmitida
Po = potencia radiante incidente una cantidad proporcional a la misma, medida
colocando en la cubeta el solvente puro
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a = absortividad, constante característica del absorbente y de la longitud de onda de la
radiación incidente.
b = longitud del paso de la luz a través de la solución del absorbente, expresada
generalmente en cm.
c = concentración del absorbente
El término log (P0 / P) se define como la Absorbancia. Cuando las medidas se efectúan
utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean
un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el
término b de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que a es también
constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces
que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración: A = kc (k = ab).
A1 / A2 = C1/ C2 donde,
A1 = Absorbancia del problema
A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida
C1 = Concentración del problema
C2 = Concentración del estándar
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Transmitancia
A medida que un haz de luz atraviesa un medio absorbente, la cantidad de luz absorbida en
cualquier volumen es proporcional a la intensidad de luz incidente multiplicado por el
coeficiente de absorción. Consecuentemente, la intensidad de un haz incidente decae
exponencialmente a medida que pasa a través del absorbente. Esta relación cuando se expresa
como Ley de Lambert es:
Donde
T= Transmitancia
ε= Coeficiente molar de extinción
c= Concentración molar del absorbente
d= Distancia en cm
T = 10-εcd o T = 10-A
Absorción
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Cromatografía y la ley de Lambert y Beer
Cuando se pasa un rayo de luz monocromática de intensidad inicial I0 a través de una solución
en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la
luz transmitida I es menor que I0. Ocurre alguna disminución en la intensidad de la luz por
dispersión de las partículas reflexión en las interfaces, pero principalmente por absorción de
la solución. La relación entre I e I0 depende de la longitud del medio absorbente, l, y de la
concentración de la solución absorberte, c, estos factores se hallan relacionados en la ley de
Lambert y Beer.
Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente,
su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente
aumenta.
Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromática pasa a traés de un medio absorbente, su
intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente
aumenta.
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Estas dos leyes se combinan en la ley de Beer-Lambert:
Sacando logaritmos:
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Relación entre la absorbancia de la luz y la concentración de una solución de una solución absorbente
Con la ayuda de tales curvas se puede determinar fácilmente la concentración de una muestra
conociendo su extinción.
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Coeficiente molar de extinción. Si l es 1 cm y c es 1 mol/l, la absorbancia será igual al coeficiente
molar de extinción k, el cual se característico para un compuesto dado. El coeficiente molar de
extinción k, es por lo tanto, la extinción producida por 1 mol/l en un recorrido de luz de 1 cm
y generalmente se escribe ; y se expresa .
1. La luz debe ser perfectamente monocromática o la longitud de onda debe estar entre
límites muy estrechos.
2. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de
la solución. Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.
3. No debe haber ionización, asociación, disociación o solvatación del soluto con respecto
a la concentración o al tiempo.
4. La solución es muy concentrada, originado un color muy intenso. La ley solo se cumple
hasta cierto límite máximo de concentración, característica para cada sustancia.
Medición de la extinción
Los primeros colorímetros se calibran “a ojo” comparando el color de una solución con los de
una serie de discos colorados. Los resultados obtenidos eran muy subjetivos y no muy
exactos. Los colorímetros visuales solo tienen ahora un interés histórico. La célula
fotoeléctrica tiene la ventaja sobre el ojo humano de poder determinar el grado de absorción
de un color y de ser mucho más objetiva.
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luego a través de un lente condensador, hasta obtener un rayo paralelo que incide sobre la
solución que se investiga, la cual se ha colocado en una celda de absorción o cubeta. La cubeta
es generalmente de vidrio y las paredes a través de las cuales para el haz fe luz son parelas. En
muchos casos, las cubetas tiene una base de 1 cm2 y pueden contener fácilmente 3 ml de
líquido.
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En algunos instrumentos el filtro se encuentra antes de la cubeta. El filtro produce bandas
angostas de transmisión y, por lo tanto, da luz aproximadamente monocromática. Los filtros
Ilford son los más comunes y algunas de las propiedades se presentan a continuación.
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APLICACIÓN DE LA COLORIMETRÍA
Industria de la impresión
Las normas de color se han empleado en la industria de la impresión durante mucho tiempo y
para ello diversos aparatos de medir se han usado con el fin de supervisar el cumplimiento de
esas normas. Los dos tipos de aparatos de medida utilizados habitualmente son:
El inconveniente de los aparatos fuera de línea es que el impresor tiene que confiar en los
valores medidos mostrados para evaluar y ajustar la apertura de la zona de tinta, proceso que
requiere extremo cuidado.
La ventaja principal del control colorimétrico es la capacidad que ofrece para mantener el
resultado de impresión tan cerca como sea posible a la impresión óptica del color deseado del
original, y el alertar al impresor cuanto antes si las desviaciones se hacen demasiado grandes.
La evaluación colorimétrica ofrece la misma percepción que el ojo humano con la ventaja de
estar libre de influencias externas subjetivas y variables; en cambio, provee resultados
objetivos.
Los datos de medición pueden ser almacenados, registrados y también se pueden usar como
un certificado de calidad. Además, los resultados de medición pueden ser automáticamente
evaluados con el software de Monitor de Calidad de Heidelberg, un componente integrado en
el Profile Toolbox de productos Prinect y en el Calibration Toolbox.
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Determinación colorimétrica de fosfato inorgánico
La mayoría de los compuestos bioquímicos no tiene coloración y pueden ser analizados
colorimétricamente pero solo después de someterlos a la acción de un reactivo químico
especifico que origine un producto coloreado. Este aspecto puede ilustrarse midiendo fosforo
inorgánico, que es, probablemente, una de las determinaciones más usuales en los
laboratorios de bioquímica.
El fosfato inorgánico reacciona con molibdato de amonio en solución acida para formar acido
fosfomolíbdico. La adición de una agente reductor reduce el molibdeno presente en el
fosfomolibdato produciendo un color azul, sin afectar el acido molíbdico libre. En este método
el agente reductor es el sulfato de p-metilaminofenol. La presencia de cobre en la solución
amortiguadora aumenta la velocidad de aparición del color.
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CONCLUSIÓN
A través de estos métodos fotométricos, es posible medir con gran presicion muchas
substancias coloreadas por fotometría visual o colorimetría. la colorimetría consiste en la
comparación visual del color de las soluciones de la substancias problema con una serie de
patrones, hasta conseguir la coincidencia. Esta técnica entonces nos perite la identificación de
muestras a través de la comparación de sustancias patrón, y una vez que se consigue la igualar
visualmente intensidad de los colores de las soluciones, se miden las longitudes de solución,
aplicando la ley de Beer se calcula la concentración y la identificación de nuestra sustancia.
REFERENCIAS
Florkin, M. y Stotz, E., Comprehensive Bichemistry, Vol 3, Methods for the Study of
Molecules, Amsterdam, Elservier, 1963.
Van Holde, K. E., Physical Biochemistry, Englewood Cilffs; N. J., Preentice Hall, 1971.
L. Hernández, C. González, Introducción al Análisis Instrumental. Editorial: Ariel
Ciencia (2002)
R. Matissek, F.M. Schnepel, G. Steiner, Análisis de los Alimentos. Editorial Acribia. S.A
McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods. 21st ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2006.
http://webs2002.uab.es/ipividori/qca%20analii/T7.pdf
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