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relatorio cromatografia

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA CURSO: ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: QUÍMICA ORGÂNICA II – EXA 411 DOCENTE: CARLA MENDES

CROMATOGRAFIA

Feira de Santana-Ba Fevereiro/2009

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA CURSO: ENGENHARIA DE ALIMENTOS DISCIPLINA: QUÍMICA ORGÂNICA II DOCENTE: CARLA MENDES

Trabalho da disciplina de Química Orgânica II do Curso de Engenharia de Alimentos realizado pelo aluno Danilo Freitas, como atividade avaliativa. Orientadora: Carla Mendes

Feira de Santana-Ba Fevereiro/2009

Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre

Parte I: Cromatografia em Camada Delgada

OBJETIVO

INTRODUÇÃO .Verificar a separação de clorofilas e carotenos presentes no extrato de espinafre a partir da análise dos cromatogramas das bandas que correspondem a cada componente após a eluição em um sistema de solvente (fase móvel).

alumina. espessura da camada do adsorvente. etc. como tamanho da partícula do adsorvente. Na escolha do solvente ou da mistura de solventes. o suporte utilizado é uma placa de vidro. Quando a placa de CCF é colocada verticalmente em um recipiente fechado que contém uma pequena quantidade de eluente.É uma técnica simples e muito importante para a separação rápida e qualitativa de pequenas quantidades de material. ativação e condições de estocagem das placas. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original. As substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as substâncias mais polares. . Os adsorventes mais utilizados como fase estacionária (FE) são: sílica. deve-se considerar a natureza química das substâncias a serem separadas e a polaridade da fase móvel. e a distância percorrida pelo solvente a partir do ponto de aplicação. de: distância percorrida pelo componente da mistura. as diversas manchas serão claramente visíveis.4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos). ninhidrina (para aminoácidos). Na prática. celulose e poliamida. Os valores de Rf são. Depois que o solvente ascendeu pela placa. etc. Um método bastante comum é o uso de vapores de iodo. Rf = dc / de. À medida que o solvente sobe pela placa. A placa coberta e seca chama-se “placa de cromatografia em camada fina”. devido a fatores. e é definido como a razão entre a distância percorrida pela substância. A relação entre as velocidades de movimento da substância e da frente do solvente é chamada Rf. dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura. verde de bromocresol (para ácidos). 2. Outros reagentes para visualização são: nitrato de prata (para derivados halogenados). os valores de Rf obtidos em uma placa raramente se repetem em outra. Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água e deixa-se secar. Para a visualização deve-se "revelar a placa". Se os componentes são substâncias coloridas. importantes quando se faz um estudo comparativo utilizando soluções de substâncias-padrão aplicadas na mesma placa. a partir do ponto de aplicação até o meio da mancha. composição do solvente grau de saturação da câmara de eluição. que reage com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor café ou amarela. é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque correspondem a compostos incolores. Cada substância se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção. esta é retirada da cuba e seca até que esteja livre do solvente. Freqüentemente. Na cromatografia em camada fina. a fase líquida ascende por uma camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. Durante este processo. a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e a fase estacionária. todavia. este irá ascender pela camada do adsorvente por ação capilar. Contudo. os diversos componentes da mistura são separados. sendo: dc: distância percorrida pelo componente da mistura.

PARTE EXPERIMENTAL Reagentes Folhas de espinafre Água Acetona Acetato de etila Gel de sílica Éter de petróleo Hexano        .

. É tóxico. Nocivo: risco de efeitos graves para a saúde em caso de exposição prolongada por inalação. Evite respirar seu pó muito fino È muito inflamável.TABELA DE TOXIDADE DOS REAGENTES REAGENTES Água Acetona Acetato de Etila Éter de Petróleo Sílica Gel Hexano TOXICIDADE -----------------------------------------------------É tóxico e irritante. È muito irritante para os pulmões. . Aquecer somente em banho-maria. irritante e muito inflamável. Evitar inalação ou contato com a pele. Facilmente inflamável. Evite contato com a pele olhos e vestuários. Irritante para a pele.

65 a 20oC ------insolúvel.cm3 ) (20-1) (g/mol 250C 18. .2o 77o 30o a 70o 69o Obs.79 a 20oC ------água.90 a 20oC -83. etanol e éter Miscível em 0. solúvel Solúvel em 0.01 Líquido incolor Líquido incolor Líquido incolor Líquido incolor Acetona C3H6O 58.18 60. etanol e éter Em água: 0.TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS Compostos Fórmula Química Água H2O Peso Aparência Solubilidade Densidade Molecular (g. sólida Miscível em 0. em clorofórmio.09 Líquido incolor Sólido branco Pont o de fusão (0C −3 1000 kg·m .11 Acetato de CH3COOCH2CH3 Etila Éter de Mistura de -----------Petróleo hidrocarbonetos voláteis Hexano Sílica Gel C6H14 SiO2 86.08 88.: A sílica usada na cromatografia de camada delgada é a gel de sílica 60G. 0o líquida 917 kg·m−3.66 a 20oC ------etanol e em clorofórmio Ponto de ebulição (0C) 100o 56.0o água.

Papel de Filtro . Etiquetas. Erlemeyer. Coluna. Funil de Vidro. Bastão de Vidro.VIDRARIAS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS Béquer. Pipeta Pasteur. Suporte Universal. Proveta. Aro. Garra. Balança.

FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Parte 1: 1.A) Preparo das cromatoplacas Preparar uma suspensão uniforme 2 g de gel de sílica 60G + 4 a 5 mL de água destilada Espalhar a suspensão de maneira uniforme sobre a placa de vidro Repouso 1.5 cm de distância da borda inferior e 1.C e 1.D para cada um 1.0 da borda superior Aplicar a solução de extrato de espinafre com o auxílio do tubo capilar no centro da marca inferior .C) Preparo da cuba cromatográfica Preparar 20 mL da fase móvel em um béquer de 250 mL A altura do solvente não deve ultrapassar 1.B) Seleção da fase móvel Escolher 4 solventes puros ou misturas de solventes Realizar as etapas 1.5 cm de altura Tampar o béquer com uma placa de Petri 1.D) Aplicação da amostra na cromatoplaca e desenvolvimento do cromatograma Fazer na placa uma marca de referência com1.

Introduzir a placa na cuba cromatográfica Esperar que a fase móvel atinja a marca superior Retirar a placa e secá-la na capela Observar as bandas e anotar as distâncias percorridas pela fase móvel e por cada um dos componentes .

CROMATOGRAMAS Placa I  Fase estacionária: Sílica gel 60G  Fase móvel: Mistura de hexano e acetona 8:2 Placa II  Fase estacionária: Sílica gel 60G  Fase móvel: Hexano Placa III  Fase estacionária: Sílica gel 60 G  Fase móvel: mistura de hexano e acetato de etila .

6 cm Rf da banda amarela: Rf = 4/5 = 0.10 cm . de: distância percorrida pelo eluente.96 cm Rf para a banda verde: Rf = 0.5/5 = 0.6/5 = 0.5 cm Rf para a banda amarela: Rf = 4.9 cm d(outros): 0.8 cm Rf da banda verde: Rf = 0.CÁLCULO DO FATOR DE RETENÇÃO A determinação do fator de retenção é obtida pela relação abaixo: Rf = dc/de dc: distância percorrida pelo componente da amostra. Logo.8 cm d(clorofila) = 0.2 cm Rf para a banda verde: Rf = 0/5 = 0 cm Placa III d(eluente) = 5 cm d(carotenos) = 4.18 cm Rf para outra banda: Rf= 0.12 cm Placa II d(eluente) = 5 cm d(carotenos) = 1 cm d(clorofila) = 0 cm Rf para a banda amarela: Rf = 1/5= 0.9/5 = 0.8/5 = 0. pode-se calcular o Rf para cada banda visível na placa: Placa I: d(eluente): 5 cm d (carotenos): 4 cm d (clorofila): 0.

O cálculo do fator de retenção ratificou a análise. ou seja. que não deslocou o grupo de clorofila.96 etila DISCUSSÃO Tendo-se a fase estacionária comumente utilizada – sílica gel (polar). o componente menos polar (caroteno) interagiu mais com a fase móvel( média polaridade) e pouco com a fase estacionária(polar). Então.18 0. pois o primeiro é de baixa polaridade e o segundo é de média polaridade. Na placa II.10 --------------------------------------- Hexano + acetato de 0. possuindo logicamente desvantagem na competição com os componentes da amostra pelo sítio de ativação na superfície da fase estacionária. logo atende ao requisito citado anteriormente. porém. uma vez que o Rf para a banda verde foi igual a zero. uma vez que a F. foram utilizados respectivamente os dois solventes julgados como mais adequados: hexano e a mistura de hexano com acetato de etila.E. sendo então facilmente deslocado pela mistura de solventes. tendo conseqüentemente um deslocamento menor do que o grupo de carotenos.8 0. uma vez que. em que se utilizou a mistura de solventes já estabelecida no roteiro ( hexano e acetona). O que confirma sua forte interação com a fase estacionária.12 0. percebe-se que o deslocamento foi muito menor do que quando o solvente utilizado foi o de média polaridade. Já o grupo de clorofila interagiu mais com a F. obtendo-se os seguintes resultados: Na placa I. o solvente utilizado foi o hexano (apolar). logicamente seu Rf será maior que o Rf dos componentes analisados.2 0. Em suma o grupo de clorofila interagiu muito com a fase estacionária e o grupo de carotenos interagiu mais com a fase estacionária se comparado com o deslocamento da banda verdade. É importante frisar que podem ter existindo outros componentes na placa que não eram visíveis.0 0. como a banda amarela foi mais deslocada pelo solvente em comparação com as demais. é normal utilizar solventes de baixa ou média polaridade.QUADRO . não dessolveu a clorofila por ser um eluente de baixa polaridade. Pode-se detectar ainda a presença de outros componentes que interagiram muito com a fase estacionária.M compete pelo sítios ativos na superfície do adsorvente com os demais componentes da amostra. foi incumbida apenas a tarefa da seleção de solventes adequados para a realização do experimento. em caso de fases estacionárias polares.RESUMO Fase estacionária Gel de sílica 60G Gel de sílica 60G Gel de sílica 60G Fase móvel hexano + acetona hexano Rf para banda Rf para banda Rf para outras amarela (cm) verde (cm) bandas (cm) 0. . por exemplo. Pode-se então fazer análise do comportamento da banda para cada solvente utilizado a partir do estudo das interações entre a fase móvel e fase estacionária e entre essas com os componentes da amostra. obtendo-se essa informação e com auxílio de uma seqüência crescente de polaridade dos eluente. A visualização só é possível a partir do uso de alguns métodos. Através do cálculo do Rf para cada banda pode-se comprovar as análises feitas a partir do cromatograma.

a temperatura. etc. variando com as condições cromatográficas empregadas com a natureza e preparação do solvente . ou seja. foi deslocado até a extremidade superior da placa .Na placa III. ou seja. o tamanho da amostra . .Logo os valores encontrados podem sofrido grandes variações. os componentes do grupo interagiram mais com a fase estacionária que o eluente. Em relação ao grupo de clorofila. sendo conseqüentemente pouco deslocado pelo mesmo. È preciso ressaltar que os valores de Rf não são constantes cromatográficas empregadas. a mistura de solventes possuiu desvantagem na competição pelo sítio de ativação na superfície do adsorvente. O que provocou uma forte interação do grupo de carotenos com a fase móvel (média polaridade). interagindo logicamente pouco com a fase estacionária. o eluente utilizado foi uma mistura de hexano com acetato de etila.

Figura 1: Esquema da prática de cromatografia em camada delgada .

Experimento: Separação Cromatográfica do Extrato de Espinafre Parte II: Cromatografia em Coluna .

OBJETIVO Separar e obter as clorofilas e carotenos presentes no extrato de espinafre. .

sendo que os mais empregados são a sílica gel (SiO2) e alumina (Al2O3). Por outro lado. Uma seqüência de eluentes de polaridade crescente é a seguinte: éter de petróleo. praticamente qualquer mistura pode ser separada. Com uma escolha cuidadosa das condições (adsorvente. geralmente na forma de pó finamente dividido. a capacidade de um determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna depende quase diretamente da polaridade do solvente com relação ao composto. cada banda contendo somente um composto. se for escolhido um solvente muito polar. O fluxo de eluente deve ser contínuo. acetato de etila. Os diferentes componentes da mistura mover-se-ão com velocidades distintas dependendo de sua afinidade relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o adsorvente) e também pelo eluente. porque os primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária. De um modo geral. bandas ou zonas móveis começam a ser formadas. éter etílico.INTRODUÇÃO Na cromatografia em coluna. hexano. velocidade de eluição). tetracloreto de carbono. ela não se moverá. eluente. todos os solutos podem ser eluídos sem serem separados. cloreto de metileno. Se o adsorvente escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura. tamanho da coluna.À medida que os compostos da mistura são separados. etanol. o sólido utilizado na fase fixa deve ser um material insolúvel na fase móvel associada (eluente). . os compostos apolares atravessam a coluna com uma velocidade maior do que os compostos polares. metanol. A mistura a ser separada é colocada na coluna com um eluente pouco polar e aumenta-se gradativamente a polaridade do eluente e conseqüentemente o seu poder de arraste de substâncias mais polares. Assim. água e ácido acético.

PARTE EXPERIMENTAL Reagentes     Folhas de espinafre Acetona Gel de sílica 60 Hexano .

È muito irritante para os pulmões. È muito inflamável. Aquecer somente em banho-maria. Evite respirar seu pó muito fino .TABELA DE TOXICIDADE DOS REAGENTES REAGENTES Acetona Hexano Sílica Gel TOXICIDADE É tóxico e irritante. Evite contato com a pele olhos e vestuários.

cm3 ) (20-250C Miscível em 0. etanol 20oC e éter Solúvel em 0.66 etanol e em 20oC clorofórmio Ponto de fusão (0C ------- Ponto de ebulição (0C) 56.2o Gel de SiO2 sílica Hexano C6H14 a ------- 69o .18 Aparência Solubilidad e Acetona Líquido incolor Sólido branco Líquido incolor Densida de (g.TABELA DE PROPRIEDADES FÍSICAS DOS REAGENTES Reagentes Fórmula Peso Química Molecular (g/mol-1) C3H6O 58.09 86.79 a água.08 60.

espalhando de maneira uniforme sobre a fase estacionária Abrir a torneira até o extrato atingir o nível do recheio Colocar uma camada de sílica sobre o extrato .A) Separação por cromatografia em coluna Fixar a coluna verticalmente Manter um béquer abaixo da coluna Preparar uma suspensão com hexano e 8 g de gel de sílica 60G Colocar a suspensão dentro da coluna A torneira deve está aberta e a coluna deve está com 1/3 de sua capacidade preenchida com hexano Deixar o material assentar Não deixar a coluna secar durante o enchimento 2.FLUXOGRAMA DO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Parte II: 2.B) Aplicação da amostra e eluição Abrir a torneira da coluna até que a camada de solvente se aproxime da sílica Sem deixar a coluna secar Sem tocar nas paredes Aplicar a solução de extrato de espinafre com uma pipeta Pasteur.

em outro frasco rotulado Observar a coloração das bandas .Adicionar o hexano. iniciando a eluição Coletar a 1ª banda num frasco rotulado Mudar a fase móvel para acetona Coletar a outra banda.

Figura2: Esquema da prática de cromatografia em coluna .

A retirada das bolhas foi possível porque a acetona retirou calor da superfície da coluna. pode-se obter a primeira banda (amarela) que por ser apolar interagiu mais com a fase móvel do que com a fase estacionária (polar). logo. devido ao constante acréscimo do solvente. Então. Para a realização de uma efetiva separação dos componentes da amostra.Já a banda verde (polar) continuou imóvel na parte superior da coluna devido a sua maior interação com a FE. implicaria em uma separação incompleta já que haveria irregularidades na coluna. tais como o auxílio de um método empírico para eliminação de bolhas. de arrastar os componentes. ou seja adicionou na coluna um solvente polar ( acetona). que foi posto no algodão e envolto na superfície da coluna onde continha as bolhas. Nesse experimento. foi necessário o uso de alguns métodos a fim de evitar irregularidades na coluna.DISCUSSÃO A separação do grupo de carotenos e clorofilas foi obtida a partir do uso da cromatografia em coluna. recolheu-se o denominado volume morto. devido à baixa polaridade do eluente. método este. É importante destacar que o deslocamento do grupo de carotenos até a extremidade inferior da placa demorou. foram eliminadas. O outro método foi encher a coluna de forma que evitasse a secagem. inicialmente. que logicamente interagiu menos com a fase estacionária. Obtendo-se a primeira fração ( banda amarela) e vendo que a banda verde continuava imóvel. pois acontecendo isso. pode-se supostamente deduzir que não houve tempo suficiente para que nenhum composto fosse deslocado pelo solvente. foi necessária a realização de uma eluição por polaridade. a qual supostamente é menos polar que a fase estacionária. resfriando as bolhas que conseqüentemente conseguiram migrar. que consistiu no uso de um solvente volátil( acetona). que possuiu desvantagem na competição pelo sítio de ativação na superfície do adsorvente. à medida que se colocou o eluente( hexano). tendo dificuldade assim. . que possibilitou o deslocamento dos componentes das clorofilas(polar). ou seja.

Obs. pode-se dessolver o extrato já que na amostra existem grupos de carotenos (apolar) e grupo de clorofilas (polar). à medida que o caroteno atravessou a coluna facilmente. Na CCD. 4) Por que o extrato foi aplicado sobre as placas previamente preparadas e não sobre as placas preparadas durante o experimento? Porque as placas preparadas durante o experimento necessitariam de mais tempo de exposição ao ar para que ocorresse uma secagem efetiva que implicasse na aderência do adsorvente sobre as mesmas. pode extrair os componentes desejados. 7) O que é Rf? Rf é o fator de retenção. 5)Qual a finalidade do uso da CCD nesse experimento? A cromatografia em coluna tem como finalidade a separação e a obtenção dos compostos (clorofilas e carotenos).ANEXO I Questionário 1)Por que as folhas foram moídas? As folhas foram moídas a fim de se obter o extrato. enquanto o caroteno foi facilmente arrastado pelo solvente para a extremidade superior da placa. uma vez que a CCD só verifica a separação dos componentes. modulando a polaridade. a clorofila permaneceu imóvel na parte superior da mesma. Sabendo-se a fase estacionária é polar. 3) Após a preparação do extrato de folhas de espinafre observa-se a presença de duas fases. o solvente orgânico extrator. É importante ressaltar que apesar das placas fabricadas terem um custo maior. 2) Por que foi utilizado uma mistura de acetona e hexano no preparo de extrato? Por ser utilizada uma mistura de um componente polar (acetona) e um componente (apolar). 6) Qual dos dois componentes é mais polar? Explique. a clorofila permaneceu no centro da placa. Explicar. Pode-se confirmar que o componente mais polar é a clorofila. e que a o grupo de clorofila interagiu mais com a FE . E as placas preparadas em laboratório estão mais sujeitas a ausência de aderência do adsorvente e a uniformidade.: Os cálculos do Rf para cada banda foi realizada durante o desenvolvimento do relatório. Na CC. elas são mais confiáveis. aumentando-se assim a superfície de contato com os solventes para a extração dos componentes da amostra e possibilitando a retirada da fase aquosa do extrato. . pois dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas. Problemas estes que implicam na realização do experimento. As duas fases correspondem à fase orgânica extraída pelo solvente e à fase aquosa proveniente da umidade natural da planta. pois foi menos deslocada pela fase móvel. Então. que é obtido a partir da relação da distância percorrida pelo componente da mistura(dc) e a distância percorrida pelo eluente ( de).

11) Qual grupo de compostos eluiu primeiro da coluna? Qual do grupo de compostos ficou mais retido? O componente que eluiu primeiro foi o caroteno. o mecanismo de separação é o processo físico. incluindo a formação de ponte de hidrogênio. No segundo método. a obtenção da separação completa de uma mistura será provavelmente impossível. A adsorção se dá na interface entre o sólido e a fase móvel. devido à presença de grupos ativos na sua superfície. Em relação à clorofila. a mesma posicionou-se no centro da placa. sob a luz UV os compostos geralmente como manchas brilhantes de prata. no caso do experimento. não podendo conseqüentemente arrastar a clorofila. pois por ser apolar interagiu com mais com a fase móvel. 9) Se os componentes não fossem coloridos como poderiam ser identificadas as bandas na cromatografia em camada delgada? Os métodos mais comuns para visualização de uma placa são:  Vapores de iodo. então separado.8) Considerando a natureza química das substâncias separadas . O estudo dos cromatogramas foi realizado na discussão. sendo eluida apenas quando se realizou uma eluição por polaridade através da escolha da acetona como o solvente.pois os dois fatores causam inclinação das bandas resultando em separação parcial. na CC. já na CCD foi facilmente arrastado até a extremidade inferior da coluna.  Lâmpada ultravioleta. uma vez que o hexano é um solvente polar. . E a clorofila ficou retida. Outro método consiste na adição de um indicador de fluorescência ao adsorvente usado para cobrir a placa. já na CCD. que é baseado principalmente em atrações eletrostáticas ou dipolares (forças de Van Der Waals). 10) Por que a coluna não deve possuir bolhas e não deve secar? Se o adsorvente secar ou tiver bolhas de ar. comparar e explicar os cromatogramas obtidos no experimento I. sendo pouco deslocada pela FM. Na CC o caroteno ficou na extremidade inferior da coluna por ter interagido mais com a fase móvel. 13) Qual é o mecanismo de separação dos dois grupos de compostos neste experimento? O mecanismo de separação é dado pela interação da fase estacionária e da fase móvel com os componentes da mistura. a polaridade da fase estacionária e da fase móvel. No primeiro método. 12) Comparar o comportamento observado das bandas na CC com o observado na CCD. sendo. que é denominado de processo de adsorção. a mesma ficou retida na extremidade superior da placa por não interagir com a fase móvel (hexano). sendo facilmente deslocado. os vapores de iodo regiram com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor marrom ou amarela.

oleracea Nome binomial Spinacia oleracea .ANEXO II Spinacia oleracea na época de floração Classificação científica Reino: Divisão: Classe: Ordem: Família: Gênero: Espécie: Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Caryophyllales Amaranthaceae Spinacia S.

Os carotenóides são pigmentos amarelos que também estão envolvidos no processo fotossintético. Duas formas diferentes destes pigmentos são as clorofilas a e b. Elas são capazes de absorver certos tipos de comprimentos de onda da luz visível que então são convertidos em energia pelas plantas. O 〈-caroteno difere do isômero ® na posição da dupla ligação no anel cicloexano (C4-C5 ao invés de C5-C6).6. a estrutura do ®-caroteno está representada na figura 2.Adicionalmente.ANEXO III As clorofilas são os pigmentos verdes que atuam como as principais moléculas foto receptoras das plantas. os cloroplastos também contêm vários derivados de carotenos contendo oxigênio chamados de xantofilas. .

28p. Análise Química Quantitativa. RJ. 4aed. Aramando. HTTP:// www. D.C.. LAVOURRETE. LTC. Técnicas e Operações Unitárias em química Laboratorial. 5a ed. Análise Química Quantitativa. Ed. Artur. 2001. 5a ed.Referências Bibliográficas VOGEL. 2003. HARRIS.. Rio de Janeiro.pdf acessado às 13:00 do dia 19 de fevereiro de 2009 .br/pdf/abmvz/v59n5/a20v59n5.Guanabara Koogan.scielo..

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