ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS

Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias,

fungos,algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar
as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se
primeiramente isolá-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos
os demais tipos de organismos, ondetodas as células na população sejam
idênticas (originárias de uma mesma célulaparental).
CULTIVO DE CULTURAS PURAS

� MEIOS DE CULTURA
Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem
sersupridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal,
uma cultura decélulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes
requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura.
Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos
diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio
laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em
placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo
(líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidossão úteis para a obtenção de
relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas
bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais
microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não
possibilitando a observação de algumas características específicas dos
microrganismos, como a morfologia de suas colônias.
Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são
utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a
composição exata de tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são
meios onde somente são fornecidos elementos químicos necessários ao
microrganismo, na forma de moléculas ou fórmulas iônicas simples. Nesses
meios somente são encontrados uma única fonte de
carbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos),
de fósforo,etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou
ácidos nucléicos.
Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informações
especiais sobre os microrganismos:
� Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento de
determinados microrganismos em detrimento de outros, que também se
encontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporação
de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal
seleção.
Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N.
meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina,
nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –
seletivos para Streptococcus mutans.
� Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação
presuntiva de espécies de microrganismos que porventura estejam
colonizando um mesmo ecossistema. Esses meios, via de regra, permitem a
obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas
(morfologia, coloração, etc), de acordo com o processamento de agentes
cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio. Ex.: ágar-
sangue (Porphyromonas e Prevotellas).
� Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos
empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos
exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno
número numa amostra que inclui grande número de outros da microbiota
normal.
� Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na
coleta e manutenção de bactérias anaeróbias, onde são adicionadas
substâncias redutoras (ácido ascórbico 0,1%, cisteína 0,1%, tioglicolato de
sódio 0,1%) que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução
(azul de metileno, resazurina).
� Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das
bactérias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. Ex.: Brain
Heart Infusion Agar – BHI agar.
� Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma
mistura simples contendo glicose, uma fonte de nitrogênio inorgânico ou
orgânico e alguns minerais. Em geral esses meios têm uma concentração
maior de açúcar (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6) que o meio para cultivo
bacteriano (pH 6,5 a 7,5). Ex.: Sabouraud Agar.

FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO

� A origem do material a ser analisado
� A espécie que se imagina estar presente na amostra
� As necessidades nutricionais dos organismos.
MÉTODOS DE CULTIVO
Inoculação
Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura), obtido de uma
suspensão original da amostra, é colocado dentro ou sobre um meio
geleificado (ágar), as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar
produzindo uma colônia isolada. Cada colônia nada mais é do que células
individuais agrupadas, com ancestral único, visível a olho nu.
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� Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de
semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio.
� Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na
superfície do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky).
� Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágar
fundido a 45°C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o ágar se
solidifica, as células são nele imobilizadas e crescem, formando colônias.
Se a suspensão de células que será inoculada foi previamente diluída, as
colônias formadas estarão bem separadas, com alta probabilidade de ser
derivada de uma única célula. Mas para se ter certeza disso é necessário
repicar uma colônia do tipo desejado, suspendê-la em solução apropriada e
replaqueá-la. Este procedimento deverá ser repetido quantas vezes for
necessário, o que irá assegurar a obtenção de uma cultura pura.
Colônias
Aparência das estrias
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Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com
extinção. Asuspensão original da amostra é diluída seriadamente e
semeiam-se amostras de cada diluição. Se apenas algumas amostras de uma
diluição particular exibirem crescimento, presume-se que essas culturas se
originaram a partir de células isoladas. Este método é utilizado somente
quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deve
ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em
uma população mista.
MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS
Por vezes, é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano em
meios artificiais, assim como este ocorre em ambiente natural. Para
contornar este problema reproduz-se em laboratório as condições ideais
para o crescimento do microrganismo que se deseja isolar, tais como:
� diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo
Microrganismo
� temperatura de incubação
� aeração
� pH
Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em uma
amostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a
semeadura em tantos meios e condições de incubação diferentes quantos
sejam necessários para se obter o crescimento da maioria das espécies
presentes na amostra.
Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma
população mista, alguns recursos podem ser empregados de acordo com as
características do microrganismo desejado, tais como meios diferenciais,
meios seletivos, meios enriquecidos, o aquecimento do material, ação de
álcalis ou ácidos fortes, e inoculação em animal sensível.
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ISOLAMENTO DE AERÓBIOS
Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. Após a
semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes são mantidos em
estufa a 37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. Existem grupos
de microrganismos,como a Neisseria gonorrohoeae, que necessitam níveis
elevados de dióxido de carbono(CO2), neste caso pode ser utilizado o
método da jarra microaerófila. Após semeados, os meio são colocados
dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é então
fechada hermeticamente. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade
reduzida de oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de
aproximadamente 10%.
ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOS
Durante a preparação dos meios, estes são fervidos para que a maior parte
do oxigênio dissolvido seja retirada. O gás nitrogênio livre de oxigênio é
colocado nostubos contendo o meio, e então um agente redutor deve ser
adicionado (normalmentecisteína), o qual remove os últimos traços de
oxigênio. Os meio são esterilizados emautoclave na completa ausência de
oxigênio.
� Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é
dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da
câmara.
A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio, dióxido de
carbono e nitrogênio. O material é introduzido ou removido da câmara por
meio de um sistema fechado para o ar. Qualquer resíduo de oxigênio na
câmara é removido pela reação com o hidrogênio, na presença do
catalisador paládio.
� Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma
jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que
geram hidrogênio e dióxido de carbono. Este sistema é inadeqüado para o
cultivo de anaeróbios estritos.
� Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em
coluna alta, crescendo no fundo do tubo de ensaio.
Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos, que são meios de
cultura com a adição de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sódio), que
são capazes de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2.

MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA

Existe uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano.
Os dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o
número de células - UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL –
ex.: Contagem celular microscópica ou eletrônica, contagem em placa ou
através de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda
através da estimativa de unidades de absorbância da massa de células em
caldo ou outras suspensões (turbidez).
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Através das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os
microrganismos, que podem variar desde uma microscopia relativamente
simples à análise do material genético encontrado na célula, procura-se
enquadrar o microrganismo numa espécie. Uma coleção de dados é
utilizada para caracterizar espécies diferentes:
� Características Culturais
O primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a
observação da natureza do meio em que o organismo está crescendo.
O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma,
dimensões, estrutura, brilho, etc) irá possibilitar uma identificação
preliminar, mas não definitiva do organismo estudado, já que muitas
espécies podem produzir colônias quenão diferem entre si. (ex.: algumas
colônias de E. coli são indistingüíveis das de Shigella quando cultivadas
em ágar- Hektoen).
Morfologia Colonial
� Características Morfológicas
Os microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico
utilizando-sepreparações fixadas e coradas. Preparações a fresco (em gota
pendente ou preparações entre lâmina e lamínula), são úteis quando a
estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes
químicos utilizados na preparação do material seco e corado, podendo ser
utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmenteou para
observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados.
As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dos
microrganismos (flagelos, membranas, cápsulas), identificar suas estruturas
internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As
colorações podem ser feitas com um ou mais corantes.
Coloração simples: realizada com uma única solução corante. As células
coram-se uniformemente com esta técnica. (ex.: Violeta de genciana)
Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. Evidencia
diferenças entre as células microbianas ou parte das células. (ex.:
Coloração de Gram, Coloração de Zihel-Nielsen)
Coloração de Gram
O microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido
de colônias isoladas para obter, através de observação ao microscópio
óptico, maiores informações sobre a morfologia celular. A maioria das
bactérias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os
resultados apresentados pelo Gram:
Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro
Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho
Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura
das paredes celulares das bactérias.
Microscopia Óptica
Os microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de
1000x o tamanho original do espécime. Com algumas modificações,
incluindo oculares
de alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar
a aproximadamente 2000x. A imagem formada pelas objetivas é também
ampliada pelas lentes oculares. Assim, a combinação do sistema de lentes
da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliação. Existem
diversos tipos de microscópio de luz: Microscópio de campo claro, de
campo escuro, de fluorescência, de contraste de fase.
O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de
200.000 – 400.000x o tamanho original do espécime, devido ao alto poder
de resolução proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos
feixes de elétrons utilizados,
em vez da luz. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra
estruturas das
células microbianas.
Existem avanços mais recentes na microscopia, como aquelas que utilizam
computadores, outras fontes de iluminação, ou novas técnicas de coloração
� Características Metabólicas
Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade
metabólica (metabolismo oxidativo, metabolismo fermentativo,
catabolismo protéico) de umorganismo. O registro das reações realizadas
por uma espécie microbiana é útil e muitasvezes essencial para sua
identificação
� Características Fisiológicas
Condições físicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o pH, a
luminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo
tambémfornecem parâmetros para a identificação. Por exemplo, os
microrganismos do corpo humano crescem a 35°C e os do oceano a
temperaturas entre 4 e 20°C.
� Características Antigênicas
Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que
podem agir como antígeno e induzir, desta forma, a produção de
anticorpos. Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem ser
usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas
e são usados para caracterizar microrganismos.
� Características patogênicas
A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal, plantas ou
micróbios), com a finalidade de reproduzir a doença, poderá determinar se
este é ou não um patógeno.
� Características genéticas
Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitem
realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos
ou compreender a sua atividade, através de métodos mais sensíveis e
precisos.
CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS
Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método de
conservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com
o objetivo do estudo a ser realizado.
Conservação por um curto período (dias a meses):
� Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C)
� Repiques freqüentes
Conservação por longos períodos:
� Nitrogênio líquido a -196°C
� Freezers a -70°C/ -120°C
� Liofilização – congelamento a seco - as amostras são congeladas,
desidratadas e fechadas à vácuo, o que possibilita a viabilidade das culturas
por muitos anos. Esta técnica permite a obtenção de uma coleção de
microrganismos como referência, por exemplo.
Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada a
atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em
particular:
CULTIVO DE VÍRUS
Para isolar vírus em laboratório, é necessário fornecer células hospedeiras
vivas, já que são parasitas intracelulares estritos.
Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados
em cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio
solidificado em placa.
Vírus animais:
� Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado, devido ao alto custo.
Alguns
vírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente em
animais vivos. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos,
coelhos e cobaias. São utilizados em estudo sobre a resposta imune do
hospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus é
capaz de causar uma infecção.
� Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos
embrionados (embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente
com vírus,
utilizando-se uma agulha e seringa, por meio de um orifício aberto na
casca. A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por
2 a 3 dias para permitir a multiplicação dos vírus. Diferentes tecidos do
embriãosão inoculados, dependendo do tipo de vírus.
� Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células, esta pode
serutilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus.
Podem ser utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem
contínua.Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus
invadem ascélulas, geralmente causando algum tipo de alteração visível. O
ECP pode ter diferentes aspectos, dependendo do vírus e do tipo de células
na cultura. Um tipo de ECP é o corpúsculo de inclusão, que é uma
estrutura intracelular anormal. Sua presença pode ajudar a identificar o
vírus que esteja causando uma infecção, por exemplo, os
corpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o
vírus da varíola.
Vírus de Plantas
Podem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas
por meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas
folhas da planta.
QUESTIONÁRIO
1. Defina o termo “cultura pura”.
2. Descreva as principais características dos microrganismos usadas na
identificação das espécies.
3. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio.
4. Quais as técnicas para conservação de culturas?
5. Explique a finalidade dos principais meios de cultura.
BIBLIOGRAFIA
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Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. & Krieg, N.R. Caracterização dos
Microrganismos. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. 2.ed. vol.1.
São
Paulo: Mc Graw Hill do Brasil. 1996. Cap.3. p. 75-99