ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos,algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente

. Para estudar as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, ondetodas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célulaparental). CULTIVO DE CULTURAS PURAS
MEIOS DE CULTURA

Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem sersupridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura decélulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura. Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidossão úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias. Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são fornecidos elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas ou fórmulas iônicas simples. Nesses meios somente são encontrados uma única fonte de carbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos), de fósforo,etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou ácidos nucléicos. Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informações especiais sobre os microrganismos: Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, que também se encontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporação de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção. Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –

uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. Pode ser adicionado sangue.5).1%) que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de metileno. etc. permitem a obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia. Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas. MÉTODOS DE CULTIVO Inoculação Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura). é colocado dentro ou sobre um meio geleificado (ágar). Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva de espécies de microrganismos que porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na coleta e manutenção de bactérias anaeróbias. tioglicolato de sódio 0.seletivos para Streptococcus mutans. resazurina). obtido de uma suspensão original da amostra. 4 Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio. via de regra.5 a 7.1%. soro animal. glicose. Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose. visível a olho nu. etc).1%. Ex. . de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio. Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky). FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO A origem do material a ser analisado A espécie que se imagina estar presente na amostra As necessidades nutricionais dos organismos. onde são adicionadas substâncias redutoras (ácido ascórbico 0. Ex. as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia isolada. Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das bactérias.: Brain Heart Infusion Agar – BHI agar. coloração. Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno número numa amostra que inclui grande número de outros da microbiota normal.: ágarsangue (Porphyromonas e Prevotellas).6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6. Esses meios. com ancestral único.: Sabouraud Agar.8 a 5. Em geral esses meios têm uma concentração maior de açúcar (4%) e um pH menor (3. cisteína 0. Ex.

o aquecimento do material. alguns recursos podem ser empregados de acordo com as características do microrganismo desejado. assim como este ocorre em ambiente natural. as colônias formadas estarão bem separadas. Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágar fundido a 45°C. que se verte em uma placa de Petri. Este método é utilizado somente quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deve ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma população mista. Asuspensão original da amostra é diluída seriadamente e semeiam-se amostras de cada diluição. MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS Por vezes. Este procedimento deverá ser repetido quantas vezes for necessário. tais como: diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo Microrganismo temperatura de incubação aeração pH Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em uma amostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condições de incubação diferentes quantos sejam necessários para se obter o crescimento da maioria das espécies presentes na amostra. 6 . ação de álcalis ou ácidos fortes. com alta probabilidade de ser derivada de uma única célula. suspendê-la em solução apropriada e replaqueá-la. as células são nele imobilizadas e crescem. o que irá assegurar a obtenção de uma cultura pura. Mas para se ter certeza disso é necessário repicar uma colônia do tipo desejado. Quando o ágar se solidifica. e inoculação em animal sensível. Se a suspensão de células que será inoculada foi previamente diluída. meios enriquecidos. Colônias Aparência das estrias 5 Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com extinção. meios seletivos. formando colônias. Para contornar este problema reproduz-se em laboratório as condições ideais para o crescimento do microrganismo que se deseja isolar. Se apenas algumas amostras de uma diluição particular exibirem crescimento. tais como meios diferenciais. presume-se que essas culturas se originaram a partir de células isoladas. Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma população mista. é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano em meios artificiais.

que são meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex. contagem em placa ou através de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda .ISOLAMENTO DE AERÓBIOS Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. estes são fervidos para que a maior parte do oxigênio dissolvido seja retirada. crescendo no fundo do tubo de ensaio. Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da câmara. Os meio são esterilizados emautoclave na completa ausência de oxigênio. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10%. Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos. o qual remove os últimos traços de oxigênio.como a Neisseria gonorrohoeae. Após a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura. Este sistema é inadeqüado para o cultivo de anaeróbios estritos. neste caso pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. O material é introduzido ou removido da câmara por meio de um sistema fechado para o ar. Após semeados. estes são mantidos em estufa a 37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. Os dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células . e então um agente redutor deve ser adicionado (normalmentecisteína). na presença do catalisador paládio. Existem grupos de microrganismos. Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna alta. os meio são colocados dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é então fechada hermeticamente. A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio. Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono. Qualquer resíduo de oxigênio na câmara é removido pela reação com o hidrogênio.UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL – ex. que são capazes de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2. dióxido de carbono e nitrogênio. ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOS Durante a preparação dos meios. O gás nitrogênio livre de oxigênio é colocado nostubos contendo o meio. MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA Existe uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano.: Contagem celular microscópica ou eletrônica.: tioglicolato de sódio). que necessitam níveis elevados de dióxido de carbono(CO2).

Coloração de Zihel-Nielsen) Coloração de Gram O microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido de colônias isoladas para obter. brilho. que podem variar desde uma microscopia relativamente simples à análise do material genético encontrado na célula. são úteis quando a estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes químicos utilizados na preparação do material seco e corado. O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma.através da estimativa de unidades de absorbância da massa de células em caldo ou outras suspensões (turbidez). Evidencia diferenças entre as células microbianas ou parte das células. (ex. A maioria das bactérias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram: Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho . etc) irá possibilitar uma identificação preliminar.: algumas colônias de E. procura-se enquadrar o microrganismo numa espécie. As células coram-se uniformemente com esta técnica. cápsulas).: Coloração de Gram. Uma coleção de dados é utilizada para caracterizar espécies diferentes: Características Culturais O primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a observação da natureza do meio em que o organismo está crescendo. maiores informações sobre a morfologia celular. As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dos microrganismos (flagelos. Morfologia Colonial Características Morfológicas Os microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico utilizando-sepreparações fixadas e coradas. através de observação ao microscópio óptico. podendo ser utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmenteou para observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados. identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. mas não definitiva do organismo estudado. já que muitas espécies podem produzir colônias quenão diferem entre si. coli são indistingüíveis das de Shigella quando cultivadas em ágar.: Violeta de genciana) Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. (ex. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes.Hektoen). IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS Através das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os microrganismos. dimensões. Coloração simples: realizada com uma única solução corante. Preparações a fresco (em gota pendente ou preparações entre lâmina e lamínula). estrutura. membranas. (ex.

desta forma. devido ao alto poder de resolução proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons utilizados. Microscopia Óptica Os microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de 1000x o tamanho original do espécime. O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de 200. como aquelas que utilizam computadores.000 – 400. A imagem formada pelas objetivas é também ampliada pelas lentes oculares. a combinação do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliação. outras fontes de iluminação. Assim. incluindo oculares de alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar a aproximadamente 2000x. os microrganismos do corpo humano crescem a 35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C. Existem avanços mais recentes na microscopia. O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitasvezes essencial para sua identificação Características Fisiológicas Condições físicas como a atmosfera gasosa.Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactérias. Existem diversos tipos de microscópio de luz: Microscópio de campo claro. a luminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo tambémfornecem parâmetros para a identificação. de contraste de fase.000x o tamanho original do espécime. Características patogênicas A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal. plantas ou . Por exemplo. Características Antigênicas Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que podem agir como antígeno e induzir. em vez da luz. o pH. de campo escuro. metabolismo fermentativo. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra estruturas das células microbianas. Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar microrganismos. a temperatura. catabolismo protéico) de umorganismo. a produção de anticorpos. Com algumas modificações. de fluorescência. ou novas técnicas de coloração Características Metabólicas Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade metabólica (metabolismo oxidativo.

com a finalidade de reproduzir a doença. Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados em cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado em placa. poderá determinar se este é ou não um patógeno. por exemplo. Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos embrionados (embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente com vírus. Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em particular: CULTIVO DE VÍRUS Para isolar vírus em laboratório. já que são parasitas intracelulares estritos. CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método de conservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado. devido ao alto custo. desidratadas e fechadas à vácuo. Vírus animais: Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado.micróbios). .as amostras são congeladas. o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. coelhos e cobaias. Alguns vírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente em animais vivos. é necessário fornecer células hospedeiras vivas. através de métodos mais sensíveis e precisos. Características genéticas Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitem realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade. São utilizados em estudo sobre a resposta imune do hospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus é capaz de causar uma infecção. Conservação por um curto período (dias a meses): Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C) Repiques freqüentes Conservação por longos períodos: Nitrogênio líquido a -196°C Freezers a -70°C/ -120°C Liofilização – congelamento a seco . Esta técnica permite a obtenção de uma coleção de microrganismos como referência. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos.

Diferentes tecidos do embriãosão inoculados. ed.1.477-499. M. esta pode serutilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus. Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células. O ECP pode ter diferentes aspectos. 1996. por meio de um orifício aberto na casca. 4. Peterson. Defina o termo “cultura pura”. S. Explique a finalidade dos principais meios de cultura. E. 1994. 2. geralmente causando algum tipo de alteração visível. Finegold.3.R. 1984. St. dependendo do vírus e do tipo de células na cultura. p. E.Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus invadem ascélulas.M. Chan. Cap. O.S. que é uma estrutura intracelular anormal. 3. Um tipo de ECP é o corpúsculo de inclusão. L. QUESTIONÁRIO 1. Podem ser utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem contínua.J. Caracterização dos Microrganismos. Bier. 75-99 . Métodos gerais de estudo das bactérias. Quais as técnicas para conservação de culturas? 5.C. BIBLIOGRAFIA Baron. In: Microbiologia e Imunologia.ed. A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por 2 a 3 dias para permitir a multiplicação dos vírus. Pelczar. Louis: Mosby. 2. Cap.R.. Vírus de Plantas Podem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas por meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas folhas da planta. Cap. N. p.J.. 9. Descreva as principais características dos microrganismos usadas na identificação das espécies.. & Krieg. 474-504. os corpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o vírus da varíola. p. 25. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. São Paulo: Melhoramentos. por exemplo. 4.utilizando-se uma agulha e seringa. São Paulo: Mc Graw Hill do Brasil. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio. Methods for identification of etiological agents of infectious disease. 23. In: Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. Sua presença pode ajudar a identificar o vírus que esteja causando uma infecção. vol. ed. dependendo do tipo de vírus.

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