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ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS

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ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos,algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente

. Para estudar as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, ondetodas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célulaparental). CULTIVO DE CULTURAS PURAS
MEIOS DE CULTURA

Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem sersupridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura decélulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura. Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidossão úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias. Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são fornecidos elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas ou fórmulas iônicas simples. Nesses meios somente são encontrados uma única fonte de carbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos), de fósforo,etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou ácidos nucléicos. Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informações especiais sobre os microrganismos: Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, que também se encontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporação de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção. Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –

1%) que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de metileno. soro animal.1%. Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas. é colocado dentro ou sobre um meio geleificado (ágar).8 a 5. obtido de uma suspensão original da amostra. MÉTODOS DE CULTIVO Inoculação Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura). Ex.seletivos para Streptococcus mutans.5 a 7. de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio. Ex.6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6. Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das bactérias. Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva de espécies de microrganismos que porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. 4 Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio. via de regra. Esses meios. Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose. FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO A origem do material a ser analisado A espécie que se imagina estar presente na amostra As necessidades nutricionais dos organismos. resazurina).1%. glicose. tioglicolato de sódio 0.: Sabouraud Agar. Pode ser adicionado sangue.5).: ágarsangue (Porphyromonas e Prevotellas). permitem a obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia. as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia isolada. . etc. onde são adicionadas substâncias redutoras (ácido ascórbico 0. Ex. Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na coleta e manutenção de bactérias anaeróbias. etc). uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. visível a olho nu. com ancestral único. coloração. Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno número numa amostra que inclui grande número de outros da microbiota normal. Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky). Em geral esses meios têm uma concentração maior de açúcar (4%) e um pH menor (3. cisteína 0.: Brain Heart Infusion Agar – BHI agar.

Este método é utilizado somente quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deve ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma população mista. Asuspensão original da amostra é diluída seriadamente e semeiam-se amostras de cada diluição. ação de álcalis ou ácidos fortes. Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágar fundido a 45°C. presume-se que essas culturas se originaram a partir de células isoladas. alguns recursos podem ser empregados de acordo com as características do microrganismo desejado. Quando o ágar se solidifica. MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS Por vezes. com alta probabilidade de ser derivada de uma única célula. e inoculação em animal sensível. tais como: diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo Microrganismo temperatura de incubação aeração pH Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em uma amostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condições de incubação diferentes quantos sejam necessários para se obter o crescimento da maioria das espécies presentes na amostra. é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano em meios artificiais. que se verte em uma placa de Petri. Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma população mista. 6 . Para contornar este problema reproduz-se em laboratório as condições ideais para o crescimento do microrganismo que se deseja isolar. Colônias Aparência das estrias 5 Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com extinção. Se apenas algumas amostras de uma diluição particular exibirem crescimento. meios enriquecidos. Este procedimento deverá ser repetido quantas vezes for necessário. formando colônias. as colônias formadas estarão bem separadas. Mas para se ter certeza disso é necessário repicar uma colônia do tipo desejado. o aquecimento do material. assim como este ocorre em ambiente natural. Se a suspensão de células que será inoculada foi previamente diluída. meios seletivos. suspendê-la em solução apropriada e replaqueá-la. as células são nele imobilizadas e crescem. tais como meios diferenciais. o que irá assegurar a obtenção de uma cultura pura.

crescendo no fundo do tubo de ensaio.ISOLAMENTO DE AERÓBIOS Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. estes são fervidos para que a maior parte do oxigênio dissolvido seja retirada. A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio. o qual remove os últimos traços de oxigênio. Existem grupos de microrganismos.: Contagem celular microscópica ou eletrônica. Os meio são esterilizados emautoclave na completa ausência de oxigênio.como a Neisseria gonorrohoeae. Após a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura.: tioglicolato de sódio). Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos. Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono. Após semeados. MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA Existe uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10%. os meio são colocados dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é então fechada hermeticamente. Os dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células . dióxido de carbono e nitrogênio. Qualquer resíduo de oxigênio na câmara é removido pela reação com o hidrogênio.UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL – ex. Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna alta. e então um agente redutor deve ser adicionado (normalmentecisteína). contagem em placa ou através de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda . ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOS Durante a preparação dos meios. estes são mantidos em estufa a 37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. na presença do catalisador paládio. Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da câmara. que necessitam níveis elevados de dióxido de carbono(CO2). que são meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex. neste caso pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. O gás nitrogênio livre de oxigênio é colocado nostubos contendo o meio. O material é introduzido ou removido da câmara por meio de um sistema fechado para o ar. Este sistema é inadeqüado para o cultivo de anaeróbios estritos. que são capazes de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2.

: Violeta de genciana) Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. maiores informações sobre a morfologia celular. cápsulas). identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. coli são indistingüíveis das de Shigella quando cultivadas em ágar. membranas. O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma. IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS Através das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os microrganismos.: Coloração de Gram. brilho. Coloração de Zihel-Nielsen) Coloração de Gram O microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido de colônias isoladas para obter. mas não definitiva do organismo estudado.Hektoen). estrutura. A maioria das bactérias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram: Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho . As células coram-se uniformemente com esta técnica. através de observação ao microscópio óptico. Evidencia diferenças entre as células microbianas ou parte das células. Uma coleção de dados é utilizada para caracterizar espécies diferentes: Características Culturais O primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a observação da natureza do meio em que o organismo está crescendo. dimensões. Morfologia Colonial Características Morfológicas Os microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico utilizando-sepreparações fixadas e coradas.: algumas colônias de E. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes. já que muitas espécies podem produzir colônias quenão diferem entre si. que podem variar desde uma microscopia relativamente simples à análise do material genético encontrado na célula. podendo ser utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmenteou para observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados. (ex. As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dos microrganismos (flagelos. etc) irá possibilitar uma identificação preliminar. (ex. Coloração simples: realizada com uma única solução corante. procura-se enquadrar o microrganismo numa espécie. são úteis quando a estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes químicos utilizados na preparação do material seco e corado. Preparações a fresco (em gota pendente ou preparações entre lâmina e lamínula).através da estimativa de unidades de absorbância da massa de células em caldo ou outras suspensões (turbidez). (ex.

de fluorescência.Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactérias. Características patogênicas A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal. plantas ou . catabolismo protéico) de umorganismo. O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitasvezes essencial para sua identificação Características Fisiológicas Condições físicas como a atmosfera gasosa. de campo escuro. Com algumas modificações. a luminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo tambémfornecem parâmetros para a identificação. Microscopia Óptica Os microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de 1000x o tamanho original do espécime. Existem avanços mais recentes na microscopia. os microrganismos do corpo humano crescem a 35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C. outras fontes de iluminação. o pH. de contraste de fase. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra estruturas das células microbianas. Por exemplo. Existem diversos tipos de microscópio de luz: Microscópio de campo claro. devido ao alto poder de resolução proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons utilizados. O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de 200. a temperatura. em vez da luz. Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar microrganismos.000x o tamanho original do espécime. ou novas técnicas de coloração Características Metabólicas Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade metabólica (metabolismo oxidativo. A imagem formada pelas objetivas é também ampliada pelas lentes oculares. a combinação do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliação.000 – 400. Assim. como aquelas que utilizam computadores. a produção de anticorpos. metabolismo fermentativo. desta forma. Características Antigênicas Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que podem agir como antígeno e induzir. incluindo oculares de alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar a aproximadamente 2000x.

CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método de conservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado. Características genéticas Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitem realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade. Conservação por um curto período (dias a meses): Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C) Repiques freqüentes Conservação por longos períodos: Nitrogênio líquido a -196°C Freezers a -70°C/ -120°C Liofilização – congelamento a seco . Vírus animais: Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos. o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. Alguns vírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente em animais vivos. Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos embrionados (embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente com vírus. através de métodos mais sensíveis e precisos.as amostras são congeladas.micróbios). Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados em cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado em placa. devido ao alto custo. Esta técnica permite a obtenção de uma coleção de microrganismos como referência. é necessário fornecer células hospedeiras vivas. poderá determinar se este é ou não um patógeno. desidratadas e fechadas à vácuo. coelhos e cobaias. por exemplo. . São utilizados em estudo sobre a resposta imune do hospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus é capaz de causar uma infecção. com a finalidade de reproduzir a doença. já que são parasitas intracelulares estritos. Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em particular: CULTIVO DE VÍRUS Para isolar vírus em laboratório.

1. A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por 2 a 3 dias para permitir a multiplicação dos vírus. Pelczar. p.utilizando-se uma agulha e seringa. dependendo do vírus e do tipo de células na cultura. 2. Explique a finalidade dos principais meios de cultura. 1994. Podem ser utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem contínua.. 75-99 . por meio de um orifício aberto na casca. ed.Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus invadem ascélulas. Diferentes tecidos do embriãosão inoculados.477-499. p. 23. Louis: Mosby. Cap. Peterson. Cap. Bier.3.J. esta pode serutilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus. 4. & Krieg. Cap.ed. BIBLIOGRAFIA Baron. vol. Chan. Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. Um tipo de ECP é o corpúsculo de inclusão. dependendo do tipo de vírus. S.M. ed. os corpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o vírus da varíola. 9. O ECP pode ter diferentes aspectos.R. Caracterização dos Microrganismos. Descreva as principais características dos microrganismos usadas na identificação das espécies. E. que é uma estrutura intracelular anormal.J. Defina o termo “cultura pura”. p. Métodos gerais de estudo das bactérias...S. 4. Methods for identification of etiological agents of infectious disease. 1996. Finegold. 25. Quais as técnicas para conservação de culturas? 5. E. Sua presença pode ajudar a identificar o vírus que esteja causando uma infecção. N. 1984.R. 474-504. In: Microbiologia e Imunologia. QUESTIONÁRIO 1. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio. 2. por exemplo. São Paulo: Melhoramentos. St. São Paulo: Mc Graw Hill do Brasil. M. Vírus de Plantas Podem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas por meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas folhas da planta.C. geralmente causando algum tipo de alteração visível. L. 3. In: Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. O.

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