ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MICRORGANISMOS Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos,algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente

. Para estudar as propriedades deum determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo emcultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, ondetodas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célulaparental). CULTIVO DE CULTURAS PURAS
MEIOS DE CULTURA

Os ingredientes necessários para o crescimento de microrganismos podem sersupridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura decélulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura. Os meios de cultura contém os materiais nutrientes para o cultivos dos diferentes microrganismos. Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (líquido) ou ágar (sólido). Os meios líquidossão úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação de dois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias. Para se determinar as necessidades nutricionais de um microrganismo são utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composição exata de tais meios. Meios de cultura mínimos ou basais são meios onde somente são fornecidos elementos químicos necessários ao microrganismo, na forma de moléculas ou fórmulas iônicas simples. Nesses meios somente são encontrados uma única fonte de carbono (geralmente glucose), de nitrogênio (sais de amônio ou nitratos), de fósforo,etc. e não são detectados fatores de crescimento, aminoácidos ou ácidos nucléicos. Meios com finalidades especiais são meios que fornecem informações especiais sobre os microrganismos: Meios seletivos – são desenvolvidos para promover o crescimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, que também se encontram na amostra em questão. A prática mais comum é a incorporação de substâncias tais como antibióticos ou inibidores que propiciam tal seleção. Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis onde os organismos contaminantes são inbidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) –

4 Técnica de esgotamento por estrias: através de uma alça ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfície do meio. permitem a obtenção de colônias com características fenotípicas diferenciadas (morfologia.5).6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6. etc. visível a olho nu. Esses meios.1%) que se combinam com o oxigênio e indicadores de oxi-redução (azul de metileno.5 a 7. Meios de enriquecimento – são variações dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos microrganismos exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno número numa amostra que inclui grande número de outros da microbiota normal. de acordo com o processamento de agentes cromogênicos ou açúcares e indicadores incorporados ao meio.seletivos para Streptococcus mutans. com ancestral único. onde são adicionadas substâncias redutoras (ácido ascórbico 0. Ex. Meios para anaeróbios – são meios pré-reduzidos empregados na coleta e manutenção de bactérias anaeróbias. coloração. . uma fonte de nitrogênio inorgânico ou orgânico e alguns minerais. glicose. cisteína 0. Meios para o cultivo de bactérias – simulam o habitat natural das bactérias. obtido de uma suspensão original da amostra. soro animal. é colocado dentro ou sobre um meio geleificado (ágar).1%. MÉTODOS DE CULTIVO Inoculação Quando o inóculo (material colocado no meio de cultura). via de regra. Meios para o cultivo de fungos – os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose.1%. FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO A origem do material a ser analisado A espécie que se imagina estar presente na amostra As necessidades nutricionais dos organismos. Em geral esses meios têm uma concentração maior de açúcar (4%) e um pH menor (3. Técnica da semeadura em superfície: o inóculo é espalhado na superfície do ágar com o auxílio de uma alça de vidro (alça de Digralsky).: ágarsangue (Porphyromonas e Prevotellas). Cada colônia nada mais é do que células individuais agrupadas. Ex.: Sabouraud Agar. etc). resazurina). tioglicolato de sódio 0. Pode ser adicionado sangue.: Brain Heart Infusion Agar – BHI agar.8 a 5. Meios diferenciais – são desenvolvidos para facilitar a separação presuntiva de espécies de microrganismos que porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. Ex. as células são imobilizadas e cada uma irá se multiplicar produzindo uma colônia isolada.

Se a suspensão de células que será inoculada foi previamente diluída. Quando o ágar se solidifica. Este procedimento deverá ser repetido quantas vezes for necessário. assim como este ocorre em ambiente natural. Este método é utilizado somente quando não é possível o cultivo em placa por algum motivo e deve ser empregado apenas para se isolar o tipo de organismo predominante em uma população mista. que se verte em uma placa de Petri. Para contornar este problema reproduz-se em laboratório as condições ideais para o crescimento do microrganismo que se deseja isolar. meios seletivos. o que irá assegurar a obtenção de uma cultura pura. meios enriquecidos. e inoculação em animal sensível. as células são nele imobilizadas e crescem. tais como meios diferenciais. MANIPULAÇÃO DO CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS Por vezes. presume-se que essas culturas se originaram a partir de células isoladas. as colônias formadas estarão bem separadas. Colônias Aparência das estrias 5 Um outro método de obtenção de cultura pura é o de diluição com extinção. Método de pour-plate: uma suspensão de células é misturada com ágar fundido a 45°C. alguns recursos podem ser empregados de acordo com as características do microrganismo desejado. 6 . Para o isolamento de um tipo particular de microrganismo presente em uma população mista. tais como: diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo Microrganismo temperatura de incubação aeração pH Quando se deseja identificar a maior parte das espécies presente em uma amostra de uma população mista de microrganismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condições de incubação diferentes quantos sejam necessários para se obter o crescimento da maioria das espécies presentes na amostra. suspendê-la em solução apropriada e replaqueá-la. é extremamente difícil reproduzir o crescimento microbiano em meios artificiais. com alta probabilidade de ser derivada de uma única célula. Asuspensão original da amostra é diluída seriadamente e semeiam-se amostras de cada diluição. Mas para se ter certeza disso é necessário repicar uma colônia do tipo desejado. ação de álcalis ou ácidos fortes. o aquecimento do material. formando colônias. Se apenas algumas amostras de uma diluição particular exibirem crescimento.

os meio são colocados dentro da jarra – juntamente com uma vela acesa que é então fechada hermeticamente. Existem grupos de microrganismos. que são capazes de absorver o oxigênio ou gerar H2 e CO2. MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA Existe uma variedade de técnicas para quantificar o crescimento bacteriano. ISOLAMENTO DE ANAERÓBIOS Durante a preparação dos meios.ISOLAMENTO DE AERÓBIOS Estes microrganismos requerem oxigênio para sua sobrevivência. estes são mantidos em estufa a 37°C em presença de oxigênio do ar atmosférico. dióxido de carbono e nitrogênio. na presença do catalisador paládio. Após a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura. neste caso pode ser utilizado o método da jarra microaerófila. Câmara de anaerobiose: a manipulação dos microrganismos é dentro da câmara que contém luvas especiais acopladas à parede da câmara. Jarras de anaerobiose: os meios inoculados são colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contém substâncias químicas que geram hidrogênio e dióxido de carbono. A atmosfera dentro da câmara é uma mistura de hidrogênio. Os dois métodos quantitativos mais comuns são aqueles que avaliam o número de células . Os meio são esterilizados emautoclave na completa ausência de oxigênio. que necessitam níveis elevados de dióxido de carbono(CO2). Após semeados. crescendo no fundo do tubo de ensaio. Após a vela se apagar será obtida uma quantidade reduzida de oxigênio livre e um teor de dióxido de carbono de aproximadamente 10%. estes são fervidos para que a maior parte do oxigênio dissolvido seja retirada. o qual remove os últimos traços de oxigênio.como a Neisseria gonorrohoeae. Método de Veillon: o microrganismo é inoculado em meio sólido em coluna alta. Para os anaeróbios são utilizados meios reduzidos.UFC/mL – Unidade Formadora de Colônias por mL – ex. contagem em placa ou através de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda .: tioglicolato de sódio). que são meios de cultura com a adição de um agente redutor (ex. O gás nitrogênio livre de oxigênio é colocado nostubos contendo o meio. Este sistema é inadeqüado para o cultivo de anaeróbios estritos. Qualquer resíduo de oxigênio na câmara é removido pela reação com o hidrogênio. e então um agente redutor deve ser adicionado (normalmentecisteína).: Contagem celular microscópica ou eletrônica. O material é introduzido ou removido da câmara por meio de um sistema fechado para o ar.

Preparações a fresco (em gota pendente ou preparações entre lâmina e lamínula). etc) irá possibilitar uma identificação preliminar. Evidencia diferenças entre as células microbianas ou parte das células. através de observação ao microscópio óptico. Coloração simples: realizada com uma única solução corante. As técnicas de coloração servem para mostrar as várias estruturas dos microrganismos (flagelos. são úteis quando a estrutura do microrganismo pode serdistorcida pelo calor ou agentes químicos utilizados na preparação do material seco e corado. Uma coleção de dados é utilizada para caracterizar espécies diferentes: Características Culturais O primeiro passo para a identificação de uma colônia isolada é a observação da natureza do meio em que o organismo está crescendo.: Violeta de genciana) Coloração diferencial: envolve mais de uma solução corante. IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS Através das técnicas laboratoriais empregadas para caracterizar os microrganismos. mas não definitiva do organismo estudado. coli são indistingüíveis das de Shigella quando cultivadas em ágar. cápsulas). dimensões. O estudo da morfologia das colônias crescidas em meio sólido (forma. (ex. que podem variar desde uma microscopia relativamente simples à análise do material genético encontrado na célula. brilho. As células coram-se uniformemente com esta técnica. Coloração de Zihel-Nielsen) Coloração de Gram O microbiologista pode utilizar a coloração de Gram do material obtido de colônias isoladas para obter. estrutura. procura-se enquadrar o microrganismo numa espécie. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes. maiores informações sobre a morfologia celular.: Coloração de Gram. podendo ser utilizadas também quando o microrganismo não se cora facilmenteou para observar motilidade ou ingestão de alimentos particulados. identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. (ex. A maioria das bactérias pode ser dividida emdois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram: Bactérias Gram-positivas – coram-se em violeta escuro Bactérias Gram-negativas – coram-se em vermelho . (ex.: algumas colônias de E.Hektoen).através da estimativa de unidades de absorbância da massa de células em caldo ou outras suspensões (turbidez). Morfologia Colonial Características Morfológicas Os microrganismos podem ser observados ao microscópio óptico utilizando-sepreparações fixadas e coradas. já que muitas espécies podem produzir colônias quenão diferem entre si. membranas.

a temperatura. Este microscópio permite o exame de vírus e das ultra estruturas das células microbianas. como aquelas que utilizam computadores. de fluorescência. os microrganismos do corpo humano crescem a 35°C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20°C. Características patogênicas A inoculação do microrganismo em hospedeiro sensível (animal. O registro das reações realizadas por uma espécie microbiana é útil e muitasvezes essencial para sua identificação Características Fisiológicas Condições físicas como a atmosfera gasosa. a combinação do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliação. A imagem formada pelas objetivas é também ampliada pelas lentes oculares. a luminosidade e os fatores de crescimento próprios de cada microrganismo tambémfornecem parâmetros para a identificação. metabolismo fermentativo. Assim. Existem diversos tipos de microscópio de luz: Microscópio de campo claro. catabolismo protéico) de umorganismo. em vez da luz.000x o tamanho original do espécime. Existem avanços mais recentes na microscopia. Microscopia Óptica Os microscópios de luz conseguem uma ampliação máxima útil de cerca de 1000x o tamanho original do espécime. ou novas técnicas de coloração Características Metabólicas Existem vários testes laboratoriais que podem determinar a atividade metabólica (metabolismo oxidativo. Características Antigênicas Uma célula microbiana apresenta estruturas físicas em sua superfície que podem agir como antígeno e induzir. a produção de anticorpos. de contraste de fase. outras fontes de iluminação.000 – 400. O microscópio eletrônico produz uma ampliação máxima útil de cerca de 200. Com algumas modificações. devido ao alto poder de resolução proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons utilizados. Os anticorpos produzidos em animais de laboratório podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar microrganismos. desta forma.Essa diferença na coloração está relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactérias. incluindo oculares de alta potência a ampliação máxima do microscópio luminoso pode chegar a aproximadamente 2000x. de campo escuro. Por exemplo. o pH. plantas ou .

Alguns vírus animais como o vírus da hepatite B podem ser cultivados somente em animais vivos.micróbios). com a finalidade de reproduzir a doença. Características genéticas Através dos avanços na biologia molecular surgiram técnicas que permitem realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade. São utilizados em estudo sobre a resposta imune do hospedeiro frente a uma infecção viral ou para determinar se um vírus é capaz de causar uma infecção. é necessário fornecer células hospedeiras vivas. CONSERVAÇÃO DE CULTURAS PURAS Após a obtenção de uma cultura pura deverá ser adotado um método de conservação destas culturas vivas por um período de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado. . Vírus animais: Cultivo em animais vivos: seu uso é limitado. por exemplo. Vírus bacterianos – bacteriófagos – são facilmente isolados e cultivados em cultura de bactérias jovens em crescimento ativo em caldo ou meio solidificado em placa. Esta técnica permite a obtenção de uma coleção de microrganismos como referência. Para o isolamento dos microrganismos em laboratório deve ser observada a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada célula microbiana em particular: CULTIVO DE VÍRUS Para isolar vírus em laboratório. Cultivo em ovos embrionados (de galinha ou pato): Ovos embrionados (embriões de 6-12 dias) podem ser inoculados assepticamente com vírus. desidratadas e fechadas à vácuo. devido ao alto custo.as amostras são congeladas. através de métodos mais sensíveis e precisos. coelhos e cobaias. poderá determinar se este é ou não um patógeno. o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. já que são parasitas intracelulares estritos. Em laboratório são utilizados normalmente camundongos. Conservação por um curto período (dias a meses): Armazenagem à temperatura de refrigeradores (4°C a 10°C) Repiques freqüentes Conservação por longos períodos: Nitrogênio líquido a -196°C Freezers a -70°C/ -120°C Liofilização – congelamento a seco .

J. In: Microbiologia e Imunologia. os corpúsculos de Guarnieri são característicos em células infectadas com o vírus da varíola.M. QUESTIONÁRIO 1. 75-99 . 474-504. 1994.1. 3.Identificação de vírus depende do ECP (efeito citopático): os vírus invadem ascélulas. Cite os passos para o isolamento de um microrganismo anaeróbio. dependendo do tipo de vírus. p. ed.R. São Paulo: Mc Graw Hill do Brasil. 2. São Paulo: Melhoramentos.S. M. St. p.R. Quais as técnicas para conservação de culturas? 5. In: Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology... Descreva as principais características dos microrganismos usadas na identificação das espécies. BIBLIOGRAFIA Baron.utilizando-se uma agulha e seringa. que é uma estrutura intracelular anormal. Métodos gerais de estudo das bactérias.477-499. vol. dependendo do vírus e do tipo de células na cultura. In: Microbiologia: Conceitos e Aplicações. L. S. Vírus de Plantas Podem ser cultivados pela inoculação de uma suspensão viral em plantas por meio de uma agulha hipodérmica ou de escarificações provocadas nas folhas da planta. O ECP pode ter diferentes aspectos. Finegold. esta pode serutilizada como um hospedeiro in vitro para um determinado vírus. ed. geralmente causando algum tipo de alteração visível. 1996. Chan. E. Caracterização dos Microrganismos. Diferentes tecidos do embriãosão inoculados. E. Louis: Mosby. Sua presença pode ajudar a identificar o vírus que esteja causando uma infecção. Defina o termo “cultura pura”. 4.. 1984. 25. 23. A abertura é selada com parafina e os ovos são incubados a 36°C por 2 a 3 dias para permitir a multiplicação dos vírus. Cultura em tecidos: uma vez obtida uma cultura de células. 2. & Krieg. Pelczar.3. por meio de um orifício aberto na casca. 4. Podem ser utilizadas células de cultura primária ou células de linhagem contínua. Cap. p.J. 9. Cap.ed. Um tipo de ECP é o corpúsculo de inclusão. Methods for identification of etiological agents of infectious disease. por exemplo. N. Explique a finalidade dos principais meios de cultura. Peterson. Bier. O. Cap.C.

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