FIZIOLOGIA BACTERIILOR. METABOLISMUL MICROBIAN.

NUTRIŢIA ŞI RESPIRAŢIA BACTERIILOR

Fiziologia bacteriană studiază viaţa şi activităţile bacteriilor – nutriţia, respiraţia, creşterea şi multiplicarea,
condiţiile de cultivare a bacteriilor.
 Metabolismul bacterian reprezintă ansamblul de reacţii biochimice care au loc în celula vie.
- Catabolism – reacţii chimice de descompunere a substanţelor complexe în elemente simple, însoţită de
degajarea energiei (metabolism energetic)
- Anabolism – reacţii chimice de sinteză a substanţelor complexe din elemente simple, necesită energie
(metabolism constructiv, de sinteză)

Particularităţile metabolismului bacterian:

 Este un metabolism necompartimentat , toate procesele metabolice se desfăşoară intr-o singură celulă
 Este foarte flexibil, realizându-se prin diverse căi metabolice (bacteriile se adaptează rapid la condiţiile
mediului)
 Este foarte intens (viteza reacţiilor este mare)
 Produsele intermediare din procesele catabolice pot fi utilizate direct în calitate de precursori pentru
reacţiile anabolice (amfibolism)
În toate reacţiile metabolice intervin catalizatori proteici specifici - enzimele

Enzimele bacteriene. Caractere generale:

- Substanţe proteice
- Active în limite largi de temperaturi (0-65°C) şi de pH (2-9)
- Specificitate de substrat şi de acţiune (reacţionează cu un substrat catalizând un tip de reacţie)
- Specificitatea este determinată de centrul activ al enzimei, complementar cu receptorul de pe substrat
- Nu se modifică în cursul reacţiei

Clasificarea enzimelor
 Constitutive (permanente)
 Inductive (adaptive), se sintetizează în prezenţa substratului (ex.: lactaza)
 Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în exces a produsului reacţiei catalizate
 După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)
 După tipul reacţiei catalizate (oxido-reductaze, hidrolaze, transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
 După impactul asupra ma/o
- Enzime metabolice
- Enzime de patogenitate, responsabile de modificări patologice ale ţesuturilor, celulelor ma/o :
hialuronidaza, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, lecitinaza, proteaze, etc.

Importanţa practică a studierii enzimelor

 Rol în identificarea şi clasificarea bacteriilor (enzimele determină activitatea biochimică specifică a
bacteriilor)
 Unele substanţe chimice, antibiotice interferează cu activitatea unor enzime, inhibând creşterea
bacteriilor (tratament)
 Determinarea mecanismelor patogenezei infecţiilor (unele enzime sunt responsabile de producerea
leziunilor în ţesutul gazdei)
 Aplicarea industrială a enzimelor

NUTRIŢIA BACTERIANĂ

1
 Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile asimilează din mediu substanţele necesare pentru
metabolism.
 Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv.
 Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot traversa MCP pentru a fi antrenate în metabolismul celulei.
Se obţin din alimente prin solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o digestie prealabilă (proteine,
polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelulară (la bacteriile G- în spaţiul periplasmic)
Nutrienţii servesc în calitate de material de construcţie şi sursă de energie pentru sinteza compuşilor şi
menţinerea vieţii bacteriei.

Transportul transmembranar
1. Difuzie simplă (conform gradientului de concentraţie, fără utilizarea energiei): O2, CO2, acizi graşi,
nutrienţi liposolubili
2. Difuzie facilitată (conform gradientului de concentraţie) – permite transportul transmembranar al
moleculelor mari prin intermediul proteinelor de transport specifice - permeaze.
3. Transport activ (contra gradientului de concentraţie, necesită energie). Participă permeazele şi alte
proteine de transport specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.
4. Translocaţie – substratul este modificat (ex.: fosforilat) în timpul transportului membranar; necesită
energie

 Substanţele care au pătruns în citoplasmă sunt descompuse de către enzimele bacteriene conform
căilor metabolice proprii fiecărei specii bacteriene (ex.: Embden-Meyerhof, Entner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obţine energie şi precursori care vor fi antrenaţi în biosinteză
(anabolism).
 Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de transport, liza bacteriei

Necesităţile nutritive ale bacteriilor

- Necesităţi elementare, de bază: C, H, O, N în cantităţi importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K în cantităţi
mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo.
Bacteriile prototrofe sunt capabile a-şi realiza integral sinteza metaboliţilor esenţiali.
- Necesităţi specifice. Bacteriile auxotrofe solicită suplimentar compuşi organici preformaţi (factori de
creştere), care nu pot fi sintetizaţi de bacterie (ex.: AA, baze purinice, pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în
mediul de cultură este indispensabilă creşterii acestor bacterii.

Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon

 Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică sursă de carbon (nepatogene)
 Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli, etc)
- Bacteriile care utilizează materia organică moartă sunt saprofite (reciclarea materiei organice)
- Bacteriile parazite (obligate, facultative) trăiesc pe contul organismelor vii, aducându-le prejudicii
- Bacteriile patogene reprezintă parazite care afectează grav gazda, provocând maladie sau moarte.

 Surse de azot
- AA sau acizi nucleici
- Săruri de amoniu, nitriţi, azot atmosferic
 Surse de substanţe minerale:
- S - din AA, sulfuri, sulfaţi;
- P - din fosfaţi;
- K, Mg, Ca, Na - din săruri minerale;
- Zn, Cu, Mn, Mo – din apă

2
Clasificarea bacteriilor după sursa de energie
 Bacterii fototrofe – utilizează energia solară (fotosint)
 Bacterii chemotrofe – folosesc energia degajată din reacţiile chimice de oxido-reducere. Ele necesită
un substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi un substrat acceptor de hidrogen. În transfer participă transportori
intermediari de electroni (lanţul respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
- Bacteriile chemolitotrofe – donorul de H este o substanţă anorganică
- Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o substanţă organică (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Mecanismele de obţinere a energiei la chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul final de H :

 Respiraţie aerobă. Acceptorul final este oxigenul gazos. Implică lanţul respirator de transport al
electronilor asociat MCP. Produs final – H2O sau H2O2 .
 Respiraţie anaerobă. Acceptori finali – compuşi anorganici (nitrat, sulfat, S). Transportul de electroni
prin lanţul respirator. Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura (în prezenţa O – H2O2).
 Fermentaţie. Substratul organic este metabolizat fără intervenţia unui agent oxidant extern. Constă în
procese de ox-red care realizează numai o oxidare parţială a substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind
substanţe organice. Astfel se ajunge de la un substrat mai redus la o moleculă mai oxidată (ex.: fermentare
lactică, fermentare alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc). Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa O2, dar
fără intervenţia acestuia.

Conservarea energiei
 O parte din energia eliberată se pierde sub formă de căldură sau poate fi utilizată direct sub formă de
energie electro-chimică (fpm) la nivelul MCP (ex.: rotaţia flagelilor, transport transmembranar) sau stocată în
compuşi chimici macroergici “bogaţi în energie”: ATP (sintetizat prin fosforilare oxidativă sau fosforilare la
substrat), fosfoenol-piruvat, acetilfosfat şi acetil-CoA.
 În procesele de respiraţie se elimină mai multă energie decât din fermentaţie (în glicoliză dintr-un mol
de glucoză - 38 moli ATP, prin fermentaţie - 2 moli ATP). În procese de fermentare se formează deşeuri
rejetate de către celulă.

Clasificarea bacteriilor după sursele de energie şi carbon

 Bacterii fotoautotrofe (energie solară, CO2)
 Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., subst.org)
 Bacterii chemoautotrofe
 Bacterii chemoheterotrofe (chemolitoheterotrofe, chemoorganoheterotrofe)

CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

 Creşterea – mărirea coordonată a masei şi volumului structurilor bacteriene ca rezultat al proceselor
de sinteză
 Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe o unitate de suprafaţă sau de volum
- Diviziune binară
- Inmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular – procesele care au loc de la formarea celulei pâna la următoarea diviziune
 Faza C – replicarea ADN
 Faza G – de latenţă, segregarea cromozomilor
 Faza D – de diviziune, formarea septului

3
Replicarea ADN depinde de masa critică a celulei, iar separarea cromozomilor şi diviziunea intervin in
momentul când celula atinge o lungime - limită

 Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul (perioada) de generaţie (TG).

 Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de creştere (condiţii optime – viteză maximă)

Creşterea bacteriilor in laborator – cultivare. Se cultivă bacteriile pentru izolarea lor din medii naturale
(prelevate patologice, alimente, apă, etc).
Izolarea bacteriilor se realizează pentru:
 Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
 Testarea sensibilităţii lor faţă de antibiotice
 Obţinerea unor produşi de biosinteză (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni steroizi), fermentare
(alcooli, acizi organici, etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Pentru creştere bacteriile au nevoie de nutrienţi şi condiţii fizico-chimice adecvate.

Condiţiile (principiile) de cultivare

- Sursă nutritivă adecvată
- Sursă de energie
- Apă
- Temperatura potrivită
- pH adecvat
- Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2
- Presiune osmotică adecvată

Temperatura de creştere
Există temperaturi minime, maxime şi optime de dezvoltare a bacteriilor. In raport cu temperatura optimă
deosebim:
 Bacterii psichrofile – tє optimă 10-20 grade C. Cresc şi la 0 gr C.
 Bacterii mezofile – optimum 30-37 grade C (limite 15-45 grє C)
 Bacterii termofile – optimum 50-60 grade C (până la 95 grC)
 Bacterii hipertermofile (cresc la 70–110 gr C)

pH
 Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele patogene) – pH 6-7,5
 Bacterii acidofile – pH 2-6 (Lactobacillus)
 Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas, Vibrio)

Presiunea osmotică
 Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc оn concentraţii reduse de NaCl (mediu izotonic cu
mediul intern al gazdei) – mi/o patogene
 Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de NaCl (1-30%) – stafilococi, vibrioni (Vibrio
parahaemolyticus)

Oxigenul
 Bacterii strict aerobe – cresc doar оn prezenţa O2. Obţin energia prin respiraţie aerobă
 Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse de O2 şi 2-10% CO2. Obţin energia prin
respiraţie sau fermentaţie (Neisseria, Brucella, Campylobacter)

4
 Bacterii strict anaerobe – cresc doar in absenţa O2. Obţin energia prin fermentaţie sau uneori respiraţie
anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2, a radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care anaerobii nu le
pot descompune (absenţa catalazei, superoxid dismutazei, peroxidazei) – Clostridium, Bacteroides
 Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte оn prezenţa O2, obţin energia prin fermentaţie, posedă
peroxidază (Lactobacillus, streptococi)
 Bacterii facultativ anaerobe – cresc in orice condiţii, obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie

Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare
cultivării bacteriilor. Ele pot fi utilizate pentru cultivarea (izolarea) bacteriilor, testarea sensibilităţii la
antibiotice, stocarea sau transportul culturilor bacteriene.

Cerinţele faţă de mediile de cultură

- Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale bacteriilor
- Umiditate optimală
- pH optimal (7,2-7,4) şi constant (caracter de tampon)
- Potenţial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi – rH2>10)
- Să fie izotonice (0,5% NaCl)
- Să fie sterile şi transparente

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

După provenienţă
 Empirice, naturale. Au la bază produse de origine animală sau vegetală (sânge, ser, lapte, ouă, cartof,
extracte din carne, cord, creier, ficat, peşte, levuri, etc). Compoziţia lor chimică precisă nu poate fi controlată
 Sintetice – includ ingrediente chimice pure, compoziţia chimică este cunoscută cu exactitate
 Semisintetice

După consistenţă
 Medii lichide (bulion)– utilizate pentru obţinerea biomasei bacteriene şi a produselor lor (antibiotice,
enzime, toxine)
 Medii solide – conţin 10-15% gelatină sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roşii, t° topire
80-100°C, solidificare 42°C). Placa de geloză оn cutii Petri este utilizată pentru izolarea culturilor pure,
geloza оnclinată (оn pantă) – pentru acumularea culturilor pure
 Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-agar. Se utilizează pentru studierea activităţii biochimice sau a
mobilităţii bacteriilor.

După compoziţia chimică (complexitate) şi destinaţie

A. Medii uzuale (universale, simple)

 Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5% NaCl)
 Bulion peptonat – BP (extract apos din carne + 1% peptonă+0,5% NaCl)
 Geloza nutritivă (BP + 2-3% agar-agar)
 Gelatina nutritivă (BP + 10-15% gelatină)
Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor nepretenţioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120°C, 20 min

B. Medii complexe
I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos de componente care permit creşterea mi/o exigente
nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat, geloză-sânge – streptococi, neisserii; ser coagulat – corinebacterii, etc)

5
II. Medii selective – medii solide cu adaos de componente sau cu condiţii fizico-chimice particulare care
stimulează creşterea unor specii şi inhibă creşterea altor specii (geloza salină - stafilococi, geloza alcalină -
vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

Mediile de imbogăţire reprezintă medii selective lichide, utilizate pentru imbogăţirea florei patogene şi
inhibarea florei de asociaţie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). Etapă premergătoare
insămânţării pe medii selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de briliant) – Salmonella
- Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella
- Apă peptonată alcalină (pH=8) –Vibrio cholerae
- Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat) – pentru anaerobi

III. Medii diferenţial-diagnostice (DD) – permit diferenţierea speciilor bacteriene in baza activităţii lor
biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere…)
Sunt construite după următoarea schemă:
Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietăţilor zaharolitice
Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na)
Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roşii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)

Studierea proprietăţilor de oxido-reducere

Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella (colonii negre – reducerea sulfitului оn sulfura de Bi)

Mediul Klauberg (geloză-sânge cu telurit de K) –pentru Corynebacterium diphtheriae (colonii negre)

Studierea proprietăţilor lipolitice

Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu lecitinază formează un halou opac оn jurul coloniei

Studierea proprietăţilor hemolitice

Geloza-sânge (geloza+5-15% sânge defibrinat)
In cazul hemolizei оn jurul coloniilor apare o zonă clară

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară

Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
Kligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
Indicatorul Andrede – fucsină+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu in
galben.
In pantă se apreciază lactoza/zaharoza (oxidare), in coloană-glucoza (fermentare).
Producerea H2S – innegrirea mediului

Medii DD pentru identificarea finală a culturii pure

- Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-solid)– un şir de tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite glucide şi
indicator.
Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG)
6
- Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi indicatori

IV. Medii speciale – pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Loewenstein-Jensen –pentru
agenţii tuberculozei, Sabouraud – fungi)

V. Medii de transport – destinate transportării sau stocării unui material (prelevat), care va fi examinat
ulterior.
Menţine in viaţă bacteriile, fără a favoriza multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerină 30%
- Soluţie tampon-fosfat
- Soluţie NaCl 3%
- Mediul Cary-Blair
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi, neisserii, etc

 Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică de material ce conţine bacterii (inoculum) se introduce
intr-un mediu de cultură (insămânţare, inoculare), care ulterior va fi incubat in termostat (pentru asigurarea
temperaturii optime).
 In timpul incubării (18-24-48 ore…..) bacteriile cresc şi se divid, formând o cultură bacteriană
(totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis – 3-5 săptămâni
V.cholerae – 6-12 ore

 Cultură pură – formată din bacterii de aceeaşi specie (indispensabilă identificării)

 Cultură mixtă – compusă din bacterii de specii diferite
 Tulpină – populaţie microbiană constituită din descendenţii unei singure izolări оn cultură pură, care
va fi studiată ulterior.
 Clonă – populaţie care rezultă din multiplicarea unei singure celule

Manifestarea creşterii şi multiplicării bacteriilor

 In mediu lichid
- Turbiditate uniformă
- Formarea unei pelicule la suprafaţa mediului (vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe pereţi (streptococi, Bacillus anthracis)

 In mediu solid – formarea coloniilor

Colonie – o aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau un grup de celule (UFC -
unitate formatoare de colonii) pe suprafaţa unui mediu solid
 Fiecare specie bacteriană formează colonii specifice (caracter util in identificare)

Caracteristica coloniilor
Dimensiuni – colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat, etc
Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată, etc
Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă, neregulată
Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc
Densitate – opacă, transparentă, etc
Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată, mucoidă

 Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede, lucioase
7
Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa uscată, rugoasă
Caracterele de cultură ale bacteriilor reprezintă exigenţele nutritive (medii, temperatură, pH, aerare, etc),
timpul apariţiei culturii şi manifestarea creşterii pe medii lichide şi solide

Dinamica multiplicării bacteriilor in culturi

In funcţie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:

- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone

Culturile discontinue se obţin la cultivarea bacteriilor оn volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt
obţinute şi utilizate оn laboratorul microbiologic

Fazele dezvoltării unei culturi discontinue

I. Faza de lag – faza de adaptare la condiţiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc in dimensiuni,
dar nu se divid. Durata este variabilă (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiţiile mediului, etc
II. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu viteză maximală constantă, curba evoluează exponenţial.
Bacteriile sunt foarte sensibile la agenţi antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilităţii la
antibiotice). Durata – 8-10 ore
III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică scade treptat, numărul celulelor vii rămâne constant mai
multe ore. Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea metaboliţilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipică
speciei, apar incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenţii antimicrobieni scade.
Durata – 10-12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor progresiv

Cultura continuă – se realizează când mediul de cultură este continuu reоnnoit şi imbogăţit cu oxigen cu
evacuarea unei cantităţi de cultură. Se realizează in chemostate sau turbidostate, cultura aflându-se permanent
in faza exponenţială. Se utilizează in microbiologia industrială.
In intestin – culturi continue.
Culturi sincrone – culturi in care bacteriile se divid in acelaşi timp

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Examenul bacteriologic constă in inocularea (insămânţarea) prelevatelor pe medii de cultură pentru izolarea
culturilor pure de bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior identificate, testate la sensibilitate vis-a-vis de
antibiotice, eventual conservate.
Examenul bacteriologic constă din câteva etape succesive, de la prelevarea (recoltarea) probelor biologice
până la remiterea rezultatelor.

Faza pre-analitică (responsabilitatea medicului)

1.Prescrierea investigaţiei (in funcţie de datele examenului clinic şi paraclinic). In ordonanţă se fixează
identitatea medicului, a pacientului, scopul analizei, manifestările patologice, locul, data apariţiei, alte date:
imunosupresie, tratament cu antibiotice, graviditate, etc.
2.Prelevarea probelor
- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, locul multiplicării sau/şi din căile de eliminare ale
agentului patogen) şi momentul prelevării

8
Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi:
- Secreţii rino-faringiene, bronşice
- Spută
- Puroi
- Exsudate, transsudate
- Sânge
- LCR
- Urină, secreţii genitale
- Mase fecale, bilă, suc duodenal
- Bioptate, punctate
- Material cadaveric, etc

Materiale de examinat din mediul extern:

- Apă
- Alimente
- Sol
- Aer
- Lavaje
- Vectori, etc

-Modul de prelevare (recoltare)

- In recipiente sterile
- Respectând regulile de autoprotecţie
- La debutul bolii
- Până la administrarea antibioticelor
- Cantitate suficientă
Transportarea
- Imediată sau utilizând medii de transport, cu respectarea condiţiilor speciale după necesitate
- In ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- In fişa de insoţire să fie indicată identitatea pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data, ora
prelevării, scopul investigaţiei, ş.a.)

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURILE AEROBE

- Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) - orientare in
diagnostic
- După necesitate, probele sunt supuse pregătirii pentru investigaţie (diluare, omogenizare, centrifugare,
etc)
- Examinarea microscopică (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) – prezenţa mi/o,
forma, cantitatea, G+/-.

I etapă – IZOLAREA CULTURILOR PURE

Scopul izolării - de a obţine o cultură pură dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un produs patologic.
O colonie separată constituie o cultură pură.
Tehnici utilizate:
 Prin epuizarea inoculului pe suprafaţa gelozei din cutia Petri (insămânţare in striuri paralele,
insămânţare in cadrane, etalarea consecutivă pe trei cutii).
 Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului in geloză topită şi răcită la 50 gradeC (10-1, 10-2,...), apoi
turnate in cutii Petri sau eprubete.
Incubare in termostat la 37 grade C, 18-24 h (in funcţie de TG).

9
Metode speciale de izolare in culturi pure:
- A bacteriilor sporulate: incălzirea prealabilă a prelevatului 80 grade C – 20 min
- A bacteriilor acido-rezistente: tratarea prealabilă cu acid a prelevatului şi neutralizarea ulterioară cu o
bază
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: imbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând
medii de imbogăţire
- A bacteriilor cu virulenţă inaltă şi pretenţioase la cultivare: inocularea la animalele de laborator
sensibile

II etapă – ACUMULAREA CULTURII PURE

- Examinarea macroscopică a coloniilor crescute (formă, culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte, confirmarea purităţii culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloză in pantă (inclinată) pentru acumularea culturii pure
- Termostat, 37 grade C, 18-24 ore

III etapă – IDENTIFICAREA CULTURII PURE

- Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)

- Identificarea culturii pure constă оn evidenţierea unor caractere specifice ale acestei culturi pentru a o
include intr-o familie, gen, specie, variantă
Se studiază caracterele:
- Morfologice
- Tinctoriale
- De cultură
- Biochimice
- Antigenice (seroidentificarea)
- De patogenitate
- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice

STUDIEREA ACTIVITĂŢII BIOCHIMICE A BACTERIILOR

Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea laptelui, etc)
Activitatea proteolitică
- Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea laptelui, etc)
- Evidenţierea enzimelor ce intervin in degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, desulfhidraze, etc)
cu detectarea produsele finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, etc…
Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fier de culoare neagră in mediile multitest – Kligler,
Olkeniţki, etc; plasarea unei benzi de hârtie de filtru imbibată cu acetat de Pb deasupra BP in care creşte
cultura studiată (formarea sulfurii de Pb innegreşte hârtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei triptofanului) – benzi de hârtie imbibate cu acid oxalic. In prezenţa
indolului indicatorul virează in roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de turnesol se colorează in albastru.

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)

(cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată – apariţia bulelor de gaz)
Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei din lanţul respirator)
Reactiv – di (tetra)metil-parafenilen-diamină (benzi sau rondele de hârtie оmbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului – culoare violetă-neagră
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
10
Oxidazo- : Enterobacteriaceae

Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% - formarea unui halou opac in jurul coloniilor

Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– halou opac in jurul coloniilor (precipitarea acizilor graşi)
Depistarea hemolizinei – geloză-sânge 5-10% - zonă clară in jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 grade C, 18-24 h

Identificarea rapidă
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde (economie de timp, spaţiu, material)
Sistemul API – o galerie din plastic formată din numeroase alveole care conţin fiecare un mediu deshidratat
diferit (glucide, AA, etc). Alveolele sunt inoculate cu o suspensie bacteriană testată şi incubate. Ulterior la
necesitate se adaugă reactive pentru detectarea metaboliţilor particulari.
Lectura – conform unui cod de cifre sau computerizat

IV etapă – EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

- Compararea rezultatelor obţinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a găsi asemănări.
- Exemplu de răspuns: Din proba examinată a fost izolată tulpina de Corynebacterium diphtheriae,
biovar gravis, tox+, sensibilă la ...., rezistentă la .....

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)

Condiţia principală – cultivare in absenţa oxigenului

1.Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat – 100 grade C, 20 min, răcit, acoperit cu vazelină;
insămânţarea in geloză in coloană)
2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică – utilizarea anaerostatului
- Metoda chimică – in exicator se introduc substanţe ce fixează oxigenul (pirogalol+bază); utilizarea
gas-pachetelor
- Metoda biologică Fortner – cultivarea concomitentă a aerobilor şi anaerobilor

Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul cu aerul (in seringi, utilizând medii speciale)

I etapă – IMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR

- Insămânţarea prelevatului in 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat
- Incălzirea unui tub la 80 grade C, 20 min – distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37 grade C, 24-48 h (va avea loc inmulţirea anaerobilor)

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

- Studierea caracterelor de cultură – tulburarea mediului, descompunerea bucăţilor de ficat, etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (insămânţarea a 0,1 ml din mediul K-T pe 3
cutii cu geloză-sânge glucozată consecutiv). Incubarea in anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h
- Metoda Weinberg – diluţii succesive ale culturii in geloză glucozată lichefiată şi aspirarea in tuburi
lungi şi inguste, inchise ermetic. Incubarea in termostat, 24 h

III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE

- Studierea macroscopică a coloniilor
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a coloniilor suspecte
11
- Repicarea in mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure
- Incubarea in termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI

- Verificarea purităţii culturii pure (frotiu Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiţiilor de anaerobioză)

V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA ŞI ELIBERAREA RĂSPUNSULUI

12