Laboratorio N°6 – Enzimas inmovilizadas

Objetivos:
• Preparación y operación de un sistema de biocatálisis con enzima inmovilizada.
• Determinación de la cinética de reacción.

Introducción
ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una

región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad
catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha
ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte.

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la
aplicación de la enzima inmovilizada. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el
empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo.
Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con
mayor pureza.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son:

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.

2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas
fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN FÍSICA

1. Atrapamiento.

2. Inclusión en Membranas:

• Microencapsulacion.
• Reactores de membrana

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN QUÍMICA

1. Union a Soportes:

• Soportes inorgánicos.
• Soportes organicos:

_ Polimeros Naturales
_Polimeros Sinteticos

1. Uniones Covalente.

2. Adsorcion.

Fuente: http://www.ugr.es/~ars/abstract/arroyo.pdf
Procedimiento:

Este laboratorio consistió en dos experiencias, en una se realizo la curva de

calibración de las muestras, y en la otra se realizo el ensayo propio para la enzima.

Para la experiencia de calibración, se obtuvo, a partir de una solución madre de

glucosa de concentración 4 mg/ml, varias muestras de 1 ml con diferentes
concentraciones (0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5)

Estas concentraciones fueron tomadas para poder entrar en el rango lineal de la curva
de absorbancia. Para los cálculos de concentración se utilizo la formula:

C1×V1 = C2×V2

V1 = C2×V2 /C1

Los resultados obtenidos fueron:

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Sol. 0 25 50 75 100 125

Madre

H2O 1000 975 950 925 900 875

De estas soluciones se extrajeron 50μl de cada concentración, realizándolo por

duplicado, y se colocaron en un tubo de hemolisis a los cuales se le agrego 1ml de
reactivo de trabajo. Dichos tubos fueron calentados en baño maría a 37°C durante 10
minutos. Pasado el tiempo, se tomo la absorbancia de cada muestra con el
espectrofotómetro con una longitud de onda de 505nm y se obtuvieron los siguientes
datos:

Curva de Calibración
t M1 M2 Promedio
0 0,0080 0,0100 0,0090
0,1 0,1500 0,1510 0,1505
0,2 0,3050 0,3040 0,3045
0,3 0,4500 0,4590 0,4545
0,4 0,5790 0,5740 0,5765
0,5 0,7480 0,7610 0,7545

Para la experiencia de la reacción con la enzima Glucosa Isomerasa inmovilizada se

procedió de la siguiente manera:

Se pesaron 0.5g de Glucosa y 5 g de Enzima. Se coloco la glucosa en un matraz de

50ml con una buffer fosfato 0.1M pH=7.5, alcanzando una concentración de 10g/L de
Glucosa. Para la muestra en el tiempo 0 se tomo del matraz una muestra de 50 micro
litros y se la coloco en un tubo de hemolisis. Posterior a esto se coloco la buffer con
Glucosa en un erlenmeyer, el cual contenía la enzima inmovilizada, se largo el tiempo
y se coloco el mismo en un baño maría a T=55ºC con agitación. Luego se tomaron las
muestras a 5, 10, 20, 30, 45, 60 minutos, colocando 50 micro litros por cada una en tubos de hemolisis ,y
realizándoles una dilución 1:20. De dichas muestras se extrajeron 50microlitros y se les coloco 1 ml de
Reactivo de trabajo, realizando este procedimiento por duplicado. Luego de esto se llevaron dichos tubos a
un baño maría de T=37ºC durante 10 minutos.

Pasado el tiempo se midió la absorbancia de cada tubo obteniendo los siguientes resultados, con los cuales
se le calculo la concentración de cada tubo y el promedio a cada tiempo.

Concentraciones = 1,473*Mi
Absorbancia
+ 0,0067
valor valor
Tiempo M1 M2 M1 M2
medio medio
0 0,6360 0,4400 0,5380 0,9435 0,6548 0,7992
5 0,5360 0,5180 0,5270 0,7962 0,7697 0,7830
10 0,5690 0,5740 0,5715 0,8448 0,8522 0,8485
20 0,4650 0,4610 0,4630 0,6916 0,6858 0,6887
30 0,4600 0,4550 0,4575 0,6843 0,6769 0,6806
45 0,4040 0,4290 0,4165 0,6018 0,6386 0,6202
60 0,3740 0,3690 0,3715 0,5576 0,5502 0,5539

Podemos observar que el valor obtenido en el tiempo 10 min, no presenta una correlación con los demás
resultados por lo que para obtener una curva más acorde podría eliminarse le mismo. En este caso dejaremos
el valor para examinar los otros resultados.

% de
valor
Tiem M1 M2 glucosa
medio
po (mg/ml) (mg/ml) sin
(mg/ml)
convertir
0 0,9435 0,6548 0,7992 100,0000
5 0,7962 0,7697 0,7830 97,9725
10 0,8448 0,8522 0,8485 106,1746
20 0,6916 0,6858 0,6887 86,1764
30 0,6843 0,6769 0,6806 85,1626
45 0,6018 0,6386 0,6202 77,6057
60 0,5576 0,5502 0,5539 69,3115

4-Del grafico de Concentraciones podemos ver que la concentración varió como se

esperaba, es decir disminuyendo a medida que aumenta el tiempo. Esto se debe al
efecto de la enzima sobre la solución, la cual isomerizó la glucosa en fructuosa. A
pesar de los resultados obtenidos en los cuales se muestran datos incoherentes,
podemos ver una tendencia lineal de la curva por lo que la actividad de la enzima se
podría decir que fue buena.