CAPITULO 17.

CROMATINA

17.1 Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras.

17.2 El nucleosoma

17.3 Estructuras de orden superior

17.4 Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la cromatina.

Bibliografía

Blackburn & Gait

Telsenfeld & McGhee. Cell, 44 (1986) 375.
Daban & Cantor. J.Mol.Biol., 156 (1982) 771.
Kornberg & Klug. Scientific American, 244, (1981), 52
Lewin, Genes. Willey, NY 1983.
Richmond and cowokers Nature, 289, 251 (1997).

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17.1 Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras.

El DNA interacciona con numerosas proteínas, como veremos en el capítulo 17.

Estas proteínas son de muy diverso tipo: enzimas involucrados en transcripción,
replicación, preserores, reguladores,..... Una de estas proteínas son las histonas, que
juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA en la célula.

El problema del empaquetamiento no es trivial, ya que aún un organismo simple

como E-Coli tiene alrededor de 3 106 pares de bases de DNA. Ello implica en DNA
doble hélice aproximadamente 1 mm! Es decir, mucho más que la longitud total de la
célula. La situación es aún más dramática en una célula eucariota (véase Fig. 1 y 2). Es
por lo tanto imprescindible que el DNA se compacte para ocupar menos espacio. El
nivel de compactación más inmediato es el de cromatina.

Figura 1. Cromosoma eucariota explotado por choque osmótico. Obsérvese la

cantidad de fibra de DNA que contenía.

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Figura 2. Esquema de compactación del DNA eucariota.

En células procariotas y en virus se pueden producir sistemas de

empaquetamiento primitivos. Por ejemplo el empaquetamiento hexagonal, donde las
fibras de DNA se agruparían como si fuesen un manojo de lápices. Este tipo de
empaquetamiento queda estabilizado por la interacción de proteínas muy básicas no
histonas: las protaminas.

Otra posibilidad de compactación la encontramos en las cabezas de los fagos.

Parece que en este caso el DNA esta enrollado como una manguera, sacando partido de
la capacidad del DNA para curvarse. El DNA enrollado forma una estructura de unos
170 Å de radio lo que da una estructura muy compacta que queda estabilizada por
medio de iones divalentes y de valencia superior. Este tipo de empaquetamiento
“curvado” coincide con datos experimentales y teóricos que demuestran la tendencia del
DNA a curvarse espontáneamente en presencia de muchos cationes de elevada valencia.

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 Desde los años setenta se sabe que el DNA eucariota se encontraba en la
cromatina compacto formando unas estructuras que involucraban proteínas y que tenían
un tamaño aproximado de 200 pares de bases (el número exacto varia entre
organismos). Estudios posteriores han demostrado que lo que existe es un octámero de
proteínas muy básicas: las histonas, entorno al cual se enrollo 1 3/4 vueltas de DNA
doble hebra. También se ha demostrado que existe otra histona: la H1 que ayuda al
empaquetamiento, pero que no está en el octámero.

Esta información se derivó a partir de datos de digestión con nucleasa

micrococal de cromatina. Al hacerlo con DNA marcado en uno de los extremos se
observó que se obtenían fragmentos de excisión cada 200 pares de bases (i.e.
fragmentos de 200, 400, 600,…). Es decir, que existína (cada 200 pb) unas estructuras
repetitivas que daban protección al DNA frente a nucleasa microcal. La longitud de
estas estructuras era de 200 pb.

Sabemos ahora que estas estructuras están formadas por el DNA sobreenrollado
sobre un core proteico formado por las histonas (Figura 3) con otra histona (la H1)
dispuesta de modo exterior al core proteico (véase más abajo).

Figura 3. Esquema de un DNA enrollado 1 ¾ vueltas sobre el core proteico del

nucleosoma. Nótese que es una doble hélice levógira.

Las histonas son proteínas muy básicas (lógico porque tienen que interaccionar
con el DNA), lo que viene dado por su alto contenido de Arg y Lys. Se habla de 5 tipos

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de histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4 (Figura 4). Estas se clasifican por su contenido
en: ricas en Arg (H3 y H4), moderadamente ricas en Lys (H2A, H2B) y muy ricas en
Lys (H1 y H5 (una variante de H1 que se da en las aves)). Es interesante notar que las
histonas son de las proteínas más conservadas por la evolución. De hecho la única
variabilidad notable se da en la histona H1 (H5), que es la histona más externa al
octámero. Esto da una idea de la importancia de la nucleación de la cromatina en
nucleosomas para la vida de la célula.

La unión de las histonas al DNA da lugar a las estructuras comentadas más

arriba, estructuras que tienen igual masa de DNA que de proteína. Digestión con
nucleasas o proteasas permiten eliminar o la parte de ácido nucleico o la de proteína de
las estructuras nucleosómicas.

Figura 4. Contenido relativo de residuos básicos de las 4 histonas.

17.2 El nucleosoma

Pasaremos ahora a analizar las estructuras repetitivas del DNA en la cromatina: los
nucleosomas. Como se comentó más arriba fueron los datos de digestión por nucleasa
micrococal los que permitieron detectar la existencia de los nucleosomas. Fueron
también importantes estudios posteriores en los que al incubar en condiciones de
degradación más agresivas se encontraron subpartículas más pequeñas. Así, del

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fragmento de 200 pb se puede obtener por digestión la excisión de un fragmento de 34
pb y una estructura que contiene todas las histonas más DNA enrollado sobre el core
central. Esta estructura de 166 pb (más histonas) se llama cromatosoma. Si se fuerzan
las condiciones de degradación se escinde otro fragmento de 20 pb más la histona H1 y
se obtiene la partícula núcleo que contiene el core proteico y unas 136 pb.

Así se demostró que la histona H1 esta fuera del core proteico (Figura 5), que se
encuentra formado por H2A, H2B, H3 y H4. Los contactos entre las histonas (esto es:
su disposición dentro del nucleosoma) se detectó por técnicas de crosslinkers, es decir
por grupos bifuncionales que unen proteínas de modo covalente. Posteriormente el
grupo A.Klug y col. obtuvieron una estructura de baja resolución por difracción de
rayos X (Figura 6) en el año 1984, donde ya se veían detalles del empaquetamiento de
las histobnas. En septiembre de 1997 el grupo de T.J.Richmod (Nature, 289, 251, 1997)
resolvió por rayos X la estructura de un nucleosoma de un fragmento palindrómico de
DNA del satélite humano, que incluía la partícula proteica y 146 pares de bases de
DNA. En este trabajo, tras décadas de trabajo se consiguió resolver el nucleosoma a 2.8
Å de resolución, lo que ya nos permite ver ya los detalles completos de la estructura del
nucleosoma (Figuras 7 y 8).

Figura 5. Esquema de la estructura del nucleosoma.

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 Como vemos existe un núcleo proteico entorno al cual se enrolla en sentido
levógiro 1 3/4 vueltas de DNA. El diámetro es aproximadamente 11 nm (110 Å) y la
altura es 5.5 nm (55 Å).

Figura 6. Estructura de baja resolución de la partícula núcleo.

Se ha visto en la estructura de alta resolución que el nucleosoma es bastante

como se postuló a partir de datos de baja resolución y análisis de reactividad química,
pero que también se habían escapado algunos detalles sutiles en los datos de baja
resolución. Primero se ve que el DNA no se encuentra enrollado de manera uniforme,
sino que en algunas zonas es casi recto, mientras que en otras tiene una muy fuerte
curvatura. Esto sugiere que las propensiones intrínsecas a doblarse del DNA marcan en
parte la estructura real del nucleosoma. Interesante, las histonas que constituyen el core
proteico emiten fragmentos polipeptídicos que se prolongan fuera del core. En algunos
casos estas cadenas polipeptídicas “atraviesan” entre 2 cadenas de DNA (ver Figuras 7
y 8) y salen hacia el exterior. Es posible que estas cadenas sean importantes para niveles
de estructuración más elevados del DNA.

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Figura 7. Estructura del nucleosoma a 2.7 Å de resolución.

Figura 8. Detalles de la curvatura del DNA sobre el nucleosoma y de las proturberancias

de cadenas de histona por los surcos.

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 Las histonas son muy ricas en hélices alfa y dan lugar a empaquetamientos que
nos recuerdan a α-bundle o α-corner (ver Figuras 7,8). Las histonas se presentan a pares
y de hecho se observan como dos heterodímeros formados por H3-H4 y por H2A-H2B,
como ya se sabia estos dímeros se repiten 2 veces dando lugar a una estructura bastante
simétrica (ver Figuras 7 y 8). Estos dímeros se forman por interacciones de apilamiento,
que si las observamos nos resultan familiares en empaquetamientos tipo α-bundle.

Las interacciones entre DNA y proteína son muy intensas y justifican que el
DNA se curve. Tal como teóricamente se habia previsto las interacciones son
básicamente electrostaticas, y son los fosfatos del DNA los residuos que más
interaccionan con residuos de la proteína. Estos residuos son en muchos casos grupos
básicos de las proteínas, y en otros grupos polares como OH, o incluso los grupos
amida. También se dan muchas interacciones con los grupos apolares de las proteinas y
las ribosas. Finalmente, se han detectado contactos muy itensos entre fragmentos de la
proteína y el hueco que generan los minor groove de 2 cadenas de DNA. Podemos
pensar que esta interacción es clave para enmascarar la fuerte repulsión fosfato-fosfato
que se da fruto de la empaquetación del DNA. De hecho los autores del trabajo en
Nature 389, 251 (1997) sugieren que parte de la propensión que ciertas secuencias, por
ejemplo pasos A.T tienen para formar nucleosomas es debido a la tendencia de estos
pasos a formar estructuras con minor grooves muy estrechos. Estos surcos concentrarán
mucha carga negativa, y que por tanto formarán puentes salinos muy fuertes con las
histonas.

Los estudios de difracción de rayos X a alta resolución han confirmado que la

razón que causa el enrollamiento del DNA sobre el nucleosoma son interacciones
electrostáticas entre las abundantes cargas positivas de las histonas, y los grupos
fosfatos del DNA. Por otro lado, respecto a la forma del DNA sobre el nucleosoma, se
ha visto que es un DNA curvado, pero a parte de eso no está excesivamente
distorsionado. Es interesante notar que el DNA no está “encerrado” o “protegido” por la
proteína, sino solo depositado sobre su superficie. Esto que ahora queda claro por la
estructura del nucleosoma se demostró hace tiempo en un experimento clásico con
DNAasa I. Este enzima corta una cadena de DNa (nick) con gran eficacia, aún en sitios
en los que este está cercano a proteínas, pero no es capaz de desnaturalizar proteínas, o
tener efecto proteasas. Al incubar DNAasa I a nucleosomas y hacer electroforesis lo que

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aparecen son bandas de aproximadamente 10 pares de bases (bp). Esto liga de manera
clara con la hipótesis de que el DNA está enrollado sobre el core proteico, pero no
protegido por él. Recordar que el DNA (B) es una doble hebra de unos diez pares de
bases por vuela, y por tanto cada 10 pares de bases el DNA estará accesible a la acción
de las nucleasas, y podrá ser cortado.

17.3 Estructuras de orden superior

Es evidente que el DNA tiene que compactarse mucho más que el nivel de
compactación que le proporciona el nucleosoma. Un ejemplo de compactación lo
representa el cromosoma (Figura 1). Entre el primer nivel de empaquetamiento y el
último hay un número de etapas intermedias. Así en primer lugar los nucleosomas se
agrupan dando fibras más o menos lineales. Esta fibra de nucleosomas se estructura más
aún formando unas “superhebras” helicoidales de unos 30 nm de anchura, y con un paso
de rosca de unos 6.7 nucleosomas por vuelta (Figuras 2 y 9). No se conoce en detalle la
estructura, pero parece que la histona H1 juega un papel clave para estabilizar el interior
de la hebra (ver Nature 368, 351 (1994)).

Figura 9. Imagen de microscopía electrónica de la fibra de 30 nm. Observar el detalle de

los nucleosomas (partículas blancas).

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 Existen varios modelos para explicar la estructura de esta sueprfibra, el más
extendido es el modelo del solenoide simple (T17.4). Este modelo no está totalmente
caracterizado a nivel estructural por el tamaño del sistema. La mayoría de los libros
recogen un modelo como el que se muestra en la Figura 10 con los nucleosomas como
apilados en un eje oblicuo al de la superfibra. Sin embargo otros autores soportan
modelos ligeramente diferentes (véase Figura 11).

Figura 10. Posible modelo del solenoide de la fibra de 30 nm.

Las superfibras constituyen ya un nivel de empaquetamiento elevado, pero no

osbtante, es preciso un nivel mucho mayor de empaquetamiento. Los niveles por
encima de la superfibra de 30 nm no están claros. Se piensa que varias superfibras se
pueden agrupar para dar una suprahélice. En cualquier caso, el paso final de
empaquetamiento es el cromosoma, en el que el elevado grado de empaquetamientod se
consigue a base de formar lazos de super o suprahélice. Se especula que hay unos ocho
lazos en un cromosoma estandard:

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Figura 11. Modelo alternativo del solenoide en la fibra de 30 nm.

17.4 Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la

cromatina.

Es un tema amplio que veremos solo superficialmente (ver capítulo 30 de

Lewin), en tanto se comentarea en otras asignaturas.

Una pregunta clave cuando hablamos de nucleosoma y actividad del DNA es: está el
DNA (en cromatina) organizado en nucleosomas cuandos e encuentra activo?, o solo
cuando esta “almacenado”?. Los datos experimentales son claros: los enes “activos”
contienen un porcentaje de nucleosomas igual a los genes inactivos. Es decir, no se
produce perdida de estructura nucleosomal cuando el DNA se activa. No sabemos en
detalle cual es la estructuración del DNA en el momento exacto de la replicación o
transcripción. El tamaño de los enzimas implicados en este proceso es muy grande, con
lo que se especulan que “chocarían” con el nucleosoma si este estuviera formado. Así,

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la idea generalizada es que en el momento justo de la replicación o transcripción el
nucleosoma se desestructurará, pero en cuanto a los enzimas implicados pasan de largo
estos se reforman. En este proceso no queda claro si cuando se produce la reformación
ésta se produce en la misma posición. Los resultados no son concluyentes, pero los
experimentos más recientes soportan un cierto “conservadurismo” en cuando a la
posición que ocupa el nucleosoma. Notad que la estructura del nucleosoma podría
jugar un papel clave al acercar el el espacio secuencias lejanas, para el
reconocimiento del DNA por proteínas).

Lo que si que esta claro es que el empaquetamiento del DNA por las histonas
produce en general una inhibición en la unión de otras DNA-binding proteins, como los
factores de transcripción. Mirando la estructura se ve que esta inhibición no se debe
tanto a la reducción del area accesible del DNA (73% de la normal en el nucleosoma),
sino a la distorsion que se genera en la estructura del DNA. Por último, es interesante
destacar que a priori la formación del nucleosoma puede crear centros de
reconocimiento. Es decir, al distorsionar el DNA puede crear un centro de
reconocimiento que sea propio de ese DNa cuando esta en el nucleosoma, pero no
cuando no está. Esta hipótesis se conforma por algunas proteínas, por ejemplo la
integrasa del HIV que tiene preferencia por unirse a fragmentos de DNA que se
encuentran en nucleosomas. Se especula (ver Cell 69, 769 (1992), y PNAS 91, 5913
(1994)) que esto se da por la especificidad de ciertas proteínas por reconocer fragmentos
de gran curvatura.

MODIFICACION QUIMICA DE HISTONAS

Las histonas no son proteínas estáticas sin reactividad alguna, como podría
sugerir su papel estructural. Por el contrario, sus cadenas laterales sufren un gran
número de reacciones tales como acetilaciones (ejemplos en las Lys), fosforilaciones, o
incliso “ubiquitinación”. La importancia biológica de todos estos procesos es algo que
no ha sido clarificado, aunque a menudo se relaciona con la formación o rotura del
nucleosoma. Por ejemplo, la acetilación de ciertas Lys en la histona H4 se ha sugerido
que conduce a una desestabilización del nucleosoma. También se sabe que el proceso de
formación/rotura del DNA implica a menudo fosforilaciones de residuos de las histonas.

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Dada la relación entre rotura/formación de nucleosomas y la funcionalidad del DNA
parece obvio que estos procesos de modificación química de las histonas estén
perfectamente regulados.

MODIFICACIONES QUIMICAS DEL DNA

Los nucleosomas pueden interaccionar con numerosas moléculas. No obstante, la

reactividad más relevante que poseen viene dada por su capacidad de metilarse y
desmetilarse. La metilación se da en citosinas, especialmente en secuencias ricas en CG.

Evidencias diversas paraecen demostrar que el pattern de metilación puede ser muy
constante (siempre en iguales zonas del DNA), y de hecho se supone que el proceso de
metilación esta catalizado por enzimas específicos: loas DNA methylasas, lo que
sugiere una importancia elevada de este proceso para la vida de la célula. Evidencias
experimentales sugieren que la desmetilación viene asociada a la expresión del gen.

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