ANEX06

METODQ DE LA MEMBRANA FILTRANTE 1. Fundamento A diferencia del metodo de tubos multiples, el metodo de filtraci6n con membrana 0 metodo de la membrana filtrante (MF) brinda un recuento directo de los collforrnes totalcs y fecales presentes en una muestra de agua determinada. EI metoda se basa en Ja filtrackm de un volumen conocido a traves de un frltro de membrana, hecha en base a algtm compuesto de celu105ay can un diametro de poros uniforrne de 0.45 m; las bacterias son retenidas en la superfieie de Ja membrana filtrante. Cuando [a membrana que contiene las bacterias se incuba en un recipiente esteril, a una temperatura apropiada con un medio de cultivo selective diferencial, se desarrollan colonias caracteristicas de colliormes totales y fecales, cuyo recuento se puede efectuar en forma directa. Las ventajas del rnetodo se describen ell el Capitulo s. 2. Volumen de la mueslra de agua a ser mtrada Como el area de filtracion es relativarnente pequena, solo puede permitir el crecimiento de un numero lirnitado de colonias, EI numero optimo es entre 20 y 80 coionias, con un maximo de 200. Si se supera esta cifra, pueden desarrollarse colonias atipicas muy pequefias, 0 desarrollarse colonias superpuestas, o puede inhibirse el crecimiento debido a la sobrepoblacion, La eleccion del volumen de la muestra a filtrar depcndera del tipo de agua. Como regia general, deben ernplearse los siguientes vohimenes de filtracion:
Tipo lie tI£'''' Volume1l de la muestru " fillrar (ml)

Agua tratada de buena calidad Ag1l8 potable no tratada Agua superficial

50-100
IO-S0

I-to

Si no se conoce el origen de la mucstra Ysu probable contenido bacteriano es incierto. deberan filtrarse difcrentes volumenes de agua que difieran entre sl par un factor de 10, con el fin de encontrar Ia gama de amplitud adecuada para el anahsis. Si el volumen que se va a filtrar es menor de 10 ml, debera colocarse por 10 menos 20 ml de agua de dilucion esteril en el embudo del filtro antes de empezar la filtracion. 119

120

GUlAS PARA LA CALIOAD

DEL AGUA POTABLE

ANEX06

121

3. Equlpo Ademas del equipo basico y los utensilios de vidrio utilizados en el metodo TM (vease el Anexo 5), se neeesitan los siguientes aparatos para i1evar a cabo la tecniea MF: (a) Aspirador de agua, bomba de vado electrica 0 cualquier dispositive adecuado para producir un vacio parcial de por 10 menos la mitad de la presion atmosferica. (b) Frasco Erlenmeyer de l litro (con brazo lateral) equipado con un tubo de goma suficientemente grueso para que el tuba no se rompa cuando se aplique el vacio. (c) Soporte del filtro, formado por una base 0 soporte poroso para el filtro, ~ue puede montarse en el frasco Erlenmeyer mediante un tapon de goma, Junto con un recipiente en la parte superior que pueda sujetarse al soporte poroso. Las dos partes del soporte del filtro deben ser envueltas en papel en forma separada y esterilizadas en la autoclave durante por 10 menos 15 minutos a 121°C. (d) Discos 0 platillos Petri de vidrio 0 pkistico, de 60 X 15 mm (tambien pueden utilizarse latas para ungUentos del mismo tamafio). (e) Membranas fikranses, de 47-50 mm de diametro, con un diametro de poros de 0.45 I'm. Son muy convenientes las membranas previamente esterilizadas y empaquetadas individualmente. Sin embargo, tambien se pueden utilizar membranas filtrantes no esterilizadas, las que deben ser envueltas en paquetes de papel en ntimero adecuado (dependiendo del numero de muestras de agua a ser analizadas); se Ies puede esterilizar en la autoclave y secar mediante un corte rapido del vapor. (I) Almohadillas absorbentes nutrientes, que constan de discos de papel f1Itrante de aproximadamente 1 mm de espesor y tienen el mismo diametro que las membranas filtrantes. (g) Pinzas (h) Una lupa con una amplifieaci6n de 4 a 5 para examinar y efectuar el recuento de las colonias en las membranas filtrantes. 4. Medlos de cnltivo y agua de dllucJon Pueden utilizarse varios medios de cultivo para el examen de organismos coliformes mediante el metodo de la membrana filtrante, De estos, el agar de lactosa tergitoi, agar de lactosa tergitolITC y cal do de lactosa con sulfato de laurllo, pueden utilizarse para los organismos coliformes a 35°C 0 37°C y para los organismos coliformes fecales a 44°C. Los medics de tipo Endo solo deben utilizarse para el recuento de organismos coliformes a 35°C 0 37°C y el caldo MFC a 44°C para el recuento de coliformes fecales. Aunque todos estes medics dependen de In fermentacion de la lactosa para la deteccion de los organisrnos coliformes presuntivos, las reacciones caracteristicas varian segun eJ medio, EI caracterlstico brillo rnetalico de las colonias en los medios de tipo Endo depende de la formacion de aldehtdo, Aunque es posible preparar los medics a partir de sus ingredientes basicos,

esto puede resultar poco practice para un Iaboratorio pequefio. Por 10 tanto, se recomlenda el uso de medics deshidratados, Los medics pueden prepararse en forma de caldo y utilizarseles junto can las almohadillas de absorci6n de nutrlentes 0 en forma de placas de agar s6lidas. Los caldos pueden ser solidificados mediante la adid6n de ] .2-1.50/0 de agar antes del hervido. A manera de ejemplo se describe a continuaci6n e1 procedimiento para preparar pequenas cantidades de medios en el caso de M-Endo y caldo FM, y de caldo MFC. (a) M-Endo yea/do FM
(i) Disuelva 2.4 g de medto de cultivo deshidratado en 50 ml de agUR destilada y agregue 1 mt de alcohol etilico a1950/0. (ii) Esterlllce calentando lentamente justo hasta el punta de ebulli-

cion. EI medio puede guardarse hasta por 4 dias en el refrigerador: aproximadamente SOml de medio es suficiente para unas 2S pruebas,
(b) Caldo MFC

Jada con un 1.0% de 3cldo rosolieo en una solucion de hidrexido de sodio de 0.2 mol/litro. (ii) Caliente el medio hasta el punto de ebullicion. (iii) Retire rapldamente del fuego y enfrielo por debajo de los 45"C. El medio preparado no debe ser esterilizado POt autoclave; puede set guardado hasta por 4 dias en el refrigerador, EI agua de dilucion debe prepararse segun 10 descrito en la seccion 4.2. 5. Procedimientos

(0 Disuelva 1.9 g del medic deshidratado en SOml de agua desti-

A continuaciou se desctiben procedimientos generales; sin embargo, se hace notar que existen diferentes tipos de unidades y equipos de filtracien, 5.1 Determinacion de coliformes totales

A. Conecte el frasco Erlenmeyer (con un brazo lateral) a la fuente de vacio (apagada) y coloque en su sitio el soporte poroso, Si se utihza una bomba electrica. se aconseja poner un segundo frasco entre el Erlenmeyer y la fuente de vacio; este segundo frasco actua como una trampa de agua y de esa manera protege a la bomba electrica,

122

GUlAS PARA LA CAUDAD DEL AGUA POTABLE

ANEXO 6

123

B. Abra un platillo Petri y el.

coloque una almohadilla en

E. Coloque el recipiente superior en su sitio y asegurelo con las abrazaderas espedales (el tipo de abrazaderas dependera del tipo de equipo).

WH()S'1tI9
itrlfO 8!.J11

c.

Con una pipeta esteril, agregue 2 ml de caldo setectivo para saturar la almohadilla.

If /{() NJJIO

------------------------~

F. Vade en el recipiente suo perior el volumen de muestra elegido como optima segun el tipo de agua, Si la muestra de prueba es de menos de 10 ml, se debera afiadir por 10 menos 20 ml de agua de diluci6n esteril al recipiente superior antes de la filtraci6n (vease seccion 2 de este Anexo). ApJique el vacio.

D. Ensamble la unidad de filtraci6n colocando una membrana fiItrante esteril sobre el soporte poroso, utilizando para clio pinzas previamente esterilizadas al fuego.

G. Despues que la muestra Itaya pasado a traves del filtro, desconecte el vacio y enjuague el recipicnte can 20-30 ml de agua de dilucion esteril, Enjuague otra vel. despues de que toda el agua del primer enjuague haya pasado a traves del fiItro.
WHO N5JII IVI/O 8J31<

124

GUlAS PARA LA CALIDAD

DEL AGVA PO rABLE

ANI:X06

125

H. Desmonte In unidad de filtraci6n y, utilizando las pinzas, coloque la memo brana filtrante en el platillo Petri sobre la almohadilla, con el lado reticulado hacia arriba, Asegurese de que no queden burbujas de a ire atrapadas entre la almohadilla y la membrana

Las colonias de bacterias coliformcs forman un medio de color raja 0 rojo oscuro, con un brillo dorado verdoso 0 metahco en la superficie. Estc brillo puede abarcar toda la colonia 0 aparecer solo en el centro de la misma, Las colonias de otro tipo no deben ser contadas. EI recuento de las colonias puede hacerse con la ayuda de una lupa. EI mimero de coliformes totales por 100 ml esta dado por:
Colitormes totales por 100 ml

No. de colomas cohformes contadas No, de rnl de muestra Iiltrada

x 100

5.2 Determinacion
L_____.

de coliformes fecalcs

filtrante.

~~~"'~"~"~'

EI procedimiento para coliformes fecales es similar al usado para la determinacion de coliformes totales. Filtre la muestra como se dcscribi6 anteriormente y coloque la membrana filtrante sobre la almohadilla saturada con, por ejemplo, medio MFC.

I. Coloque el platillo Petri en posicion invertida para la incubacion,

A. Coloque los platillos Petri en una incubadora a 44 ± O.soC durante 24 horas can 100% de humedad. Un metoda alternative puede ser colocar los plati1I0s Petri sell ados 0 con tapas firmemente ajustadas en bolsas plasticas impermeabies para la incubacion.

J. Incube a 35°C 6

durante 18-24 horas con un 100% de humedad (para garantizar esto, coloque un pedazo de algodon humedo dentro de la incubadora). Si se estan utilizando Iatas para ungUentos 0 platillos de plastico con tapas firmemente ajustadas, no es necesaria la humectacron.

Jrc

18-24

():
wHO §JJI1

":

·n..

B. Sumerja las bolsas en bafio Maria, manteniendolas a 44 ± O.5°C durante 24 horas, Las bolsas de plastico deben estar debajo de la superficie del agua durante todo el periodo de incubacion. Ello puede lograrse utilizando un peso adecuado, par ejemplo una gradtlla 0 soporte de metal.

24 h

WI/08JJI.

126

GUlAS PARA LA CAUDAD DEL AGUA POTABLE

Las colonias de las hacterias coliformes fecalcs son de color azul. Las colonias de coliforrues no fecales toman un color gris 0 crema. Se puede hacer el recuento de las colonias con la ayuda de una lupa. Finalmente, eI numero de coliformes fecales por 100 ml esta dado pot:
Collformes fecales por 100 m1 "'" No. de colonias de coliform", fecales contada, No. de ml de muestra fillrada
X 100

ANEX07
DETERMINACION DEL CLORO LJBRE RESIDUAL Pueden usarse dos procedimientos para determinar el cloro libre residual: uno se basa en un comparador visual comercial y el otro comprende la inspeccion visual y la comparacion del color que presenta el agua en los tubos de ensayo. Se cuenta con dos reactivos diferentcs para esto: N,N dietilparafenilenediarnina (DPD) y ortotolidina (OT), el ultimo tiene la desventaja de ser carcinogeno y, 5i lIegara a usarsele, habra que manipularlo con extreme cuidado, Tambien se brinda aqui detalles sobre un metodo basado en cl uso de almidon y yoduro de potasio. Sin embargo. este metodo no es especifico para el c1oro Iibre residual y, por to tanto, puede brindar falsos resultados positives. A pesar de esta limitacion, se Ie ha lncluido debido a Sll amplio uso en muchos paises. 1. Tecnica del comparador visual comercial 1.1 Equipo Los comparadores comerciales son de dos tipos basicos: (i) del tipo disco, can una rueda de pequefios vidrios coloreados; y (ii) del tipo dispositive con patrones liquidos en ampolletas de vidrio. Sin embargo, ambos tienen los mismos cornponentes: una caja con un lente ocular en la parte frontal y dos celdas; el conjunto esta dispuesto de tal manera que ambas celdas estan en el campo de vision del lente ocularUna celda, que contenga una muestra de agua sin los reactivos, se coloea en linea con los vidrios colorcados grratorios 0 con las ampolJetas que COI1tienen los patrones liquidos. La rnuestra de agua con el reactrvo se coloca en otra celda. Si existe c1oro Iibre presente, se desarrollara un color. La concentracion de c1oro se estima comparando los colores de ambas celdas segun se ven a traves dcllente ocular. Cada color del disco 0 ampolleta corrcsponde a eierta cantidad de c1oro en el agua; para cada uno de los reactivos especiflcados, se nccesitan diferentes discos 0 ampolletas de calibracion. 1.2 Reaetivos Como la mayoria de comparadores estan hechos para usarlos con los reactivos del fabricante, debe tenerse cuidado de mantener una buena canttdad de estos. Esta es una desventaja, pues implica una dependcncia del proveedor local y, en algunas ocasiones, pucden surgir problemas de importacion. Por otro lado, una ventaja de la tecnica consiste en que no es necesario preparar soluciones para patrones de color, 10 que hace que sea muy facil efectuar el procedimiento de comparacion. 127

128

GUlAS PARA LA CALIDAI)

OEL AGUA POTABLE

ANI'XO 7

12q

1.3 Determinacion

del cloro libre

A. Enjuague una celda del comparador tres veces y luego llenela con la muestra de agua hasta la sefial respectiva.

D. Atiada el reactivo en la

segunda celda segnn las instrucciones del fabricante.

WHO a:I112

B. Coloque la celda en el portaceldas del cornparador, que esta alineado con los patrones colore ados (B).

E. Agite la celda (durante no mas de 3-5 segundos) para mezclar el reactivo.

II'IW

ssin

WHO Sl171

C. Enjuague

la segunda celda y llenela con la misma agua.

F. Coloque la celda en el
comparador.

WHO ~511]

WHO 85216

130

GUlAS PARA LA CAUDAD

DEI. AGUA PorABLE

ANEX07

131

G. Manteniendo el comparador de frente a la luz natural, gire el disco hasta que el color de uno de los patrones (B) sea el mismo que el que ha desarrollado el reactive (A). Inmediatamente (es decir, en rnenos de 20 segundos), lea en C el valor de cloro libre en mg/litro. Tambien es ventajoso enfriar la muestra hasta aproximadamente I°C (vease el Capitulo 6). 2_ Teenlea con tubos de ensayo La tecnica clasica de tubos de ensayo supone el uso de tubos Nessler. Sin embargo, en el campo se pueden emplear tubas de ensayo comunes, EI metodo se basa en la comparacion visual entre el color que se desarrolla en un tubo al eual se Ie han agregado reactivos y el color de soluciones tipo previamente preparadas, contenidas en tubos de ensayo sellados. Como la mayoria de las aguas potables se cloran para tener una concentracion final de cloro residual menor a 1 mg/litro, los patrones permanentes de color son preparados solo para eubrir una gam a de 0.0-1.0 mg/Iitro. Al igual que con la tecnica del cornparador comercial, la rapidez de la determinacion (menos de 20 segundos) ayudarii a evitar que el react iva actue sobre el cloro combinado que pueda encontrarse presente y de esta manera se reducira eI riesgo de obtener valores de cloro libre equivoeadamente elevados. EI cnfriamiento de la muestra basta aproximadamente l C tambien minimiza el error provoeado por la presencia de eloro combinado (vease el Capitulo 6). La aplicacion de la tecnica de tub os de ensayo requiere que un laboratorio local 0 regional prepare los patrones de color y los reactivos. EI equipo necesario, los reactivos y el proccdimiento se describen en los textos pertinentes sobre metodos de analisis (vease la Bibliografia). 3. Metodo de Blmldon y yoduro de potasio 3.1 Equipo Se requiere el siguiente equipo: -un recipiente cilindrico de 100 ml =-una pipeta cuentagotas. 3.2 ReBctlvo Disue1va 2 g de almidon soluble en 100 ml de agua destilada. Hierva la solucion y dejela enfriar a temperatura ambiente. Agrequc 8 g de yoduro de

potasio y agite la mezcla basta que este cornpletamente disuelta. Guarde la solucion en un frasco de vidrio marron, Si sc agregan 2 6 3 gotas de cloroformo (0 formaldehido), la solucion permanecera estable durante 2-3 semanas. 3.3 Determinacion del cloro residual

A. Agrcgue 3-6 gotas de la solucion de almtdon y yoduro a 100 ml de la muestra de agua en un cilindro de medici6n.

B. Mezcle completarnente,

c(
11'110

_)_)

nJ04

EI contenido de cloro residual de la muestra de agua se calcula a partir del color obtenido, de la siguiente rnanera:
CalQr lncoloro Celeste Azul oseuru Color residuol Img/Iitro) 0.0 01-0.3

>0 ..3