ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

19

23 25 27 28

36 38 40

1

1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

2

3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

3

4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

4

homogenizar. . . lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) . contar todas as células dos 4 quadrados externos.Pipetar 1000 µ L. algodão B) PROCEDIMENTO .sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) .pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. .deixar sedimentar por 3 minutos.micropipetas de 10 µ l. com objetiva 40 x .4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS . plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 .micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL .câmara de Neubauer espelhadas . . preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) . x 1 x 10 x 100 = no.contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja.misturar por inversão. com objetiva 40x .PLAQ/ mm3 = no.ST com EDTA .tubos de ensaio. por 2 minutos.câmaras de Neubauer espelhadas.Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO .1 x 20 = no.BM a 37oC. tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra.Leucócitos / mm3 = no. x ¼ x 1/ 0. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS . preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) .solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados . todo o quadrado central de 1 mm2). . placa de Petri.tubos de hemólise.

3 – 19. indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2.5 [181] Alterações do Tamanho = 1. Microplaquetas < que 2 μm.contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------. na maioria delas. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 .000.55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15. > 8 – 10 μm 3.000 hemácias / mm3 ----------.Aldrich Alterações da Forma = 1.x 6. Satelitismo Plaquetário 6 .80 plaquetas em 4. achado encontrado na rara doença de Wiskott . isto é.20 – 11.preparo do esfregaço do hemograma normal . Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro. Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos. granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) . MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro.

MATERIAIS .7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7. pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes. . METODOLOGIA .5 mL da solução de Drabkin em tubo. de 5 mL B .Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa. a 11000 rpm / 5 min.micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro.ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) . sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : .empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 .sangue total (ST) com EDTA . .lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar .tubo capilar para microhematócrito .pipetar 2. .espectrofotômetro.homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A .reagente de cor (solução de Drabkin) .tubos de ensaio 75 x 100mm. leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7.solução de Hb padrão comercial .

4 [181] 7. em objetiva de 100x.lâmina de hemograma corada.96 µ m3 ou 82.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht.Microcitose . onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .5 – 97. em peso. de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 .Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 . observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço.2 [181] 7.óleo de imersão TÉCNICA = .4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc.32 pg(10-12) 26. volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 .olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço . faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço.Macrocitose .8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = .4 – 33. exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.4 – 32. .Calculado o Fator.

lâminas de vidro 24 x 76 mm.amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C . campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e .micropipetas de 20 µ L .deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos .solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio. 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço.- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= .ressuspender com agitação suave. com objetiva de 100.colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise . ao mesmo tempo. marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 . tubos de hemólise .

além da correção pela anemia.EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente.150.observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 . Ht (%) Index (dias) > 40% 1. os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais. quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta.20 % 2. Os estudos de ferrocinética de Hillman . há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0.0 30 . e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) .40 % 1. em 1985.feito o esfregaço corado com Leishman . que é diretamente proporcional ao grau de anemia.8 – 1 % das Hc / dia.30 % 2.0 10 . mostraram que. em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS . o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias).5 20 .passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão).000 Hc / mm3 y Ret RET = 124. olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra .

Hiato Leucêmico .Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) . com suas próprias funções. podendo ser absoluta (no.Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro. mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças.7. porque cada tipo celular é um sistema separado. (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = .62.Reação Leuco-Eritroblástica . anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO .Vacuolizações 11 .em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos.481] .Hipossegmentação Nuclear .Reação Leucemóide . Por convenção.em valores absolutos : x células / mm3 .Hipogranulações Citoplasmáticas .Neutrofilia ou Neutrocitose .Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado . não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2.4. / mm3) ou relativa (%).Neutropenia ou Neutrocitopenia .Granulações Tóxicas . isto é.NO necrobióticos .

com auxílio da pera.Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas .Eosinopenia ou Anaeosinofilia . 12 .Linfocitose .Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS .Inclusões Anormais .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS .Monocitopenia .Eosinofilia .Homogenizar a amostra e encher. pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = .Linfócitos Atípicos .Monocitose .Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen. até a marca superior 0. a pipeta de Westergreen.Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS .Linfopenia ou Linfocitopenia .Basofilia .

fazer esfregaços e corar com Leishman 12. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x. . sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : . contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%). colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11.- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1.papel de filtro. recolhido em vidro de relógio. álcool para antissepsia .algodão. e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6. IVY [260] 13 . passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. . separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min.lancetas para punção digital. deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4. homogenizar o sedimento. sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%)./5000 rpm.esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 . para um tubo B. reservar 3. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7. passar o filtrado.cronômetro . aspirar e desprezar o sobrenadante. homogenizar manualmente ou no vórtex 9. 10.

haveria melhor correlação clínica.calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 . a punção é feita no lóbulo da orelha. sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 . com cerca de 3 – 4 mm de profundidade ..- recomendado pela ICSH.Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) . descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço.PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : .a punção é feita na polpa digital. DUKE MODIFICADO .4 mm de extensão em sua borda. estando mais sujeito a falsos resultados. embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 .descrito em 1912. DUKE [260] . com uma incisão de +.5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “. 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +. ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 .Esfigmomanômetro adulto ou infantil . pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre.medir a PA do paciente . temperatura ambiente .

TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = . >5 mm = ++++ 17 .banho-maria a 37 o C .TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5.colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) .calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 .após coagulação. descrito em 1913) = .identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 .Tubo de hemograma (EDTA) .tubos de ensaio 75 x 100 mm .6.3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados .BM a 37 oC . 2 a 4 mm = +++  incontáveis.medir com pipeta graduada o volume de soro restante .após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra. deixar o tubo no BM por até 2 horas .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .62. abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50. no tubo original .71] MATERIAIS = .determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira . até o dorso da mão = ++  >70.pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = .

e colocar 1 mL em cada tubo. o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min. incubar a 37 o C de minuto a minuto. tubos siliconizados = 20 – 30 min. e após a coagulação deste.- - colher 4 – 5 mL de ST.TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. por inversão lenta. com o menor trauma possível. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) .  tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 . até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos.  centrífuga de soro. VR = 19 . observar o 1º tubo .

5 – 13.5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1. idem TAP 2. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11. centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3. em tubo de hemólise . Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. separar o PPP.5 segundos 20 . agitar o frasco antes do uso 2 . colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo.00 a 1. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 . a 37oC 5 . CaCl2 solução a 0.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1. para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1. após a leitura em segundos. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril.5 A 13. para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11. Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 .40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras. olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE. se não realizar imediatamente. pelo menos. no volume indicado no frasco.25 M (estoque) ou a 0. alça de metal.025 (pronta para uso) 17 . incubar por dois minutos também 6.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1.

mas aumentam com a mistura M2 22. em tubo de hemólise em BM.PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril.25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0. 18 . sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1. cronômetro . incubar por 3 minutos 7.025 M).: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1.centrífuga de soro. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3. preparar a solução de CaCl2 para uso (0. agitar o frasco antes do uso 3.9 a 1.025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5. colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina .reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL).METODOLOGIA = 2. BM a 37o C. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1.amostra de ST em tubo citratado .DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10. se não realizar imediatamente. no volume indicado no frasco.25 = presença de inibidor normal paciente < 1.25.25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= . fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 .

segundo o fabricante) . .Homogenizar suavemente antes de usar. pré . PPP citratado 4 . .calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit.2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia. . onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K.centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) . centrífuga de soro 6 .TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 .reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante).misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2.plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = .diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos . BM a 37o C 19 . onde n é a diluição do PPP usada (10). será = K x n. Tampão do mesmo kit 3.determinado pelo fabricante. deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR). tubos de ensaio 5 . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio. sendo que a concentração de FIB. Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 .

quando formar o coágulo. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5. centrifugar novamente como no item b) 6.1 mL de ácido acético 1 % 2. pipetar 0. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3.62] 1.Método de Bloom (1961) [141]= 1. solução de CaCl2 M/10 = 1.7 .3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1.C por 30 minutos 3. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão. Ácido acético 1 % = 0.2 com ácido acético a 1 % 24. cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1. homogenizar e incubar a 4o. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0.8 M em 100 mL de AD 4. PPP citratado 2.5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7. após o início da lise observar a cada 5 minutos. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos. solução salina tamponada pH 7. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4.5 mL de PPP + 0.37 mL de CaCl2 1. ajustando o pH para 5. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. 8.94 g dietilbarbiturato de sódio 2.1.5 mL do CaCl2. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4.6. 20 .

Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina). . (1978) [5] = 1.0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min. descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml.1 m L de HCl 0. cuidados na coleta. diluídos em AD qsp 10 ml 4.A heparina não precipita na fração euglobulínica .34 g 21 . a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs. / 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min.025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3.Método de Nilsson. PPP citratado mantido a 4o C 2. anotar o tempo de lise total do coágulo. solução de ácido acético 0.as variações fisiológicas são acentuadas.9. segundo atividade. adicionar 500 l da solução de trombina e. tampão salina barbital pH 7.1 N. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5.O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) . DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24. Só levar em consideração os grandes encurtamentos.2.9 – 6. alimentação.Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 .38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2.30 minutos .: . incubar 37o C / 10 min. após a formação do coágulo. disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 .

que deve estar entre 60 . Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal. 4. 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3. 2.80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80. 3. 5.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 .AD 1. na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste. desprezar e preparar outro) 6.

6 23 . ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.26.

a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo). fazer a transparentização. 7.2 g + EDTA 0. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex.MATERIAIS = 1. em outra cuba. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba.. previamente. mergulhada na solução tampão.5g + Ácido tricloroacético 5. Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5. e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min.6 tris-hidroxi-metilamina 10. analisar o fracionamento inicialmente sem corar. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min. 3. papel de filtro ou Perfex. aplicador.. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C. embeber o acetato de celulose na solução tampão. 9..6 g + Ácido bórico 3. Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4.. até sua transparentização (alguns minutos). fonte geradora de voltagem 2. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. em posição reta e esticada.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. na solução transparentizadora. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão. SF 0.2 g + AD qsp 1000 mL 4. 6. cubas de eletroforese. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba.0 g + AD qsp 100 mL 3. agitando-a cuidadosamente. 14. Solução tampão tris-EDTA-borato 0. 8. 10. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. 11. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . 13. desligar a fonte. 5. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. 12. Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0. estufa a 60 – 70o C 4. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador. tiras de acetato de celulose 3. 4. e depois por 3 min.025 pH = 8. por pelo menos 10 – 15 min.

não pode ser guardado. é tecnicamente mais demorado.pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas. 1.homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. não deve ser feita coloração nas tiras . o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml . Regra Prática = Se Ht paciente vol. ST vol. por exemplo). agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min. recentrifugar antes de usar.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. Obs. dosa-la no hemolisado.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra . hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar.para 100 μl de ST. Sol.se usadas Hc não lavadas. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis . colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% . e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . se houver a formação de precipitados no tubo. em congelador (controles. Ao usar hemolisados congelados. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4. as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais . 3.se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. 7. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min. um volume de Hc. para poder detectar Hb H.. amostra com heparina ou EDTA 2. desde que mantidos estéreis 10.se usado KCN. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb. está pronto para uso.uso de AD é o método mais puro.: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. se necessário. adicionar um volume de clorofórmio 6. Lavadas + dois volumes de AD. ST são estáveis a 4o C.

lâminas e lamínulas de vidro 2. à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1.78 g + K2HPO4 anidro 59.1. pipetas 2. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4.50 g + AD qsp 250 mL 3. 4. 2. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. 6.33 g + Saponina 2. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . em lugar fresco. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. placa de Petri. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2. preparar antes de fazer o esfregaço 2. 7. tubos de vidro 12 x 75 mm. amostra de ST colhido com EDTA 1. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. esmalte de unhas ou Entellan 3. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. 3. 5. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5.

tesoura METODOLOGIA = 1. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4. em absorbância de 415 nm.5 – 5.5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2. deixar eluir por 2 horas. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. ler. agitando os tubos a cada 15 minutos 7. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos.7 % 30. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais. acertando o zero com AD 8.0 – 9. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 . terminada a corrida eletroforética. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2.0 2. sem coloração. espectrofotômetro 3.0 – 3.5 cm de largura 5.MATERIAIS = 1.

083 N no tubo A 3. papel de filtro Whatmann ou similar 7. Separar o tubo B para o filtrado 4.B. após exatamente 1 minuto acrescentar 6.C. espectrofotômetro 5. Colocar 4 tubos em fila (A. Hidróxido de Amônio 0.083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2.2 ml de NaOH 0.D) 2. acertando o zero do aparelho com água destilada 10.8 ml de SAS 50%.MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 . tubos de hemólise 13 x 100 mm. misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8.2 ml do hemolisado no tubo A. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C. Ler a absorbância em 415 nm. Solução NaOH 0. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. misturar bem. Pipetar inicialmente 3.500 µ L 6.0% (ADULTOS) 31. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5.04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6. cronômetro. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 . Pipetar 0. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3.

30 0.65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0.20 0.2H2O 2.43 g pois cada diminuição de 0.5 6.5 2.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%.5 4.0 1.35 0. 1960)= 1. misturando-se por inversão [279]) 7.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie.0 1.4 NaH2PO4. tubos de ensaio 3.0 AD (mL) 0.5 7. homogenizar por inversão 5.0 4.0 2.60 0.10 0. NaCl 1% (mL) 10 8.0 0.0 3.1 equivale a Na2HPO4 13.40 0.0 5. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. coletar ST do paciente e controle normal 2. Espectrofotômetro.75 0.0 10.00 0.65 0. NaCl(%) 1. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3. 2. 90 g OBS.5 3.5 5.5 7. AD.5 4.0 6. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 .5 6.0 5. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo .50 0. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7.45 0.0 8.MATERIAIS = 1.5 6.0 conc.5 3. solução fisiológica. deixar em repouso por 30 minutos em TA 6.55 0.A. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4.5 5.0 4. e trabalhar com a metade da diluição (2. sem ressuspender o depósito.85 0.0 9.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5.: é importante controlar o pH para 7.

45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0.25 0. com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3.30 % de NaCl) OBS. no teste com incubação por 24 horas.45 0.: 1. calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0. porém usando 17 tubos.95 36 .100 65 . Neste. com a inclusão de concentrações de 0.8.00 % de hemólise 100 91 – 100 90 .60 0.75 0.9 – 0.70 0.19 0–9 0 0 0 0 0 2. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9.10 0.40 0.88 15 .40 0 .100 80 .7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0.70 0 .8 – 0.100 55 .90 1.100 75 . sendo que a esterilidade é fundamental. o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10.80 0. A sequência técnica é a mesma como descrito acima. incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas.20 0.35 0. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 . não pode ser usado o EDTA. porque provoca alterações morfológicas nas Hc.85 0. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32.30 0.55 0. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado.50 0.65 0.

como : a) eletroforese de Hb pH 8. 4. amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1.12H2O 9g KH2PO4 5.6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue).É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes .MATERIAIS = 1.Outros métodos podem ser usados.8 (solução de estoque) Na2HPO4. solução tampão fosfato M/60 pH = 6.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %.: . tubos de ensaio 17 x 100 mm 2.8 (tubo A) 2. no tubo B. espectrofotômetro. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 . em tubo de ensaio. e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6. ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3.7 g AD qsp 1000 mL 4. no tubo A. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2.8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS.

exatamente. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6. estável por 72 horas) 2. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. Solução de Nitrito de Sódio 0. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B. dependendo dos níveis de G6PD 34. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL. diluir todos os tubos na proporção de 0.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC. invertendo – os delicadamente. do vermelho ao castanho. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1.5 mg + AD 10 mL 4. por 15 minutos 4. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3. incubar em BM a 37ºC por 3 horas. Solução de Azul de Metileno 0. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 . homogenizar os tubos sem agitar. entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1. nas mesmas dosagens 3.1 mL para 10 mL de AD.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2. Solução de Glicose 0.(G6PD) 33. misturar e fazer a leitura 6.

solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0. Na Doença da Hb H. No Traço α . em BM. por 1 a 2 horas 2. usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1.talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2. No Portador Silencioso de α .talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3. ler em lâmina de imersão .4 g 0. 33 . tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.MATERIAIS = 1.6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal. procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas.8 g 100 mL 3.: 1. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8. idem para contagem de reticulócitos 2.

. .. 0 ausência de aglutinação.. . .. .. . fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 .GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise. . A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios. ou microscopicamente. . em Imunohematologia. . contra fonte de luz ou superfície iluminada.. Segundo a literatura.... ... podem ser lidas macroscopicamente. . 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo . . . .. colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula.. . .. w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . ... as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo ... .

de cada diluição em valores individuais. modificado por Marsh [Marsh W. faz-se a conversão da intensidade de aglutinação.. Scoring of Hemaglutination.L.quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 . depois somados (medida semi .12:352 – 353] . Transfusion 1972.Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger.

Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. micropipetas de 10. esvaziar o tubo por inversão 6. em tubo. centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5. e TCD MATERIAIS : . homogenizar o botão de hemáceas 7. Essas suspensões são usadas para Tipagem. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4. Cartão (GEL) Tubos . pipetas de Pasteur 6. amostra de ST colhida em EDTA 2. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3.teste de triagem sorológica 1.9% Gotas (μl) 20 (1.9 % 3. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5. por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8. pisseta com SF 0. retirar completamente o sobrenadante OBS.35. exceto para 50 Hemoterapia 36 . após a última lavagem. PAI. repetir os procedimentos 3 a 6. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0.

-M) 2. autoanticorpo anti-I 7.36. 3. 4. amostra contaminada ou erro de identificação 3. anti-B e anti-A. TCD positivo 4. 2. 6. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4. 1. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. subgrupos de A ou B 5. 6. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 . APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. 5. 4. 3. 7. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. 2.B 3. 5. antissoros anti-A. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. tubos de hemólise. presença de rouleaux 6.

= D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1. se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. se aglutinação negativa. 38 . lavar cada tubo 3 vezes em salina 10. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. deve ser da mesma procedência que o anti-D. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. agitação forte na ressuspensão das células. colocar no tubo CRh. uso de antissoro errado 2. substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. uso de antissoro errado 2. tubos de hemólise. proteínas anormais no soro-teste 4. identificar 2 tubos D e CRh 2. pesquisar D fraco = repetir passos 1. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. se aglutinação negativa. Se não for possível. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente). autoaglutinação. tempo ou velocidade de centrifugação) 4. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. poliaglutinação. usar controle Rh de outro fabricante. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11. colocar no tubo D. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. ressuspender o botão e ler. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2. mas sem o anticorpo. Como testemunho negativo. contaminação dos reagentes com bactérias. Soro de Coombs monoespecífico 4. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1.2 e 3. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. ressuspender e ler. dispersando aglutinações fracas Obs.37.

9 % Hc de triagem Triacell ou similar. 4. identificar os tubos I e II 3. homogenizar. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. 7. em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário. homogenizar. 5. 2. 5. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5.38. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. separar o soro a testar 2. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8. 2. 3. ressuspender e ler 39 . em cada um. centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. centrifugar e ler 9. ressuspender e ler 6. 6. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. centrífuga. para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1. tubos de hemólise 12 x 75 mm. 3. lavar 3 vezes em salina 10. 4. homogenizar. microscópio óptico pisseta com SF 0. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. estantes para tubos.

antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise. 5. 2. pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . centrífuga METODOLOGIA : 1. 4. após fazer a suspensão. 4. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. lavar 6 vezes em salina. 3. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. 3. repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G.39. 2.

Revercell B e Triacell ) 7. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. B e O (suspeita de incompatibilidade ABO). deitado. B e O. ler a olho nu e em microscópio óptico. antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. pôr em freezer a – 6 / . até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. com objetiva 100 x.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. rolar o tubo para os lados. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1. Revercell B e Triacell. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1. entre lâmina e lamínula 41 .40 . rotular tubos A1. em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1. centrífuga. por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado. descongelar em BM 37o C 4. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1.20o C. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful