ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

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23 25 27 28

36 38 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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contar todas as células dos 4 quadrados externos. .PLAQ/ mm3 = no. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS .câmara de Neubauer espelhadas . com objetiva 40x . x ¼ x 1/ 0. .BM a 37oC.Pipetar 1000 µ L. tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra. por 2 minutos.micropipetas de 10 µ l. . .pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) . com objetiva 40 x . placa de Petri.1 x 20 = no.micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL . x 1 x 10 x 100 = no. todo o quadrado central de 1 mm2). preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) .Leucócitos / mm3 = no. preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) . . homogenizar.4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS .Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO .solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados .deixar sedimentar por 3 minutos.ST com EDTA .sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) .câmaras de Neubauer espelhadas.misturar por inversão.contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja.tubos de ensaio. algodão B) PROCEDIMENTO . plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 .tubos de hemólise.

na maioria delas.20 – 11. isto é.000.contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------. Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro. > 8 – 10 μm 3. indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2.5 [181] Alterações do Tamanho = 1. granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6.80 plaquetas em 4.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) .000 hemácias / mm3 ----------. Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 .x 6. achado encontrado na rara doença de Wiskott .preparo do esfregaço do hemograma normal . Satelitismo Plaquetário 6 .3 – 19. Microplaquetas < que 2 μm.55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15. MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro.Aldrich Alterações da Forma = 1.

leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7.homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7.tubo capilar para microhematócrito . .solução de Hb padrão comercial .Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa. de 5 mL B .sangue total (ST) com EDTA .espectrofotômetro. .empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 .micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro. sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) .lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar . a 11000 rpm / 5 min.tubos de ensaio 75 x 100mm.5 mL da solução de Drabkin em tubo.reagente de cor (solução de Drabkin) . pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes. .pipetar 2.1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : . MATERIAIS .2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A . METODOLOGIA .

volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 .Macrocitose . onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .lâmina de hemograma corada.5 – 97.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média.32 pg(10-12) 26. .3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht. em objetiva de 100x.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço. de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 .Calculado o Fator.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc.4 – 32.2 [181] 7.olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço .óleo de imersão TÉCNICA = .8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = .Microcitose . faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7.Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 . em peso. observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço.96 µ m3 ou 82. exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.4 [181] 7.4 – 33.

solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio.amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C .deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos . com objetiva de 100.lâminas de vidro 24 x 76 mm. campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e .- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço. tubos de hemólise .ressuspender com agitação suave. 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= . ao mesmo tempo.colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise . marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 .micropipetas de 20 µ L .

quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia.20 % 2. que é diretamente proporcional ao grau de anemia.30 % 2. os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais. em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta.5 20 .150. há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0. Os estudos de ferrocinética de Hillman .EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente. e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) .passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão). Ht (%) Index (dias) > 40% 1. em 1985.feito o esfregaço corado com Leishman .0 10 .40 % 1. mostraram que. além da correção pela anemia. o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias). olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra .8 – 1 % das Hc / dia.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS .observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 .0 30 .000 Hc / mm3 y Ret RET = 124.

mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças. (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = .Reação Leucemóide . com suas próprias funções. não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2.Hipogranulações Citoplasmáticas .Neutropenia ou Neutrocitopenia .Vacuolizações 11 . isto é. anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO .Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) .em valores absolutos : x células / mm3 .Reação Leuco-Eritroblástica .em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos.Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado .Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro.481] .4.Hiato Leucêmico .Neutrofilia ou Neutrocitose .62.Granulações Tóxicas .7.NO necrobióticos . Por convenção. podendo ser absoluta (no.Hipossegmentação Nuclear . / mm3) ou relativa (%). porque cada tipo celular é um sistema separado.

Homogenizar a amostra e encher.Linfocitose .Basofilia .Linfopenia ou Linfocitopenia .Monocitose .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS . com auxílio da pera.Linfócitos Atípicos .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS .Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas .Eosinopenia ou Anaeosinofilia .Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS . 12 .Eosinofilia . pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = .Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen.Inclusões Anormais .Monocitopenia . a pipeta de Westergreen. até a marca superior 0.Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .

álcool para antissepsia . e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6./5000 rpm. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7. para um tubo B. sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%). deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. 10. contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%). reservar 3.esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 .cronômetro . recolhido em vidro de relógio. .algodão. aspirar e desprezar o sobrenadante.lancetas para punção digital. homogenizar manualmente ou no vórtex 9. homogenizar o sedimento. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11. fazer esfregaços e corar com Leishman 12. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4. passar o filtrado.papel de filtro. IVY [260] 13 .- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1. sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : . passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. .

Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) .a punção é feita na polpa digital. sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 .5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “.- recomendado pela ICSH.. temperatura ambiente . 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +.PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : . DUKE [260] . embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 . com cerca de 3 – 4 mm de profundidade .descrito em 1912. descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço.4 mm de extensão em sua borda. pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre. estando mais sujeito a falsos resultados.medir a PA do paciente . ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 . a punção é feita no lóbulo da orelha.haveria melhor correlação clínica.Esfigmomanômetro adulto ou infantil .calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 . DUKE MODIFICADO . com uma incisão de +.

determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira .Tubo de hemograma (EDTA) .BM a 37 oC . até o dorso da mão = ++  >70. 2 a 4 mm = +++  incontáveis.71] MATERIAIS = .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 .TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = . deixar o tubo no BM por até 2 horas .medir com pipeta graduada o volume de soro restante . >5 mm = ++++ 17 . abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50.3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .62. no tubo original .tubos de ensaio 75 x 100 mm .após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra.colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) .banho-maria a 37 o C .calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 .pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = .após coagulação.6. descrito em 1913) = .TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5.

até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos. tubos siliconizados = 20 – 30 min. e colocar 1 mL em cada tubo.  tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 . o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min.  centrífuga de soro. VR = 19 . por inversão lenta. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) . incubar a 37 o C de minuto a minuto. e após a coagulação deste. com o menor trauma possível.TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. observar o 1º tubo .- - colher 4 – 5 mL de ST.

olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 . se não realizar imediatamente.5 – 13. centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3. pelo menos. CaCl2 solução a 0. no volume indicado no frasco. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. em tubo de hemólise .40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras.5 segundos 20 . Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3. alça de metal.00 a 1. colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo. para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1. idem TAP 2. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos.025 (pronta para uso) 17 . deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11. agitar o frasco antes do uso 2 . incubar por dois minutos também 6. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 .5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1. separar o PPP.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1. para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11. após a leitura em segundos.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1.25 M (estoque) ou a 0. a 37oC 5 . reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril.5 A 13.

cronômetro . reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3.25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2.PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1. preparar a solução de CaCl2 para uso (0. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 .025 M).amostra de ST em tubo citratado .9 a 1. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10.METODOLOGIA = 2. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1. MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= . agitar o frasco antes do uso 3.DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1.025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1. colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina . incubar por 3 minutos 7.25. mas aumentam com a mistura M2 22. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0.25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs. no volume indicado no frasco. BM a 37o C. em tubo de hemólise em BM.centrífuga de soro. se não realizar imediatamente.reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL). separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4.25 = presença de inibidor normal paciente < 1. 18 .

diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2. solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio. deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).determinado pelo fabricante. segundo o fabricante) . tubos de ensaio 5 . PPP citratado 4 . onde n é a diluição do PPP usada (10). Tampão do mesmo kit 3. centrífuga de soro 6 .2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia. . . sendo que a concentração de FIB. BM a 37o C 19 .diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos . onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K.Homogenizar suavemente antes de usar.misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. será = K x n.reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante).plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = .calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit. pré . Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 .centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) . .TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 .

ajustando o pH para 5. solução de CaCl2 M/10 = 1. 8. solução salina tamponada pH 7.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0.6. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5.2 com ácido acético a 1 % 24.5 mL de PPP + 0. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1.Método de Bloom (1961) [141]= 1. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos.3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3.7 .5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2.37 mL de CaCl2 1.C por 30 minutos 3.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0. pipetar 0. quando formar o coágulo. após o início da lise observar a cada 5 minutos. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD.1 mL de ácido acético 1 % 2. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3. Ácido acético 1 % = 0. homogenizar e incubar a 4o.62] 1.1. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1. 20 .8 M em 100 mL de AD 4. PPP citratado 2. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão. centrifugar novamente como no item b) 6.5 mL do CaCl2. cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5.94 g dietilbarbiturato de sódio 2.

Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 . . diluídos em AD qsp 10 ml 4. cuidados na coleta. Só levar em consideração os grandes encurtamentos.as variações fisiológicas são acentuadas.A heparina não precipita na fração euglobulínica .2.Método de Nilsson. Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina). segundo atividade. anotar o tempo de lise total do coágulo. incubar 37o C / 10 min.1 N.34 g 21 . disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 .025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3.9. solução de ácido acético 0. / 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min. DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1.9 – 6.O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) .30 minutos . adicionar 500 l da solução de trombina e.0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min. alimentação. tampão salina barbital pH 7.: .38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2. após a formação do coágulo. (1978) [5] = 1. descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5.1 m L de HCl 0.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24. a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs. PPP citratado mantido a 4o C 2.

5. 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3. 4. 2.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. 3. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal. na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste. desprezar e preparar outro) 6.80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80. que deve estar entre 60 .AD 1. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 .

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.6 23 .26.

e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural.2 g + AD qsp 1000 mL 4. tiras de acetato de celulose 3. e depois por 3 min.6 g + Ácido bórico 3. 9. em posição reta e esticada. embeber o acetato de celulose na solução tampão. estufa a 60 – 70o C 4. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador.. Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5. previamente. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão.6 tris-hidroxi-metilamina 10. Solução tampão tris-EDTA-borato 0. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. fazer a transparentização. 5.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex. na solução transparentizadora. em outra cuba. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba.5g + Ácido tricloroacético 5. fonte geradora de voltagem 2. 12. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min. 11.. analisar o fracionamento inicialmente sem corar. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. por pelo menos 10 – 15 min. 7. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4. 4. cubas de eletroforese.. 6. 14..0 g + AD qsp 100 mL 3. aplicador. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba. 8. a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo). Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0.2 g + EDTA 0.025 pH = 8.MATERIAIS = 1. 3. SF 0. até sua transparentização (alguns minutos). desligar a fonte. 13. 10. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min. papel de filtro ou Perfex. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. mergulhada na solução tampão. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. agitando-a cuidadosamente.

e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . para poder detectar Hb H. colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% .homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado.uso de AD é o método mais puro. 7. transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. não deve ser feita coloração nas tiras .para 100 μl de ST.: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4. ST vol. agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min. 3. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. em congelador (controles.se usado KCN. amostra com heparina ou EDTA 2. Regra Prática = Se Ht paciente vol. recentrifugar antes de usar. Ao usar hemolisados congelados. Obs. dosa-la no hemolisado. o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml . se necessário. é tecnicamente mais demorado. hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . Lavadas + dois volumes de AD.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis . adicionar um volume de clorofórmio 6.. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. desde que mantidos estéreis 10. um volume de Hc. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. 1.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra . Sol. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. está pronto para uso. não pode ser guardado. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min. ST são estáveis a 4o C. se houver a formação de precipitados no tubo.se usadas Hc não lavadas.pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas. por exemplo). as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais .se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar.

placa de Petri. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. 7. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. 4. à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. esmalte de unhas ou Entellan 3. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2. 3. pipetas 2. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5. tubos de vidro 12 x 75 mm. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. 2. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4. lâminas e lamínulas de vidro 2. preparar antes de fazer o esfregaço 2. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29.33 g + Saponina 2. em lugar fresco. 5. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33. 6. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1.50 g + AD qsp 250 mL 3. amostra de ST colhido com EDTA 1.78 g + K2HPO4 anidro 59.1.

0 – 9. acertando o zero com AD 8. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2. terminada a corrida eletroforética. agitando os tubos a cada 15 minutos 7. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6. ler. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. sem coloração. tesoura METODOLOGIA = 1.0 2. em absorbância de 415 nm.MATERIAIS = 1. deixar eluir por 2 horas. espectrofotômetro 3.0 – 3. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2.5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4.5 – 5. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4.7 % 30.5 cm de largura 5. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 .

após exatamente 1 minuto acrescentar 6. acertando o zero do aparelho com água destilada 10.0% (ADULTOS) 31.B. Pipetar 0. Ler a absorbância em 415 nm. papel de filtro Whatmann ou similar 7.083 N no tubo A 3. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8. Hidróxido de Amônio 0. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 . misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9.C.2 ml de NaOH 0.2 ml do hemolisado no tubo A.D) 2. Colocar 4 tubos em fila (A. Separar o tubo B para o filtrado 4. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C. cronômetro.8 ml de SAS 50%. espectrofotômetro 5.083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2.500 µ L 6. Pipetar inicialmente 3. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5.MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1.04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 . tubos de hemólise 13 x 100 mm. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3. Solução NaOH 0. misturar bem. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6.

1960)= 1.A.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie.43 g pois cada diminuição de 0.5 4.0 0. NaCl 1% (mL) 10 8.45 0.: é importante controlar o pH para 7.4 NaH2PO4.0 2. e trabalhar com a metade da diluição (2.30 0.0 9.35 0. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 .0 6.5 6.00 0.10 0. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7.0 1.0 4.40 0.0 conc.5 5.5 3. homogenizar por inversão 5. deixar em repouso por 30 minutos em TA 6. tubos de ensaio 3.2H2O 2.0 8.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados.5 3.5 7. misturando-se por inversão [279]) 7.0 5.5 4. NaCl(%) 1.65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0.60 0.0 4.0 10.55 0.85 0. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4. Espectrofotômetro.50 0. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. 2. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo .0 3.5 6. 90 g OBS.5 2.1 equivale a Na2HPO4 13.MATERIAIS = 1. AD.1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5.5 7.0 1. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3.0 AD (mL) 0.0 5. sem ressuspender o depósito.75 0.5 5. solução fisiológica.5 6. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%. coletar ST do paciente e controle normal 2.20 0.65 0.

7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0. sendo que a esterilidade é fundamental.55 0.19 0–9 0 0 0 0 0 2.45 0.25 0. no teste com incubação por 24 horas. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 .9 – 0. calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0.90 1.88 15 .50 0.: 1. com a inclusão de concentrações de 0.100 75 .95 36 . incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas.00 % de hemólise 100 91 – 100 90 .60 0.20 0.35 0.30 0.100 80 .75 0.70 0.30 % de NaCl) OBS. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9.100 65 .80 0. com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3. o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10.40 0.45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0.10 0.70 0 . Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32.8.100 55 .65 0. A sequência técnica é a mesma como descrito acima. não pode ser usado o EDTA.85 0. porque provoca alterações morfológicas nas Hc. Neste.40 0 .8 – 0. porém usando 17 tubos.

tubos de ensaio 17 x 100 mm 2. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %. espectrofotômetro.: . calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS. como : a) eletroforese de Hb pH 8. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3. no tubo B. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 . ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5.7 g AD qsp 1000 mL 4. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue).Outros métodos podem ser usados.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6.6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33.8 (tubo A) 2.É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes . e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6. solução tampão fosfato M/60 pH = 6.12H2O 9g KH2PO4 5. em tubo de ensaio. amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1.MATERIAIS = 1.8 (solução de estoque) Na2HPO4.8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. no tubo A. 4.

nas mesmas dosagens 3. invertendo – os delicadamente. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. incubar em BM a 37ºC por 3 horas. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1. diluir todos os tubos na proporção de 0. Solução de Glicose 0. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 . entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%. por 15 minutos 4.(G6PD) 33.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2. estável por 72 horas) 2. Solução de Azul de Metileno 0.1 mL para 10 mL de AD. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6. do vermelho ao castanho.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B. Solução de Nitrito de Sódio 0. misturar e fazer a leitura 6.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs.5 mg + AD 10 mL 4. homogenizar os tubos sem agitar. dependendo dos níveis de G6PD 34.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL. exatamente.

em BM.talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.MATERIAIS = 1. Na Doença da Hb H. + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8.8 g 100 mL 3. ler em lâmina de imersão . 33 . usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0.6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. No Traço α .4 g 0. por 1 a 2 horas 2. procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas.talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3.: 1. idem para contagem de reticulócitos 2. No Portador Silencioso de α . enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.

. colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula. .GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise... Segundo a literatura. . contra fonte de luz ou superfície iluminada.. . . 0 ausência de aglutinação.. . .. ..... . em Imunohematologia. . as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo . . . . ... A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios. podem ser lidas macroscopicamente... . ou microscopicamente. ..... 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo .. w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . . fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 .

L. Transfusion 1972. faz-se a conversão da intensidade de aglutinação.quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 . modificado por Marsh [Marsh W. Scoring of Hemaglutination.Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger. depois somados (medida semi ..12:352 – 353] . de cada diluição em valores individuais.

repetir os procedimentos 3 a 6. micropipetas de 10. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . PAI. Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. exceto para 50 Hemoterapia 36 . por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. após a última lavagem. esvaziar o tubo por inversão 6.teste de triagem sorológica 1. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor. homogenizar o botão de hemáceas 7. centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5.9% Gotas (μl) 20 (1.35. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3. tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. pipetas de Pasteur 6. pisseta com SF 0. em tubo. Cartão (GEL) Tubos . amostra de ST colhida em EDTA 2. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2.9 % 3. fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0. retirar completamente o sobrenadante OBS. Essas suspensões são usadas para Tipagem. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5. e TCD MATERIAIS : .

presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. anti-B e anti-A. TCD positivo 4. 4. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 .B 3. 3. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4. autoanticorpo anti-I 7. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. presença de rouleaux 6. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1. 4. 1. 2. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. 6. -M) 2. 7. 5. 2. amostra contaminada ou erro de identificação 3. APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. subgrupos de A ou B 5.36. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. 5. tubos de hemólise. 6. antissoros anti-A. 3.

contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. uso de antissoro errado 2. falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3. poliaglutinação. dispersando aglutinações fracas Obs. uso de antissoro errado 2. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2. ressuspender e ler. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. contaminação dos reagentes com bactérias. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. Como testemunho negativo. usar controle Rh de outro fabricante. colocar no tubo CRh. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3.2 e 3. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4. substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. Se não for possível. se aglutinação negativa. ressuspender o botão e ler. lavar cada tubo 3 vezes em salina 10. agitação forte na ressuspensão das células. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. tempo ou velocidade de centrifugação) 4. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. mas sem o anticorpo. identificar 2 tubos D e CRh 2. autoaglutinação. se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. pesquisar D fraco = repetir passos 1. tubos de hemólise. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente).37. se aglutinação negativa. proteínas anormais no soro-teste 4. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. = D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1. colocar no tubo D. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. Soro de Coombs monoespecífico 4. deve ser da mesma procedência que o anti-D. 38 .

em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário. 5. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. microscópio óptico pisseta com SF 0. centrifugar e ler 9. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1. separar o soro a testar 2. 2. 6. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. identificar os tubos I e II 3. 7. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. ressuspender e ler 39 . incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. tubos de hemólise 12 x 75 mm. 4. centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. homogenizar. centrífuga. em cada um. homogenizar. homogenizar. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8. ressuspender e ler 6. 3.38. 4. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5. 3. 5. estantes para tubos. lavar 3 vezes em salina 10. 2. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI.9 % Hc de triagem Triacell ou similar.

pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. 3.39. 3. 4. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. 2. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. 4. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. 2. após fazer a suspensão. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. lavar 6 vezes em salina. repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G. 5. centrífuga METODOLOGIA : 1.

centrífuga. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. B e O. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6. por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado. em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. pôr em freezer a – 6 / . B e O (suspeita de incompatibilidade ABO). rolar o tubo para os lados.40 . ler a olho nu e em microscópio óptico. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1. até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. rotular tubos A1. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1. Revercell B e Triacell.20o C. descongelar em BM 37o C 4. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1. entre lâmina e lamínula 41 . com objetiva 100 x. antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. deitado.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. Revercell B e Triacell ) 7.

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