ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

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23 25 27 28

36 38 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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câmara de Neubauer espelhadas .misturar por inversão.tubos de ensaio. placa de Petri. algodão B) PROCEDIMENTO . x 1 x 10 x 100 = no.ST com EDTA . . todo o quadrado central de 1 mm2). homogenizar. .BM a 37oC. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS . .contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja. preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) . tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra.pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. por 2 minutos.sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) .solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados . .PLAQ/ mm3 = no. .4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS .micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL .Leucócitos / mm3 = no.Pipetar 1000 µ L. contar todas as células dos 4 quadrados externos.tubos de hemólise. com objetiva 40x .1 x 20 = no. lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) . plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 . preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) .micropipetas de 10 µ l. x ¼ x 1/ 0. com objetiva 40 x .deixar sedimentar por 3 minutos.câmaras de Neubauer espelhadas.Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO .

Aldrich Alterações da Forma = 1. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 .20 – 11.3 – 19.5 [181] Alterações do Tamanho = 1.000 hemácias / mm3 ----------. granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) . isto é.000. MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro. indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2. Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos.55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15. > 8 – 10 μm 3.preparo do esfregaço do hemograma normal .80 plaquetas em 4. Satelitismo Plaquetário 6 .contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------. na maioria delas. achado encontrado na rara doença de Wiskott . Microplaquetas < que 2 μm. Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro.x 6.

2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A . . METODOLOGIA .7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7.pipetar 2.tubos de ensaio 75 x 100mm. a 11000 rpm / 5 min.reagente de cor (solução de Drabkin) .sangue total (ST) com EDTA . leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7.1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : . .homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 .espectrofotômetro. pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes. de 5 mL B .5 mL da solução de Drabkin em tubo.lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar . MATERIAIS . .tubo capilar para microhematócrito .solução de Hb padrão comercial .ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) .micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro.Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa. sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.

2 [181] 7.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc. em objetiva de 100x.Calculado o Fator.8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = . faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7. onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .96 µ m3 ou 82.5 – 97. .óleo de imersão TÉCNICA = .Microcitose .32 pg(10-12) 26.4 – 32. volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 .olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço .lâmina de hemograma corada.Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 .3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média.4 [181] 7.Macrocitose . de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 .4 – 33. exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço. em peso. observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço.

campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e .lâminas de vidro 24 x 76 mm.solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio.colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise .- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= . tubos de hemólise .micropipetas de 20 µ L . com objetiva de 100. marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço.deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos .amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C .ressuspender com agitação suave. 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= . ao mesmo tempo.

Os estudos de ferrocinética de Hillman .0 10 . Ht (%) Index (dias) > 40% 1. os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais. que é diretamente proporcional ao grau de anemia.20 % 2. mostraram que.0 30 .observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 . em 1985. e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) .30 % 2. além da correção pela anemia.150.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta.passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão). olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra . em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS .5 20 .8 – 1 % das Hc / dia.feito o esfregaço corado com Leishman . o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias). há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0.000 Hc / mm3 y Ret RET = 124. quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia.EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente.40 % 1.

7. com suas próprias funções.Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado .Reação Leuco-Eritroblástica .62. Por convenção.Hipossegmentação Nuclear . não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2.Granulações Tóxicas .Hipogranulações Citoplasmáticas .Neutropenia ou Neutrocitopenia . mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças.Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) .Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro.NO necrobióticos . / mm3) ou relativa (%).4. porque cada tipo celular é um sistema separado.Vacuolizações 11 . isto é.Neutrofilia ou Neutrocitose .481] .Reação Leucemóide .em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos. podendo ser absoluta (no.Hiato Leucêmico . anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO .em valores absolutos : x células / mm3 . (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = .

Homogenizar a amostra e encher. até a marca superior 0.Monocitose . 12 .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS . com auxílio da pera.Eosinofilia .Inclusões Anormais .Linfócitos Atípicos .Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen.Linfopenia ou Linfocitopenia .Monocitopenia .Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS . a pipeta de Westergreen.Basofilia .Eosinopenia ou Anaeosinofilia .Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS .Linfocitose .Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas . pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = .

recolhido em vidro de relógio. para um tubo B. IVY [260] 13 . passar o filtrado. reservar 3. deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2.algodão. . fazer esfregaços e corar com Leishman 12.cronômetro . álcool para antissepsia . passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. . homogenizar manualmente ou no vórtex 9. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7.lancetas para punção digital.esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 . e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6. sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : . colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11. homogenizar o sedimento.- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1. aspirar e desprezar o sobrenadante. sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%). contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%). 10. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4./5000 rpm.papel de filtro.

estando mais sujeito a falsos resultados..medir a PA do paciente . 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +.5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “. pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre.a punção é feita na polpa digital. temperatura ambiente .PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : . DUKE MODIFICADO .- recomendado pela ICSH. com uma incisão de +.4 mm de extensão em sua borda. embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 .Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) . DUKE [260] . sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 .Esfigmomanômetro adulto ou infantil .haveria melhor correlação clínica.calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 .descrito em 1912. descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço. ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 . a punção é feita no lóbulo da orelha. com cerca de 3 – 4 mm de profundidade .

identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 . deixar o tubo no BM por até 2 horas .TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = . >5 mm = ++++ 17 .pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .62.71] MATERIAIS = .banho-maria a 37 o C .tubos de ensaio 75 x 100 mm .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .BM a 37 oC .Tubo de hemograma (EDTA) .após coagulação.colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) . 2 a 4 mm = +++  incontáveis. descrito em 1913) = .3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados . até o dorso da mão = ++  >70. no tubo original .TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5.após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra. abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50.medir com pipeta graduada o volume de soro restante .6.calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 .determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira .

TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos. e colocar 1 mL em cada tubo. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) . observar o 1º tubo . incubar a 37 o C de minuto a minuto. e após a coagulação deste.  centrífuga de soro. VR = 19 .  tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 .- - colher 4 – 5 mL de ST. tubos siliconizados = 20 – 30 min. com o menor trauma possível. o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min. por inversão lenta.

40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras.5 A 13. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril.25 M (estoque) ou a 0.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 . deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 .5 segundos 20 . centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3.5 – 13.025 (pronta para uso) 17 . alça de metal. em tubo de hemólise . idem TAP 2. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11. após a leitura em segundos. se não realizar imediatamente.5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1. colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo. agitar o frasco antes do uso 2 . para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11. no volume indicado no frasco. olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE. CaCl2 solução a 0.00 a 1. separar o PPP. pelo menos. para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1. a 37oC 5 . Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. incubar por dois minutos também 6. Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3.

fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2.25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras. agitar o frasco antes do uso 3. colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina . reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6. 18 . acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0. MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= .025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0.25 = presença de inibidor normal paciente < 1. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4. mas aumentam com a mistura M2 22. BM a 37o C.METODOLOGIA = 2. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5. no volume indicado no frasco. cronômetro .25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 .reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL). proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10. em tubo de hemólise em BM.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1.centrífuga de soro.025 M). se não realizar imediatamente.DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1. incubar por 3 minutos 7.25.PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1.amostra de ST em tubo citratado . preparar a solução de CaCl2 para uso (0.9 a 1.

deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR). onde n é a diluição do PPP usada (10). pré . Tampão do mesmo kit 3. .TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 . . . tubos de ensaio 5 .2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia. PPP citratado 4 . sendo que a concentração de FIB. centrífuga de soro 6 .plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = . será = K x n.Homogenizar suavemente antes de usar. segundo o fabricante) . diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2.reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante). BM a 37o C 19 .calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit.determinado pelo fabricante.centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio. onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K.misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 .diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos .

cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5.37 mL de CaCl2 1.5 mL do CaCl2. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0.1 mL de ácido acético 1 % 2.1.2 com ácido acético a 1 % 24. quando formar o coágulo. homogenizar e incubar a 4o.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0. centrifugar novamente como no item b) 6. Ácido acético 1 % = 0.62] 1.8 M em 100 mL de AD 4. 8.6. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3. PPP citratado 2. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4.7 . 20 .5 mL de PPP + 0.5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos. pipetar 0.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4.C por 30 minutos 3. ajustando o pH para 5. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1. após o início da lise observar a cada 5 minutos. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6.Método de Bloom (1961) [141]= 1. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5.3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1. solução de CaCl2 M/10 = 1. solução salina tamponada pH 7. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5.94 g dietilbarbiturato de sódio 2.

disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 . cuidados na coleta.as variações fisiológicas são acentuadas.9. PPP citratado mantido a 4o C 2.2. DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1.Método de Nilsson.1 m L de HCl 0. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5. anotar o tempo de lise total do coágulo. Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina).34 g 21 . descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24. a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs. . / 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min.O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) . diluídos em AD qsp 10 ml 4. (1978) [5] = 1.A heparina não precipita na fração euglobulínica .0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min.: . incubar 37o C / 10 min. Só levar em consideração os grandes encurtamentos. tampão salina barbital pH 7.38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2.Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 . segundo atividade. adicionar 500 l da solução de trombina e. solução de ácido acético 0.025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3. alimentação.1 N.30 minutos . após a formação do coágulo.9 – 6.

4. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 . que deve estar entre 60 . 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3.80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80. desprezar e preparar outro) 6. 3.AD 1. 5. 2.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste.

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.6 23 .26.

7. mergulhada na solução tampão. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba.2 g + EDTA 0. em posição reta e esticada.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1.0 g + AD qsp 100 mL 3. 12. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão. Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5..5g + Ácido tricloroacético 5.MATERIAIS = 1. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida. fazer a transparentização. estufa a 60 – 70o C 4. cubas de eletroforese. 6.6 g + Ácido bórico 3.6 tris-hidroxi-metilamina 10. por pelo menos 10 – 15 min. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0.. SF 0. Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4. 13. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural. desligar a fonte. e depois por 3 min. a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo). tiras de acetato de celulose 3. em outra cuba.025 pH = 8. 11.. 10. aplicador. até sua transparentização (alguns minutos). 3. fonte geradora de voltagem 2. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min.2 g + AD qsp 1000 mL 4. 4. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba. 14. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. agitando-a cuidadosamente. previamente.. 9. na solução transparentizadora. Solução tampão tris-EDTA-borato 0. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. papel de filtro ou Perfex. embeber o acetato de celulose na solução tampão. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador. 8. 5. analisar o fracionamento inicialmente sem corar. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex.

se usadas Hc não lavadas. se necessário. as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais .pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas. o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml ..: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. está pronto para uso. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis . colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% .: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. se houver a formação de precipitados no tubo. não deve ser feita coloração nas tiras . Lavadas + dois volumes de AD. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4. 3. desde que mantidos estéreis 10. 7. em congelador (controles. Regra Prática = Se Ht paciente vol. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. para poder detectar Hb H.uso de AD é o método mais puro. não pode ser guardado. por exemplo). transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. Sol. um volume de Hc. e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . dosa-la no hemolisado. adicionar um volume de clorofórmio 6. Ao usar hemolisados congelados.se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. 1. ST são estáveis a 4o C. hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . ST vol. Obs. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar. amostra com heparina ou EDTA 2. agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min. é tecnicamente mais demorado. recentrifugar antes de usar.se usado KCN.homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra .para 100 μl de ST. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min.

33 g + Saponina 2. pipetas 2. em lugar fresco. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. 2. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. 5. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. 4.78 g + K2HPO4 anidro 59. à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1. tubos de vidro 12 x 75 mm.1. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. lâminas e lamínulas de vidro 2. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33. esmalte de unhas ou Entellan 3. amostra de ST colhido com EDTA 1. 3. 7. placa de Petri. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4. preparar antes de fazer o esfregaço 2. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . 6.50 g + AD qsp 250 mL 3.

preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 .5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4. tesoura METODOLOGIA = 1.0 2. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais. agitando os tubos a cada 15 minutos 7. ler.7 % 30. em absorbância de 415 nm. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2.0 – 9. deixar eluir por 2 horas. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. terminada a corrida eletroforética. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2. sem coloração.5 – 5. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos. acertando o zero com AD 8.MATERIAIS = 1.5 cm de largura 5.0 – 3. espectrofotômetro 3.

D) 2. Separar o tubo B para o filtrado 4. tubos de hemólise 13 x 100 mm. após exatamente 1 minuto acrescentar 6. acertando o zero do aparelho com água destilada 10. Colocar 4 tubos em fila (A. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 .C.8 ml de SAS 50%. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1.500 µ L 6. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C. cronômetro.2 ml de NaOH 0.083 N no tubo A 3.083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2.2 ml do hemolisado no tubo A. Pipetar 0. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8.MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1. espectrofotômetro 5. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 . Hidróxido de Amônio 0. misturar bem. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6.0% (ADULTOS) 31. misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9. papel de filtro Whatmann ou similar 7. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5.04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4.B. Solução NaOH 0. Ler a absorbância em 415 nm. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7. Pipetar inicialmente 3.

5 7.0 10. homogenizar por inversão 5.30 0.0 9.43 g pois cada diminuição de 0. coletar ST do paciente e controle normal 2.5 4. AD.65 0. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo.: é importante controlar o pH para 7.0 3. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 .MATERIAIS = 1. 1960)= 1.5 6.4 NaH2PO4.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P.A. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie.65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0.5 3.45 0.5 4.0 4.5 5.20 0.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.1 equivale a Na2HPO4 13. misturando-se por inversão [279]) 7.0 AD (mL) 0. 2. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4.5 2.40 0. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7.0 4.00 0. NaCl(%) 1.0 1.75 0.2H2O 2. tubos de ensaio 3.0 5.35 0.50 0.85 0. NaCl 1% (mL) 10 8. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%. 90 g OBS.5 3. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo .5 7.0 1.60 0.0 0.55 0. solução fisiológica.5 5.0 2. Espectrofotômetro.5 6. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3.0 conc.1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5. deixar em repouso por 30 minutos em TA 6. sem ressuspender o depósito. e trabalhar com a metade da diluição (2.0 5.10 0.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados.0 8.0 6.5 6.

25 0.100 55 .100 80 . DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 . incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas. no teste com incubação por 24 horas.70 0.35 0. A sequência técnica é a mesma como descrito acima.80 0. sendo que a esterilidade é fundamental.100 75 . o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9.75 0.88 15 .85 0.100 65 .00 % de hemólise 100 91 – 100 90 . porque provoca alterações morfológicas nas Hc.8 – 0.45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0.45 0.20 0.10 0. Neste. não pode ser usado o EDTA. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado.95 36 . porém usando 17 tubos.70 0 .: 1.55 0.30 % de NaCl) OBS. com a inclusão de concentrações de 0.8.30 0.60 0. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32.40 0 . calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0.9 – 0.65 0. com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3.19 0–9 0 0 0 0 0 2. o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10.50 0.40 0.7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0.90 1.

pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3. ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5.8 (tubo A) 2. espectrofotômetro. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue).8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. no tubo A.6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33.Outros métodos podem ser usados. 4. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2. tubos de ensaio 17 x 100 mm 2.É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes . DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 .MATERIAIS = 1.8 (solução de estoque) Na2HPO4. como : a) eletroforese de Hb pH 8.12H2O 9g KH2PO4 5. e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3. em tubo de ensaio. calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS. solução tampão fosfato M/60 pH = 6.7 g AD qsp 1000 mL 4. no tubo B.: . solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %.

diluir todos os tubos na proporção de 0. incubar em BM a 37ºC por 3 horas.5 mg + AD 10 mL 4. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%. estável por 72 horas) 2. dependendo dos níveis de G6PD 34. entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável. exatamente.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. homogenizar os tubos sem agitar.1 mL para 10 mL de AD. invertendo – os delicadamente. misturar e fazer a leitura 6. Solução de Nitrito de Sódio 0. nas mesmas dosagens 3.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3. Solução de Glicose 0. Solução de Azul de Metileno 0. por 15 minutos 4. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5. do vermelho ao castanho. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 . colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC.(G6PD) 33.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6.

talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2.: 1. por 1 a 2 horas 2. 33 . usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1.8 g 100 mL 3. Na Doença da Hb H. + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8. idem para contagem de reticulócitos 2.talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3. procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas. No Traço α . em BM. No Portador Silencioso de α . incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.MATERIAIS = 1. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0.6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. ler em lâmina de imersão . enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.4 g 0.

Segundo a literatura. . . . 0 ausência de aglutinação. . . A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios.. . .. . .. colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula... w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . . contra fonte de luz ou superfície iluminada. . as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo .. . .. .. .. 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo ... podem ser lidas macroscopicamente. fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 . ...... ou microscopicamente... em Imunohematologia.GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise. .

depois somados (medida semi . faz-se a conversão da intensidade de aglutinação. de cada diluição em valores individuais.Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger.12:352 – 353] . modificado por Marsh [Marsh W. Scoring of Hemaglutination. Transfusion 1972..quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 .L.

pisseta com SF 0. em tubo.9% Gotas (μl) 20 (1. homogenizar o botão de hemáceas 7. repetir os procedimentos 3 a 6. Essas suspensões são usadas para Tipagem. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . e TCD MATERIAIS : . por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8. centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5. pipetas de Pasteur 6.9 % 3. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5.35. micropipetas de 10. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor. Cartão (GEL) Tubos .teste de triagem sorológica 1. exceto para 50 Hemoterapia 36 . fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0. amostra de ST colhida em EDTA 2. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4. esvaziar o tubo por inversão 6. após a última lavagem. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3. retirar completamente o sobrenadante OBS. tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%. PAI.

3. presença de rouleaux 6. 5. -M) 2. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. anti-B e anti-A. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 .36. TCD positivo 4. 2. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1. tubos de hemólise. 1. APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. subgrupos de A ou B 5. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. 4. antissoros anti-A. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. 2. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4.B 3. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. autoanticorpo anti-I 7. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. 5. amostra contaminada ou erro de identificação 3. 4. 6. 7. 6. 3.

acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11. se aglutinação negativa. Se não for possível. proteínas anormais no soro-teste 4. tempo ou velocidade de centrifugação) 4.2 e 3. Como testemunho negativo. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. identificar 2 tubos D e CRh 2. se aglutinação negativa. ressuspender o botão e ler. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3.37. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3. colocar no tubo D. contaminação dos reagentes com bactérias. autoaglutinação. dispersando aglutinações fracas Obs. falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3. 38 .: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D. usar controle Rh de outro fabricante. deve ser da mesma procedência que o anti-D. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. mas sem o anticorpo. tubos de hemólise. uso de antissoro errado 2. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente). se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. Soro de Coombs monoespecífico 4. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS. substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. uso de antissoro errado 2. colocar no tubo CRh. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. agitação forte na ressuspensão das células. pesquisar D fraco = repetir passos 1. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4. lavar cada tubo 3 vezes em salina 10. = D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1. poliaglutinação. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. ressuspender e ler.

para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1.9 % Hc de triagem Triacell ou similar. centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. 3. 5. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI. incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. homogenizar. em cada um. 5. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. ressuspender e ler 6. centrifugar e ler 9. centrífuga. 2. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. estantes para tubos. 4. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. microscópio óptico pisseta com SF 0. em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário.38. separar o soro a testar 2. ressuspender e ler 39 . adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. 7. homogenizar. homogenizar. tubos de hemólise 12 x 75 mm. 4. 2. 3. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8. identificar os tubos I e II 3. lavar 3 vezes em salina 10. 6. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5.

39. 2. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. após fazer a suspensão. 2. 3. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G. 5. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. centrífuga METODOLOGIA : 1. lavar 6 vezes em salina. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . 3. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. 4. 4. antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise.

20o C. ler a olho nu e em microscópio óptico. B e O. rolar o tubo para os lados. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1. pôr em freezer a – 6 / . antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. descongelar em BM 37o C 4. entre lâmina e lamínula 41 . por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado. rotular tubos A1. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6. Revercell B e Triacell. Revercell B e Triacell ) 7. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1. centrífuga. até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio. com objetiva 100 x. deitado. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1.40 . B e O (suspeita de incompatibilidade ABO).

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