ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

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23 25 27 28

36 38 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS . tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra. .1 x 20 = no. com objetiva 40 x .micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL .micropipetas de 10 µ l.câmara de Neubauer espelhadas . placa de Petri.PLAQ/ mm3 = no.Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO . Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS .câmaras de Neubauer espelhadas. algodão B) PROCEDIMENTO . . .ST com EDTA . x ¼ x 1/ 0.solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados . lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) . com objetiva 40x . homogenizar.pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. todo o quadrado central de 1 mm2). x 1 x 10 x 100 = no. preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) .sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) .Pipetar 1000 µ L. contar todas as células dos 4 quadrados externos.deixar sedimentar por 3 minutos. . por 2 minutos. preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) .contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja.BM a 37oC. plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 .misturar por inversão. .tubos de hemólise.Leucócitos / mm3 = no.tubos de ensaio.

MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro.x 6. Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos.preparo do esfregaço do hemograma normal . Microplaquetas < que 2 μm.Aldrich Alterações da Forma = 1.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) . > 8 – 10 μm 3. granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6.5 [181] Alterações do Tamanho = 1. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 . isto é.000 hemácias / mm3 ----------. na maioria delas.3 – 19. indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2.80 plaquetas em 4.contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------.20 – 11. achado encontrado na rara doença de Wiskott .55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15. Satelitismo Plaquetário 6 . Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro.000.

solução de Hb padrão comercial .7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7. leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7.sangue total (ST) com EDTA .micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro.ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) .1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : .lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar .pipetar 2.2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A .empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 . de 5 mL B . sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa. METODOLOGIA . .reagente de cor (solução de Drabkin) . MATERIAIS .tubo capilar para microhematócrito . pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes. .tubos de ensaio 75 x 100mm.5 mL da solução de Drabkin em tubo. a 11000 rpm / 5 min. .espectrofotômetro.

Calculado o Fator.lâmina de hemograma corada.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média. volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 . em peso.óleo de imersão TÉCNICA = .4 [181] 7. de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 . observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço.5 – 97. em objetiva de 100x.2 [181] 7.olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço .Macrocitose .32 pg(10-12) 26. faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7. exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht.Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 .4 – 32.96 µ m3 ou 82.Microcitose .8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = . .4 – 33. onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço.

marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 . tubos de hemólise .- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= .micropipetas de 20 µ L . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço.amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C .colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise .ressuspender com agitação suave. campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e .lâminas de vidro 24 x 76 mm. com objetiva de 100.solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio. ao mesmo tempo. 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= .deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos .

em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4. em 1985.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta. olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra .observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 . Os estudos de ferrocinética de Hillman . há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0. que é diretamente proporcional ao grau de anemia.EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente.passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão).000 Hc / mm3 y Ret RET = 124. quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS .8 – 1 % das Hc / dia.5 20 .0 30 .20 % 2.30 % 2.feito o esfregaço corado com Leishman . o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias). e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) .150. Ht (%) Index (dias) > 40% 1.0 10 . os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais. além da correção pela anemia. mostraram que.40 % 1.

isto é.62. / mm3) ou relativa (%).Reação Leucemóide . Por convenção.4.7.481] .Hipossegmentação Nuclear . podendo ser absoluta (no.Granulações Tóxicas .Vacuolizações 11 .NO necrobióticos .Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) .Reação Leuco-Eritroblástica .em valores absolutos : x células / mm3 . com suas próprias funções.Hipogranulações Citoplasmáticas . não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2. porque cada tipo celular é um sistema separado.Hiato Leucêmico .Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro.Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado .Neutropenia ou Neutrocitopenia .Neutrofilia ou Neutrocitose . mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças.em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos. anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO . (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = .

Homogenizar a amostra e encher.Linfocitose .Eosinopenia ou Anaeosinofilia . com auxílio da pera.Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen. pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS . a pipeta de Westergreen.Monocitopenia . 12 .Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS .Eosinofilia .Basofilia .Inclusões Anormais .Linfócitos Atípicos . até a marca superior 0.Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .Linfopenia ou Linfocitopenia .Monocitose .Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS .

reservar 3. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4.papel de filtro. fazer esfregaços e corar com Leishman 12. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7. aspirar e desprezar o sobrenadante. homogenizar manualmente ou no vórtex 9.cronômetro .- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. recolhido em vidro de relógio. passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. para um tubo B. IVY [260] 13 . .esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 . separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. álcool para antissepsia . 10. sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : ./5000 rpm. contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%). deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x.algodão. .lancetas para punção digital. sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%). passar o filtrado. e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6. homogenizar o sedimento.

ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 .calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 . DUKE [260] . temperatura ambiente .5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “. a punção é feita no lóbulo da orelha.Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) . sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 .a punção é feita na polpa digital. com uma incisão de +. DUKE MODIFICADO .haveria melhor correlação clínica. com cerca de 3 – 4 mm de profundidade . estando mais sujeito a falsos resultados. pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre.PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : .Esfigmomanômetro adulto ou infantil .- recomendado pela ICSH.4 mm de extensão em sua borda. embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 . 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +.medir a PA do paciente .descrito em 1912. descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço..

3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados .BM a 37 oC .medir com pipeta graduada o volume de soro restante .após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra. deixar o tubo no BM por até 2 horas . descrito em 1913) = .tubos de ensaio 75 x 100 mm .colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) .Tubo de hemograma (EDTA) . >5 mm = ++++ 17 . 2 a 4 mm = +++  incontáveis.TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = .identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 .6. abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50. no tubo original .71] MATERIAIS = .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5. até o dorso da mão = ++  >70.banho-maria a 37 o C .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira .após coagulação.calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 .pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = .62.

 tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 . observar o 1º tubo . com o menor trauma possível. e após a coagulação deste. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) . por inversão lenta.TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. e colocar 1 mL em cada tubo. até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos. incubar a 37 o C de minuto a minuto. o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min. tubos siliconizados = 20 – 30 min.- - colher 4 – 5 mL de ST.  centrífuga de soro. VR = 19 .

deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11. CaCl2 solução a 0. separar o PPP. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 .25 M (estoque) ou a 0.025 (pronta para uso) 17 . para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 . se não realizar imediatamente. Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3.40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras. olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE. no volume indicado no frasco.5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1.5 – 13. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril.00 a 1. em tubo de hemólise . colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo. incubar por dois minutos também 6. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1. agitar o frasco antes do uso 2 .5 A 13. a 37oC 5 . idem TAP 2.5 segundos 20 . após a leitura em segundos. centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. pelo menos.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1. alça de metal. para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1.

acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. se não realizar imediatamente. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4.25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6. em tubo de hemólise em BM. BM a 37o C. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3.025 M). fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2.025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1.amostra de ST em tubo citratado .centrífuga de soro.METODOLOGIA = 2.25 = presença de inibidor normal paciente < 1.PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1. no volume indicado no frasco. mas aumentam com a mistura M2 22. MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= .9 a 1. 18 . incubar por 3 minutos 7. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5. preparar a solução de CaCl2 para uso (0. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 .25.DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1. agitar o frasco antes do uso 3.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1. cronômetro . colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina . fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril.25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras.reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL).

PPP citratado 4 . Tampão do mesmo kit 3. BM a 37o C 19 .reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante). . centrífuga de soro 6 . . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio. será = K x n.calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit. pré . sendo que a concentração de FIB.TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 . Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 . diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2. tubos de ensaio 5 . onde n é a diluição do PPP usada (10).misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K.determinado pelo fabricante.Homogenizar suavemente antes de usar. deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia.plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = .centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) .diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos . segundo o fabricante) . .

colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4. homogenizar e incubar a 4o. centrifugar novamente como no item b) 6.62] 1. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1. 8. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6. quando formar o coágulo.5 mL de PPP + 0.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5.Método de Bloom (1961) [141]= 1.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3. ajustando o pH para 5.C por 30 minutos 3. pipetar 0.94 g dietilbarbiturato de sódio 2. 20 . colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3.3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1. PPP citratado 2.1.5 mL do CaCl2. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0. cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5.5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1.37 mL de CaCl2 1. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0.1 mL de ácido acético 1 % 2.8 M em 100 mL de AD 4. solução de CaCl2 M/10 = 1. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos.6. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0.2 com ácido acético a 1 % 24. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão. após o início da lise observar a cada 5 minutos. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4. Ácido acético 1 % = 0.7 . solução salina tamponada pH 7.

/ 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min.9 – 6. PPP citratado mantido a 4o C 2.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24.0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min. diluídos em AD qsp 10 ml 4. incubar 37o C / 10 min. descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml. a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs.1 N.38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2. tampão salina barbital pH 7.A heparina não precipita na fração euglobulínica . Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina).9. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5. alimentação. .34 g 21 .O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) . (1978) [5] = 1.30 minutos .Método de Nilsson. após a formação do coágulo.: . cuidados na coleta.1 m L de HCl 0. disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 . anotar o tempo de lise total do coágulo. Só levar em consideração os grandes encurtamentos. segundo atividade.025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3.as variações fisiológicas são acentuadas. DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1. adicionar 500 l da solução de trombina e.2. solução de ácido acético 0.Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 .

AD 1. 2. 4. na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal. 3. desprezar e preparar outro) 6.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 .80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80. 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3. 5. que deve estar entre 60 .

6 23 . ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.26.

mergulhada na solução tampão. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min. 6. Solução tampão tris-EDTA-borato 0.. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. cubas de eletroforese.. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min.5g + Ácido tricloroacético 5. e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural. Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4.6 g + Ácido bórico 3.6 tris-hidroxi-metilamina 10. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. fazer a transparentização. 10. 3. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C. 13.MATERIAIS = 1. agitando-a cuidadosamente. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. analisar o fracionamento inicialmente sem corar.. fonte geradora de voltagem 2. a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo). 14. tiras de acetato de celulose 3. 9. SF 0. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex. desligar a fonte. por pelo menos 10 – 15 min. Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0.2 g + EDTA 0. 5.2 g + AD qsp 1000 mL 4. embeber o acetato de celulose na solução tampão. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba. 12. na solução transparentizadora. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador. e depois por 3 min. aplicador.. até sua transparentização (alguns minutos). 11. estufa a 60 – 70o C 4. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida. em outra cuba. papel de filtro ou Perfex. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão. 8. Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1. em posição reta e esticada.0 g + AD qsp 100 mL 3.025 pH = 8. 4. 7. previamente.

para poder detectar Hb H.para 100 μl de ST. é tecnicamente mais demorado.homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado. 1. o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml . Lavadas + dois volumes de AD. transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. em congelador (controles. não deve ser feita coloração nas tiras .se usado KCN. desde que mantidos estéreis 10. não pode ser guardado. as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais . Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb. hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min..: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. Sol. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar. recentrifugar antes de usar.uso de AD é o método mais puro. 7. amostra com heparina ou EDTA 2. Obs. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. ST são estáveis a 4o C. 3. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. Regra Prática = Se Ht paciente vol. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. se necessário. por exemplo).pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas. Ao usar hemolisados congelados. ST vol. colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% .: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%.se usadas Hc não lavadas. e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . um volume de Hc. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4. está pronto para uso. se houver a formação de precipitados no tubo. adicionar um volume de clorofórmio 6. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis .se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. dosa-la no hemolisado.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra .

4. 5. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1.33 g + Saponina 2. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5. tubos de vidro 12 x 75 mm. placa de Petri. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. esmalte de unhas ou Entellan 3.50 g + AD qsp 250 mL 3. pipetas 2. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. 7. à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . em lugar fresco. amostra de ST colhido com EDTA 1. 6. 3. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33.1. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4.78 g + K2HPO4 anidro 59. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. 2. lâminas e lamínulas de vidro 2. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29. preparar antes de fazer o esfregaço 2.

acertando o zero com AD 8. terminada a corrida eletroforética. em absorbância de 415 nm. tesoura METODOLOGIA = 1.5 cm de largura 5. sem coloração. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6.MATERIAIS = 1.5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4. agitando os tubos a cada 15 minutos 7.0 – 3. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4.7 % 30.5 – 5. ler.0 – 9. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2. espectrofotômetro 3.0 2. deixar eluir por 2 horas. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 .

misturar bem.D) 2.8 ml de SAS 50%. cronômetro. espectrofotômetro 5.083 N no tubo A 3. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5. papel de filtro Whatmann ou similar 7. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3. Pipetar 0. Separar o tubo B para o filtrado 4.0% (ADULTOS) 31. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C.500 µ L 6.04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4. Solução NaOH 0.C. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7.2 ml do hemolisado no tubo A.B. Colocar 4 tubos em fila (A. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 .083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6. acertando o zero do aparelho com água destilada 10. misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 . Ler a absorbância em 415 nm. Hidróxido de Amônio 0.MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8. após exatamente 1 minuto acrescentar 6. tubos de hemólise 13 x 100 mm.2 ml de NaOH 0. Pipetar inicialmente 3.

0 2.0 5. 1960)= 1. tubos de ensaio 3. deixar em repouso por 30 minutos em TA 6.5 5. solução fisiológica. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo .1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5. NaCl 1% (mL) 10 8.4 NaH2PO4. NaCl(%) 1.0 10.2H2O 2.0 4.1 equivale a Na2HPO4 13.60 0.5 5.0 9. AD.65 0.5 6.0 6.MATERIAIS = 1. misturando-se por inversão [279]) 7. e trabalhar com a metade da diluição (2.5 7.0 0. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie. sem ressuspender o depósito.20 0.43 g pois cada diminuição de 0. 90 g OBS.0 conc.5 6.0 4.5 4.0 3.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P.00 0.55 0.0 1.5 3.30 0.0 5. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%.75 0.0 AD (mL) 0.5 2.45 0. homogenizar por inversão 5.5 4.40 0. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo.0 1.5 6. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 .65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3.A.85 0. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4. coletar ST do paciente e controle normal 2. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7. Espectrofotômetro.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.50 0.10 0.5 3.35 0.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados.0 8.: é importante controlar o pH para 7. 2.5 7.

30 % de NaCl) OBS.50 0. Neste.: 1.00 % de hemólise 100 91 – 100 90 .75 0.25 0. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado. A sequência técnica é a mesma como descrito acima.70 0.100 65 .8.70 0 .90 1.20 0.19 0–9 0 0 0 0 0 2.30 0.65 0.9 – 0. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 .85 0.100 80 . com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3.8 – 0. com a inclusão de concentrações de 0. não pode ser usado o EDTA.10 0.40 0.95 36 .80 0. porém usando 17 tubos.45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0. incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas.45 0.88 15 .100 75 . sendo que a esterilidade é fundamental.40 0 . porque provoca alterações morfológicas nas Hc.7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0.100 55 . o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10. no teste com incubação por 24 horas.60 0.35 0. calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0.55 0. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32.

6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33.: . em tubo de ensaio.8 (solução de estoque) Na2HPO4.8 (tubo A) 2. espectrofotômetro.8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. solução tampão fosfato M/60 pH = 6. no tubo B. tubos de ensaio 17 x 100 mm 2. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %. calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS. 4.7 g AD qsp 1000 mL 4.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6.Outros métodos podem ser usados. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3.MATERIAIS = 1. e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6. ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5. como : a) eletroforese de Hb pH 8.12H2O 9g KH2PO4 5. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue).É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes . DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 . amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3. no tubo A.

exatamente. Solução de Azul de Metileno 0. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC. nas mesmas dosagens 3. homogenizar os tubos sem agitar.(G6PD) 33.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs. diluir todos os tubos na proporção de 0. misturar e fazer a leitura 6. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 . Solução de Glicose 0. entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3. dependendo dos níveis de G6PD 34. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%. do vermelho ao castanho. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6. por 15 minutos 4. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. incubar em BM a 37ºC por 3 horas. invertendo – os delicadamente. estável por 72 horas) 2.1 mL para 10 mL de AD. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1. Solução de Nitrito de Sódio 0.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1.5 mg + AD 10 mL 4.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1.

talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0. 33 . + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8.talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2. em BM. idem para contagem de reticulócitos 2. por 1 a 2 horas 2. ler em lâmina de imersão . procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas. usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1. tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.MATERIAIS = 1. enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.: 1.8 g 100 mL 3. No Portador Silencioso de α . incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. No Traço α .6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. Na Doença da Hb H.4 g 0.

fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 . . . . colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula.GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise. em Imunohematologia. .. 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo ... . ... . .. ou microscopicamente. . . . contra fonte de luz ou superfície iluminada...... podem ser lidas macroscopicamente. .. . A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios.. .... 0 ausência de aglutinação. . Segundo a literatura.. . w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo .. .

12:352 – 353] . depois somados (medida semi . Transfusion 1972.quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 .L. faz-se a conversão da intensidade de aglutinação. de cada diluição em valores individuais. modificado por Marsh [Marsh W. Scoring of Hemaglutination..Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger.

9% Gotas (μl) 20 (1. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%. fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . repetir os procedimentos 3 a 6. amostra de ST colhida em EDTA 2. retirar completamente o sobrenadante OBS.35. pipetas de Pasteur 6. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5. micropipetas de 10. tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. Cartão (GEL) Tubos . centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5. por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8.9 % 3.teste de triagem sorológica 1. Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. pisseta com SF 0. exceto para 50 Hemoterapia 36 . e TCD MATERIAIS : . após a última lavagem. Essas suspensões são usadas para Tipagem. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3. PAI. homogenizar o botão de hemáceas 7. em tubo. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2. esvaziar o tubo por inversão 6. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4.

presença de rouleaux 6. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. amostra contaminada ou erro de identificação 3. 2.B 3. -M) 2. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4. autoanticorpo anti-I 7. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1. APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. anti-B e anti-A. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. tubos de hemólise. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 . 5. antissoros anti-A. 1.36. 6. 5. 4. 3. 6. 2. subgrupos de A ou B 5. 7. TCD positivo 4. 4. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. 3.

acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11. Soro de Coombs monoespecífico 4. dispersando aglutinações fracas Obs. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D. usar controle Rh de outro fabricante. substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1. se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. colocar no tubo D. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente).37. agitação forte na ressuspensão das células. identificar 2 tubos D e CRh 2. ressuspender o botão e ler. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. deve ser da mesma procedência que o anti-D. autoaglutinação. 38 . poliaglutinação. se aglutinação negativa. = D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1.2 e 3. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. proteínas anormais no soro-teste 4. ressuspender e ler. Como testemunho negativo. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4. Se não for possível. se aglutinação negativa. uso de antissoro errado 2. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2. uso de antissoro errado 2. mas sem o anticorpo. lavar cada tubo 3 vezes em salina 10. pesquisar D fraco = repetir passos 1. colocar no tubo CRh. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3. tubos de hemólise. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. tempo ou velocidade de centrifugação) 4. contaminação dos reagentes com bactérias. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS.

homogenizar. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8. 2. centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. 3. separar o soro a testar 2. incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. 2. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. centrífuga. 5. 4. centrifugar e ler 9. tubos de hemólise 12 x 75 mm. homogenizar.9 % Hc de triagem Triacell ou similar. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. microscópio óptico pisseta com SF 0. estantes para tubos. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI. em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário. para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1. em cada um.38. 3. 6. ressuspender e ler 39 . 7. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5. lavar 3 vezes em salina 10. homogenizar. ressuspender e ler 6. identificar os tubos I e II 3. 4. 5.

4. pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . 3.39. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. centrífuga METODOLOGIA : 1. 3. 2. lavar 6 vezes em salina. 4. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. após fazer a suspensão. 2. repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise. 5.

por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado. ler a olho nu e em microscópio óptico. antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1. deitado. B e O (suspeita de incompatibilidade ABO).20o C. B e O. pôr em freezer a – 6 / . separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6. Revercell B e Triacell ) 7. rotular tubos A1. Revercell B e Triacell. rolar o tubo para os lados. descongelar em BM 37o C 4. entre lâmina e lamínula 41 . em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. centrífuga. com objetiva 100 x.40 . Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1.