ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

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23 25 27 28

36 38 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS . . todo o quadrado central de 1 mm2).tubos de hemólise.1 x 20 = no.Pipetar 1000 µ L.câmaras de Neubauer espelhadas. tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra.sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) . . x 1 x 10 x 100 = no. x ¼ x 1/ 0.misturar por inversão. contar todas as células dos 4 quadrados externos. com objetiva 40 x .micropipetas de 10 µ l.deixar sedimentar por 3 minutos. plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 .tubos de ensaio. . lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) .BM a 37oC. com objetiva 40x .ST com EDTA .Leucócitos / mm3 = no.câmara de Neubauer espelhadas .PLAQ/ mm3 = no.solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados .micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL .4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS . por 2 minutos. algodão B) PROCEDIMENTO . . homogenizar. preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) .Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO .contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja. . preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) . placa de Petri.

MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro. Satelitismo Plaquetário 6 . > 8 – 10 μm 3. achado encontrado na rara doença de Wiskott . indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2.000 hemácias / mm3 ----------.80 plaquetas em 4.000.preparo do esfregaço do hemograma normal .55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) . Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro. isto é. granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6.5 [181] Alterações do Tamanho = 1. Microplaquetas < que 2 μm. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 . Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos.contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------.3 – 19.20 – 11.x 6.Aldrich Alterações da Forma = 1. na maioria delas.

5 mL da solução de Drabkin em tubo.solução de Hb padrão comercial . de 5 mL B .pipetar 2.2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A . leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7.7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7. pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes. sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar .ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) .homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro.1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : .empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 . .tubos de ensaio 75 x 100mm.sangue total (ST) com EDTA . .espectrofotômetro. MATERIAIS .reagente de cor (solução de Drabkin) . a 11000 rpm / 5 min.Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa.tubo capilar para microhematócrito . . METODOLOGIA .

lâmina de hemograma corada. observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço. em objetiva de 100x.5 – 97. de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 .4 – 32. volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 . em peso.Macrocitose .2 [181] 7. faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7. onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .96 µ m3 ou 82.4 [181] 7.óleo de imersão TÉCNICA = .Calculado o Fator.Microcitose .olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço . exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média. .8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = .4 – 33.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht.32 pg(10-12) 26.Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 .

marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 . campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço. ao mesmo tempo.colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise .micropipetas de 20 µ L .solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio.deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos . 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= . com objetiva de 100.amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C .- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= . tubos de hemólise .ressuspender com agitação suave.lâminas de vidro 24 x 76 mm.

8 – 1 % das Hc / dia. Ht (%) Index (dias) > 40% 1.passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão).0 30 . em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4.EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente. quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS . os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais.observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 . o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias).40 % 1.feito o esfregaço corado com Leishman .000 Hc / mm3 y Ret RET = 124. que é diretamente proporcional ao grau de anemia.5 20 .20 % 2.0 10 .30 % 2. olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra . mostraram que.150.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta. além da correção pela anemia. e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) . Os estudos de ferrocinética de Hillman . há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0. em 1985.

4.Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado . anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO .62.NO necrobióticos . podendo ser absoluta (no. (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = . Por convenção. mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças.7.Neutrofilia ou Neutrocitose .Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) . isto é. porque cada tipo celular é um sistema separado. com suas próprias funções.Reação Leuco-Eritroblástica .Hipogranulações Citoplasmáticas .481] . não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2.Granulações Tóxicas .Vacuolizações 11 . / mm3) ou relativa (%).em valores absolutos : x células / mm3 .em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos.Neutropenia ou Neutrocitopenia .Hipossegmentação Nuclear .Reação Leucemóide .Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro.Hiato Leucêmico .

Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen.Monocitopenia . 12 .Inclusões Anormais .Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .Linfocitose .Linfopenia ou Linfocitopenia . pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = . até a marca superior 0.Linfócitos Atípicos .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS .Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS .Homogenizar a amostra e encher.Basofilia .Monocitose .Eosinopenia ou Anaeosinofilia . a pipeta de Westergreen.Eosinofilia .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS . com auxílio da pera.Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas .

cronômetro . reservar 3. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x. para um tubo B. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5.lancetas para punção digital. . separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11. . homogenizar o sedimento. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7. álcool para antissepsia . deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2. passar o filtrado. sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : . homogenizar manualmente ou no vórtex 9. e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6. fazer esfregaços e corar com Leishman 12.algodão.papel de filtro. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. recolhido em vidro de relógio. aspirar e desprezar o sobrenadante. IVY [260] 13 . sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%).esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 .- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1. 10. passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%)./5000 rpm.

3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +.haveria melhor correlação clínica.5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “. ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 .- recomendado pela ICSH. com cerca de 3 – 4 mm de profundidade . pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre. sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 . estando mais sujeito a falsos resultados. com uma incisão de +.4 mm de extensão em sua borda. DUKE MODIFICADO . DUKE [260] .medir a PA do paciente .descrito em 1912.PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : .. temperatura ambiente . a punção é feita no lóbulo da orelha.Esfigmomanômetro adulto ou infantil . embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 .calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 .Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) .a punção é feita na polpa digital. descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço.

TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = .medir com pipeta graduada o volume de soro restante .BM a 37 oC .62.TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5.pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = . 2 a 4 mm = +++  incontáveis. deixar o tubo no BM por até 2 horas . abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50. até o dorso da mão = ++  >70.banho-maria a 37 o C .identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 .calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 . descrito em 1913) = .após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra.Tubo de hemograma (EDTA) .3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira . no tubo original .71] MATERIAIS = .tubos de ensaio 75 x 100 mm .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .6.após coagulação. >5 mm = ++++ 17 .colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) .

o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min. incubar a 37 o C de minuto a minuto. e após a coagulação deste. e colocar 1 mL em cada tubo.  centrífuga de soro. por inversão lenta. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) .TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos. com o menor trauma possível.  tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 . VR = 19 . tubos siliconizados = 20 – 30 min. observar o 1º tubo .- - colher 4 – 5 mL de ST.

acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 . alça de metal. olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE. pelo menos. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. separar o PPP. colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo. centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3. CaCl2 solução a 0. em tubo de hemólise . Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3.5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1.5 A 13. para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11.25 M (estoque) ou a 0.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1.00 a 1. se não realizar imediatamente. após a leitura em segundos. idem TAP 2. no volume indicado no frasco. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11.5 – 13.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1. incubar por dois minutos também 6. a 37oC 5 . para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1.5 segundos 20 . reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 . agitar o frasco antes do uso 2 .40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos.025 (pronta para uso) 17 .

em tubo de hemólise em BM. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril. 18 .25 = presença de inibidor normal paciente < 1. BM a 37o C. incubar por 3 minutos 7. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3. se não realizar imediatamente. colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina .25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras. preparar a solução de CaCl2 para uso (0. cronômetro .025 M).amostra de ST em tubo citratado .: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6.9 a 1. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. no volume indicado no frasco. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10.METODOLOGIA = 2.centrífuga de soro. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 . fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2.025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0. MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= . deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5. agitar o frasco antes do uso 3.25. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4. mas aumentam com a mistura M2 22. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0.PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1.DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1.reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL).25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs.

reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante). centrífuga de soro 6 . BM a 37o C 19 .calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit.diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos .misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. onde n é a diluição do PPP usada (10). . Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 . onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K. PPP citratado 4 . Tampão do mesmo kit 3.centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) .plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = . será = K x n.Homogenizar suavemente antes de usar. deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR). tubos de ensaio 5 . diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2. sendo que a concentração de FIB.2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia. . pré . .TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 . segundo o fabricante) . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio.determinado pelo fabricante.

3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5.62] 1.5 mL do CaCl2. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0.7 .6.8 M em 100 mL de AD 4. ajustando o pH para 5. 8.2 com ácido acético a 1 % 24.1.5 mL de PPP + 0.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4. 20 . pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5. solução de CaCl2 M/10 = 1.37 mL de CaCl2 1. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD. centrifugar novamente como no item b) 6.94 g dietilbarbiturato de sódio 2. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1. após o início da lise observar a cada 5 minutos. homogenizar e incubar a 4o.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3. pipetar 0. PPP citratado 2.Método de Bloom (1961) [141]= 1. solução salina tamponada pH 7.5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7. cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5.C por 30 minutos 3. quando formar o coágulo.1 mL de ácido acético 1 % 2. Ácido acético 1 % = 0. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos.

as variações fisiológicas são acentuadas.Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 .1 m L de HCl 0. disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 .Método de Nilsson. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5. tampão salina barbital pH 7.9 – 6. incubar 37o C / 10 min.34 g 21 .30 minutos .: .O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) . segundo atividade.9.1 N.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24. alimentação. .2. PPP citratado mantido a 4o C 2. descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml. solução de ácido acético 0. / 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min. a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs.A heparina não precipita na fração euglobulínica . Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina). após a formação do coágulo.025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3. diluídos em AD qsp 10 ml 4. adicionar 500 l da solução de trombina e.38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2. (1978) [5] = 1. anotar o tempo de lise total do coágulo. Só levar em consideração os grandes encurtamentos.0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min. cuidados na coleta. DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1.

AD 1. 4. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 . na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste.80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. que deve estar entre 60 . 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal. desprezar e preparar outro) 6. 5. 2. 3.

6 23 . ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.26.

agitando-a cuidadosamente.025 pH = 8.6 tris-hidroxi-metilamina 10. SF 0. por pelo menos 10 – 15 min. 14. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural. fazer a transparentização. 6. 4. em posição reta e esticada.. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão. 3. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min. Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex.2 g + AD qsp 1000 mL 4. tiras de acetato de celulose 3.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C.6 g + Ácido bórico 3.. fonte geradora de voltagem 2.2 g + EDTA 0. analisar o fracionamento inicialmente sem corar. aplicador. 8. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min.MATERIAIS = 1.. Solução tampão tris-EDTA-borato 0. estufa a 60 – 70o C 4. 13. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . mergulhada na solução tampão. embeber o acetato de celulose na solução tampão. 10. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. 7. 11. Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba. 5. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida.0 g + AD qsp 100 mL 3. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. até sua transparentização (alguns minutos). Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo). Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5. desligar a fonte. papel de filtro ou Perfex. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba. em outra cuba. e depois por 3 min. previamente. na solução transparentizadora. 12. 9. cubas de eletroforese..5g + Ácido tricloroacético 5. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador.

para 100 μl de ST. se necessário. e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . em congelador (controles. ST são estáveis a 4o C. Sol.pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min. para poder detectar Hb H.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%. não pode ser guardado. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. se houver a formação de precipitados no tubo.. Regra Prática = Se Ht paciente vol. por exemplo). estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar. não deve ser feita coloração nas tiras . 3. dosa-la no hemolisado. 1. um volume de Hc. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis . desde que mantidos estéreis 10. 7. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% . recentrifugar antes de usar. as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais .: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. amostra com heparina ou EDTA 2. agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min. o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml .se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . ST vol.homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. Lavadas + dois volumes de AD. Obs.se usado KCN. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. Ao usar hemolisados congelados.se usadas Hc não lavadas. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra . é tecnicamente mais demorado. transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. adicionar um volume de clorofórmio 6.uso de AD é o método mais puro. está pronto para uso. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb.

solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. pipetas 2. 7. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. 5. 4. em lugar fresco. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1. esmalte de unhas ou Entellan 3. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2.50 g + AD qsp 250 mL 3.78 g + K2HPO4 anidro 59. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5. lâminas e lamínulas de vidro 2. 2. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. placa de Petri.1.33 g + Saponina 2. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. 3. amostra de ST colhido com EDTA 1. preparar antes de fazer o esfregaço 2. tubos de vidro 12 x 75 mm. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29. 6.

0 – 3. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4. terminada a corrida eletroforética. deixar eluir por 2 horas. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6.5 cm de largura 5. agitando os tubos a cada 15 minutos 7. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais. sem coloração.0 2. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. em absorbância de 415 nm.5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4. acertando o zero com AD 8. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. tesoura METODOLOGIA = 1. espectrofotômetro 3. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 .0 – 9. ler.7 % 30. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos.5 – 5.MATERIAIS = 1.

pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 .MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7. Pipetar 0. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5. acertando o zero do aparelho com água destilada 10. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6. tubos de hemólise 13 x 100 mm. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C. Separar o tubo B para o filtrado 4. após exatamente 1 minuto acrescentar 6. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. papel de filtro Whatmann ou similar 7.8 ml de SAS 50%. Hidróxido de Amônio 0.B.2 ml do hemolisado no tubo A. espectrofotômetro 5. Colocar 4 tubos em fila (A.0% (ADULTOS) 31. misturar bem. cronômetro.2 ml de NaOH 0. Ler a absorbância em 415 nm.083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2.D) 2. Solução NaOH 0.C.500 µ L 6.083 N no tubo A 3. Pipetar inicialmente 3. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 .04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4. misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9.

deixar em repouso por 30 minutos em TA 6. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3.45 0. NaCl(%) 1. 1960)= 1.2H2O 2.5 6.43 g pois cada diminuição de 0.10 0. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7.65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0.0 5.0 conc. homogenizar por inversão 5. sem ressuspender o depósito.MATERIAIS = 1. e trabalhar com a metade da diluição (2.5 5.5 2.5 3. NaCl 1% (mL) 10 8.5 7.20 0.A. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%.0 4.5 4.0 5. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie.50 0. AD.0 6. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4. solução fisiológica. 2. misturando-se por inversão [279]) 7.4 NaH2PO4.5 6.0 10.0 1. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo . 90 g OBS.0 0.0 9.1 equivale a Na2HPO4 13.35 0.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 . coletar ST do paciente e controle normal 2. tubos de ensaio 3.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.5 4.5 5.: é importante controlar o pH para 7.0 1.55 0.75 0.0 AD (mL) 0.00 0.85 0.0 4.0 3.5 3.0 2.40 0. Espectrofotômetro.0 8.30 0.5 6.60 0.65 0.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P.5 7.1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5.

50 0. sendo que a esterilidade é fundamental.90 1.100 80 .30 % de NaCl) OBS.55 0.7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0.100 75 .100 65 .00 % de hemólise 100 91 – 100 90 .40 0.35 0. incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas.40 0 .20 0.85 0.75 0.88 15 . com a inclusão de concentrações de 0. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32.8 – 0.19 0–9 0 0 0 0 0 2.10 0. porque provoca alterações morfológicas nas Hc.45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0.60 0. não pode ser usado o EDTA. calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0. porém usando 17 tubos.8. Neste. no teste com incubação por 24 horas. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 . Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado.70 0. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9.70 0 . A sequência técnica é a mesma como descrito acima. com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3. o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10.95 36 .9 – 0.80 0.45 0.100 55 .65 0.30 0.25 0.: 1.

4.8 (solução de estoque) Na2HPO4.Outros métodos podem ser usados. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3.É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes . amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1. no tubo B.6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6.MATERIAIS = 1.: . solução tampão fosfato M/60 pH = 6. espectrofotômetro. calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %.7 g AD qsp 1000 mL 4. no tubo A. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 .8 (tubo A) 2. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue). pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3.8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. como : a) eletroforese de Hb pH 8. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6. tubos de ensaio 17 x 100 mm 2. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2. ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5. em tubo de ensaio.12H2O 9g KH2PO4 5.

estável por 72 horas) 2.5 mg + AD 10 mL 4.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1. homogenizar os tubos sem agitar. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1. invertendo – os delicadamente. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 . nas mesmas dosagens 3. Solução de Azul de Metileno 0. Solução de Nitrito de Sódio 0. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6. do vermelho ao castanho. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5. dependendo dos níveis de G6PD 34.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL.1 mL para 10 mL de AD. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. incubar em BM a 37ºC por 3 horas. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs. misturar e fazer a leitura 6. exatamente.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2. Solução de Glicose 0. por 15 minutos 4. entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável. diluir todos os tubos na proporção de 0. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%.(G6PD) 33.

enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. em BM. usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1. No Portador Silencioso de α . procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0. idem para contagem de reticulócitos 2. ler em lâmina de imersão . tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.4 g 0. + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8.talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3. Na Doença da Hb H.talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2.8 g 100 mL 3. 33 .MATERIAIS = 1. por 1 a 2 horas 2. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. No Traço α .: 1.

colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula. 0 ausência de aglutinação. .. as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo .GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise. ou microscopicamente. . . contra fonte de luz ou superfície iluminada. . ... podem ser lidas macroscopicamente.. . ... . w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 . .. . 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo ... Segundo a literatura... . .. ... .... . em Imunohematologia. A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios. .. .

quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 . depois somados (medida semi .L.. modificado por Marsh [Marsh W. Scoring of Hemaglutination. de cada diluição em valores individuais.12:352 – 353] . Transfusion 1972. faz-se a conversão da intensidade de aglutinação.Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger.

e TCD MATERIAIS : . Cartão (GEL) Tubos . centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5. pipetas de Pasteur 6. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3. em tubo. exceto para 50 Hemoterapia 36 . após a última lavagem. pisseta com SF 0. PAI.9 % 3. Essas suspensões são usadas para Tipagem. micropipetas de 10.9% Gotas (μl) 20 (1.teste de triagem sorológica 1. centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5. por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8. tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. repetir os procedimentos 3 a 6. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. esvaziar o tubo por inversão 6.35. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%. amostra de ST colhida em EDTA 2. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4. fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . homogenizar o botão de hemáceas 7. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. retirar completamente o sobrenadante OBS.

presença de rouleaux 6. 5. 3. autoanticorpo anti-I 7. 3. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. subgrupos de A ou B 5. 4. 6. tubos de hemólise. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 .B 3. 6. 1. APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. amostra contaminada ou erro de identificação 3. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. 5. 2. -M) 2. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. anti-B e anti-A. 2. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1.36. 4. TCD positivo 4. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4. 7. antissoros anti-A.

substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. poliaglutinação. ressuspender o botão e ler. 38 . se aglutinação negativa. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2. = D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1. uso de antissoro errado 2. tempo ou velocidade de centrifugação) 4. tubos de hemólise. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente). contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11.2 e 3. ressuspender e ler. Como testemunho negativo. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. colocar no tubo CRh. pesquisar D fraco = repetir passos 1. identificar 2 tubos D e CRh 2. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3. usar controle Rh de outro fabricante. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. mas sem o anticorpo. se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. Soro de Coombs monoespecífico 4. proteínas anormais no soro-teste 4. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1. Se não for possível. colocar no tubo D. se aglutinação negativa. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. deve ser da mesma procedência que o anti-D. autoaglutinação. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS. uso de antissoro errado 2. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3. dispersando aglutinações fracas Obs.37. agitação forte na ressuspensão das células. contaminação dos reagentes com bactérias. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. lavar cada tubo 3 vezes em salina 10.

para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1. identificar os tubos I e II 3. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. 6. tubos de hemólise 12 x 75 mm. centrifugar e ler 9.9 % Hc de triagem Triacell ou similar. em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. ressuspender e ler 6. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI. 2. 7. homogenizar. estantes para tubos. 4.38. incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8. homogenizar. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. homogenizar. 2. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5. 4. microscópio óptico pisseta com SF 0. em cada um. 5. centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. 3. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. centrífuga. separar o soro a testar 2. ressuspender e ler 39 . 3. lavar 3 vezes em salina 10. 5.

2. 4. lavar 6 vezes em salina. centrífuga METODOLOGIA : 1. 3. 5. 2. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. 3. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. 4. antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. após fazer a suspensão.39.

até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. B e O (suspeita de incompatibilidade ABO). lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. descongelar em BM 37o C 4. rotular tubos A1. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1. pôr em freezer a – 6 / . B e O.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio.20o C. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. Revercell B e Triacell. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1.40 . antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1. Revercell B e Triacell ) 7. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6. entre lâmina e lamínula 41 . em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. deitado. rolar o tubo para os lados. com objetiva 100 x. centrífuga. ler a olho nu e em microscópio óptico. por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado.

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