ÍNDICE

PÁGINA
02 03 04 05 06 06 07 07 10 12 12 13 14 14 15

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02 EXAME DE GOTA ESPESSA CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04 CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA HEMATÓCRITO HEMOGLOBINA VCM - HCM - CHCM MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08 RETICULÓCITOS 09 DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11 VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) PESQUISA DE CÉLULAS LE TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) PROVA DO LAÇO (PL) RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16 TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17 PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17 DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18 TEMPO DE TROMBINA (TT) TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19 DOSAGEM DE FATOR V 21 PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22 ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA PROVA DE FALCIZAÇÃO TESTE DE ITANO 25 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30 DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31 PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35 TIPAGEM ABO EM TUBO TIPAGEM Rh EM TUBO 37 PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) TESTE DE COOMBS DIRETO 39 ELUATO

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23 25 27 28

36 38 40

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1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA
A. MATERIAIS = Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA Lâminas de vidro de 24x76 mm; lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO = - colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina - com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade até suas bordas laterais - mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial, num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm - deixar secar na horizontal sobre a bancada - identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente, e a data. - Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO
A . MATERIAIS - sangue total; tubo de ensaio - pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro B . PROCEDIMENTO - colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos - aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio - fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
. A .MATERIAIS - amostra de sangue total em EDTA - lâminas de vidro de 24x76 mm; - estufa a 37 º c (opcional); - solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada B .PROCEDIMENTO - colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina - esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC - corar com Giemsa por 30 min. - transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min - deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA
Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )= Céls./mm3 = no. células contadas (Área em mm2 e altura em mm) x 1 / área x 1 / altura x diluição

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4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS - tubos de ensaio de 9 x 75 mm; - micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL - câmaras de Neubauer espelhadas; - lamínulas de vidro, - Solução diluente de Gower [ 6 ] Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) Ácido acético glacial Água destilada

625 mg 1,66 mL 10 mL

B) METODOLOGIA – pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes na mesma solução (1 : 200) – agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos – colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara – cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos – ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2 – calcular segundo a fórmula : No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

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todo o quadrado central de 1 mm2).deixar sedimentar por 3 minutos. x 1 x 10 x 100 = no.câmaras de Neubauer espelhadas.micropipetas de 10 µ l. com objetiva 40x .solução diluente oxalato de amônio 100 mg AD 10 mL Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL) guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados . tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l da amostra. contar todas as células dos 4 quadrados externos.ST com EDTA .contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja. placa de Petri.BM a 37oC. . plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3 5 .1 x 20 = no.Pipetar 1000 µ L.micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL .tubos de hemólise. .4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS A) MATERIAIS . lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição 1:20 ) .Solução diluente de Turk Ácido Acético Glacial PA Violeta genciana ou Azul de Metileno Água destilada qsp 150-200 μL 100 μL 10 mL B) PROCEDIMENTO . preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL) .misturar por inversão. por 2 minutos.Leucócitos / mm3 = no. . com objetiva 40 x .sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com papel de filtro ou algodão umedecido com AD) . . homogenizar. x ¼ x 1/ 0.tubos de ensaio. algodão B) PROCEDIMENTO . preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL) . Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3 4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite) A) MATERIAIS .PLAQ/ mm3 = no.pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST. .câmara de Neubauer espelhadas .

Satelitismo Plaquetário 6 . granulação fina azurófila no citoplasma VPM (fl) = 6. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas 2 .x 6.55 [181] PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15.preparo do esfregaço do hemograma normal . Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase Regenerativas : de 4 – 8 μm de diâmetro. MORFOLOGIA DE PLAQUETAS Morfologia normal = 1 – 3 μm de diâmetro.5 [181] Alterações do Tamanho = 1.Aldrich Alterações da Forma = 1.5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto) .000.3 – 19. indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da MO) 2.80 plaquetas em 4. Microplaquetas < que 2 μm. na maioria delas. > 8 – 10 μm 3. Plaquetas Gigantes do tamanho de Hc ou linfócitos. isto é.contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias por mm3 do paciente : exemplo = se em 1000 hemácias -----------.000 hemácias / mm3 ----------. achado encontrado na rara doença de Wiskott .20 – 11.

a 11000 rpm / 5 min. . METODOLOGIA . MATERIAIS .homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos .tubos de ensaio 75 x 100mm. .lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar . de 5 mL B .espectrofotômetro.tubo capilar para microhematócrito .1 HEMATÓCRITO A) Micrométodo -MATERIAIS : .5 mL da solução de Drabkin em tubo.solução de Hb padrão comercial .pipetar 2.reagente de cor (solução de Drabkin) .2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA A .micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro. leitura no gráfico (acompanha as centrífugas) Ht = ___ % 7. sem atingir a coluna de Hemácias centrifugar com a extremidade fechada para fora.empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco” Obs : Cálculo do Fator : Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl) Fator = Hb padrão / absorbância 7 .7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA) 7.Centrífuga de microhematócrito TÉCNICA : encher o capilar com ST até a 1 cm da borda fechar a extremidade vazia com calor/massa. .sangue total (ST) com EDTA .ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo) . pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes.

óleo de imersão TÉCNICA = .5 – 97.2 [181] 7. de Hb em cada Hc HCM = Hb(g%) Hc(x1012 /L) ou = Hb (g%) x 10 Hc (106 /mm3) VR = 27 . em peso. .96 µ m3 ou 82. observar em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade da cauda do esfregaço.4 – 32.32 pg(10-12) 26.lâmina de hemograma corada.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM) Relação entre Hc e Ht.Microcitose . volume médio de cada Hc VCM = Ht (%) x 1000 ou fl(10-15) Hc (x1012 / L) = Ht(%) x 10 Hc (x106 / mm3) VR = 84 . exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a % da Hc que existe como Hb”) CHCM = Hb(g%) x 100 Ht(%) VR = 30-35 g / dl 31.8 [181] 8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS MATERIAIS = .4 [181] 7.Anisocitose b) Alterações da cor (teor de Hb) = Normocromia Hipocromia 8 . em objetiva de 100x.4 – 33.na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço. faz-se Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g % 7. onde pode haver distorção das células) VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas a) Alterações do tamanho = Normocitose .4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM) Quantidade média.Calculado o Fator.Macrocitose .5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM) concentração de Hb na Hc.olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do esfregaço .

lâminas de vidro 24 x 76 mm. 2H2O __________ 40 mg AD _______________________ qsp 100 mL METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )= .- Hipercromia Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia c) Alterações da forma = Poiquilocitose Esferocitose Eliptocitose Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo) Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells) Hemáceas crenadas ou Equinócitos Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas Drepanócitos ou hemáceas falciformes Ovalócitos Estomatócitos Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos Rouleaux Aglutinação de hemáceas d) Presença de inclusões eritrocitárias Ponteados basófilos Corpos de Howell-Jolly Anéis de Cabot Eritroblastos Hematozoários 9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS MATERIAIS= .deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos . ao mesmo tempo.ressuspender com agitação suave. marcar quantos reticulócitos foram vistos 9 . fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço.solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg NaCl PA _____________________ 850 mg citrato de sódio. tubos de hemólise . campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000 e .micropipetas de 20 µ L .colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise .amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C . com objetiva de 100.

150.000 Hc / mm3 y Ret RET = 124.5 IPR = % RET / index 10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS .20 % 2.feito o esfregaço corado com Leishman . além da correção pela anemia.30 % 2. em mm3 se em 1000 Hc 30 Ret em 4. Ht (%) Index (dias) > 40% 1. olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a distribuição das células e a celularidade da amostra . que é diretamente proporcional ao grau de anemia.5 20 .0 30 . quando a eritropoiese é muito estimulada em relação à anemia. mostraram que.passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão).40 % 1. o tempo que o Ret permanece na circulação (em dias).8 – 1 % das Hc / dia.500 / mm3 c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o normal para a idade e sexo Ret Corrigido = Ht paciente x % Ht normal d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) = leva em conta. e contar 100 leucócitos na mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda) .0 10 . há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0.EXPRESSÃO DOS RESULTADOS : a) como % de células = se em 1000 Hc em 100 Hc RET = 3 % 30 Ret y Ret b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente. os RET são liberados mais precocemente na circulação Em situações normais.observar as alterações qualitativas dos leucócitos Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço): 10 . em 1985. Os estudos de ferrocinética de Hillman .

Hipogranulações Citoplasmáticas .Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado .Reação Leuco-Eritroblástica .Neutrofilia ou Neutrocitose .em valores absolutos : x células / mm3 .Granulações Tóxicas .NO necrobióticos .Hiato Leucêmico .7. mecanismos de controle e resposta a diferentes doenças.Neutropenia ou Neutrocitopenia .Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita) .Hipossegmentação Nuclear .62.Reação Leucemóide .em valores percentuais : x % Fórmula Leucocitária = é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos.481] . Por convenção. não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula” [2. isto é. podendo ser absoluta (no. anota – se na seguinte seqüência : MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO .Expressão dos resultados : “ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro. porque cada tipo celular é um sistema separado.Vacuolizações 11 .4. com suas próprias funções. / mm3) ou relativa (%). (mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados – eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos) ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS LEUCÓCITOS : 1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS = .

pera Suporte para pipetas Westergreen - METODOLOGIA = .Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells) 5 ) MONÓCITOS .Vacuolizações Citoplasmáticas 11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS) MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ : MATERIAIS = ST com EDTA Pipetas de Westergreen.Inclusões Anormais .Granulações bsofílicas 3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS . com auxílio da pera.Homogenizar a amostra e encher.Basofilia .Linfopenia ou Linfocitopenia .Linfocitose .Eosinopenia ou Anaeosinofilia . 12 . a pipeta de Westergreen. até a marca superior 0.Monocitose .Monocitopenia .Basopenia 4 ) LINFÓCITOS .Eosinofilia .Linfócitos Atípicos .- Bastões de Auer Corpos de Dohle 2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS .Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas .

deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas 2. homogenizar manualmente ou no vórtex 9./5000 rpm. álcool para antissepsia . 10. para um tubo B. .cronômetro . passar o filtrado. homogenizar o sedimento. e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30 minutos 6. sugestivo de outra doenças 13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) MATERIAIS : . passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A 8. fazer esfregaços e corar com Leishman 12. IVY [260] 13 . colher 10 mL de ST em TUBOS SECO. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos 11.esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy) MÉTODOS : 1 . recolhido em vidro de relógio. contando 500 neutrófilos se > 5 células LE / 500 NO (>1%). colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro 4. aspirar e desprezar o sobrenadante. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de 500 µ L 7. sugestivo de LES se < 5 células LE / 500 NO (<1%).lancetas para punção digital. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos. reservar 3.papel de filtro.- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas 12-PESQUISA DE CÉLULAS LE MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO : 1. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo 5. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x. . separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min.algodão.

descrito em 1912. embora seja tido como menos sensível VR = 1 a 4 minutos 3 .a punção é feita na polpa digital. DUKE MODIFICADO . com uma incisão de +. a punção é feita no lóbulo da orelha.haveria melhor correlação clínica. pela maior sensibilidade a vasoconstricção ou vasodilatação (febre.medir a PA do paciente . sem encostar no coágulo plaquetário VR = 1 a 7 minutos 2 .PROVA DO LAÇO (PL) (PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE) MATERIAIS : .calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD 3 14 . DUKE [260] ..- recomendado pela ICSH. 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais fazer 2 incisões de +. com cerca de 3 – 4 mm de profundidade . ansiedade ou medo do paciente) VR = 1 a 3 minutos 14 .Cronômetro MÉTODO : ( Rumpel – Leed ) . temperatura ambiente .Esfigmomanômetro adulto ou infantil .4 mm de extensão em sua borda. estando mais sujeito a falsos resultados.5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos ) absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “. descrito em 1941 fazer antissepsia com algodão embebido em álcool punção na face volar lateral do antebraço.

determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira . até o dorso da mão = ++  >70.3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados .TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5.calcular % retração = volume de soro x volume do ST Ht teste Ht normal VR = 40 – 60 % 18 .- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço .Tubo de hemograma (EDTA) .banho-maria a 37 o C .amostra de sangue total colhido sem anticoagulante MÉTODO (Lee – White .tubos de ensaio 75 x 100 mm .BM a 37 oC .6. no tubo original . descrito em 1913) = .62. abaixo da prega do cotovelo inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62) Interpretação =  até 5 = negativo  6 a 10 = duvidoso  10-50 = +  >50.medir com pipeta graduada o volume de soro restante .após coagulação.pipetas graduadas METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) = . >5 mm = ++++ 17 . deixar o tubo no BM por até 2 horas . 2 a 4 mm = +++  incontáveis.TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) MATERIAIS = .identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62) 15 .colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase) .71] MATERIAIS = .após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o restante da amostra.

com o menor trauma possível. e colocar 1 mL em cada tubo. o 3 º tubo anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética tubos de vidro = 6 – 12 min. observar o 1º tubo . até que o sangue coagule (marcar o tempo) passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos. incubar a 37 o C de minuto a minuto. VR = 19 .  centrífuga de soro. e após a coagulação deste.- - colher 4 – 5 mL de ST.TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP) MATERIAIS =  ST colhido em tubo citratado. pondo o sangue nos tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual) disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) . por inversão lenta.  tubos de ensaio  BM a 37oC  Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI™ ou similar)  cronômetro 16 . tubos siliconizados = 20 – 30 min.

separar o PPP.00 a 1.25 M (estoque) ou a 0. idem TAP 2.025 (pronta para uso) 17 . deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 11.5 A 13. pelo menos. CaCl2 solução a 0. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril. para determinação da % de atividade da protrombina e do RNI VR = Medida do tempo de coagulação em segundos = 11.5 SEGUNDOS Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1. colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos. Cefalina comercial (Cefamat™ ou Replastin™ ou Hemostat™ ou similar) 3.25 Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1. para detectar a formação do coágulo METODOLOGIA (Método de Quick modificado)= 1.TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA) MATERIAIS = 1. centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos 3. olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE.5 segundos 20 . se não realizar imediatamente. no volume indicado no frasco. a 37oC 5 . Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. após a leitura em segundos.5 – 13. colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo. alça de metal. deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 4 . acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro 6 . em tubo de hemólise . agitar o frasco antes do uso 2 .40 ISI RNI = R = TAP paciente TAP normal ISI TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras. incubar por dois minutos também 6.

em tubo de hemólise em BM.25 = presença de inibidor normal paciente < 1.centrífuga de soro. colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina . MÉTODO DE CLAUSS (1957) MATERIAIS= . deixar o PPP a 4oC até a realização do teste 5.025 M).25 TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP) 3. preparar a solução de CaCl2 para uso (0.METODOLOGIA = 2. diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10. no volume indicado no frasco. incubar por 3 minutos 7. Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso 6. mas aumentam com a mistura M2 22. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1.reagentes : 1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL). cronômetro .amostra de ST em tubo citratado . se não realizar imediatamente. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos 4. agitar o frasco antes do uso 3.25 = deficiência de fator e ausência de inibidor normal Obs. BM a 37o C.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1.DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO 1.25.025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro VR = 26 a 35 segundos Relação = TTPA paciente TTPA normal(teste) de 0. Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2) VR = se R se R paciente > 1. deve ser preparado periodicamente e deve estar entre 30 – 40 segundos 21 .PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO Método de Howell ou Método da Mistura de Soros = 1.9 a 1. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0. fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia (alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal) 2. 18 .

misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no cronômetro. tubos de ensaio 5 . será = K x n. solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio. Tampão do mesmo kit 3. sendo que a concentração de FIB.diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos . BM a 37o C 19 . .plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit METODOLOGIA = . diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL) 2. centrífuga de soro 6 . onde o resultado em segundos será convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K.centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas (PPP) .Homogenizar suavemente antes de usar.calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit. pré .determinado pelo fabricante. PPP citratado 4 .2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia. deixar à temperatura ambiente de 20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).TEMPO DE TROMBINA (TT) MATERIAIS = 1 . onde n é a diluição do PPP usada (10). Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido) 23 . segundo o fabricante) . . .reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante).

PPP citratado 2. não deixar a solução de trombina a 37o C VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado 5.1 mL de ácido acético 1 % 2. quando formar o coágulo.25 24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA MATERIAIS = 1.1 N (solução de HCl original = 12 N) e Soro fisiológico 90 mL 3. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo 5. após o início da lise observar a cada 5 minutos. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD.94 g AD qsp 100 mL b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas 6. pipetar 0. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar 2. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM 3.5 mL do CaCl2.1. solução salina tamponada pH 7.5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado 7.C por 30 minutos 3. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0. homogenizar e incubar a 4o. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão. enxugando as paredes do tubo com lenço de papel 4. disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro 4. 8.6. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0.62] 1. cronômetro METODOLOGIA (método de Caen) = [5.1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD 5. ajustando o pH para 5.5 mL de PPP + 0.Método de Bloom (1961) [141]= 1.7 .94 g dietilbarbiturato de sódio 2.3 a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1. 20 . Ácido acético 1 % = 0.37 mL de CaCl2 1.2 com ácido acético a 1 % 24.8 M em 100 mL de AD 4. solução de CaCl2 M/10 = 1. centrifugar novamente como no item b) 6.

9 – 6. cuidados na coleta. a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do coágulo de euglobulina VR = 90 – 180 minutos Obs. Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina).34 g 21 .as variações fisiológicas são acentuadas.1 m L de HCl 0. alimentação. tampão salina barbital pH 7.0 (PASSO FUNDAMENTAL) misturar e incubar 30 min. . após a formação do coágulo. (1978) [5] = 1.38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2. segundo atividade.A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio 24. descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml. / 4o C centrifugar 2000 rpm / 5 min.Método de Nilsson.O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado [93]) .2.025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD 3. diluídos em AD qsp 10 ml 4. solução de ácido acético 0. DOSAGEM DE FATOR V I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5] Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1. anotar o tempo de lise total do coágulo.Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 .9.A heparina não precipita na fração euglobulínica .30 minutos . disparar o cronômetro checar a lise do coágulo a cada 15 minutos VR = 70 – 300 minutos 25 .: . incubar 37o C / 10 min. adicionar 500 l da solução de trombina e.1 N. preparar na hora - - - misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5. PPP citratado mantido a 4o C 2. Só levar em consideração os grandes encurtamentos.

Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL METODOLOGIA : Construir curva de diluição com PPP normal.000 rpm para obtenção do PPP Fazer pool de plasmas normais oxalatados Incubar em BM 37o C por 24 horas Checar o TAP. 4. que deve estar entre 60 . 5. desprezar e preparar outro) 6. PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS 22 . 100 mL Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio Centrifugar por 10 minutos a 3. na mesma técnica para dosagem de fator VIII ao trabalhar com a amostra-teste.80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se > 80. 2. 3.AD 1.

26. ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8.6 23 .

6 g + Ácido bórico 3. sem deixa-lo totalmente seco) e colocar no suporte da cuba. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min. 5. até sua transparentização (alguns minutos). remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min.. tiras de acetato de celulose 3. em outra cuba. 10. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra. desligar a fonte. 13. agitando-a cuidadosamente.0 g + AD qsp 100 mL 3. fazer a transparentização. fonte geradora de voltagem 2.6 tris-hidroxi-metilamina 10.025 pH = 8.. a 2 cm do compartimento do polo negativo (catodo).2 g + EDTA 0. e deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 % REAGENTES = 1. SF 0.9 % METODOLOGIA (método de Kohn) = 1. analisar o fracionamento inicialmente sem corar. estufa a 60 – 70o C 4. papel de filtro ou Perfex. 7.. 11. 3. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante) 2. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C. em posição reta e esticada. 14. cubas de eletroforese. por pelo menos 10 – 15 min. 4.2 g + AD qsp 1000 mL 4.. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba. 6. deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min. tocando a ponte de papel de filtro ou Perfex.MATERIAIS = 1. previamente. aplicador. 9. Remover as fitas e colar no laudo do paciente PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb : 24 . 8. Solução Corante (Ponceau) Ponceau S 0. Solução Descorante Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL 4. Solução tampão tris-EDTA-borato 0. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador. na solução transparentizadora. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante. embeber o acetato de celulose na solução tampão. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida. mergulhada na solução tampão. e depois por 3 min. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão.5g + Ácido tricloroacético 5. Solução Transparentizadora Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL 5. 12.

transferir o sobrenadante para o outro tubo 8. deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm 9. Sol. para poder detectar Hb H. Obs.homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado. dosa-la no hemolisado. amostra com heparina ou EDTA 2. Regra Prática = Se Ht paciente vol.se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4. é tecnicamente mais demorado. Lavadas + dois volumes de AD. um volume de Hc.para 100 μl de ST. está pronto para uso.se usado KCN. desde que mantidos estéreis 10. lavar as Hc por 3 vezes com SF 4.pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas.existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas para outros exames com a mesma amostra . se necessário. hemolisante > 40 % 1 2–3 30 – 40 % 1 1 < 30 % 2 1 27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO MATERIAIS = 25 . ST vol. Ao usar hemolisados congelados.uso de AD é o método mais puro. ST são estáveis a 4o C.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%. em congelador (controles. se houver a formação de precipitados no tubo. não pode ser guardado. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C 2. 3. não deve ser feita coloração nas tiras . 7.se usadas Hc não lavadas. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar. 1. Técnica do Clorofórmio = [13] 1. recentrifugar antes de usar. e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis ..: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos) OBS. colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST colocar 50 μl de saponina 2% . por exemplo). Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143] Indicada para toda eletroforese de Hb. adicionar um volume de clorofórmio 6. agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise completa 5. e eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas . o que não é possível com o uso de clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143] AD 100 ml . as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais . agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min.

5.1.78 g + K2HPO4 anidro 59.33 g + Saponina 2. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais 5. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos 4. ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro vedar as bordas da lamínula com o esmalte deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas. preparar antes de fazer o esfregaço 2. amostra de ST colhido com EDTA 1. lâminas e lamínulas de vidro 2. à temperatura ambiente ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação 28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO) MATERIAIS = 1. acrescentar 20 µ L da amostra de ST 3. pipetas 2. placa de Petri. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste) 2. 3. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26 . solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL. em lugar fresco.50 g + AD qsp 250 mL 3. esmalte de unhas ou Entellan 3. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 % colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina colocar a lamìnula sobre a gota de sangue. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33. 2. ditionito de sódio (Na2S2O4) METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] = 1. tubos de vidro 12 x 75 mm. 6. 7. algodão e AD METODOLOGIA = (método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948) 1. 4. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S 29.

5 – 5.0 – 9. espectrofotômetro 3. deixar eluir por 2 horas. terminada a corrida eletroforética. calcular Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100 5 x DO Hb A1 + DO Hb A2 VR = 2. agitando os tubos a cada 15 minutos 7.0 – 3. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos.7 % 30.5 cm de largura 5. cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1. observando visualmente a separação da Hb A2 das demais.5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4. em absorbância de 415 nm. acertando o zero com AD 8. sem coloração. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27 .0 2. ler. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8. colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD 6.MATERIAIS = 1. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio 4. tesoura METODOLOGIA = 1.

tubos de hemólise 13 x 100 mm.C. misturar e deixar em repouso por 20 minutos 7.083 N(N/12) NaOH 332 mg AD 100 ml 2. Pipetar 0. Hidróxido de Amônio 0. Colocar 4 tubos em fila (A. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml (solução de uso) AD 800 ml HCl 10 N 4 ml 3. misturar bem. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C. após exatamente 1 minuto acrescentar 6. Ler a absorbância em 415 nm. acertando o zero do aparelho com água destilada 10.500 µ L 6. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28 .B. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo 8. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C 5. cronômetro.2 ml de NaOH 0. Separar o tubo B para o filtrado 4.D) 2.MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey) MATERIAIS : 1. funis pequenos (3-4 cm de diâmetro) METODOLOGIA : 1. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D 6. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 .2 ml do hemolisado no tubo A.04% NH4(OH)2 4 ml AD 1000 ml 4. Solução NaOH 0.083 N no tubo A 3.8 ml de SAS 50%. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B) Leitura do Padrão (D) VR = < 1. papel de filtro Whatmann ou similar 7. espectrofotômetro 5. misturar e transferir 50 μl para o tubo D 9. Pipetar inicialmente 3.0% (ADULTOS) 31.

: é importante controlar o pH para 7. deixar em repouso por 30 minutos em TA 6.45 0. 1960)= 1.A.0 9. e trabalhar com a metade da diluição (2.0 10.5 6.35 0.30 0.0 8.0 0. NaCl 1% (mL) 10 8.0 2.55 0.0 5.65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl AD qsp 1000 mL em 0.1 equivale a Na2HPO4 13. 90 g OBS.MATERIAIS = 1.00 HEMÓLISE (%) 0 0 0 0 0 0 0a5 5 a 45 50 a 90 90 a 99 97 a 100 100 100 100 transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados.0 1.5 4. e pingar 2 gotas de NH4OH 1%.0 5. 2.5 6.5 7.0 3.5 2.0 6.65 0.5 5.0 4.20 0.50 0. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm 29 . acrescentar 50 μL do ST em cada tubo . sem ressuspender o depósito. METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie.43 g pois cada diminuição de 0.0 4.5 7. misturando-se por inversão [279]) 7.4 = SOLUÇÃO ESTOQUE NaCl P. tubos de ensaio 3. homogenizar por inversão 5. diluir a SF 1% como indicado na tabela TUBOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 3.00 0.0 1.0 AD (mL) 0. solução fisiológica. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7.5 3.2H2O 2. Espectrofotômetro. AD.60 0.5 mL em cada tubo = para o controle e o teste) 4.1 g/L solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO) solução estoque 10% 25 mL AD qsp 250 mL 5.4 NaH2PO4.10 0.75 0. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279] (transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo.85 0.5 3.5 4.40 0. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue) 4.0 conc. coletar ST do paciente e controle normal 2.5 5. NaCl(%) 1.5 6.

70 0. o tubo 14 representa o 100% de hemólise 10.30 0. no teste com incubação por 24 horas.9 – 0.45 0.35 0.65 0.8.100 55 .80 0.25 0. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise) 9. Neste. sendo que a esterilidade é fundamental. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb) 30 . calcular % hemólise = cada tubo(1-13) DO sobrenadante cada tubo x 100 DO sobrenadante tubo 14 VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0.90 1.88 15 . com as porcentagens de hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa 3.10 0. porém usando 17 tubos.40 0.50 0.7 % de NaCl VR = 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 % de NaCl 0.85 0.40 0 .75 0. com a inclusão de concentrações de 0.30 % de NaCl) OBS.70 0 . Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil) 32. não pode ser usado o EDTA.: 1.00 % de hemólise 100 91 – 100 90 .19 0–9 0 0 0 0 0 2. porque provoca alterações morfológicas nas Hc.100 65 .20 0.55 0.8 – 0.100 75 .95 36 .60 0. A sequência técnica é a mesma como descrito acima.100 80 .45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0. incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado.

8 (solução de estoque) Na2HPO4.6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +) b) pesquisa de corpos de Heinz 33. amostra de ST normal para controle METODOLOGIA (método colorimétrico) = 1. solução tampão fosfato M/60 pH = 6.: .Outros métodos podem ser usados.12H2O 9g KH2PO4 5. calcular % MHb = DO A x 100 VR = até 4 % DO A + (10 x DO B) OBS. pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST + 100 µ L de saponina a 1 %. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE 31 .8 (solução de trabalho) solução 3 (ESTOQUE) 250 mL AD qsp 1000 mL 5. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L 3.MATERIAIS = 1. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6. ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no sangue).8 (tubo A) 2. em tubo de ensaio. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B) 3. ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb) 5. tubos de ensaio 17 x 100 mm 2. espectrofotômetro.5 mL e 50 µ L de saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante) 6. no tubo B.É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes .7 g AD qsp 1000 mL 4. no tubo A. e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6. 4. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2. como : a) eletroforese de Hb pH 8.

homogenizar os tubos sem agitar.1 mL para 10 mL de AD. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B. diluir todos os tubos na proporção de 0. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L 6. exatamente.18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL Obs.(G6PD) 33.28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL 2. misturar e fazer a leitura 6. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2 C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3 3. entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste) B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste) C (teste) = cor variável. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%. do vermelho ao castanho.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina) MATERIAIS = 1. por 15 minutos 4. invertendo – os delicadamente.0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1. nas mesmas dosagens 3. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos) 5. retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%) METODOLOGIA QUALITATIVA = 1. estável por 72 horas) 2. Solução de Azul de Metileno 0. Solução de Nitrito de Sódio 0.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de AD qsp 100 mL.5 mg + AD 10 mL 4. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC. incubar em BM a 37ºC por 3 horas. Solução de Glicose 0. homogenizando de 15 / 15 minutos 5. dependendo dos níveis de G6PD 34. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32 .

: 1.6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10 – 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal. ler em lâmina de imersão . em BM. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil citrato de sódio NaCl AD qsp 1g 0. 33 . procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul – pálidas. idem para contagem de reticulócitos 2.8 g 100 mL 3. tipo bolas de golfe VR = negativo OBS.talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 – 1 / 2000 Hc 2. No Traço α . No Portador Silencioso de α . por 1 a 2 horas 2. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %. enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 – 100 % somente na Hidropsia Fetal.4 g 0.MATERIAIS = 1. + em todos os campos observados À Eletroforese Hb em pH 8. Na Doença da Hb H.talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc 3. usar amostra controle normal METODOLOGIA = 1.

GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM MUNOHEMATOLOGIA A leitura das reações de aglutinação / hemólise. podem ser lidas macroscopicamente. . . . .. fundo bastante róseo com hemáceas em suspensão 34 . 1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo . A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre diferentes laboratórios. ... ... . . .. .. 0 ausência de aglutinação. colocando-se 1 gota da suspensão entre lâmina e lamínula. . . .... as intensidades de reação podem ser : 4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro 3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro 2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo .... . ou microscopicamente. w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo . .. contra fonte de luz ou superfície iluminada. .. ... Segundo a literatura.. em Imunohematologia.

.Quantificação das reações de aglutinação : Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+ Método do escore numérico = segundo Race e Sanger. Scoring of Hemaglutination. faz-se a conversão da intensidade de aglutinação. depois somados (medida semi . de cada diluição em valores individuais.L. modificado por Marsh [Marsh W. Transfusion 1972.quantitativa da reatividade do anticorpo) Intensidade da Aglutinação ++++ +++ ++ + fraco negativo Escore 12 10 8 5 2 0 35 .12:352 – 353] .

PAI. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS : As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%. porém como o rigor em laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor. 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1.teste de triagem sorológica 1. após a última lavagem. exceto para 50 Hemoterapia 36 . pisseta com SF 0. micropipetas de 10. Cartão (GEL) Tubos .9 % 3. por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical) 8. homogenizar o botão de hemáceas 7. esvaziar o tubo por inversão 6.000 μl) 19 (950 μl) 950 HEMÁCIAS LAVADAS (μl) 30 50 METODOLOGIA INDICADA Microtubos . repetir os procedimentos 3 a 6. pipetas de Pasteur 6. amostra de ST colhida em EDTA 2.9% Gotas (μl) 20 (1. retirar completamente o sobrenadante OBS. centrífuga de soro ou de Imunohematologia 5. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda 4. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia. em tubo. Essas suspensões são usadas para Tipagem. Cartão (GEL) Sangue total = Tubos. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm 2. e TCD MATERIAIS : . tubos de hemólise 12 x 75 mm 4. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm 5.35. fazemos diluição simples sem lavar as hemácias SUSPENSÃO 3% 5% 5% SF 0. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise 3.

presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B 37 . -M) 2. centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl METODOLOGIA : 1. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 4.36. 1. 2. autoanticorpo anti-I 7. presença de rouleaux 6. Fase Direta = prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) rotular tubos em A. TCD positivo 4. 4. 5. antissoros anti-A. subgrupos de A ou B 5. anti-B e anti-A. tubos de hemólise. 6. 2. 5. APENAS se fôr feita a Fase Reversa) 2. 3. 3. amostra contaminada ou erro de identificação 3.B 3. B e AB colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste homogenizar centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada) ressuspender o botão ler Fase Reversa = rotular tubos A e B colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B) homogenizar centrifugar ressuspender ler Causas de Discrepâncias ABO = 1. 7. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco. 6. TIPAGEM ABO EM TUBO MATERIAIS : 1. 4.

poliaglutinação. contaminação dos reagentes com bactérias. mas sem o anticorpo. tempo ou velocidade de centrifugação) 4. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE METODOLOGIA : 1. se positivo = D fraco positivo = Rh positivo 9. mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente). falta de adicionar antissoro ao tubo teste 3. centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl OBS. ressuspender e ler. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos 8. 38 . contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação) 3. Se não for possível. = D negativo (Rh negativo) Causas de Falso-positivos = 1. 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste 3. autoaglutinação. proteínas anormais no soro-teste 4. lavar cada tubo 3 vezes em salina 10. se aglutinação negativa. pesquisar D fraco = repetir passos 1. tubos de hemólise. Soro de Coombs monoespecífico 4. ressuspender o botão e ler. deve ser da mesma procedência que o anti-D. colocar no tubo CRh. Como testemunho negativo. soro anti-Rh (D) e Controle Rh 3. colocar no tubo D. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35) 2.37. uso de antissoro errado 2. agitação forte na ressuspensão das células. dispersando aglutinações fracas Obs. se aglutinação negativa.2 e 3. substâncias estranhas Causas de Falso-negativos = 1. 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste 4. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos 12. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo 11. TIPAGEM Rh EM TUBO MATERIAIS : 1. uso de antissoro errado 2. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos 5. e incubar em BM 37o C / 15-30 minutos 7. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo 6. se + = D fraco positivo = Rh positivo e se D fraco negativo. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro. usar controle Rh de outro fabricante. identificar 2 tubos D e CRh 2.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D.

centrifugar e ler PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE) 1. homogenizar. 4. incubar em BM 37o C / 15 minutos lavar 3 vezes em salina acrescentar 50 μl de SAH centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos. ressuspender e ler 39 . homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina) 5. 3. 5. lavar 3 vezes em salina 10. microscópio óptico pisseta com SF 0. separar o soro a testar 2. homogenizar. tubos de hemólise 12 x 75 mm. centrifugar e ler 9. 7. centrífuga. idem 1 – 2 acima colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI.38. ressuspender e ler 6. pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados) 4. em suspensão salina ou BFI albumina humana 22% ou BFI SAH (soro de Coombs poliespecífico) amostra de soro do paciente a testar suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário. 2. 3. centrifugar e ler (fase albumínica imediata) 7. para autocontrole) METODOLOGIA : PAI EM SALINA = 1. estantes para tubos. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana) 11. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE DE COOMBS INDIRETO MATERIAIS : 1. identificar os tubos I e II 3. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%. 5. 4. homogenizar. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica) 8.9 % Hc de triagem Triacell ou similar. em cada um. 6. 2.

TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD) MATERIAIS : 1. 5. pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH homogenizar. centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler se negativo. 2. 4. amostra do paciente em EDTA suspensão de Hc em 5% (página 35) (se ST de cordão umbelical. 2. recentrifugar e ler se reação + em qualquer etapa. deixar de repouso em TA por 5-10 minutos. antes de fazer a suspensão) SAH (soro de Coombs poliespecífico) tubos de hemólise. repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs) POSITIVO POSITIVO Ig G. 4.39. centrífuga METODOLOGIA : 1. lavar 6 vezes em salina. ou Ig G + Ig M POSITIVO NEGATIVO Ig M NEGATIVO POSITIVO Ig G SORO POLIESPECÍFICO SORO MONOESPECÍFICO CLASSE DO ANTICORPO ENVOLVIDO 40 . 3. após fazer a suspensão. 3.

antes de fazer a suspensão a 5% do paciente. em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos 8. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG 9. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22% 2. entre lâmina e lamínula 41 . separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo 6. colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo (hemácias Revercell A1.20o C. rotular tubos A1. com objetiva 100 x. centrífuga. Revercell B e Triacell ) 7. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos 5. rolar o tubo para os lados. B e O. ou hemácias controle O Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1. B e O (suspeita de incompatibilidade ABO). ler a olho nu e em microscópio óptico. ou hemácias de doadores conhecidos Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano) METODOLOGIA Método de LUI : [218] 1.40 . por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado. até congelar (tempo mínimo = 10 minutos) 3. Revercell B e Triacell. descongelar em BM 37o C 4.TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO) MATERIAIS: tubos de ensaio. banho maria 37o C Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35) Albumina humana 22% Hemácias controle A1. deitado. pôr em freezer a – 6 / .