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ÍNDICE PÁGINA

ESFREGAÇOS DE HEMOGRAMA 02
ESFREGAÇOS DE CREME LEUCOCITÁRIO (BUFFY-COAT) 02
EXAME DE GOTA ESPESSA 03
CONTAGEM DE HEMÁCIAS (HEMOCITÔMETRO) 04
CONTAGEM DE LEUCÓCITOS (HEMOCITÔMETRO) 04
CONTAGEM DE PLAQUETAS (HEMOCITÔMETRO E LÂMINA) 05
MORFOLOGIA PLAQUETÁRIA 06
HEMATÓCRITO 06
HEMOGLOBINA 07
VCM - HCM - CHCM 07
MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS 08
RETICULÓCITOS 09
DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS 10
MORFOLOGIA E ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS DOS LEUCÓCITOS11
VHS (VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO) 12
PESQUISA DE CÉLULAS LE 12
TEMPO DE SANGRAMENTO (TS) 13
PROVA DO LAÇO (PL) 14
RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC) 14
TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) 15
TEMPO DE ATIVAÇÃO DA PROTROMBINA (TAP) 16
TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO (TTPA) 17
PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO (ACL) 17
DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO (FIB) 18
TEMPO DE TROMBINA (TT) 19
TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA (TLE) 19
DOSAGEM DE FATOR V 21
PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS (PRP) 22
ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA 23
PROVA DE FALCIZAÇÃO 25
TESTE DE ITANO 25
DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2 26
DOSGEM DE HEMOGLOBINA FETAL 27
CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA 28
DOSAGEM DE METEMOGLOBINA 30
DOSAGEM DE G6PD (CLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE) 31
PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H 32
PREPARO DA SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS 35
TIPAGEM ABO EM TUBO 36
TIPAGEM Rh EM TUBO 37
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) 38
TESTE DE COOMBS DIRETO 39
ELUATO 40

1
1- ESFREGAÇOS DE SANGUE PARA HEMOGRAMA

A. MATERIAIS =
- Amostra de sangue total (ST) colhido com EDTA
- Lâminas de vidro de 24x76 mm;
- lâmina espalhadora

B. PROCEDIMENTO =
- colocar 10 µL de sangue total a 1-2 cm de uma das extremidades da lâmina
- com lâmina aplicadora, encostar na gota pela frente e deixar o sangue escorrer por capilaridade
até suas bordas laterais
- mantendo inclinação de 30-45o, desliza-se a 2ª lâmina sobre a 1ª , sem alterar o ângulo inicial,
num movimento suave e de velocidade constante, criando um esfregaço de cerca de 3-4 cm
- deixar secar na horizontal sobre a bancada
- identificar com lápis, sobre a parte inicial (mais grossa) do esfregaço, o nome e no. do paciente,
e a data.
- Corar pelo método de Leishman ou May-Grunwald-Giemsa

2-ESFREGAÇO DE CREME LEUCOCITÁRIO


A . MATERIAIS
- sangue total; tubo de ensaio
- pipetas de 100 μL; centrífuga de separação de soro

B . PROCEDIMENTO
- colher a amostra e centrifugar a 2000 - 2500 rpm por 10 - 20 minutos
- aspirar 200 μL da parte mais superficial do sedimento (camada esbranquiçada leucocitária ou
buffy-coat ), e diluir com 100 - 200 μL do plasma, colocando em outro tubo de ensaio
- fazer dois ou mais esfregaços

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3. EXAME DE GOTA ESPESSA
.
A .MATERIAIS
- amostra de sangue total em EDTA
- lâminas de vidro de 24x76 mm;
- estufa a 37 º c (opcional);
- solução corante de Giemsa diluída 5% em água destilada

B .PROCEDIMENTO
- colocar uma gota grande de sangue em àrea circular de 1 cm 2 no centro da lâmina
- esperar secar totalmente por 2-3 horas em temp.ambiente ou 30 minutos em estufa a 37ºC
- corar com Giemsa por 30 min.
- transferir a lâmina para recipiente com tampão-fosfato pH = 7,2 por 10-20 min
- deixar secar na posição horizontal e ler procurando por toda a lâmina a presença dos parasitas

4-CONTAGEM DE CÉLULAS E PLAQUETAS EM CÂMARA


Fórmula geral para contagem de células em câmara ( de qualquer tipo )=

Céls./mm3 = no. células contadas x 1 / área x 1 / altura x diluição


(Área em mm2 e altura em mm)

3
4A-CONTAGEM DE HEMÁCIAS (Hc)
A) MATERIAIS
- tubos de ensaio de 9 x 75 mm;
- micropipetas de 20 µ L e pipetas de 5 mL
- câmaras de Neubauer espelhadas;
- lamínulas de vidro,
- Solução diluente de Gower [ 6 ]
Sulfato de sódio anidro PA (Na2SO4) 625 mg
Ácido acético glacial 1,66 mL
Água destilada 10 mL

B) METODOLOGIA
– pipetar 4 ml do diluente em tubo de ensaio e adicionar 20 µ L de ST, lavando a ponteira 2-3
vezes na mesma solução (1 : 200)
– agitar levemente, invertendo o tubo várias vezes, por 2 minutos
– colher 10 – 20 µL da diluição e preencher a câmara
– cobrir com lamínula, deixar sedimentar por 3 minutos
– ler em objetiva 40 x, em 5 quadrados de 1/25 mm2 ( 4 externos e um central ou 5 seguidos na
diagonal ) dentro do quadrado central de 1 mm2
– calcular segundo a fórmula :

No. Hc = no. Hc contadas x 5 x 10 x 200 = no. Hc contadas x 10.000 = ___ / mm3

4
4B-CONTAGEM DE LEUCÓCITOS
A) MATERIAIS
- tubos de hemólise;
- micropipetas de 20 µ l e pipetas de 1 mL
- câmara de Neubauer espelhadas
- Solução diluente de Turk
Ácido Acético Glacial PA 150-200 μL
Violeta genciana ou Azul de Metileno 100 μL
Água destilada qsp 10 mL

B) PROCEDIMENTO
- pipetar 400 µ l do diluente e adicionar 20 µ l de ST, lavando a ponteira 2-3 vezes ( diluição
1:20 )
- misturar por inversão, por 2 minutos; preencher a câmara de Neubauer (10 – 20 µL)
- deixar sedimentar por 3 minutos; contar todas as células dos 4 quadrados externos, com objetiva
40 x
- Leucócitos / mm3 = no. x ¼ x 1/ 0,1 x 20 = no. Leucócitos contados x 50 = _____ / mm3

4C-CONTAGEM DE PLAQUETAS (Método Direto ou de Brecher-Cronkite)


A) MATERIAIS
- ST com EDTA ;
- micropipetas de 10 µ l;
- tubos de ensaio;
- câmaras de Neubauer espelhadas;
- solução diluente
oxalato de amônio 100 mg
AD 10 mL
Azul de Metileno 1 % 1 gota (50 μL)
guardar em geladeira e filtrar antes do uso para diminuir os precipitados
- BM a 37oC, placa de Petri, algodão

B) PROCEDIMENTO
- Pipetar 1000 µ L, tirar 10 µ L (volume final de 990 µ L e diluição 1:100) e adicionar 10 µ l
da amostra; homogenizar; preencher a câmara com a solução final (10 – 20 µL)
- sedimentar por 10 – 15 minutos em câmara úmida (BM a 37oC ou placa de Petri revestida com
papel de filtro ou algodão umedecido com AD)
- contar as plaquetas nos 25 quadradinhos de 1/25 mm2 (ou seja, todo o quadrado central de 1
mm2), com objetiva 40x
- PLAQ/ mm3 = no. x 1 x 10 x 100 = no. plaquetas contadas x 1000 = ___ / mm3

5
5-CONTAGEM DE PLAQUETAS EM LÂMINA
MÉTODO DO ESFREGAÇO COMUM (método indireto)
- preparo do esfregaço do hemograma normal
- contar o número de plaquetas em 1000 hemácias e fazer regra de três com o número de hemácias
por mm3 do paciente :

exemplo = se em 1000 hemácias ------------ 80 plaquetas


em 4.000.000 hemácias / mm3 ----------- x

6. MORFOLOGIA DE PLAQUETAS
Morfologia normal =
1 – 3 μm de diâmetro, granulação fina azurófila no citoplasma
VPM (fl) = 6,20 – 11,55 [181]
PDW (Índice de Anisocitose Plaquetária) = 15,3 – 19,5 [181]

Alterações do Tamanho =
1. Anisocitose Plaquetária ou Megaplaqueta ou Megatrombócitos ou Plaquetase
Regenerativas :
de 4 – 8 μm de diâmetro, indicam aumento da atividade trombopoiética (resposta da
MO)
2. Plaquetas Gigantes
do tamanho de Hc ou linfócitos, isto é, > 8 – 10 μm
3. Microplaquetas
< que 2 μm, na maioria delas, achado encontrado na rara doença de Wiskott - Aldrich

Alterações da Forma =
1. Plaquetas Cinzentas : cor azul – acinzentadas
2 . Satelitismo Plaquetário

6
7-INDICES HEMATIMÉTRICOS (HEMATIMETRIA)
7.1 HEMATÓCRITO

A) Micrométodo

-MATERIAIS :
- tubo capilar para microhematócrito
- sangue total (ST) com EDTA
- lamparina ou bico de Bunsen ou massa de modelar
- Centrífuga de microhematócrito

- TÉCNICA :
- encher o capilar com ST até a 1 cm da borda
- fechar a extremidade vazia com calor/massa, sem atingir a coluna de Hemácias
- centrifugar com a extremidade fechada para fora, a 11000 rpm / 5 min.
- leitura no gráfico (acompanha as centrífugas)
- Ht = ___ %

7.2 DOSAGEM DE HEMOGLOBINA

MÉTODO DA CIANOMETAHEMOGLOBINA
A . MATERIAIS
- tubos de ensaio 75 x 100mm,
- solução de Hb padrão comercial
- reagente de cor (solução de Drabkin)
- espectrofotômetro,
- micropipetas automáticas de 10 µ L e de vidro, de 5 mL

B . METODOLOGIA
- pipetar 2,5 mL da solução de Drabkin em tubo, pipetar 10 µ L de ST e lavar a ponteira 3 vezes;
- homogenizar o tubo e aguardar pelo menos 3 minutos
- ler no espectrofotômetro em onda de 540 – 545 nm e multiplicar pelo “Fator” (ver abaixo)
- empregar o diluente (solução de Drabkin) ou a água destilada como “branco”

Obs : Cálculo do Fator :


Fazer leitura em triplicata da solução de Hb padrão (exemplo : 10 g/dl)
Fator = Hb padrão / absorbância

7
Calculado o Fator, faz-se
Hb (amostra teste) = absorbância x Fator = ___ g / dL ou g %

7.3 VOLUME CORPUSCULAR MÉDIO (VCM)


Relação entre Hc e Ht; volume médio de cada Hc

VCM = Ht (%) x 1000 ou = Ht(%) x 10 VR = 84 - 96 µ m3 ou


fl(10-15)
Hc (x1012 / L) Hc (x106 / mm3) 82,5 – 97,4 [181]

7.4 HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (HCM)

Quantidade média, em peso, de Hb em cada Hc

HCM = Hb(g%) ou = Hb (g%) x 10 VR = 27 - 32 pg(10-12)


Hc(x1012 /L) Hc (106 /mm3) 26,4 – 32,2 [181]

7.5 CONCENTRAÇÃO DE HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MÉDIA (CHCM)


concentração de Hb na Hc, exprime relação entre a saturação da Hb e o volume da Hc (“a %
da Hc que existe como Hb”)

CHCM = Hb(g%) x 100 VR = 30-35 g / dl 31,4 – 33,8 [181]


Ht(%)
8-MORFOLOGIA DE HEMÁCIAS
MATERIAIS =
- lâmina de hemograma corada;
- óleo de imersão
TÉCNICA =
- olhar inicialmente no pequeno aumento (10x) e observar a distribuição celular e qualidade do
esfregaço
- na transição entre a porção média para a mais fina do esfregaço, em objetiva de 100x, observar
em vários campos onde as Hc possam ser vistas separadas umas das outras (sem ser na extremidade
da cauda do esfregaço, onde pode haver distorção das células)

VR = hemáceas normocíticas e normocrômicas

a) Alterações do tamanho =
- Normocitose - Microcitose - Macrocitose - Anisocitose

b) Alterações da cor (teor de Hb) =


- Normocromia
- Hipocromia

8
- Hipercromia
- Policromasia ou Policromatofilia ou Anisocromasia

c) Alterações da forma =
- Poiquilocitose
- Esferocitose
- Eliptocitose
Hemáceas em alvo (Target-Cells) ou Leptócitos
- Esquistócitos ou esquizócitos (ou Células em crescente ou em forma de Elmo)
- Acantócitos (células espúrias ou espiculadas ou burr-cells)
- Hemáceas crenadas ou Equinócitos
- Dacriócitos ou hemáceas em lágrimas
- Drepanócitos ou hemáceas falciformes
- Ovalócitos
- Estomatócitos
- Hemáceas com dentadas ou bite – cells ou degmácitos
- Rouleaux
- Aglutinação de hemáceas

d) Presença de inclusões eritrocitárias


- Ponteados basófilos
- Corpos de Howell-Jolly
- Anéis de Cabot
- Eritroblastos
- Hematozoários
9-CONTAGEM DE RETICULÓCITOS
MATERIAIS=
- lâminas de vidro 24 x 76 mm, tubos de hemólise
- micropipetas de 20 µ L
- amostra de ST colhido com EDTA e BM A 37o C
- solução corante azul brilhante de cresil __________ 1000 mg
NaCl PA _____________________ 850 mg
citrato de sódio. 2H2O __________ 40 mg
AD _______________________ qsp 100 mL

METODOLOGIA (coloração pelo azul brilhante de cresil )=


- colocar 150 µ L de ST e 50 µ L da solução corante a em tubo de hemólise
- deixar em BM a 37oC por 15 – 20 minutos
- ressuspender com agitação suave, fazer o esfregaço e contar em área fina do esfregaço, com
objetiva de 100, campos consecutivos de hemácias até que o número de Hc contadas chegue a 1000
e , ao mesmo tempo, marcar quantos reticulócitos foram vistos

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EXPRESSÃO DOS RESULTADOS :

a) como % de células = se em 1000 Hc 30 Ret


em 100 Hc y Ret
RET = 3 %

b) como número absoluto / mm3 = correlação com o número total de Hc do paciente, em mm3
se em 1000 Hc 30 Ret
em 4.150.000 Hc / mm3 y Ret RET = 124.500 / mm3

c) como RET Corrigido ou Índice Reticulocitário = Ret em % relacionado com o Ht do paciente e o


normal para a idade e sexo
Ret Corrigido = Ht paciente x %
Ht normal

d) como Índice de Produção Reticulocitária (IPR) =


leva em conta, além da correção pela anemia, o tempo que o Ret permanece na circulação
(em dias), que é diretamente proporcional ao grau de anemia.
Os estudos de ferrocinética de Hillman , em 1985, mostraram que, quando a eritropoiese é
muito estimulada em relação à anemia, os RET são liberados mais precocemente na circulação Em
situações normais, há apenas a reposição das Hc velhas à velocidade de 0,8 – 1 % das Hc / dia.
Ht (%) Index (dias)
> 40% 1,0
30 - 40 % 1,5
20 - 30 % 2,0
10 - 20 % 2,5
IPR = % RET / index

10-CONTAGEM DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS


- feito o esfregaço corado com Leishman , olhar inicialmente com objetiva 10 para avaliar a
distribuição das células e a celularidade da amostra
- passar para objetiva 40x e depois para 100x (com óleo de imersão), e contar 100 leucócitos na
mesma área de avaliação da morfologia de hemácias (da porção intermediária para a cauda)
- observar as alterações qualitativas dos leucócitos

Maneiras possíveis de percorrer a lâmina (na parte mais fina do esfregaço):

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- Expressão dos resultados :
“ o número absoluto de cada célula reflete melhor qualquer quadro, porque cada tipo
celular é um sistema separado, com suas próprias funções, mecanismos de controle e resposta
a diferentes doenças, não fazendo sentido interpretar uma variação relativa a outra célula”
[2,4,7,62,481]
- em valores absolutos : x células / mm3
- em valores percentuais : x %

- Fórmula Leucocitária =
é a relação numérica existente entre os diferentes tipos de leucócitos, podendo ser absoluta (no. /
mm3) ou relativa (%).
Por convenção, anota – se na seguinte seqüência :

MBL – PMC – MC – MMC – BT – SEG – EO – BO – LO – MO , isto é,

(mieloblastos – promielocitos – mielócitos – metamielócitos – bastonetes – segmentados –


eosinófilos – basófilos – linfócitos – monócitos)

ALTERAÇÕES QUANTITATIVAS E QUALITATIVAS (MORFOLÓGICAS) DOS


LEUCÓCITOS :

1 ) GRANULÓCITOS NEUTRÓFILOS =
- Neutrofilia ou Neutrocitose
- Neutropenia ou Neutrocitopenia
- Desvio à Esquerda Escalonado e Não escalonado
- Reação Leucemóide
- Reação Leuco-Eritroblástica
- Hiato Leucêmico
- Hipersegmentação Nuclear (Polilobocitose ou desvio à direita)
- Hipossegmentação Nuclear
- NO necrobióticos
- Hipogranulações Citoplasmáticas
- Granulações Tóxicas
- Vacuolizações

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- Bastões de Auer
- Corpos de Dohle

2 ) GRANULÓCITOS EOSINÓFILOS
- Eosinofilia
- Eosinopenia ou Anaeosinofilia
- Vacuolizações e Hipogranulações citoplasmáticas
- Granulações bsofílicas

3 ) GRANULÓCITOS BASÓFILOS
- Basofilia
- Basopenia

4 ) LINFÓCITOS
- Linfocitose
- Linfopenia ou Linfocitopenia
- Linfócitos Atípicos
- Sombras Celulares de Grumprecht ( ou Smear Cells ou Smudge Cells)

5 ) MONÓCITOS
- Monocitose
- Monocitopenia
- Inclusões Anormais
- Vacuolizações Citoplasmáticas

11-VELOCIDADE DE HEMOSSEDIMENTAÇÃO (VHS)


MÉTODO DE WESTERGREEN – KATZ :

MATERIAIS =
- ST com EDTA
- Pipetas de Westergreen;
- pera
- Suporte para pipetas Westergreen

METODOLOGIA =
- Homogenizar a amostra e encher, com auxílio da pera, a pipeta de Westergreen, até a marca
superior 0;

12
- Colocar a pipeta na posição vertical e ler a coluna de plasma após 1 e 2 horas

12-PESQUISA DE CÉLULAS LE
MÉTODO DE HARGRAVES MODIFICADO :

1. colher 10 mL de ST em TUBOS SECO; deixar coagular em BM a 37o C por 2 horas


2. separar o soro por inversão para um tubo A e centrifugá-lo por 5 min./5000 rpm; reservar
3. colocar uma peneira de malha fina sobre um cálice de vidro
4. colocar o coágulo na peneira e amassá-lo com o fundo de um tubo
5. passar o filtrado, recolhido em vidro de relógio, para um tubo B, e centrifugá-lo a 2000 rpm / 30
minutos
6. aspirar a camada leucocitária (entre o soro hemolisado e o sedimento de Hc) com uma pipeta de
500 µ L
7. passar o material aspirado para um tubo C e acrescentar 500 µ L do soro do tubo A
8. homogenizar manualmente ou no vórtex
9. incubar o tubo C em BM 37o C / 30 minutos;
10. centrifugar o tubo C a 2000 rpm/10 minutos
11. aspirar e desprezar o sobrenadante; homogenizar o sedimento; fazer esfregaços e corar com
Leishman
12. examinar ao MO com objetiva de 40x e 100 x, contando 500 neutrófilos

se > 5 células LE / 500 NO (>1%), sugestivo de LES


se < 5 células LE / 500 NO (<1%), sugestivo de outra doenças

13 -TEMPO DE SANGRAMENTO (TS)


MATERIAIS :
- lancetas para punção digital;
- papel de filtro;
- cronômetro
- algodão; álcool para antissepsia
- esfigmomanômetro adulto e/ou infantil (método de Ivy)

MÉTODOS :

1 . IVY [260]

13
- recomendado pela ICSH, descrito em 1941
- fazer antissepsia com algodão embebido em álcool
- punção na face volar lateral do antebraço., 3 – 5 cm abasixo da prega do cotovelo
- o esfigmomanômetro deve ser inflado a 40 mm Hg 30 segundos antes da punção
- escolher áreas sem pelos ou cicatrizes ou vênulas superficiais
- fazer 2 incisões de +- 5 mm de extensão e 1 – 2 mm de profundidade ( lesão apenas de pequenos vasos )
- absorver o sangue com papel de filtro a cada 30 “, sem encostar no coágulo plaquetário

VR = 1 a 7 minutos

2 . DUKE [260]
- descrito em 1912, a punção é feita no lóbulo da orelha, com uma incisão de +- 4 mm de extensão em sua
borda, com cerca de 3 – 4 mm de profundidade
- haveria melhor correlação clínica, embora seja tido como menos sensível

VR = 1 a 4 minutos

3 . DUKE MODIFICADO
- a punção é feita na polpa digital, estando mais sujeito a falsos resultados, pela maior sensibilidade a
vasoconstricção ou vasodilatação (febre, temperatura ambiente , ansiedade ou medo do paciente)

VR = 1 a 3 minutos

14 - PROVA DO LAÇO (PL)


(PROVA DE FRAGILIDADE CAPILAR OU PROVA DO TORNIQUETE)

MATERIAIS :
- Esfigmomanômetro adulto ou infantil
- Cronômetro

MÉTODO : ( Rumpel – Leed )


- medir a PA do paciente
- calcular sua PA MÈDIA (PAM) = PAS + 2 PAD
3

14
- marcar área de 5 x 5 cm no antebraço , abaixo da prega do cotovelo
- inflar o manguito e deixar na PAM por 3 – 5 minutos
- contar o número de petéquias imediatamente após o teste (e depois de 30 minutos – 62)
Interpretação =
 até 5 = negativo
 6 a 10 = duvidoso
 10-50 = +
 >50, até o dorso da mão = ++
 >70, 2 a 4 mm = +++
 incontáveis, >5 mm = ++++

17 - TESTE DE RETRAÇÃO DO COÁGULO (RC)


MATERIAIS =
- tubos de ensaio 75 x 100 mm
- BM a 37 oC
- Tubo de hemograma (EDTA)
- pipetas graduadas

METODOLOGIA ( MÉTODO DE BIGGS-MaCFARLANE 1962) =


- colher 5 mL de ST em tubo seco e colocar em BM para coagular (pode-se fazer o TC nesta fase)
- após coagulação, deixar o tubo no BM por até 2 horas
- determinar o Ht do paciente com outra amostra colhida junto com a primeira
- após 2 horas (ou assim que o coágulo estiver bem firme após este tempo) retirar o coágulo e centrifugar o
restante da amostra, no tubo original
- medir com pipeta graduada o volume de soro restante
- calcular

% retração = volume de soro x Ht teste


volume do ST Ht normal VR = 40 – 60 %

18 - TEMPO DE COAGULAÇÃO (TC) [5,6,62,71]

MATERIAIS =
- 3 tubos de vidro de 13 x 100 mm ou tubos siliconizados
- banho-maria a 37 o C
- amostra de sangue total colhido sem anticoagulante

MÉTODO (Lee – White , descrito em 1913) =


- identificar os três tubos com números 1 – 2 – 3 ou dois tubos (62)

15
- colher 4 – 5 mL de ST, com o menor trauma possível, e colocar 1 mL em cada tubo, pondo o sangue nos
tubos 3 – 2 – 1 (menos contaminada com tromboplastina tecidual)
- disparar o cronômetro assim que começar a fluir sangue (se colhido em seringa de vidro) ou disparar ao
colocar no primeiro tubo ( no caso de seringa de plástico) .
- incubar a 37 o C
- de minuto a minuto, observar o 1º tubo , por inversão lenta, até que o sangue coagule (marcar o tempo)
- passar a observar o 2º tubo de 30 em 30 segundos, e após a coagulação deste, o 3 º tubo
- anotar o tempo de cada um deles e fazer sua média aritmética

VR = tubos de vidro = 6 – 12 min.


tubos siliconizados = 20 – 30 min.

19 - TEMPO DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA (TAP)


MATERIAIS =
 ST colhido em tubo citratado;
 centrífuga de soro;
 tubos de ensaio
 BM a 37oC
 Tromboplastina Cálcica Liofilizada (Trombo ISI ou similar)
 cronômetro

16
 alça de metal, para detectar a formação do coágulo

METODOLOGIA (Método de Quick modificado)=


1. reconstituir a solução de Tromboplastina com água destilada estéril, no volume indicado no frasco.
Deixar dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea; agitar o frasco antes
do uso
2 . separar o PPP, centrifugando a 3000 rpm/ 10 minutos
3. se não realizar imediatamente, deixar o PPP a 4oC até a realização do teste
4 . em tubo de hemólise , colocar 100 µ l do PPP e incubar por 2 minutos, pelo menos, a 37oC
5 . colocar 200 µ l da solução de Tromboplastina em outro tubo, incubar por dois minutos também
6. acrescentar o PPP no tubo com a Tromboplastina e disparar o cronômetro
6 . após a leitura em segundos, olhar a tabela NA COLUNA DO TEMPO CONTROLE, para determinação
da % de atividade da protrombina e do RNI

VR =
Medida do tempo de coagulação em segundos = 11,5 A 13,5 SEGUNDOS
Avaliação da Porcentagem de atividade da Protrombina = 70 – 100 % de AP
Relação Tempo de coagulação Paciente / Controle = < 1,25
Relação Normalizada Internacional (RNI) = 1,00 a 1,40

ISI ISI
RNI = R = TAP paciente
TAP normal

TAP (teste ou controle)= pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve
estar entre 11,5 – 13,5 segundos

20 - TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADO(TTPA)


MATERIAIS =
1. idem TAP
2. Cefalina comercial (Cefamat ou Replastin ou Hemostat ou similar)
3. CaCl2 solução a 0,25 M (estoque) ou a 0,025 (pronta para uso)

17
METODOLOGIA =
2. reconstituir a solução de Cefalina com água destilada estéril, no volume indicado no frasco. Deixar
dissolver e agitar suavemente por inversão até obter suspensão homogênea, agitar o frasco antes do uso
3. separar o PPP centrifugando a amostra de ST em 3000 rpm/10 minutos
4. se não realizar imediatamente, deixar o PPP a 4oC até a realização do teste
5. preparar a solução de CaCl2 para uso (0,025 M), diluindo a solução-estoque com água destilada 1:10.
Incubar a 37oC por pelo menos 5 minutos antes do uso
6. em tubo de hemólise em BM, colocar 100 µ l de PPP + 100 µ l de cefalina ; incubar por 3 minutos
7. acrescentar 100 µ l de CaCl2 a 0,025 M (solução de uso 1:10) e acionar o cronômetro

VR = 26 a 35 segundos
Relação = TTPA paciente de 0,9 a 1,25
TTPA normal(teste)

TTPA teste = pool de PPP de pelo menos 4 amostras, deve ser preparado periodicamente e deve estar entre
30 – 40 segundos

21 - PESQUISA DE ANTICORPO ANTICOAGULANTE LÚPICO


Método de Howell ou Método da Mistura de Soros =

1. sempre que TTPA ou TAP com relação paciente / teste > 1,25, fazer mistura 1:1 com PPP normal do dia
(alguns autores sugerem uma mistura de 1:4 com PPP normal)
2. proceder como nas respectivas técnicas (TTPA ou TAP)
3. fazer leitura imediata após a colocação dos reagentes (M1) e após incubação de 2 horas (M2)

VR = se R paciente > 1,25 = presença de inibidor


normal
se R paciente < 1,25 = deficiência de fator e ausência de inibidor
normal

Obs.: 15 % dos casos de SAA têm correção do TTPA com a mistura M1, mas aumentam com a mistura M2

22- DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO


1. MÉTODO DE CLAUSS (1957)

MATERIAIS=
- amostra de ST em tubo citratado
- centrífuga de soro, BM a 37o C, cronômetro
- reagentes :
1 = trombina bovina liofilizada (diluir em AD no volume indicado = 100 U / mL);

18
2 = diluente com tampão Veronal ou Imidazol (varia, segundo o fabricante)
- plasma padrão = pool de amostras de plasmas de 4 pessoas normais ou comercial acompanhando o kit

METODOLOGIA =
- centrifugar a amostra do paciente por 10 minutos a 3000 rpm e separar o plasma pobre em plaquetas
(PPP)
- reconstituir o reagente 1 com AD (segundo a orientação do fabricante); deixar à temperatura ambiente de
20-25o C antes de misturar com a amostra (NÃO INCUBAR).
- Homogenizar suavemente antes de usar.
- diluir o plasma a 1/10 (100 µ L de PPP e 900 µ L do reativo 2) e deixar incubado por 2 minutos
- misturar 100 µ L do reativo 1 com 200 µ L do PPP diluído e ler o tempo de coagulação no
cronômetro.
- calcular a concentração usando a tabela que acompanha o kit, onde o resultado em segundos será
convertido em concentração de fibrinogênio através da correção pelo fator K, pré - determinado pelo
fabricante, sendo que a concentração de FIB. será = K x n, onde n é a diluição do PPP usada (10).
Considerar também o tipo de anticoagulante usado (seco x líquido)

23 - TEMPO DE TROMBINA (TT)


MATERIAIS =
1 . solução de Trombina bovina do kit de Fibrinogênio, diluída 1 : 10 (concentração de 10 U/mL)
2. Tampão do mesmo kit
3. PPP citratado
4 . tubos de ensaio
5 . centrífuga de soro
6 . BM a 37o C

19
7 . cronômetro

METODOLOGIA (método de Caen) = [5,6,62]


1. preparar a solução de trombina a 10U/mL e não incubar
2. colocar 200 µ l de PPP puro em tubo de ensaio em BM
3. colocar 100 µ l da solução de trombina no tubo e disparar o cronômetro
4. inverter delicadamente o tubo até a formação do coágulo
5. o ideal é sempre fazer um controle normal do dia com pool de plasmas
6. não deixar a solução de trombina a 37o C

VR = 15 a 18 segundos Relação com PPP normal < 1,25

24 – TEMPO DE LISE DE EUGLOBULINA


MATERIAIS =
1. PPP citratado
2. solução salina tamponada pH 7,3
a) solução base de acetato de Veronal : acetato de sódio tri-hidratado 1,94 g
dietilbarbiturato de sódio 2,94 g
AD qsp 100 mL
b) diluir 5 mL da solução a) em 5 mL de ácido clorídrico 0,1 N (solução de HCl original = 12 N) e
Soro fisiológico 90 mL
3. solução de CaCl2 M/10 = 1,37 mL de CaCl2 1,8 M em 100 mL de AD
4. Ácido acético 1 % = 0,1 mL de ácido acético glacial em 10 Ml de AD
5. solução salina diluída 1/10 = 10 mL de soro fisiológico em 90 mL de AD, ajustando o pH para
5,2 com ácido acético a 1 %

24.1- Método de Bloom (1961) [141]=


1. pipetar em 2 tubos de ensaio 9 mL de AD + 0,5 mL de PPP + 0,1 mL de ácido acético 1 %
2. homogenizar e incubar a 4o.C por 30 minutos
3. centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos e desprezar o sobrenadante por inversão, enxugando as paredes do
tubo com lenço de papel
4. pipetar 5 mL da salina diluída e ressuspender o precipitado
5. centrifugar novamente como no item b)
6. pipetar 0,5 mL da solução salina tamponada e dissolver completamente o precipitado
7. incubar os tubos a 37oC por 2 minutos e adicionar 0,5 mL do CaCl2.
8. quando formar o coágulo, disparar o cronômetro e observar inicialmente a cada 15 minutos; após o
início da lise observar a cada 5 minutos.

20
9. anotar o tempo de lise total do coágulo; a média dos tempos será considerada como o tempo de lise do
coágulo de euglobulina
VR = 90 – 180 minutos
Obs.:
- as variações fisiológicas são acentuadas, segundo atividade, alimentação, cuidados na coleta. Só levar em
consideração os grandes encurtamentos.
- Pacientes com fibrinólise suficiente para provocar sangramentos encurtam o TLE para 20 - 30 minutos
- O teste deve ser feito dentro de 2 horas da separação da fração euglobulínica ( armazenamento do
precipitado euglobulínico não dissolvido a – 20o C permite fazer o teste até 24 horas depois de preparado
[93])
- A heparina não precipita na fração euglobulínica
- A lise depende principalmente da concentração do I e do plasminogênio

24.2- Método de Nilsson, (1978) [5] =


1. PPP citratado mantido a 4o C
2. solução de ácido acético 0,025% = 100 μl de Ácido acético glacial em 40 mL de AD
3. tampão salina barbital pH 7,38 = 60 mg de dietilbarbiturato de sódio + 70 mg de NaCl + 2,1 m L de HCl
0,1 N, diluídos em AD qsp 10 ml
4. Solução de Trombina a 10 U / ml (como no tempo de trombina), preparar na hora

- misturar 1 ml de PPP com 9 ml de ácido acético e acertar o pH para 5,9 – 6,0 (PASSO
FUNDAMENTAL)
- misturar e incubar 30 min. / 4o C
- centrifugar 2000 rpm / 5 min.
- descartar o sobrenadante por inversão e secar as paredes do tubo
- dissolver e ressuspender o precipitado no tampão PBS 1 ml; incubar 37o C / 10 min.
- adicionar 500 l da solução de trombina e, após a formação do coágulo, disparar o cronômetro
- checar a lise do coágulo a cada 15 minutos
VR = 70 – 300 minutos

25 . DOSAGEM DE FATOR V

I) PREPARO DE PLASMA OXALATADO (deficiente em fator V): [5]


Solução de oxalato de cálcio oxalato de cálcio 1,34 g

21
AD 100 mL

1. Misturar 9 volumes de ST para 1 volume da solução de oxalato de cálcio


2. Centrifugar por 10 minutos a 3.000 rpm para obtenção do PPP
3. Fazer pool de plasmas normais oxalatados
4. Incubar em BM 37o C por 24 horas
5. Checar o TAP, que deve estar entre 60 - 80 segundos (se < 60 = incubar por mais algumas horas e se >
80, desprezar e preparar outro)
6. Aliquotar este PPP em frascos de 1 mL

METODOLOGIA :
Construir curva de diluição com PPP normal, na mesma técnica para dosagem de fator VIII
ao trabalhar com a amostra-teste,

PREPARO DE PLASMA RICO EM PLAQUETAS

22
26. ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA ALCALINA
Método : Eletroforese em Acetato de Celulose pH = 8,6

23
MATERIAIS =
1. cubas de eletroforese, fonte geradora de voltagem
2. tiras de acetato de celulose
3. papel de filtro ou Perfex, aplicador, estufa a 60 – 70o C
4. clorofórmio ou solução de Saponina a 1 %

REAGENTES =
1. Solução tampão tris-EDTA-borato 0,025 pH = 8,6
tris-hidroxi-metilamina 10,2 g + EDTA 0,6 g + Ácido bórico 3,2 g + AD qsp 1000 mL

4. Solução Corante (Ponceau)


Ponceau S 0,5g + Ácido tricloroacético 5,0 g + AD qsp 100 mL

3. Solução Descorante
Ácido Acético Glacial 100 mL + Metanol 50 mL + AD qsp 1000 mL

4. Solução Transparentizadora
Álcool Metílico 87 mL + Ácido Acético 12 mL + Glicerol 1 mL

5. SF 0,9 %

METODOLOGIA (método de Kohn) =


1. Preparar o hemolisado rápido com saponina : 100 μL de ST com 150 μL de saponina 1% (ver adiante)
2. colocar de 30 a 40 mL do tampão de cada lado da cuba;
3. embeber o acetato de celulose na solução tampão, previamente, em outra cuba, por pelo menos 10 –
15 min.;
4. enxugar o acetato de celulose com papel absorvente (para retirar o excesso do tampão, sem deixa-lo
totalmente seco) e colocar no suporte da cuba, em posição reta e esticada, tocando a ponte de papel de
filtro ou Perfex, mergulhada na solução tampão;
5. aplicar 2 – 5 µ L da amostra com o microaplicador, a 2 cm do compartimento do polo negativo
(catodo);
6. cobrir a cuba com a tampa para evitar a evaporação e contaminação da amostra;
7. passar 300 V / 20 minutos ou 200 V / 30 minutos de corrida, desligar a fonte;
8. analisar o fracionamento inicialmente sem corar;
9. remover as tiras e corar com Ponceau S por 5-10 min.;
10. enxaguar em água corrente para tirar o excesso do corante;
11. transferir para outra vasilha com a solução descorante por 3 – 5 min., agitando-a cuidadosamente, e
deixando até que fiquem só as frações e que o resto da fita volte à cor branca natural;
12. fazer a transparentização, deixando as tiras descoradas em metanol puro por 1-2 min., e depois por 3
min. na solução transparentizadora;
13. colocar as tiras bem esticadas em superfície de vidro e levar à estufa entre 60 – 70o C, até sua
transparentização (alguns minutos);
14. Remover as fitas e colar no laudo do paciente

PREPARO DOS HEMOLISADOS PARA ELETROFORESE DE Hb :

24
- existem muitas técnicas mas dependerá da prática local e de eventuais técnicas adicionais a serem usadas
para outros exames com a mesma amostra
- se usadas Hc não lavadas, as proteínas plasmáticas podem ser confundidas com Hbs anormais
- se usadas Hc tratadas com solventes orgânicos como tolueno ou CCl 4, é tecnicamente mais demorado, e
eventuais Hbs Instáveis e hemoglobina H podem ser degradadas
- se usado KCN, não deve ser feita coloração nas tiras
- uso de AD é o método mais puro, e de escolha quando há suspeita de Hbs Instáveis
- pode–se guardar Hc lavadas ou hemolisados mas nunca Hc não lavadas, em congelador (controles, por
exemplo).
- Ao usar hemolisados congelados, recentrifugar antes de usar.

1. Técnica do Clorofórmio = [13]


1. amostra com heparina ou EDTA
2. 2 mL do ST centrifugar a 1500 rpm / 5 min.
3. lavar as Hc por 3 vezes com SF
4. um volume de Hc. Lavadas + dois volumes de AD, agitar vigorosamente e homogenizar até a hemólise
completa
5. adicionar um volume de clorofórmio
6. agitar vigorosamente e centrifugar a 2000 – 3000 rpm / 15 min.
7. transferir o sobrenadante para o outro tubo
8. estocagem = hemolisados em congelador – ao descongelar, se houver a formação de precipitados no tubo,
deve-se centrifugar por 5 minutos / 1500 rpm
9. ST são estáveis a 4o C, desde que mantidos estéreis
10. tempo de conservação das soluções = 30 dias em geladeira a 4o C

2. Técnica de Hemolisado rápido com Saponina 1% [13] ou 2% [143]


Indicada para toda eletroforese de Hb, para poder detectar Hb H, o que não é possível com o uso de
clorofórmio : Saponina 1g [13] ou 2g [143]
AD 100 ml
- para 100 μl de ST, colocar 3 gotas de saponina 1% (aproximadamente 150 μl) ou para 25 μl de ST
colocar 50 μl de saponina 2%
- homogenizar com um bastão de plástico ou palito de dentes cortado; está pronto para uso, não pode ser
guardado.
Obs.: as soluções de Saponina devem ser estocadas em geladeira (facilidade de contaminação por fungos)
OBS.: estas técnicas gralmente dão Hb final do hemolisado de 10 – 15 g%; se necessário, dosa-la no
hemolisado; Regra Prática =
Se Ht paciente vol. ST vol. Sol. hemolisante
> 40 % 1 2–3
30 – 40 % 1 1
< 30 % 2 1

27 -PROVA DE FALCIZAÇÃO
MATERIAIS =

25
1. solução de metabissulfito de sódio : metabissulfito de sódio (Na2S2O5) 200 mg + AD qsp 10 mL, preparar
antes de fazer o esfregaço
2. amostra de ST colhido com EDTA
1. lâminas e lamínulas de vidro
2. esmalte de unhas ou Entellan
3. placa de Petri, algodão e AD

METODOLOGIA =
(método do afoiçamento pelo metabissulfito de sódio ou método de Daland e Castle – 1948)

1. pegar 50 μL de ST com 50 μL de solução de metabissulfito a 2 %


2. colocar sobre uma lâmina e misturar com a ponta de outra lâmina
3. colocar a lamìnula sobre a gota de sangue, ter o cuidado de evitar a permanência de bolhas de ar
4. retirar o excesso de sangue das bordas com gaze ou papel de filtro
5. vedar as bordas da lamínula com o esmalte
6. deixar a lâmina em câmara úmida por 24 horas, em lugar fresco, à temperatura ambiente
7. ler em MO com objetiva 40 x com 1 hora e com 24 horas incubação

28-TESTE DE SOLUBILIDADE PARA Hb S (TESTE DE ITANO)


MATERIAIS =
1. tubos de vidro 12 x 75 mm, pipetas
2. solução de fosfato : KH2PO4 anidro 33,78 g + K2HPO4 anidro 59,33 g + Saponina 2,50 g + AD qsp 250
mL
3. ditionito de sódio (Na2S2O4)

METODOLOGIA [Método de Itano (1953)] =


1. dissolver 100 mg do ditionito de sódio em 10 mL da solução de fosfato (2 mL por teste)
2. acrescentar 20 µ L da amostra de ST
3. misturar por rotação e aguardar por 2 minutos
4. colocar o tubo a 2 cm de um papel branco traçado com linhas negras horizontais
5. interpretação = se linhas visíveis =não turvação da solução pela ausência da Hb S
se linhas não visíveis = turvação da solução pela presença de Hb S

29. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA A2

26
MATERIAIS =
1. idem Eletroforese de Hemoglobina em acetato de celulose pH 8,0 – 9,0
2. espectrofotômetro
3. tesoura

METODOLOGIA =
1. preparar o hemolisado pela técnica do clorofórmio
4. aplicar 10 μL de hemolisado em 2 fitas de Celogel de 2,5 cm de largura ou 20 μL em fita com 4,5 – 5,5
cm de largura
5. correr 200 V/30 minutos ou 300 V/20 minutos, observando visualmente a separação da Hb A2 das
demais; terminada a corrida eletroforética, cortar as faixas correspondente à Hb A2 e A1, sem coloração,
colocando A2 em tubo com 3 mL de AD e A1 em tubo com 15 mL de AD
6. deixar eluir por 2 horas, agitando os tubos a cada 15 minutos
7. ler, em absorbância de 415 nm, acertando o zero com AD
8. calcular
Hb A2 (%) = DO Hb A2 x 100
5 x DO Hb A1 + DO Hb A2

VR = 2,0 – 3,7 %

30. DOSAGEM DE HEMOGLOBINA FETAL

27
MÉTODO DE SINGER MODIFICADO (por Pombrey)

MATERIAIS :
1. Solução NaOH 0,083 N(N/12) NaOH 332 mg
AD 100 ml
2. Sulfato de Amônio saturado a 50% Sulfato de Amônio saturado 800 ml
(solução de uso) AD 800 ml
HCl 10 N 4 ml
3. Hidróxido de Amônio 0,04% NH4(OH)2 4 ml
AD 1000 ml
4. espectrofotômetro
5. pipetas de 1 – 2 – 5 – 10 mL e micropipetas de 50 – 100 - 500 µ L
6. cronômetro, papel de filtro Whatmann ou similar
7. tubos de hemólise 13 x 100 mm, funis pequenos (3-4 cm de diâmetro)

METODOLOGIA :
1. Colocar 4 tubos em fila (A,B,C,D)
2. Pipetar inicialmente 3,2 ml de NaOH 0,083 N no tubo A
3. Separar o tubo B para o filtrado
4. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (1a diluição do padrão) – tubo C
5. Pipetar 5 ml do NH4(OH)2 (diluição final do padrão) – tubo D
6. Pipetar 0,2 ml do hemolisado no tubo A, misturar bem; após exatamente 1 minuto acrescentar 6,8 ml de
SAS 50%; misturar e deixar em repouso por 20 minutos
7. Filtrar para o tubo B usando papel de filtro Whatman 42 duplo
8. Pipetar 100 μl do hemolisado no tubo C, misturar e transferir 50 μl para o tubo D
9. Ler a absorbância em 415 nm, acertando o zero do aparelho com água destilada

10. Calcular : Hb F (%) = Leitura do Filtrado (B)


Leitura do Padrão (D)

VR = < 1,0% (ADULTOS)

31. PROVA E CURVA DE FRAGILIDADE OSMÓTICA

28
MATERIAIS =
1. solução fisiológica, AD;
2. Espectrofotômetro, tubos de ensaio
3. Sangue heparinizado (1 gota / mL de sangue)

4. Solução fisiológica 10% (10 g/L) tamponada pH 7,4 = SOLUÇÃO ESTOQUE


NaCl P.A. 90 g OBS.: é importante controlar o pH para 7,4
NaH2PO4.2H2O 2,43 g pois cada diminuição de 0,1 equivale a
Na2HPO4 13,65 g diminuir a tonicidade da solução de NaCl
AD qsp 1000 mL em 0,1 g/L

5. solução fisiológica 1% (SOLUÇÃO DE USO)


solução estoque 10% 25 mL
AD qsp 250 mL

METODOLOGIA ( Método de Lise por soluções hipotônicas da NaCl ou método de Dacie, 1960)=

1. coletar ST do paciente e controle normal


2. diluir a SF 1% como indicado na tabela

TUBOS NaCl 1% AD conc. HEMÓLISE


(mL) (mL) NaCl(%) (%)

1 10 0,0 1,00 0
2 8,5 1,5 0,85 0
3 7,5 2,5 0,75 0
4 6,5 3,5 0,65 0
5 6,0 4,0 0,60 0
6 5,5 4,5 0,55 0
7 5,0 5,0 0,50 0a5
8 4,5 5,5 0,45 5 a 45
9 4,0 6,0 0,40 50 a 90
10 3,5 6,5 0,35 90 a 99
11 3,0 7,0 0,30 97 a 100
12 2,0 8,0 0,20 100
13 1,0 9,0 0,10 100
14 0,0 10,0 0,00 100

3. transportar 5 mL de cada diluição para outros 14 tubos identificados, e trabalhar com a metade da
diluição (2,5 mL em cada tubo = para o controle e o teste)
4. acrescentar 50 μL do ST em cada tubo , homogenizar por inversão
5. deixar em repouso por 30 minutos em TA
6. agitar suavemente e centrifugar a 2000 rpm / 5 minutos ou 2500 rpm / 10 minutos [279]
(transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo, sem ressuspender o depósito, e pingar 2 gotas de
NH4OH 1%, misturando-se por inversão [279])
7. transferir o sobrenadante para a cubeta de leitura e ler em filtro verde a 540 ou 550 nm

29
8. o aparelho deve ser zerado com o sobrenadante do tubo 1 (branco ou 0% de hemólise)
9. o tubo 14 representa o 100% de hemólise
10. calcular

% hemólise = DO sobrenadante cada tubo x 100


cada tubo(1-13) DO sobrenadante tubo 14

VR = a faixa normal de hemólise inicia no tubo 8 (0,45 % de NaCl) e termina no tubo 11 (0,30 % de NaCl)

OBS.:
1. no teste com incubação por 24 horas, incubar a amosta de ST a 37 oC em BM por 24 horas, sendo que a
esterilidade é fundamental. Neste, não pode ser usado o EDTA, porque provoca alterações morfológicas nas
Hc. A sequência técnica é a mesma como descrito acima, porém usando 17 tubos, com a inclusão de
concentrações de 0,9 – 0,8 – 0,7 % de NaCl

VR = % de NaCl % de hemólise

17 0,10 100
16 0,20 91 – 100
15 0,25 90 - 100
14 0,30 80 - 100
13 0,35 75 - 100
12 0,40 65 - 100
11 0,45 55 - 95
10 0,50 36 - 88
09 0,55 15 - 70
08 0,60 0 - 40
07 0,65 0 - 19
06 0,70 0–9
05 0,75 0
04 0,80 0
03 0,85 0
02 0,90 0
01 1,00 0

2. Os resultados devem ser expressos em gráfico feito em papel milimetrado, com as porcentagens de
hemólise na ordenada e as porcentagens de NaCl na abscissa
3. Deve-se comparar com uma curva normal do dia (torna a interpretação mais fácil)

32. DOSAGEM DE METEMOGLOBINA (MHb)

30
MATERIAIS =
1. espectrofotômetro; tubos de ensaio 17 x 100 mm
2. pipetas de 1 – 2 – 10 – mL e micropipetas de 50 e 100 µ L
3. solução tampãop fosfato M/15 pH = 6,8 (solução de estoque)
Na2HPO4.12H2O 9g
KH2PO4 5,7 g
AD qsp 1000 mL
4. solução tampão fosfato M/60 pH = 6,8 (solução de trabalho)
solução 3 (ESTOQUE) 250 mL
AD qsp 1000 mL
5. amostra de ST normal para controle

METODOLOGIA (método colorimétrico) =


1. em tubo de ensaio, pôr 200 µ L da solução de Hb (hemolisado com clorofórmio) ou 100 µ L de ST +
100 µ L de saponina a 1 %, e acrescentar 6 mL da solução – tampão fosfato M/60 pH 6,8 (tubo A)
2. pegar 300 µ L do tubo A e colocar 3 ml do tampão fosfato M/60 (tubo B)
3. no tubo B, ler a DO em 540 nm e anotar como DO B (esta leitura estima a % de oxi-Hb existente no
sangue);
4. no tubo A, ler a solução em 630 nm e anotar como DO A (essa leitura estima a % de metaHb)
5. fazer todas as medidas contra um branco formado pela solução tampão de fosfato 2,5 mL e 50 µ L de
saponina a 1 %(se tiver sido usada como hemolisante)
6. calcular
% MHb = DO A x 100 VR = até 4 %
DO A + (10 x DO B)

OBS.:
- É recomendável sempre fazer controle normal com 1 – 2 amostras diferentes
- Outros métodos podem ser usados, como :
a) eletroforese de Hb pH 8,6 = fração difusa cor cinza ou marrom na posição da Hb F ( nas causas
congênitas é + mas nas causas adquiridas raramente +)
b) pesquisa de corpos de Heinz

33. DOSAGEM DE GLICOSE – 6 – FOSFATO – DESIDROGENASE

31
(G6PD)

33.1 Método de Brewer (Prova de Redução da Metemoglobina)

MATERIAIS =
1. Solução de Glicose 0,28 M (R1) : Glicose 500 mg + AD qsp 10 mL
2. Solução de Nitrito de Sódio 0,18 M (R2) [estável por 30 dias] : NaNO2 125 mg + AD qsp 10 mL
Obs.: no artigo original é preparada apenas 1 solução de NaNO3 + Glicose num mesmo volume de
AD qsp 100 mL, nas mesmas dosagens

3. Solução de Azul de Metileno 0,0004 M (R3) : Azul de Metileno trihidratado 1,5 mg + AD 10 mL


4. BM a 37 ºC + tubos de ensaio de vidro (reagentes podem aderir às paredes dos tubos plásticos)
5. Pipetas de 1 mL e micropipetas de 50 µ L
6. ST colhido com EDTA (se Ht < 30%, retirar plasma para Ht final de 40% ± 5%)

METODOLOGIA QUALITATIVA =
1. colher 3 mL de ST em EDTA (conservar a 4ºC, estável por 72 horas)
2. rotular 3 tubos A = padrão normal 500 µ L ST
B = padrão positivo 500 µ L ST+ 25 µ L R1 + 25 µ L R2
C = teste 500 µ L ST + 25 µ L R1 + 25µ L R2 + 25 µ L R3
3. homogenizar os tubos sem agitar, invertendo – os delicadamente, por 15 minutos
4. incubar em BM a 37ºC por 3 horas, exatamente, homogenizando de 15 / 15 minutos
5. diluir todos os tubos na proporção de 0,1 mL para 10 mL de AD, misturar e fazer a leitura
6. comparar a cor do teste (C) com a cor dos tubos A e B, entre 2 e 10 minutos após a diluição das amostras

- A (controle normal) = cor vermelho vivo (< 5% de metaHb formada persiste)

- B (controle positivo) = cor acastanhada (> de 70% da metaHb formada persiste)

- C (teste) = cor variável, do vermelho ao castanho, dependendo dos níveis de G6PD

34. PESQUISA DE CORPOS DE INCLUSÃO DE HEMOGLOBINA H

32
MATERIAIS =
1. idem para contagem de reticulócitos
2. solução de azul cresil brilhante (13) : azul cresil 1g
citrato de sódio 0,4 g
NaCl 0,8 g
AD qsp 100 mL
3. usar amostra controle normal

METODOLOGIA =
1. incubar 100 µ L de ST com 300 µ L da solução de azul de cresil brilhante a 1 %, em BM, por 1 a 2 horas
2. ler em lâmina de imersão , procurando e quantificando a quantidade de células com inclusões azul –
pálidas, tipo bolas de golfe

VR = negativo

OBS.:
1. No Portador Silencioso de α - talassemia = proporção de hemácias com Hb H é de cerca de 1 / 1000 –
1 / 2000 Hc
2. No Traço α - talassêmico = proporção de 1 / 250 – 1 / 500 Hc
3. Na Doença da Hb H, + em todos os campos observados

À Eletroforese Hb em pH 8,6 pode-se observar a Hb H em níveis de 2 % no Traço α – Talassêmico / 10


– 20 % na doença da Hb H e na Hidropsia Fetal, enquanto a Hb Bart”s geralmente é vista em níveis de 80 –
100 % somente na Hidropsia Fetal.

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GRADUAÇÃO DAS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO EM
MUNOHEMATOLOGIA
A leitura das reações de aglutinação / hemólise, em Imunohematologia, podem ser lidas
macroscopicamente, contra fonte de luz ou superfície iluminada, ou microscopicamente, colocando-se 1 gota
da suspensão entre lâmina e lamínula.
A padronização da graduação de leitura é importante para padronizar as interpretações entre
diferentes laboratórios.

Segundo a literatura, as intensidades de reação podem ser :

4+ botão sólido com pequenos grumos e fundo claro

3+ grumos grandes e numerosos com fundo claro

2+ grumos pequenos e numerosos com fundo róseo

.......

1+ grumos pequenos e fundo bastante róseo

.......
.......

w presença de minúsculas aglutinações em fundo bastante róseo

. . . . .
. . . . . .
. . . . .
.
0 ausência de aglutinação; fundo bastante róseo com hemáceas em
suspensão

34
Quantificação das reações de aglutinação :

Título da Reação = maior diluição onde têm-se aglutinação 1+

Método do escore numérico = segundo Race e Sanger, modificado por Marsh [Marsh W.L., Scoring of
Hemaglutination. Transfusion 1972;12:352 – 353] , faz-se a conversão da intensidade de aglutinação, de
cada diluição em valores individuais, depois somados (medida semi - quantitativa da reatividade do
anticorpo)

Intensidade da Aglutinação Escore

++++ 12
+++ 10
++ 8
+ 5
fraco 2
negativo 0

35
35. PREPARO DE SUSPENSÃO DE HEMÁCIAS :
As técnicas de referência recomendam trabalhar com suspensão a 3 – 5%, em tubo.
Essas suspensões são usadas para Tipagem, PAI, e TCD

MATERIAIS : - teste de triagem sorológica


1. amostra de ST colhida em EDTA
2. pisseta com SF 0,9 %
3. tubos de hemólise 12 x 75 mm
4. centrífuga de soro ou de Imunohematologia
5. pipetas de Pasteur
6. micropipetas de 10, 50 e 100 μl

METODOLOGIA :
1. centrifugar o tubo com a amostra de ST por 1 minuto / 3000 rpm
2. transferir 10 gotas de hemáceas para outro tubo de hemólise
3. encher este tubo com SF até a 1 cm da borda
4. centrifugar 1 minuto / 3000 rpm
5. esvaziar o tubo por inversão
6. homogenizar o botão de hemáceas
7. repetir os procedimentos 3 a 6, por mais 2 vezes (mais 5 vezes se amostra de cordão umbelical)
8. após a última lavagem, retirar completamente o sobrenadante

OBS. : este é o procedimento recomendado pelas Normas Técnicas em Hemoterapia, porém como o rigor em
laboratórios clínicos QUE NÃO TRABALHAM COM HEMOTERAPIA é menor, fazemos diluição
simples sem lavar as hemácias

SUSPENSÃO SF 0,9% HEMÁCIAS METODOLOGIA


Gotas (μl) LAVADAS (μl) INDICADA

3% 20 (1.000 μl) 30 Microtubos , Cartão (GEL)

5% 19 (950 μl) 50 Tubos , Cartão (GEL)

5% 950 Sangue total = Tubos, exceto para


50 Hemoterapia

36
36. TIPAGEM ABO EM TUBO
MATERIAIS :
1. amostra de ST em EDTA (e em tubo seco, APENAS se fôr feita a Fase Reversa)
2. antissoros anti-A, anti-B e anti-A,B
3. hemáceas A1 e B (APENAS se fôr feita a Fase Reversa)
4. tubos de hemólise, centrífuga e micropipetas de 50 e 100 μl

METODOLOGIA :

Fase Direta =
1. prepara suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)
2. rotular tubos em A, B e AB
3. colocar 50 μl do soro reagente conhecido e 50 μl das Hc-teste
4. homogenizar
5. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos ou deixar em TA / 10 minutos (bancada)
6. ressuspender o botão
7. ler

Fase Reversa =
1. rotular tubos A e B
2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da Hc reagente (A1 e B)
3. homogenizar
4. centrifugar
5. ressuspender
6. ler

Causas de Discrepâncias ABO =


1. presença de anticorpos irregulares frios (anti-P1, -M)
2. amostra contaminada ou erro de identificação
3. TCD positivo
4. subgrupos de A ou B
5. presença de rouleaux
6. autoanticorpo anti-I
7. presença de anti-A1 em indivíduos A2 ou A2B

37
37. TIPAGEM Rh EM TUBO

MATERIAIS :
1. suspensão das Hc-teste a 5% em salina (página 35)
2. soro anti-Rh (D) e Controle Rh
3. Soro de Coombs monoespecífico
4. tubos de hemólise, centrífuga de soro e micropipetas de 50 e 100 μl

OBS. O USO DO CONTROLE Rh GARANTE MAIOR QUALIDADE AO TESTE

METODOLOGIA :
1. identificar 2 tubos D e CRh
2. colocar no tubo D, 50 μl de anti-D e 50 μl de Hc-teste
3. colocar no tubo CRh, 50 μl de CRh e 50 μl de Hc-teste
4. homogenizar e centrifugar a 1000 rpm / 1 minuto ou 3400 rpm / 15 segundos
5. ressuspender o botão e ler : se + = D positivo
6. se aglutinação negativa, pesquisar D fraco = repetir passos 1,2 e 3, e incubar em
BM 37o C / 15-30 minutos
7. centrifugar 3400 rpm / 15 segundos
8. ressuspender e ler; se positivo = D fraco positivo = Rh positivo
9. se aglutinação negativa, lavar cada tubo 3 vezes em salina
10. acrescentar 100 μl de SAH em cada tubo
11. centrifugar 1000 rpm / 2 minutos
12. ressuspender o botão e ler; se + = D fraco positivo = Rh positivo e
se D fraco negativo, = D negativo (Rh negativo)

Causas de Falso-positivos =
1. uso de antissoro errado
2. contaminação do reagente por outros anticorpos (fabricação)
3. poliaglutinação, autoaglutinação, proteínas anormais no soro-teste
4. contaminação dos reagentes com bactérias, substâncias estranhas

Causas de Falso-negativos =
1. uso de antissoro errado
2. falta de adicionar antissoro ao tubo teste
3. não seguir normas técnicas (proporção incorreta de Hc x soro, tempo ou velocidade de centrifugação)
4. agitação forte na ressuspensão das células, dispersando aglutinações fracas

Obs.: o Controle Rh é um reagente que contém o mesmo meio macromolecular do soro anti-D, mas sem
o anticorpo. Como testemunho negativo, deve ser da mesma procedência que o anti-D. Se não for
possível, usar controle Rh de outro fabricante, mas não a albumina bovina a 22% (usada empiricamente).

38
38. PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) OU TESTE
DE COOMBS INDIRETO
MATERIAIS :

1. tubos de hemólise 12 x 75 mm, estantes para tubos, centrífuga, microscópio óptico


2. pisseta com SF 0,9 %
3. Hc de triagem Triacell ou similar, em suspensão salina ou BFI
4. albumina humana 22% ou BFI
5. SAH (soro de Coombs poliespecífico)
6. amostra de soro do paciente a testar
7. suspensão de Hc do paciente a 5% em salina (se necessário, para autocontrole)

METODOLOGIA :

PAI EM SALINA =

1. separar o soro a testar


2. identificar os tubos I e II
3. em cada um, pôr 100 μl de soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc I e II (em tubos separados)
4. homogenizar e deixar em TA por 30 minutos (fase salina)
5. ressuspender e ler
6. adicionar 100 μl de albumina bovina 22%, homogenizar, centrifugar e ler (fase albumínica imediata)
7. incubar em BM 37o C / 30 minutos (fase térmica)
8. homogenizar, centrifugar e ler
9. lavar 3 vezes em salina
10. acrescentar 100 μl de SAH (fase da Antiglobulina Humana)
11. homogenizar, centrifugar e ler

PAI COM BFI = (AINDA NÃO UTILIZADO NO LABORATÓRIO DA UNIUBE)

1. idem 1 – 2 acima
2. colocar 100 μl do soro-teste e 50 μl da suspensão de Hc em BFI, incubar em BM 37o C / 15 minutos
3. lavar 3 vezes em salina
4. acrescentar 50 μl de SAH
5. centrifugar a 2000 rpm / 15 segundos, ressuspender e ler

39
39. TESTE DE COOMBS DIRETO EM TUBO (TCD)

MATERIAIS :

1. amostra do paciente em EDTA


2. suspensão de Hc em 5% (página 35)
3. (se ST de cordão umbelical, lavar 6 vezes em salina, antes de fazer a suspensão)
4. SAH (soro de Coombs poliespecífico)
5. tubos de hemólise, centrífuga

METODOLOGIA :

1. após fazer a suspensão, pôr 50 μl de Hc e 100 μl de SAH


2. homogenizar, centrifugar 1200 rpm / 1 minuto e ler
3. se negativo, deixar de repouso em TA por 5-10 minutos, recentrifugar e ler
4. se reação + em qualquer etapa, repetir o teste com SAG monoespecífico (soro de Coombs)

SORO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO


POLIESPECÍFICO
SORO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO
MONOESPECÍFICO
CLASSE DO Ig G, ou Ig G + Ig M Ig M Ig G
ANTICORPO
ENVOLVIDO

40
40 .TÉCNICA DE ELUIÇÃO (TESTE DO ELUATO)

MATERIAIS:

- tubos de ensaio, centrífuga, banho maria 37o C


- Suspensão de hemácias lavadas a 5% (página 35)
- Albumina humana 22%
- Hemácias controle A1, B e O (suspeita de incompatibilidade ABO); ou hemácias controle O
Rh negativo e O Rh positivo (suspeita de incompatibilidade Rh) = hemácias Revercell A1, Revercell
B e Triacell, ou hemácias de doadores conhecidos
- Soro de Coombs poliespecífico (soro anti-humano)

METODOLOGIA

Método de LUI : [218]

1. Pegar 750 μL de de Hc lavadas e acrescentar 150 μL de albumina 22%


2. rolar o tubo para os lados, pôr em freezer a – 6 / - 20o C, deitado, até congelar (tempo mínimo = 10
minutos)
3. descongelar em BM 37o C
4. centrifugar a 3400 rpm/ 2 minutos
5. separar o sobrenadante (eluato) para outro tubo
6. rotular tubos A1, B e O, colocando 50 μL de suspensão 5 % de uma delas no respectivo tubo
(hemácias Revercell A1, Revercell B e Triacell )
7. por 2 gotas do sobrenadante (eluato) em cada tubo (também 2 gotas do último lavado, antes de fazer a
suspensão a 5% do paciente, em outros tubos) e incubar a 37o C/ 30 minutos
8. lavar as Hc 4 vezes com salina e acrescentar 2 gotas de SAG
9. ler a olho nu e em microscópio óptico, com objetiva 100 x, entre lâmina e lamínula

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