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MANUAL PARA GERMINAÇÃO IN VITRO DE ORQUIDEAS

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MANUAL PARA GERMINAÇÃO IN VITRO DE ORQUIDEAS Dra.

Sheena McKendrick
© Copyright 2000, Fundação Ceiba para Conservação Tropical Março 2000 O manual seguinte inclui a biologia básica para a germinação de sementes de orquídeas, algumas técnicas usadas para a germinação de orquídeas com ajuda da técnica em vitro, e um apêndice dos meios e espécies experimentados dentro do programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma. O manual foi desenhado especificamente para o Programa Orquideologico de O Pahuma, porém pode adaptar-se a outros programas. RECONHECIMENTOS Agradecimento especial para Nelson Zabala e para a Universidade São Francisco de Quito por permitir a Ceiba para fazer uso dos seus equipamentos para levar a cabo o programa de germinação em vitro. Nós também agradecemos Margaret Ramsay de Jardins Botânicos Reais, Kew, Inglaterra, pela sua util coleção de notas sobre propagação de orquídeas, e para Robert Mitchell e Grace Prendergast, também de Kew, por ter me ensinado estas técnicas. Igualmente eu quero estender meu agradecimento a Dick Warren da Companhia de Planta Equatorial, David Menzies de Glasgow Botanic Gardens e a Mónica de Navarro da Sociedade Orquideológica de Quito por toda sua ajuda e seus conselhos. Também agradeço a Lorena Gamboa de Rainforest Rescue que fez a tradução deste manual para espanhol. Por ultimo, quero agradecer de um modo especial a Família Lima que com o grande desejo em conservar a floresta tornou possível que este projeto fosse realizado. 2 ÍNDICE 1 INTRODUÇÃO 1. 2. propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma A biologia da germinação de sementes de orquídeas

1.3 Fundações da germinação em vitro 1.3.1 germinação de Sementes Simbióticas e não Simbióticas 1.3.2 Bases para manter as condições de esterilização 1.3.3 Uso da câmara de fluxo laminar 2. PREPARAÇÃO DOS MEIOS 2.1 introdução para a preparação dos meios 2.2 metodologia geral para a preparação dos meios 2.3 transferência dos Meios 3. SEMEADURA DAS SEMENTES

INTRODUÇÃO 1.3 disseminação a partir de cápsulas maduras 3.2 método do Pacote (ou fundo de papel) 3. Os objetivos deste programa de propagação em vitro são os seguintes: 1.1 Coleta e armazenamento das sementes 3.2 disseminação a partir de cápsulas verdes 3.1 propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma A germinação em vitro de sementes de orquídeas é um componente importante do programa de conservação da Fundação Ceiba para a Conservação Tropical na Reserva Orquideológica O Pahuma.3 cobertura dos recipientes 3.1 método da Seringa 3.4 manutenção de registros 4 CUIDADO DAS PLANTULAS 4. a Noroeste de Quito. Cultivar orquídeas para o Jardim Botânico O Pahuma.1 cápsulas verdes vs.2 Transplante 5 CONCLUSÃO 6 BIBLIOGRAFIA 7 APENDICES 3 1. cápsulas maduras 3. 2.3. estimular o interesse público e coletar.2.2. Prover sementes para a venda na Reserva como um meio para parar a coleção de espécimes silvestres. entre outro). 3.3. Reproduzir espécies raras e únicas de orquídeas para aumentar tanto o numero nos meios naturais da Reserva como em lugares fora dela (como jardins botânicos. rendas para o desenvolvimento da Reserva e outros programas de . e para prover sementes a programas de restauração e regeneração de florestas.1 As plántulas nos frascos 4. programa de conservação.2.2.2.3.2 Semeadura das sementes 3.Equador.

as sementes se semeiam com uma porção pequena de fungo micorriza apropriado. o que os facilita produzir parte.2 A biologia da germinação de sementes de orquídeas As sementes de orquídeas são normalmente conhecidas como sementes em pó porque elas são minúsculas e elas contêm poucas reservas de alimento. coloniza às sementes em processo de germinação e se origina uma relação simbiótica que se espera alimenta ao protocornio até produzir folhas e se tornar autotrófico. o mesmo que abastecem as plantas jovens com açúcares e nutrientes que eles precisam até que eles são o suficientemente grande para fabricar seu próprio alimento. No caso de orquídeas terrestres. a desvantagem é que se precisa selecionar o tipo de fungo micorriza apropriado para que se origine a simbiose e prevenir o parasitismo e a morte conseqüente das sementes. Toda receita que vêm da venda de espécies de orquídeas. Na germinação simbiótica. Esta técnica é amplamente usada para propagação de orquídeas terrestres em áreas temperadas. 1. Por outro lado. Porém. o protocornios de orquídeas epífitas é geralmente verde. meses ou até mesmo anos dependendo das espécies até que alcança a idade apropriada para produzir raízes e folhas.3. 4 1.1 germinação Simbiótica e não Simbiótica de Sementes Por meio da germinação em vitro. Os meios usados para o germinação asimbiótica é mais complexo que para a germinação simbiótica Já que todos os nutrientes. e portanto não se dispõe do fungo micorriza apropriado. 4. as mesmas que tendem a crescer facilmente em comparação com suas parentes em áreas temperadas. . de seu alimento. Tem a vantagem de usar um meio simples ( um dos mais geralmente usados consiste em aveia em pó com uma quantidade pequena de extrato de levedura). Há dois tipos básicos de germinação em vitro: simbiótica e não simbiótica. Cultivar sementes de espécies sem igual ou ornamentais para a exportação em frascos com o propósito de apoiar a conservação empreendido na Reserva Orquideológica O Pahuma. O fungo cresce nos meios. Estas sementes normalmente não germinam nos meios naturais a menos que eles sejam infetados por um fungo micorriza. Quando a semente germina produz uma massa indiferenciada de células chamados protocornio (figura 1). e como resultado das plantas micorrizadas são normalmente mais fortes e mais resistentes a infecções que as cultivadas asimbióticamente. orgânico e inorgânico e os açúcares devem estar disponíveis para a orquídea em uma forma apropriada já que não existe intermediação do fungo.3 Fundamentos da Germinação Em Vitro 1. tanto em O Pahuma como por meio da exportação.conservação de orquídeas. Existe pequena investigação na relação do micorriza em forma de fungo com as orquídeas tropicais. é de importância vital que a relação orquídea -fungo se conserve durante os estados do ciclo de vida da planta no qual o protocornio enterrado não pode fabricar alimento por si mesmo. A germinação asimbiótica é normalmente usado na propagação de orquídeas tropicais. o protocornio continuarão seu crescimento durante várias semanas. se reproduzem sementes em frascos de vidro ou plástico sobre um meio de ágar nutritivo que contém os açúcares e minerais necessário de forma que as sementes germinem e cresçam. eles serão reinvestidos na Reserva e em outros projetos de conservação. A relação orquídea-fungo não esteve em sua totalidade investigado para o caso das orquídeas tropicais. Mantendo as condições normais.

Tudo que entrará na câmara deve ser esterilizado. Com certo cuidado e pratica se pode criar e manter condições de esterilização desde a germinação até o transplante das sementes. ter muito cuidado se utiliza álcool anti-séptico que também contém metanol. a esterilização consiste em esvaziar os meios e semear as sementes em uma câmara de fluxo laminar. Use um avental de laboratório e lave-o constantemente. porém no caso de existirem problemas com contaminação bacteriana usar as luvas novamente.3 uso da câmara de fluxo laminar Deve-se prestar atenção a certas regras básicas ao usar a câmara de fluxo laminar: 1. ou peroxido de hidrogênio. ou desinfetando sementes maduras com hypochlorito de sódio ou cálcio.3. 1. Esta temperatura e pressão são bastante para matar todos os esporos de bactérias e fungos presentes nos meios. Outras técnicas para manter estas condições de esterilização são possíveis ( Thompson 1980). Qualquer bactéria ou fungo que introduzido nos frascos crescerá mais rápido que as sementes e logo vai ocupar o espaço delas até as matar. . Com prática. secar e esterilizar com álcool. No caso de se dispor do fungo a partir de semeaduras em situ. 5 As sementes devem ser esterilizadas e ser transferidas aos frascos sem introduzir fungos ou bactérias externas. As condições de esterilização na preparação do meio se criam autoclavando o meio e os frascos a serem utilizados por 15 minutos a 15 atm. Temos de ter certeza que estão desinfetados todos os instrumentos usados na transferência. passando álcool e os mantendo na câmara até que o álcool seque. Deve ser desinfetado tanto antes como depois de usar a câmara . Use luvas e os desinfete completamente antes de usar.A germinação asimbiótica é um método usado no momento no programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma. Geralmente. Use um roceador e limpe todas as superfícies da câmara com um algodão encharcado de álcool (inclusive as paredes e o teto). é possível no lugar de usar luvas. porém eles são complicados tecnicamente e não devem ser desenvolvido em condições úmidas e sem limpeza apropriada. lavar as mãos e esfregar as unhas usando um sabão antibacteriano.2 Fundamentos para manter condições de esterilização Tanto para a germinação simbiótica e asimbiótica é de importância vital que os meios. Sempre se deve desinfetar por completo usando álcool de 70-90 % (de preferência Etanol. No programa de germinação para O Pahuma.3. 1. haveria a possibilidade usar técnicas simbióticas no futuro. Tenha o cuidado de não inalar quando se passe o etanol para usar a câmara . O metanol é tóxico e pode causar cegueira se ingerido). os frascos. este processo se realiza semeando desde a superfície desinfetada de cápsulas verdes. os aparatos e as sementes se mantenham desinfetados desde o inicio do processo de germinação.

Tenha cuidado para não QUEIMAR suas MÃOS .1977. conversação pessoal). A maioria de orquídeas germina dentro de um meio de pH 5. a esterilização é assegurada submergindo em etanol 100% e incendiando-a três vezes antes de usar.particularmente quando usa luvas! É fácil de fazer isto pois você não pode sentir se o álcool das luvas evaporaram completamente. conversação pessoal). Quando se inicia o processo de germinação de uma nova espécie é aconselhável provar com diferentes meios para uma concentração total e parcial para determinar qual é o melhor meio para esta espécie. 1. 5. 3. Por exemplo. 2 PREPARAÇÃO DOS MEIOS 2. embrulhando-os previamente em papel de alumínio ou papel de empacotar café fechado com fita adesiva. o gênero Masdevallias é conhecido como um gênero "escolhedor" dos meios em qual desenvolverá (Richard Warren. Aldrich.5 porem. Os frascos de vidro podem ser roceados com álcool ao introduzi-los na câmara . Esses instrumentos podem ser autoclavados antes do seu uso. Uma vez na câmara . Vantajosamente o etanol queima em baixa temperatura e podem ser facilmente evaporado quando agitado com força.Tenha certeza que os frascos de vidro estejam limpos. De um modo especial. 3 Mantenha as condições de esterilização por meio da limpeza regular da câmara com álcool. Há diferente tipos de meios disponíveis para a venda como também outros específicos para certas espécies projetadas por peritos profissionais. Qualquer nota escrita com marcador no vidro será apagada pelo etanol. O nível de pH também é importante. desinfete os instrumentos novamente depois do seu uso e lave as mãos novamente depois de ter tido contato com qualquer objeto fora da câmara .1 introdução para a Preparação dos Meios Os meios podem ser preparados usando ingredientes básicos (Thompson. não toque no cabelo ou na face com as luvas colocadas. Inglaterra) e Murashige e Skoog foram os meios principais usados no projeto de O Pahuma (março de 2000).ou queimar as sementes que você esta transferindo de um lugar para outro . As preparações comerciais de Phytamax (Sigma Química.os instrumentos a ser usados se esquentam altamente depois de duas . Se os frascos estão limpos. espécies andinas preferem níveis mais altos de pH. Deixe-os esfriar antes do uso. SEMPRE SE LEMBRE DE FEICHAR O GAS . tussa ou espirre dentro da câmara . Tenha cuidado para não QUEIMAR . ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO 1. mas com precaução. Mantenha movimentos leves e evite criar turbulência de ar que possa causar contaminação. Depois de Flambar os instrumentos estes devem ser colocados depressa em um frasco de vidro esterilizado para continuar com o flameado. apêndice 1) ou comprar em pó dos fornecedores.9 (Mónica de Navarro. rocearlos com etanol não serão necessários. Ao experimentar com o pH se deve considerar que o pH dos meios será mais alto somando o ágar que antes de fazê-lo. Se lembre que qualquer esporo de bactéria ou fungo dentro da câmara flutuará para o interior e em direção a sua pessoa.tanto no isqueiro de fogo como na parte superior do cilindro de gás. Nunca ponha as mãos.6 ao 5. Trabalhe no possível pela parte de atrás da câmara e minimize o tempo de exibição dos meios quanto possível. 2. O melhor modo para conservar o etanol está em frascos grandes de vidro para permitir a máxima exposição dos instrumentos ao etanol. Não fale. . mangas ou outro objeto sobre ou em direção de algo desinfetado (como os meios).

Qualquer um destes meios pode estar tanto preparado para uma concentração parcial ou total (a concentração parcial é recomendada para Murashige e Skoog). e Skoog. 3. por razões de segurança a Universidade prefere usar duas garrafas ou frascos de 500 ml deste modo para manter a barra magnética na garrafa e agitar suavemente antes de verter para dispersar o carvão ativado. Porém. . Medir o pH e ajusta-lo a 5. Murashige.6 usando HCl ou NaOH e misturando completamente com a barra magnética. ou o carvão ativado. Medir a quantidade correta do meio em pó usando uma garrafa de 1 litro e evitando o contato com o pó da atmosfera. Se não temos o medidor de pH. 4. Em condições ideais os meios devem ser preparados em uma garrafa com a barra magnético durante todo processo de autoclave inteiro com o propósito de que o meio seja misturado antes de vertê-lo nos frascos. Se você tiver contato com o pó do Phytamax. alcançando uma distribuição melhor do carvão ativado no mesmo. acrescentar 4 gramas de ágar a cada recipiente (8 gr/l de ágar) e misturar para que se disperse. Somar uma barra magnética e uma pequena quantidade de água destilada e misturar até que se dissolva. 1. Eles estarão bastante quentes e você pode sofrer queimaduras. 6. TENHA CUIDADO AO TIRAR OS FRASCOS E GARRAFAS DA AUTOCLAVE . ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO 1. 7 O método geral para a preparação destes meios é o que é detalhado a seguir. cobrir os frascos com papel alumínio e os levar ao autoclave. deverá lavar imediatamente a parte afetada com bastante água fria. * Precaução: se estiver usando um medidor de pH não se deve misturar o meio quando se encontra dentro o pHmetro: a membrana é muito delicada e cara e pode quebrar facilmente.2 método geral para a preparação dos meios 1. Encher o recipiente com água destilada até obter 1 litro e agitar continuamente. 7. Verter a metade do líquido em um frasco. 2. NÃO RESPIRE O PHYTAMAX EM PÓ E EVITE O CONTATO COM A PELE E OS OLHOS. os papeis indicadores de pH são suficientes. Se tiver contato com os olhos. 2. Sempre tenha certeza que as tampas estão frouxas ao colocar os frascos na autoclave: só podem fechar eles fortemente depois dos frascos esfriarem. 2. NUNCA FECHE HERMETICAMENTE A TAMPA DO FRASCO OU GARRAFA ANTES DE COLOCA-LA NA AUTOCLAVE. lave os imediatamente com água fria e solicite cuidado clínico. Fechar a tampa da garrafa sem apertar totalmente. 3. Só para Murashige e Skoog: somar a quantidade correta de açúcar e 2gr/l de carvão ativado. O elevado aumento de pressão na autoclave causará explosão do frasco ou garrafa.

8 2. deve-se usar a câmara de fluxo laminar (veja item 1. pode-se derramar nos meios.3 Transferência dos Meios (colocar nos frascos) Verter os meios nos frascos ou caixas Petri esterilizadas. é melhor coletar cápsulas que foram expostas a um dia seco. 1. e no caso de períodos mais prolongados (como uma meia hora) se provocara a precipitação do carvão ativado. Se a pessoa não tiver tampas disponíveis. Se foi preparado 2 litros prontos de meio você pode usar uma estufa para manter uma garrafa quente até terminar de usar a outra. A estufa quente só deve ser usado por pouco tempo (emergências). Novamente. 19xx). Uma cápsula verde que está amadurecendo.3). A preparação completa do meio desde a mistura dos ingredientes até o estabelecimento do meio vertido tem um tempo estimado de 4 horas de duração. Uma vez as sementes estão secas. A água disponível nos frascos pode ou não ser útil dependendo da maturidade das sementes. está cheio com sementes e não se deforma quando se aperta com as pinças. soltando o tampas dos frascos. Deve-se repetir a esterilização dos frascos que saem da autoclave com papel alumínio ou sem o papel de alumínio. Os frascos devem ser ensaboados e lavados completamente quatro vezes antes de usar. Pode se cobrir esses frascos imediatamente depois que derramou o meio. pode -se armazenar por muitos meses em frascos fechados dentro de um refrigerador (4-5°C). Não se deve armazenar as sementes em potes de plástico pois as cápsulas suarão e serão apodrecidas. 3. Se este composto não esta à disposição. Deixe que se assente o meio e ponha as tampas novamente. É aconselhável usar sementes frescas ou secas numa solução saturada de hexahidrato de cálcio (Seaton & Pitchard. SEMEADURA DAS SEMENTES 3. e esta pronta para ser semeado. 3. 9 Se for possível. 1. pode cobrir os frascos com um pedaço de papel alumínio. e desinfetado por 15 minutos a 15 Psi. Tire as tampas dos frascos ou caixas Petri e verta o ágar movendo da esquerda para direita (se és destro) para evitar que qualquer parte da mão ou do avental de laboratório toque em um frasco ou caixa aberta. 2. Se derramar o ágar muito quente pode-se causar uma condensação alta. Você também pode usar papel de empacotar café fechado com um barbante. Espere os meios esfriarem bastante para pegar com as mãos. Ponha em linha os frascos ou caixas Petri começando do fundo da câmara de fluxo laminar. .2. Se temos frascos com tampa se lembre de fecha-las totalmente antes de coloca-los na autoclave. gel de sílica. mas é mais inadequado.1 Coleta e Armazenamento das Sementes As sementes podem ser coletadas a partir de cápsulas verdes ou cápsulas maduras. na autoclave." está intato. pode-se secar com cloreto de cálcio. as sementes nunca devem ser armazenadas ou transportadas em potes de plástico ou recipientes com ar dentro. (mais áspero que o cloreto de cálcio e somente recomendado usar a curto prazo) ou simplesmente secar a temperatura ambiente em um quarto (só em climas secos). mas a pessoa pode causar condensação. Quando o ágar est a menos líquido e a garrafa ou frasco não está tão quente." As cápsulas podem ser armazenadas por algumas semanas se envolvidas em papel de cozinha e se os coloca num lugar do refrigerador com bastante aeração (como o compartimento para o queijo).

o que poderia causar sua deterioração. secadas ao ar. A vantagem deste método é que as sementes podem ser coletadas. se a parte externa da mesma é esterilizado. .2 Semeadura a partir de cápsulas verdes O método geral para semear sementes a partir de cápsulas verdes é o seguinte : 1. Deveria ser considerado que o que se semeia é determinado pela disposição de qualquer uma das duas formas de encontrar as sementes de acordo com a época que se coletam. as sementes de Epidendrum ou Masdevallia requerem aproximadamente de 3. e lembrando-se de incluir este número nos detalhes do semeadura.2. Todas as plantas coletadas na Reserva Orquideológica O Pahuma deve ser marcado com uma fita adesiva e registrada com um código. Então. 3. 1. Enxágüe a cápsula em água. então se enxágua com água destilada e se semeia nos meios preparados. Logo são descritas as vantagens e desvantagens de ambos os métodos: 1. algumas sementes tomadas de cápsulas quase maduras poderiam germinar mais rapidamente que as vindo de cápsulas maduras por causa dos mecanismos de dormência.O tempo desde o florescimento até a maturação das sementes varia significativamente de acordo com as espécies e o lugar. conversação pessoal). 3. A vantagem deste método é que não se requer a esterilização das sementes. Semeadura a partir de sementes secas. Use uma escova de dente macia para esfregar a cápsula suavemente com a solução ensaboada. Introduza a cápsula aproximadamente durante 10 minutos em uma solução de hypochlorito de sódio a 1% ao qual foi acrescentada uma gota de detergente (levar em conta que o cloro comum é hypochlorito de sódio a 5% portanto é necessário diluir). As sementes são agitadas dentro da solução que também contém uma gota de detergente para " umedecer". na realidade uma cápsula que cresce em um recipiente de vidro quente vai amadurecer muito mais rápido do que aquele crescendo na floresta nublada. 2. hypochlorito de cálcio ou peroxido de hidrogênio. Transfira a cápsula submersa na solução de cloro à câmara de fluxo laminar.1 Cápsulas verdes vs. é usada uma solução de hypochlorito (cloro) de sódio.2 Semeadura das Sementes 3. onde fungos e bactérias podem ser desenvolvidas. armazenado por vários meses no refrigerador e usado quando é necessário. as sementes deixam de ser estéreis e requerem um processo de esterilização.2. Geralmente. Semeadura a partir de cápsulas verdes.5 meses para amadurecer enquanto as sementes de Odontoglossum requerem ao redor de 18 meses (Mónica de Navarro. 3. Uma vez que a cápsula está aberta. Por exemplo. As estimativas convencionais não levam em conta as diferenças climáticas. sementes secas Você pode semear sementes a partir de cápsulas verdes ou a partir de sementes secas. remova a flor morta da cápsula cuidadosamente 2. O interior das cápsulas de orquídeas permanece estéril se as cápsulas estão intatas. e abre-se as cápsulas debaixo de condições de esterilização as sementes poderão manter-se desinfetadas. A desvantagem deste método é que ao abrir a cápsula todas as sementes dela devem ser usadas ou eliminadas (algumas sementes maduras poderiam secar e ser armazenadas). Com ajuda de um bisturi. 4. Também. Também se deve considerar que as sementes semeadas a partir de cápsulas que não amadureceram bastante poderiam germinar lentamente ou simplesmente não germinar.

já que a água demora bastante para esfriar-se depois do autoclave. 3.3. Pegue uma seringa de 5 ml. Deixe que o álcool se queime completamente e que a cápsula e a pinça se esfriem. 10. Repita o processo duas vezes para as cápsulas grandes. Use uma folha de bisturi nova para cada cápsula prevenir a propagação de vírus. autoclave uma certa quantidade de água destilada (em frascos ou garrafas) e as pinças. Em geral. . Tire a cápsula da solução de cloro usando uma pinça e levando preferivelmente do lado que cai o pecíolo. Tanto para o método da seringa como para o método do pacote é aconselhável esterilizar os instrumentos e a água necessária previamente 1 dia. uma gama de tempos de esterilização é recomendado para as sementes novas. mude a posição da pinça antes de flambar novamente. dependendo das espécies. 2. método que usa o funil de Buchner. como a filtração. insira o embolo novamente e autoclave. das condições climáticas do momento da coleta e dos métodos de secar e armazenamento. 3. 9. Erga uma metade da cápsula com a pinça e bata ligeiramente no meio para espalhar as sementes. mas as técnicas variam. Ao mesmo tempo. Todos eles se baseiam na esterilização das sementes e lavagem em água destilada antes dos semear. a técnica da seringa é usada para a maioria das sementes enquanto a técnica do pacote é usada para sementes mais raras e menores. 7. Corte a cápsula longitudinalmente ao meio com ajuda de um bisturi desinfetado. As sementes menos maduras podem ser retiradas da cápsula com a pinça. O tempo de esterilização também varia. mas eles não são incluídos neste manual.1 Método da Seringa 1. O programa de conservação em O Pahuma usa duas técnicas principalmente para semear sementes maduras: o método da seringa e o método do pacote (ou saco de papel). tape a ponta da seringa com um pedaço de algodão envolto em um pedaço de meia de nylon (veja o diagrama). Tire o embolo da seringa e coloque uma quantidade pequena de sementes na seringa.2. Normalmente são somadas algumas gotas de água em cada frasco de modo que certos grupos de sementes se separem e se distribuam no ágar. Repetir este passo até que todas as sementes são usadas. 8.6. Por isto. Para o caso das cápsulas pequenas e frágeis você decide com discrição o tempo de passar pela chama (talvez só uma vez). do tempo de maturação logo que a semente é coletada. É possível usar outras técnicas. Então submirja em álcool a 100% e passe rapidamente pelo fogo (Flambar). Transfira a cápsula a uma superfície desinfetada (como uma caixa esterilizada Petri).2.3 Semeadura a partir de capsulas dehiscentes (aberto com sementes secas) 11 Métodos diferentes existem para o semeadura a partir de sementes secas. Se não for possível sustentar pelo pecíolo.

3 Fechamento dos Frascos Depois do semeadura os frascos podem se fechar usando "filme" ou papel cortado celofane das bolsas transparentes para assar.3. transfira os pacotes à solução de cloro a 1% e que também contém uma gota de detergente. 4. tenha certeza que as sementes estão completamente molhadas dentro da solução e que não estão em bolsas de ar.(Uma grande quantidade de sementes formará uma massa em forma de pasta se você usa a técnica 5b para o semeadura. 5. ficando difícil a semeadura apropriada). Agite. 5. o filme devera estar desenrolado na câmara de fluxo. e o mais próximo lado para a parte posterior da câmara é o que devera ser . Aperte os pacotes suavemente para eliminar o excesso de água e transferi-los para uma superfície esterilizada. Expulse esta solução e absorva outra porção de solução fresca novamente. Absorver com a seringa 4 ml da solução de cloro a 1% (a que foi adicionado uma gota de detergente). tirando fora o algodão com uma pinça e colocando as sementes sobre os meios. os grampos agirão como campos magnéticos e eles agitarão os pacotes automaticamente. Dobre e marque os pacotes usando grampos. quantidades grandes de sementes causará ajuntamento das sementes e impedem a penetração do cloro. Com ajuda de pinça. Submirja em água destilada por de 5-10 minutos. Lave as sementes 3-4 vezes absorvendo água destilada e esterilizada na seringa. 3. Agite durante outras 5 minutos e a expulse novamente. Agite a seringa durante 5 minutos (ou outro tempo de esterilização). e ao submergir ao mesmo tempo vários pacotes em cloro podem apressar o processo de semeadura. agitando por um momento e logo expelindo o líquido. Transfira o pacote mais o cloro para a câmara de fluxo laminar. Normalmente. 1. Repita isto 3-4 vezes para enxaguar as sementes. Corte e abra o pacote usando tesoura desinfetada e semeie as sementes nos meios. vertendo as sementes nos meios e eliminando o excesso de água ou b) expelindo todo excesso de água. 1. Novamente. dobrado um lado sobre o outro. Elabore um pacote a partir de um pedaço de papel (veja o diagrama) 2. agitando-os continuamente.2. Insira o embolo novamente. Freqüentemente agitando os pacotes os mesmos resultados são obtidos.2 método do Pacote (ou saco de papel) 12 1. Esparrame uma quantidade pequena de sementes dentro dos pacotes. Usando pinças transplante o pacote para água destilada (em um frasco). 3. 3. De acordo com a teoria. 4. Semeie as sementes assim: a) esterilizando o colo da seringa. apertando suavemente para dispersar qualquer bolsa de ar. Isto nunca funcionou em minha experiência pessoal. Se é usado "filme". Deixe-os na solução durante 10 minutos (ou outro tempo de esterilização). ao usar esta técnica se colocam os pacotes em um recipiente que contenha cloro e este sobre uma placa magnética.

4. Cada frasco tem um rótulo com o código de semeadura e qualquer outra informação relevante e útil para te-la em um acesso fácil e não ter que recorrer aos cartões. Os frascos são examinados semanalmente e se deve registrar qualquer contaminação e germinação com a data correspondente. Água destilada pode ser adicionada se os frascos estão secos.1 As sementes nos frascos. 4. ou se existe pouco líquido no fundo do frasco. pode-se deixar que as sementes cresçam. Os detalhes sobre os meios preparados. deve ser apontado com um X ao lado do código da espécie e com um X grande no cartão inteiro. o processo de semeadura e as notas de observação devem registrar no caderno. pode ser útil mais tarde para analisar as causas do problema. com o propósito de prevenir qualquer confusão durante o armazenamento ou a semeadura. e se coloca no frasco que contém o meio e assegura ele usando uma fita elástica.colocado nos frascos. usando uma seringa desinfetada. nomeando um código para cada um. e abaixo da data o número de frascos. . Cada frasco também está rotulado com um código simples no momento verter os meios. O papel celofane é mais fácil de administrar que o filme e é reutilizável. o frasco deve ser eliminado. Se um frasco é eliminado deve-se marcar em algum lugar visível com um X e devese registrar a causa (por exemplo. mas devem ser transplantadas antes que o fungo ocupe seu espaço e as destrua (contatar com Mónica para conselhos).4 Manutenção de registros 13 Os registros devem ficar tanto em um caderno de laboratório e um sistema de cartões ou no computador. contaminação por fungos ou bactérias). e se autoclava dentro dos frascos fechados antes de ser usado. conversação pessoal). Então. Porém. O cartão não devera ser descartado. De um modo ocasional. como é o tempo de esterilização. A data em que a semeadura foi feito é colocado no canto superior esquerdo do cartão. uma contaminação de fungos poderiam motivar a germinação (Mónica de Navarro. Neste último caso. segura-se o filme com uma fita elástica e corta-se a sobra. o mesmo que consiste no código das espécies (por exemplo TF = Trichopilia fragrans) mais o código de semeadura (por exemplo TF12 se é no décimo segundo semeio de Trichopilia). tipo de meio (e a data que se preparou se lembrar ). O quadrado de celofane se retira dos frascos usando pinças. o código e fonte da semente e qualquer outra observação durante o processo de semeadura. Em casos como este. No sistema de cartões se registram todo o semeio. 3. CUIDADO DAS PLÁNTULAS. As plántulas são transferidas a frascos novos que contêm o meio usando pinças desinfetados. uma vez que o fungo produziu esporos. Por tanto é recomendado para usar como material de cobertura. Corta-se o papel celofane em quadrados. Das bolsas transparentes assar KLAR 2000 a pessoa pode obter 20 quadrados por bolsa e 160 quadrados por pacote (8 bolsas por pacote). Os recentes frascos devem ser revisados regularmente depois da semeadura pelo risco de contaminação. não é aconselhável combater esta contaminação. A exceção para esta regra se da quando for mais eficaz remover os protocornios de um frasco ou caixa Petri contaminada. As sementes no USFQ crescem 40 cm abaixo dos tubos fluorescentes de 20 watts em um quarto de crescimento que é regulado aos 18°C com 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Se todos os frascos de um lote foram eliminados . As plantas pequenas são transplantadas quando elas começarem a aparecer folhas e começam a encher o frasco. pode-se combater antes que se disperse totalmente . Se a contaminação é descoberta mais cedo possível.

3. Modifique estes passos quando for necessário. temperatura e iluminação variam constantemente. A umidade nos frascos são altas e as plantas são protegidas de ataques de fungos. . substâncias complexas (como banana . Os deixe deste modo por outros poucos dias e revise diariamente. Solte o tampas para permitir a entrada de quantidades pequenas de ar. Abra os frascos um pouco mais. precise se acostumar gradualmente para meios mais secos antes de ser transplantadas. Os deixe de 2 a 4 semanas com as tampas. Abra as tampas até a metade da abertura. 4. bactérias e herbívoros. Também. Revise diariamente se tem folhas murchas e que os meios estão úmidos mas não totalmente molhado. Os baixos níveis de luz e a umidade alta por este tempo ajudaria que as sementes se aclimatassem e se estabilizassem. Finalmente. leite de coco. Se é possível mante-los abertos por uma semana antes de levar as plántulas e transplanta-las no criador. As novas plantas devem ser protegidas de modo especial da luz solar forte: uma pequena quantidade de luz solar poderia queimar as folhas destas plantas até mesmo as que normalmente crescem na sombra. Os deixe deste modo durante outros poucos dias e revise diariamente. Abra as tampas três quartos. 2. O meio seguinte pode ser o mesmo que o primeiro. mas é normalmente melhor se a pessoa acrescentar ao meio. 15 6. 1. Nos meios naturais. Se é possível a fase de transplante começar no inicio de um período chuvoso. 4. e mais de uma vez ao dia se o clima é seco e ensolarado. o plántulas que cresceram em condições de alta umidade terá cutículas fracas e para isto. O tempo de duração de cada fase pode variar com respeito ao especificado: o constante monitorando deveria dar uma idéia da coisa mais apropriada para cada espécie debaixo de certas condições. No quarto de crescimento. Deve-se fazer alguns transplantes antes que as plantas estejam prontas. Na continuação se detalham alguns conselhos para o transplante. conversação pessoal). A pessoa pode fazer um buraco pequeno nas tampas (se eles são feitos de metal ou plástico. possivelmente no celofane e não aconselhável no filme) e selando dois ou três vezes com o microporo para proporcionar uma superfície de respiração seguro a prova de esporos nas tampas. Deixe-as deste modo durante 1 semana. (Porém é necessário considerar que um alto teor de umidade poderia fomentar um ataque de fungos quando é plantado neste tempo) Coloque os frascos num lugar sombrio e protegido da chuva de forma que se aclimatem as novas condições de luz e temperatura. as plántulas devem ser cuidadas diariamente para evitar problemas. Abra os frascos completamente. Os deixe durante alguns poucos dias e revise diariamente. tanto na fase de aclimatação como no de transplante. suco de abacaxi ou vitamina B) fomentar o desenvolvimento da raiz (ver o Apêndice xx).2 Transplante Nos frascos as plántulas foram desenvolvidos em uma atmosfera fechada e limpa e para que devera se acostumar gradualmente à atmosfera externa antes de ser transplantadas para as bandejas.Uma agulha de crochê é útil nesta fase para retirar sementes delicadas ( Mónica de Navarro. a luz é baixa e tanto a luz como a temperatura são praticamente constante. 1.

Umedeça as raízes da planta com fungicida e plante em meios flutuantes. Em J. 5. & Pritchard. PÁG.A Manual. Londres. plantadas em bandejas para venda ou para introdução na floresta da Reserva ou outras áreas. 243 -370. Cornell Universidade Imprensa. Págs.. Germinação de semente de orquídea e cultura de muda . Cambridge. J. Rocear água ajudarão manter a umidade nas primeiras fases. Escolha os meios corretos para plantar as plantas pequenas. Novamente. o que significa que poderão admirar muitas plantas... 1989. Coloque as novas plántulas na câmara de aclimatação ou em uma pequena carpa de mesa feita de plástico transparente para que assegure a alta umidade durante a fase de estabelecimento. Ramsay. O do´s e don´ts de armazenamento de semente de orquídea. porta completamente aberta. Apontamentos não publicados sobre germinação de sementes de orquídeas. Métodos modernos em conservação de orquídea: O papel de fisiologia. M. aclimate as plántulas gradualmente aos novos meios (por exemplo carpa completamente marcada. Seaton. Encha uma bandeja (funda com buracos) com composto e submerge isto dentro uma grande fonte de água. remover a proteção da chuva. ecologia e administração. 10. CONCLUSÃO Por meio da germinação em vitro um número maior de plantas pode ser cultivado por um período de tempo relativamente menor (alguns meses para espécies mais rápidas). H. Cuidadosamente retire as plantas dos frascos. Um grupo destas sementes germinadas poderá ser exportado facilmente porque as orquídeas cultivadas e mantidas em frascos esterilizados estão isentas dos regulamentos habituais CITES relativo a sanidade vegetal e vida selvagem Outro grupo de sementes pode ser enviado para o berçário de orquídeas da Reserva Orquideológica O Pahuma. Pritchard. o meio deve aderir as raízes das orquídeas sem os destruir. remover a carpa mas proteger da chuva.) Biologia de orquídea: revisões e perspectivas II.W.8. julgue você quanta quantidade de água e quando colocar considerando que deve ser evitado que a planta seja ressecada . BIBLIOGRAFIA Arditti. Cambridge Universidade Imprensa. 12. 11. 1982. (o Ed. os separe suavemente e enxágüe os resíduos de ágar. (ver o Apêndice) 9. mas o crescimento de fungos não pode ser propiciado. Arditti (o Ed.. com certeza espécies deveria ser protegido todas as plantas provavelmente em baixo de um coberto com plástico) Quando eles já são aclimados e são suficientemente grandes. ramo ou pedaço de cortiça (com ou sem um pouco de musgo experimental) Rocee água nas fases iniciais do desenvolvimento.) 1989. Cada cápsula de orquídeas contém muitos milhares de sementes. eles podem ser transplantadas a bandejas maiores ou simplesmente aderido ao tronco de uma árvore. Quando a bandeja é retirada da água. 16 6. . H. porta da carpa parcialmente aberta. 19xx.

P. Garrafa de Pyrex de 1 litro Frasco de Pyrex de 1 litro Placa e barra magnética Medidor de PH NaOH e HCl para ajustar o pH Água destilada Meio Phytamax para o cultivo de orquídeas (P6668. Thompson.Xxxx.A. Orquídeas de semente. 1980. Londres. 17 APÊNDICE 1 Equipamentos e materiais usados para a germinação de sementes na USFQ Câmara de fluxo laminar Autoclave Quarto de crescimento (18°C. HMSO. 8 horas de escuridão) Estantes com abajures fluorescentes de 20 watts. Sigma Químico) Sales Murashige e Skoolg (xxx) Ágar-ágar (Sigma Químico) Açúcar Carvão ativado Vitamina B Complexo Pinça de vários tamanhos 2 bisturis com folhas disponíveis Potes de vidro para o etanol Frascos de vidro Potes de plástico de 250 ml . 16 horas de luz.

Caixas Petri Recipientes pequenos de vidro para as sementes Tampas para frascos Avental de laboratório Papel de alumínio Toalha pequena para mãos Pacotes de papel Luvas de cozinha marrons Fita adesiva Luvas de plástico descartáveis Filme Pedaços de tela Bolsas de assar (celofane) Papel de cozinha Fitas elásticas Microporo Papel Álcool anti-séptico (etanol a 70%) Etanol a 100% Roceador para o etanol Marcadores indeléveis (preto) Cloro Seringas Algodão Meia nylon Grampeador e grampos .

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