Como funciona la hibridacin in situ.

Desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN por la temperatura

Agentes desnaturantes: - Temperatura - Molculas polares(con grupos amino y carbonilo que compitan por la formacin de puentes

Alteracin de las propiedades fsicas del ADN por desnaturalizacin

Curvas de Desnaturacin

Las curvas de desnaturacin son especficas para cada molcula de ADN y dependen de la composicin nucleotdica -La curva sigmoidal muestra que las interacciones que mantiene la doble hlice son cooperativas (la separacin en un punto estimula la separacin consecutiva de otros puntos en la molcula) -De esta curva se obtiene la Tm (temperatura media de fusin) -La Tm muestra una

Como funciona la hibridacin in situ.

Aplicacin de la hibridacin de cidos nucleicos en el anlisis molecular

-Formacin de hbridos de DNA:DNA o DNA:RNA durante un proceso de renaturacin - El apareamiento de los hbridos depender de la complementariedad de bases y de las condiciones qumicas y trmicas del proceso de renaturacin Astringencia o rigor (Stringency):grado de especificidad en el apareamiento de los hbridos. Experimentalmente se regula cambiando la temperatura, tiempo, longitud y composicin de las cadenas a hibridar y ambiente qumico (pH, cationes (Na+), molculas polares(formamida))

Como funciona la hibridacin in situ.

Tipos de hibridacin in situ *tisular *cromosomica *FISH (fluorescente) *cromosomica con sondas fluorescentes

Hibridaciones in situ FISH (Fluorescent In Situ Hybridization, Hibridaciones in situ con fluorescencia)
1 Fase.Regin cromosmica de inters.Preparacin de la sonda. Una sonda es un segmento de ADN marcado con fluorescencia, que es complementario Marcado con una molcula fluorescente

Sonda 2 Fase.Hibridacin. Los cromosomas de ADN desnaturalizados, fijos enel porta objetos del microscopio, son expuestos a la sondamarcada con fluorescencia. La hibridacin (fusin) tiene lugarentre la sonda y el ADN cromosmico complementario(es Desnaturalizacin decir,se acopla). e hibridacin 3 Fase.Visu alizac in .Tras la hibridacin, se examina el portaobjeto al microscopio con luz fluorescente. Las seales fluorescentes indican la presencia de ADN cromosmico complementario. La ausencia de tales seales implica que no hay ADN cromosmico complementario.

Entonces
Glosario: Hibridizacin: Formacin de dplex a partir de cualquier combinacin de cidos nucleicos. Dplex: Estructura de cidos nucleicos de doble cadena. Factores que afectan la Hibridacin: Temperatura. La concentracin de sales. Bases no complementarias. Longitud del fragmento. Es importante tomar en cuente estos factores ya que las condiciones optimas no son las mismas para cada experimento.
Que es una sonda? Son oligonucletidos sintticos, cDNA, fragmentos de DNA genmico o RNA de cadena sencilla complementarias a la regin de DNA o RNA blanco.

Sondas Marcadas Contienen alguna marca que revela su unin (hibridacin) a la secuencia elegida, generalmente se trata de P32.

Marcaje
Marcaje: 1er tipo de clasificacin
Caractersticas: -alta sensibilidad (tririo) -alta resolucin -es posible usar mtodo cuantitativo
Algunos istopos: *3-H: seal a nivel subcelular, t=largo Resolucin de un dimetro celular *35-S: tiempo exposicin 1 semana *32P:resolucin menor que el anterior pero menos tiempo *33P: resolucin igual el S en menor tiempo pero de mayor costo

Autorradiografa Inmunocito quimica

Mtodos para ser detectar los marcajes

(Haptenos)
2 clasificaciones de sistemas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda Tipos de marcaje

Directo La molcula detectable (reportera) es enlazada al acido nucleico y este hibrido puede ser visualizado directamente en el microscopio *el paso limitante de este mtodo es que el hibrido subsiste a las condiciones de lavado

Indirecto Requiere una marca que contenga la molcula reportera (inducida qumica o enzimaticamente ) que pueda ser detectada por afinidad citoquimica. En este mtodo al igual que el anterior , el marcaje no debe interferir co n la hibridacin , ya que ola molcula reportera debe estar accesible a los anticuerpos que la detecten

Marcaje: 2do tipo de clasificacin

Marcaje: Isotpicos
Ejemplo con 32P para ver tripletes
(lectura)
En el mosaico se observaron fragmentos de 7,1 y 6,6 Kpb, correspondientes a 747 y 293 tripletes CGG para la MC y un fragmento de 2,9 Kpb correspondiente a una premutacin de 113 repetidos CGG. (figura 1b). En el caso de metilacin parcial se observan fragmentos de tamao entre 6,2 y 7,2 Kpb correspondientes a una amplificacin de 363 a 696 repeticiones CGG con metilacin del locus y fragmentos entre 2,8 y 5,2 kpb correspondientes a amplificacin entre 30 y 830 repetidos CGG, no metilados (figura 1C). Figura 1. Autorradiografa de Southern blot e hibridacin con la sonda StB 12,3 marcada con ?-32P [dCTP]. 1A)Carril 1: Mujer normal. Carriles 2, 3 y 4: Probando hombre con mutacin completa. 1B)Carril 1: Mujer normal. Carril 2: Probando con mutacin completa y premutacin (mosaico). 1C)Carril 1: Probando con mutacin completa y metilacin parcial. Carril 2: Mujer normal.

Marcaje: Isotpicos
Ejemplo de una autoradiografa de AND

FIGURA. Autoradiografa de hibridizacin Southern realizada con ADN de plantas de maz obtenidas por cultivo de tejidos (Dp 1, Dp 4, Dp 6, Dp 9, Dp 14, Dp 17) lneas A hasta F, respectivamente, y plantas utilizadas como control (LH 51 y B 73) lneas G y H. Las enzimas de restriccin empleadas fueron HpaII y MspI sensibles a la metilacin. Como sonda se us el fragmento P8b de maz. Los nmeros desde 1 hasta 4 representan bandas de peso molecular decreciente.

Marcaje: NO Isotpicos
Ejemplo con Hibridacin In Situ Fluorescente

CITOGENTICA MOLECULAR - FISH Caractersticas : FISH (Hibridacin In Situ Fluorescente). Es una metodologa que se basa en la propiedad de apareamiento de las bases nitrogenadas adenina-timina (A-T) y guanina-citocina (G-C) de los cidos nuclicos.

Deteccin de genes especficos mediante la utilizacin de sondas marcadas con distintos fluorocromos. Cromosomas humanos MO de fluorescencia.

En conclusin
Cmo se logra esto? Que es la hibridacin en situ a grandes rasgos?

La tcnica dehibridacin in situ est basada en la capacidad que poseen los cidos nucleicos para hibridarse entre s, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADNo ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.

Se disea una sonda (formada por una secuencia de ADN Previamente conocida), Y marcada con un fluorocromo o Istopo radiactivo. Que logramos con ello? o Qu se La utilizacin de esta tcnica produce: La hibridacin (unin),de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (si est presente) y posteriormente mediante tcnicas especficas de deteccin (FISH), se obtiene la transformacin de la secuencia en algo visible.
produce?

Preparacin del tejido

Fijacin : Se utiliza para preservar morfolgicamente el material Biolgico. Desde el punto de vista qumico existen limitaciones en el tipo de fijacin: i) Los grupos funcionales involucrados en el apareamiento de las bases estn protegidos por la estructura de DNA. ii) El RNA es poco reactivo con agentes entrecruzantes iii) La reaccin es reversible con formaldehdo Tejidos embebidos y su seccionamiento: El seccionamiento de los tejidos puede ser realizado en un criostato o embeber la muestra en una matriz para despus cortarla con un microtomo. La parafina es el medio ms popular para embeber Tejidos , posteriormente la parafina puede ser disuelta totalmente del tejido antes de la hibridacin.

Tratamiento de la laminilla
Las laminillas se tratan para que tengan la capacidad de adherir las clulas o tejidos y puedan ser retenidos durante los pasos subsecuentes de la hibridacin in situ. Alternativamente las laminillas se venden cargadas positivamente dando una buena adherencia.

Pretratamiento del tejido

Antes del a hibridacin, el tejido debe tener un pretratamiento para que incremente la eficiencia de la hibridacin y minimice los pegados inespecficos: a) Los tejidos o secciones son usualmente tratadas con solventes orgnicos (etanol o metanol) para permeabilizar las clulas removiendo las membranas lipdicas. b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesibilidad al RNA de inters. la digestin con proteasas es un paso crtico; una digestin insuficiente o la sobre digestin puede afectar sustancialmente la intensidad de la seal as como la morfologa. La digestin es seguida de una refijacin, de lo contrario la desintegracin del tejido ocurrir. c) Inactivacin endgena enzimtica. Cuando hay una enzima es usada como marca, la actividad enzimtica endgena puede ser inactivada. Ejemplo, para el caso de peroxidasa la muestra es tratada con 1% perxido de hidrgeno en metanol por 30 minutos. d) Tratamiento con RNAsas. Sirve para remover RNA endgeno y puede mejorar la seal en hbridos DNA-DNA. Este tratamiento puede ser usado como control en hibridaciones de mRNA. e) Tratamiento con HCl. la extraccin de protenas y la hidrlisis parcial de las secuencias blanco puede contribuir a un mejoramiento en la seal. f) Tratamiento con detergentes. (si los componentes de la membrana lipdica no han sido extrados por otros procedimientos como fijacin, deshidratacin, incrustacin e inactivacin endgena de la enzima.)

Microscopia
a) De campo claro. Las imgenes son obtenidas por transmisin directa de luz a travs de la muestra. Es la preferida para muchas aplicaciones rutinarias porque las preparaciones son permanentes. (ejemplo: localizacin de una copia de un gen, requiere el deteccin de atogramos de DNA). b) De campo oscuro. La luz dispersa entra a los lentes del microscopio, por tanto el material aparece como un objeto iluminado en un fondo negro. Usada para experimentos radioactivos. c) De contraste de fases. Explota los efectos de la interfase producida cuando dos sets de onda se combinan. ste es el caso cuando la luz pasa a travs de una parte delgada o densa de la clula (como el ncleo) y es retrasda. En consecuenia su fase es cambiada relativamente a la luz que pasa por una regin adyacente (delgada) del citoplasma. Usada para deteccin enzimtica. d) Microscopa de contraste de reflexin. Es similar a la de contraste de fases. Esta tcnica mide el cambio de la longitud de onda de la luz reflejada de la muestra que de la luz emitida directamente. Se utiliza para detectar una copia simple del gen sin radiactividad.

e) De fluorescencia. Contiene una lmpara para excitar fluorforo y un filtro especial, el cual transmite un alto porcentaje de luz emitida por el fluorforo. es de gran utilidad para la hibridacin in situ no radioactiva. f) Imgenes digitales. Puede detectar seales que no pueden ser vistas con microscopa covencional. La tecnologa de procesamiento de imgenes provee de un mejoramieto dn la deteccin de la seal como medida de datos cuantificados. Si se quieren ver imgenes en 3 dimensiones, ste es el instrumento ideal. Para anlisis en tres dimensiones la microspia confocal es una alternativa. g) Microscopa electrnica. La resolucin de este tipo de microscopa resalta cuando los electrones en lugar de luz son usados, teniendo cortas longitudes de onda (0.004 nm). El poder de resolucin de los microscopios electrnicos ms modernos es de 0.01 nm. La resolucin de la microscopia electrnica es de 0.1 nm resuelve las estructuras finas de la clula. h) Flujo citomtrico. La velocidad donde la cual la fluorescencia de clulas individuales puede ser medido con un flujo citomtrico lo cual tiene muchas ventajas para la cuantificacin de la seal en la hibridacin in situ.

Legend: Process of creating a hybrid strand of DNA/RNA The two strands of a DNA molecule are denatured by heating to about 100C = 212F (a to b). At this temperature, the complementary base pairs that hold the double helix strands together are disrupted and the helix rapidly dissociates into two single strands. The DNA denaturation is reversible by keeping the two single stands of DNA for a prolonged period at 65C = 149F (b to a). This process is called DNA renaturation or hybridization. Similar hybridization reactions can occur between any single standed nucleic acid chain: DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA. If an RNA transcript is introduced during the renaturation process, the RNA competes with the coding DNA strand and forms double-stranded DNA/RNA hybrid molecule (c to d). These hybridization reactions can be used to detect and characterize nucleotide sequences using a particular nucleotide sequence as a probe.