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ZAMORANO
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Area de Actividad: Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin In Vitro

IV. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Esta parte del laboratorio permitir al estudiante llevar a cabo todos los pasos correspondientes en la preparacin de un medio de cultivo usando como base las sales minerales del medio de Murashige y Skoog (MS). Este medio fue originalmente desarrollado para cultivo de tejidos de tabaco pero ha sido utilizado en muchas otras especies con muy buenos resultados. La caracterstica distintiva del medio MS es su alto contenido de sales, especialmente las sales de K y de N. Tambin utiliza B, Mn y Zn en cantidades altas. La manipulacin de los niveles de auxina y citocinina va a influenciar la respuesta en cuanto a morfologa de los tejidos; esta respuesta puede variar desde la formacin de tejido calloso no diferenciado, hasta la formacin de races, yemas, o embrioides. Macroelementos CaCl22H2O KH2PO4 KNO3 MgSO47H2O NH4NO3 Microelementos H3BO3 CoCl26H2O CuSO45H2O KI MnSO44H2O Na2MoO42H2O ZnSO47H2O Hierro FeSO47H2O Na2EDTA mg/L 440 170 1900 370 1650 mg/L 6.2 0.025 0.025 0.83 22.3 0.25 8.6 mg/L 27.8 37.3 Componentes orgnicos myo-inositol cido nicotnico piridoxina-HCl tiamina-HCl mg/L 100.0 0.5 0.5 0.1

AIA (u otra auxina) 2.0 (1-30) Kinetina (u otra citocinina) 0.2 (0.04-10) (Se pueden usar otros reguladores del crecimiento en lugar de, o en adicin a las auxinas y citocininas) pH 5.7 - 5.8

4.1

Modificaciones del medio MS:

35 Las cantidades recomendadas para los compuestos orgnicos del medio de Murashige y Skoog (MS) (1962) fueron desarrolladas como producto de una investigacin extensiva. Una modificacin en las cantidades de orgnicos dio origen al medio Linsmaier-Skoog (1965). Este medio contiene los mismos compuestos inorgnicos que el medio MS, y los orgnicos que incluye son el myo-inositol con la misma dosis y la tiamina en una dosis de 0.4 mg/L; el resto de compuestos orgnicos (piridoxina y cido nicotnico) se omiten. En aos recientes el hierro ha sido incorporado al medio en forma de FeNaEDTA a razn de 50 mg/L en lugar de la mezcla de FeSO47H2O y Na2EDTA que se utiliz en el medio original.

4.2

Pasos a seguir en la Preparacin de Medios Nutritivos

Los pasos a seguir en la preparacin de un litro de medio de cultivo son: 1. En un beaker agregar la mitad (500 ml) de agua bidestilada del volmen total de medio a preparar. Colocar una barra agitadora magntica en el fondo del beaker y mantener en agitacin constante con la ayuda de un agitador automtico; 2. Si el medio utiliza el 100% de las sales minerales MS entonces agregar las siguientes soluciones: a) 100 ml de la solucin madre de macroelementos que ha sido previamente preparada a una concentracin de 10x; b) 1 ml de la solucin madre de microelementos que ha sido previamente preparada a una concentracin de 1000x; c) 5 ml de la solucin madre de hierro que ha sido previamente preparada a una concentracin de 200x; 3. A continuacin agregar los compuestos orgnicos (vitaminas, aminocidos, reguladores del crecimiento) de acuerdo al protocolo del cultivo con que est trabajando. Para la mayora de compuestos orgnicos que se utilizan se preparan con anticipacin soluciones madres en varias diluciones (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, etc.), recuerde de utilizar la dilucin correcta de acuerdo a la concentracin requerida del compuesto; 4. Seguidamente agregar la sacarosa y esperar a que se disuelva totalmente; 5. Aforar al volmen deseado (en este caso es de 1L) con un frasco volumtrico de 1000 ml; 6. Colocar el medio nuevamente en el beaker y nivelar el pH de acuerdo al cultivo con el que est trabajando. El pH se regula con soluciones 0.1N, 1N o 2N de KOH, NaOH o HCl; 7. Si el medio es slido entonces este es el momento de agregar la cantidad recomendada de agar. Si el medio es lquido entonces no se agrega agente gelatinizador y se pasa directamente al paso 9; 8. Si se agreg agar, ste necesita ser disuelto en un horno microondas. Se coloca el beaker con el medio en el horno microondas y se calienta suficiente tiempo hasta que el agar este disuelto. Durante el tiempo que esta calentndose es conveniente estar agitando el medio

36 en el agitador automtico cada dos minutos aproximadamente. El tiempo que va a permanecer el medio en el microondas calentndose va a depender del volmen de medio que se est preparando; 9. Dispensar el medio en los contenedores. Es importante que los contenedores estn previamente identificados con el nombre del cultivo que se va a sembrar y la etapa en el proceso de micropropagacin a que corresponde ese medio; 10. Tapar los contenedores; 11. Esterilizar en el autoclave. Una vez que los contenedores con el medio salen del autoclave hay que dejarlos enfriar y luego refrigerarlos hasta que se vayan a utilizar. Es recomendable utilizar el medio dentro de una semana despus de haber sido preparado.

4.3 Como Preparar Soluciones Madre

Siempre antes de preparar una solucin madre hay que estar seguro cunto del qumico se debe agregar a la cantidad de medio nutritivo que estamos preparando. Por ejemplo: Si la cantidad requerida de BA en un medio de cultivo es de 1 mg/L, esto equivale a decir que: 0.1 mg de BA se requieren para preparar 100 ml de medio, y 0.25 mg se requieren si es que la cantidad a preparar es de 250 ml de medio. Entonces, si vamos a preparar solamente 250 ml de medio de cultivo, vamos a necesitar agregar 0.25 mg de BA. Esta cantidad de BA se puede agregar utilizando una solucin madre de 1:1 (1mg = 1ml). As que con una pipeta de 1 ml, se agregan 0.25 ml de esta solucin madre de 1:1 al medio de cultivo para llenar el requisito correspondiente a 0.25 mg de BA en el medio nutritivo. Para la preparacin de soluciones madre dependiendo del tipo de solvente y de la dilucin a utilizar referirse a la informacin que aparece a continuacin.