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Zamorano
Carrera de Ciencia y Produccin Agropecuaria Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagacin

Mdulo de Biotecnologa Aplicada Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagacin in vitro

5.5
Explante: Material Vegetal:

Organognesis Directa
Porciones de Lmina Foliar Violeta Africana (Sainpaulia ionantha)

Introduccin
En la micropropagacin de violeta africana (Saintpaulia ionantha) y otras gesnericeas (Episcia, Ajuga) dos tipos de explante han dado buenos resultados: tejido de pecolo y de hojas. El propsito de esta prctica de laboratorio es familiarizar a los estudiantes con los procedimientos de extraccin, esterilizacin, y establecimiento in vitro de explantes de violeta africana.

Materiales y Mtodos
1. Hojas maduras de violeta africana (para la prctica de establecimiento) 2. Material establecido in vitro en etapas II III (para las prcticas de multiplicacin y/o enraizamiento) 3. Material en etapa III, listo para salir al invernadero 4. Platos Petri estriles 5. Pinzas y bistures No. 11 6. Solucin de 70% Ethanol 7. Solucin desinfectante preparada con 2% Ca(OCl) (hipoclorito de Ca) ms 2 gotas de tween 80 por cada 100 ml de solucin. 8. Agua destilada estril para los enjuages 9. 10 frascos / estudiante conteniendo medio para establecimiento de violeta (Etapa I) 10. 10 frascos / estudiante conteniendo medio para multiplicacin / enraizamiento de violeta africana (Etapas II y III) 11. Bandejas multiceldas y microinvernaderos para la prctica de aclimatacin (Etapa IV) 12. Macetas para la transferencia a contenedores individuales

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Procedimientos
1. Obtenga varias hojas maduras de violeta africana con aproximadamente 2 a 3 cm. de pecolo. 2. Coloque las hojitas en un beaker, cubra con gasa y ajuste con una banda. 3. Remueva las partculas superficiales de polvo y rastros de suelo poniendo el beaker con los segmentos directamente bajo el chorro de agua de la llave durante 15 min. (usar agua fra). 4. Limpie la cmara de flujo laminar y el espacio donde va a trabajar con 70% ethanol. 5. Luego del enjuage bajo el agua de la llave, manipule las hojas solamente con las pinzas, no con las manos. Separe los pecolos de las lminas y coloquelos en un beaker para proceder a su desinfeccin. 6. Coloque los explantes en una solucin de 70% ethanol durante 15 segundos. 7. Transfiera los explantes a la solucin desinfectante y mantenga los dos tipos de explante en esta solucin durante15 minutos. 8. Transfiera el beaker con las hojas y los pecolos en la solucin desinfectante a la cmara de flujo laminar. Vace la solucin desinfectante en otro recipiente. 9. Enjuague las hojas tres veces con agua destilada estril. 10. Luego del ltimo enjuage en agua destilada estril, coloque las hojas en un plato petri estril conteniendo papel filtro. 11. Con la ayuda de pinzas y bistur proceda a cortar los explantes segn demostracin del instructor. 12. Coloque uno de los explantes de hoja en un tubo con medio. Repita para los otros tubos provistos. 13. Coloque uno de los explantes de pecolo en un tubo con medio. Repita para los otros tubos provistos. 14. Sellar los tubos con parafilm y anotar la fecha y el nombre segn instrucciones. 15. Colocar los cultivos en el cuarto de crecimiento (16 horas luz; 25oC).

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Violeta Africana Etapa I (Secciones de Hoja y Peciolo)

Componente Macroelementos MS EDTAFeNa Microelementos MS Inositol Acido nicotinico Glicina Tiamina BAP Sacarosa Phytagel pH = 5.8

1 Litro 50 ml (Solucin madre 10x) 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) 1 ml (Solucin madre 1000x) 100 mg 0.25 mg 1.0 mg 0.05 mg 0.5 mg 30 g 3.75 g

Referencia: protocolo desarrollado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagacin, Zamorano

Etapa II (Secciones de Hoja y Peciolo)

Componente Macroelementos MS EDTAFeNa Microelementos MS Inositol Tiamina AIA Sacarosa Phytagel pH = 5.8 1 Litro 50 ml (Solucin madre 10x) 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) 1 ml (Solucin madre 1000x) 100 mg 0.4 mg 1.0 mg 15 g 3.75 g

Referencia: protocolo desarrollado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagacin, Zamorano

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Violeta Africana Etapa I, II, III (Secciones de Hoja)

Componente Macroelementos MS EDTAFeNa Microelementos MS NaH2PO4 Inositol Piridoxina Niacina Tiamina BAP AIA Sacarosa Phytagel pH = 5.5

1 Litro 50 ml (Solucin madre 10x) 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) 1 ml (Solucin madre 1000x) 170 mg 100 mg 0.4 mg 0.4 mg 0.4 mg 0.08 mg 2.0 mg 30 g 3.75 g

Referencia: Kyte, L. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation.

Etapa I,II,III (Secciones de Peciolo)

Componente Macroelementos MS EDTAFeNa Microelementos MS NaH2PO4 BAP Sacarosa Phytagel pH = 5.5

1 Litro 50 ml (Solucin madre 10x) 50 mg (5 ml de Solucin madre 200x) 1 ml (Solucin madre 1000x) 170 mg 0.01 mg 15 g 3.75 g

Referencia: Kyte, L. Plants from test tubes. An introduction to micropropagation.