Fundamentos de la microscopia

Cuando se acerca un observador a un objeto, crece el ngulo visual y ese objeto parece ser mayor. Sin embargo, por debajo de una determinada distancia (unos 25 cm) entre el ojo y el objeto, ste no se ve con claridad. Este lmite se debe a la capacidad mxima de deformacin del cristalino. Si se sita entre le ojo y el objeto un sistema ptico capaz de aumentar el ngulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. Ese sistema ptico es el MICROSCOPIO. Produce una imagen aumentada de un objeto no visible de forma que sea perceptible por el ojo humano. Se consigue mediante el uso de lentes u otros sistemas. Esta ampliacin de la imagen se puede conseguir de dos formas: ondas luminosas: m. ptico haz de electrones (): m. Electrnico Trminos que describen las caractersticas pticas del microscopio AUMENTO: relacin entre el tamao a simple vista y el tamao observado con el microscopio (es el nmero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su valor real). En el microscopio compuesto se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Se expresa mediante un nmero seguido del signo por (x). CONTRASTE: diferencia en la absorcin de luz entre el objeto estudiado y el medio que lo rodea. Puede aumentarse mediante procedimientos de tincin. PODER DE RESOLUCIN: capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Determina la mxima amplificacin til del microscopio. Depende de la longitud de onda (L) y de la apertura numrica (AN): cuanto menor es L y/o mayor la AN, mayor es la resolucin. La resolucin mxima de un microscopio ptico es de 200 nm. APERTURA NUMRICA: capacidad de la lente para juntar los rayos de luz proyectados hacia ella. Determina la eficacia del condensador y del objetivo. La AN depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y la lente (IR), y del seno de la mitad del ngulo del cono de luz que penetra en la lente (sen ). Si se rellena el espacio existente entre la muestra y el objetivo no con aire, sino con una sustancia de mayor IR (p.e. aceite), se consigue que la mayor parte de los rayos perdidos por los fenmenos pticos ocasionados en el condensador y en el portaobjetos, se refracten y penetren en el objetivo, con lo que se incrementa la resolucin del microscopio. PROFUNDIDAD DE CAMPO: espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento. Ser mayor cuanto menor sea el aumento. REA DEL CAMPO: es el dimetro de la parte de la preparacin que se est viendo. Ser mayor cuando menor sea el aumento.

Funcionamiento del microscopio

Los microscopios tienen tres sistemas que facilitan su funcionamiento, que son: Sistema mecnico * SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. * PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. * CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, etc * REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. * TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque. Es la estructura que sostiene las dems partes del microscopio y le permite moverse. Est formado por el tubo, la platina y el pie. El tubo contiene en su extremo superior el ocular, y a travs de l la luz llega hasta el lente objetivo; La platina es donde se coloca la muestra que se va a observar; y el pie es la estructura sobre la que se apoya el microscopio. En el mecnico se incluyen dos tornillos que facilitan el enfoque del objeto observado: el tornillo macromtrico (permite el enfoque global de la muestra) y el tornillo micromtrico (enfoca detalladamente y con precisin cada una de sus partes). Por tanto este sistema de soporte y mecnico del microscopio est compuesto por: tubo del ocular, revlver, platina, pinzas, brazo, base, tornillos macromtrico y micromtrico.

Conjuntamente se encargan de amplificar la imagen de las estructuras y organismos. El ocular y los objetivos estn marcados con unos nmeros que indican el aumento de cada lente. Si multiplicamos estos nmeros, se conoce el aumento total con el cual estamos observando. Sistema de iluminacin Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos: * Fuente de iluminacin: se trata generalmente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas. * El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la plana, para iluminacin natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo. * Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia. * Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico. Sistema ptico El sistema ptico es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego ampla. * El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado. * Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersin. * Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. * El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior. A. B. C. D. E. F. OCULARES (A) REVOLVER (B) OBJETIVOS (C) (los aumentos en el ext.) PLATINA (D) Tornillos para desplazar la preparacin sobre la platina en sentido longitudinal y transversal (E) CONDENSADOR (F)

G. Tornillo MACROMTRICO (G) H. Tornillo MICROMTRICO (H) I. DIAFRAGMA IRIS (I) J. Tornillo para regular la altura del condensador (J) K. INTERRUPTOR (K) L. Regulador de la Intensidad de Luz (L) M. PINZAS para ajustar la preparacin sobre la platina (M) N. PIE O SOPORTE (N)

Microscopio ptico
Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticas. Tambin se le conoce como microscopio de luz, microscopio fotnico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una nica lente pequea y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espcimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos. Partes del microscopio ptico y sus funciones Las partes esenciales que componen un microscopio ptico son: Parte mecnica Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en l se encuentra la fuente de iluminacin. Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparacin, y unas escalas que ayudan a conocer qu parte de la muestra se est observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten desplazar la preparacin sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal respectivamente. Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y objetivos. Es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Revlver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos. Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomat el microscopio para trasladarlo de lugar. Tornillo macromtrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al utilizrse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible. Tornillo micromtrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macromtrico. Tambin desplaza verticalmente la platina, pero de forma prcticamente imperceptible. Es el nico tornillo de enfoque que se utiliza, una vez realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento. Parte ptica Oculares: son los sistemas de lentes ms cercanos al ojo del observador, situados en la parte superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se resea en la parte superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que se utilizarn en esta prctica). Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden se mono o binoculares. Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo, mediante el revlver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma creciente segn sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que tambin van reseados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la preparacin al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersin (normalmente van marcados con un anillo rojo). Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la preparacin, de manera que proporciona mayor o menos contraste. Se regula en altura mediante un tornillo Fuente de iluminacin: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminacin est constituido por una lmpara halgena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un reflector que enva los rayos luminosos hacia la platina. Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminacin. Abrindolo o cerrndolo permite graduar la intensidad de la luz. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la red, es necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo llevan incorporado en el pie del microscopio. Adems, el transformador dispone de un potencimetro para regular la intensidad de la luz. 1) Microscopio Optico Simple: Este es el ms comn, y popularmente se lo conoce como lupa, este esta formado por un lente convergente y es l ms sencillo de los instrumentos pticos. Este microscopio tiene una capacidad de ampliacion de unas 10 veces aproximadamente. 2) Microscopio Optico Compuesto: Este se halla comprendido por tres sistemas Sistema Mecnico: Sirve de soporte a las piezas donde se instalan los lentes, y posee mecanismos de movimiento controlado; Aqu se encuentra el pie o base que da la estabilidad, la columna que sostiene las diversas partes, la platina que se usa para colocar el objeto a observar, el carro que va sobre la platina y permite desplazar la preparacion, el brazo en el que se encuentran los tornillos macrometicos y micrometicos, el tubo va unido al brazo y en su parte superior se coloca el ocular y en su parte inferior se coloca el revolver de objetos; el revolver es donde van enfocados los objetivos. Sistema ptico: Esta formado por: * El ocular: Se encuentra en la parte superior del tubo y recibe ese nombre porque se encuentra cerca del ojo del observador, y cumple la funcin de aumentar la imagen formada por la lente del objetivo. * Los Objetivos: Son una serie de lentes montados sobre cilindros de distintos tamaos que se enroscan al revolver, y por estar prximos a la preparacin que se observa producen el aumento de la misma. Estos lentes se clasifican en menor, mediano, y mayor aumento, y son considerados como objetivos secos, puesto que no necesitan ningn liquido en su estructura para su desempeo. Sistema de Iluminacin: Comprende de: * El condensador: Es un conjunto de lentes situado debajo de la platina, que permite concentrar la luz sobre el objeto a observar. * El espejo: Nos permite dirigir la luz, ya sea artificial o natural al campo de observacin del microscopio, tiene una cara plana para observar la luz natural y otra cncava para la luz artificial. Pero hoy ya no se fabrican estos, porque los microscopios traen una lamparilla incorporada. * El iris: Esta debajo del diafragma y es el que regula el paso de la luz hacia el condensador y por consiguiente la platina. Algunos microscopios copticos compuestos pueden aumentar un objetos por sobre las 2.00 veces. Aplicaciones del microscopio ptico Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la organizacin microscpica es importante, incorporndose con xito a investigaciones dentro del rea de la qumica (en el estudio de cristales), la fsica (en la investigacin de las propiedades fsicas de los materiales), la geologa (en el anlisis de la composicin mineralgica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biologa (en el estudio de estructuras microscpicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la ciencia. Hasta ahora se da uso en el laboratorio de histologa y anatoma patolgica, donde la microscopa permite determinadas aplicaciones diagnsticas, entre ellas el diagnstico de certeza del cncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lpidos, protenas, depsitos seos, depsitos de amiloide, etctera. El microscopio ptico tiene muchas aplicaciones, siendo las principales: Se realizan estudios de: Hematologa: Frmula roja, blanca y rutina, plaquetas, tiempo de protombina, glucosa urea, creatinina, general de orina, bilirrubina: Directa e indirecta. TGO, TGP, acido rico, factor Reumatoide, protena C reactiva, reacciones febriles, bacteriologa, exudado uretral, faringeo, vaginal y de heridas varias. Microscopio de fluorescencia Descubierto en 1908 por Khler y Siedentopf, y se basa en que una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos. Siendo escasas las molculas autofluorecentes, su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores. Es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados

debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. Fluorescencia El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un electrn de un tomo absorbe toda la energa de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situacin inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energa que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital. Aprovechando este fenmeno, se han creado los fluorocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitacin que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los ms comunes son el DAPI que tie el ncleo de las clulas y el GFP. Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a determinadas molculas u orgnulos. Pero lo ms habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras molculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo especfico a estructuras concretas de la clula. Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energa) cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta). Problema: La utilizacin de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas, entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la desaparicin de la fluorescencia. Fluorescencia: A medida que las molculas excitadas regresan a su estado normal liberan el exceso de energa en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiacin excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, segn el color del colorante usado. CONSTITUCION FUNDAMENTAL: Fuente luminosa (lmpara de mercurio o halgena): Debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el lmite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparacin de la misma forma en que lo hace un microscopio ptico comn Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiacin ultra-violeta. Filtros: Retienen la radiacin ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiacin visible, que no es peligrosa. Existen un gran nmero de juegos de filtros de excitacin y de emisin para los diferentes fluorocromos: *El de excitacin: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. *El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daos retinianos que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrmico. Corta completamente la luz de excitacin no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisin del fluorocromo. *Espejo Dicroico: Permite la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia. Posicionado en 45 respecto al eje ptico, la longitud de onda ms corta es reflejada y la longitud de onda ms larga lo atraviesa. FUNDAMENTO FISICO La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin. Ejemplo: 1. Primer filtro de excitacin: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el esquema est seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul) 2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el fluorocromo . 3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm. Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos: *El largo de onda de la fluorescencia (emisin) es generalmente ms largo que el largo de onda de la luz excitadora

*Mientras ms larga sea la longitud de onda, ms baja es la energa de la luz. Por lo tanto la energa de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida. *La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho ms baja que la de la luz de excitacin *La fluorescencia se desvanece. *Cada substancia posee un espectro de fluorescencia caracterstico. APLICACIONES 1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma. 2.Fluorescencia inducida: Partes especficas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante mtodos de tincin. Ej:substancias especficas como organelos celulares, protenas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. 3. Sobre objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin, siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molcula de DNA, un virus. MICROSCOPIO INVERTIDO Como su nombre lo dice un microscopio invertido est al revs comparado con un microscopio convencional. La fuente de luz y el condensador estn sobre la plataforma apuntando hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla estn debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Las nicas cosas que estn en disposicin corriente son el tubo binocular o trinocular, as mismo la muestra es colocada sobre la plataforma o platina mecnica. Aunque un microscopio electrnico tiene gran significado en la magnificacin y resolucin de la muestra, ste requiere que el especmen sea completamente preparado, conduciendo a que cualquier tipo de vida en la muestra no sobreviva. Por otra parte, el microscopio de luz concede una observacin temporal de muestras vivas, sin embargo, stas requieren una hidratacin constante que las somete a estres permanente, imposibilitando de tal manera su supervivencia. A diferencia de estos microscopios, el microscopio invertido permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparacin previa, favoreciendo el monitoreo del estado de crecimiento, comportamiento y dems parmetros involucrados en el desarrollo del cultivo. Con un microscopio invertido se pueden observar cultivos enteros o grandes muestras bajo estados ms naturales y con disminuidas condiciones de estres. La observacin se realiza a travs de las bases de diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables, tales como placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plsticas y de vidrio. El material plstico es pticamente superior que el de vidrio debido que son ms delgados y uniformes. Una desventaja del microscopio invertido es su limitada magnificacin, debido a que los objetivos ms potentes son de 40X y de 60X, aunque ste ltimo eventualmente se encuentra en el mercado y es de muy alto costo. Si embargo estos objetivos tienen la ventaja de sobrepasar el lmite del grosor del recipiente y observar la imagen con fineza. Componentes. En el microscopio invertido se identifican los siguientes componentes: -Portalmpara: Es un casquillo dentro del cual se encuentra la lmpara que es la fuente de luz halgena. -Soporte de filtros: Es un contenedor dentro del cual se insertan filtros especficos para el tipo de iluminacin requerida en la observacin. El filtro de cobalto es de color azul, pasa la luz de amarillo a blanco, vindose la imagen en campo claro (es un tipo de iluminacin que permite observar la muestra oscura contra un fondo claro). El filtro verde es indispensable para el contraste de fases (es un tipo de iluminacin que diferencia la imagen en grado de tono, brillo o color, observndose las clulas traslcidas) y eventualmente puede emplearse para contraste en relieve o de interferencia (que produce alto contraste, imgenes tridimensionales y reales de objetos transparentes, a diferencia del contraste de fases suple una claridad definida, imagen detallada de clulas gruesas o clulas con amplios ndices de refraccin). -Portanillos de luz: Es una corredera de anillos, que se maneja de acuerdo con el tipo de iluminacin requerida (contraste de fases o contraste en relieve). No se emplean anillos para campo claro. -Apertura del diafragma: Es un dispositivo con el cual se grada el nivel de luz emitido por la lmpara. Puede ser mantenido bajo para enfocar fcilmente sobre muestras no coloreadas o abierto para contraste de fases. -Condensador: Es un sistema de lentes que recoge los rayos de luz y los converge dentro de un foco. Est localizado directamente por encima de la plataforma del microscopio y est acoplado con la apertura del diafragma para controlar el incremento de la resolucin, realzar el contraste, reducir el resplandor y garantizar ptimos resultados con todas las combinaciones ocularobjetivos.

-Soporte: Es el que sostiene el condensador y la lmpara manteniendo la estabilidad del microscopio. - Plataforma mecnica: Platina metlica donde se colocan las muestras a observar, presenta un orificio central que comunica la luz proveniente del condensador con los objetivos. -Carro mecnico: Soporte hueco en el cual se acopla el recipiente del cultivo, posee una regleta que permite el movimiento del carro sobre la plataforma mecnica, de derecha a izquierda o de arriba hacia abajo. De acuerdo con el tipo de recipiente se emplea un soporte especfico. En el caso de los frascos no se emplea este soporte. Sin embargo ste es un accesorio que puede ser reemplazado, colocando cualquier recipiente directamente sobre la plataforma mecnica y haciendo el monitoreo del cultivo manualmente, con movimientos diagonales o en zig zag. -Objetivos: Es un sistema de lentes complejos localizados debajo de la plataforma mecnica. Los objetivos corrientes de alto poder, tienen muy corta distancia de trabajo y por lo tanto deben acercarse a la muestra para su enfoque, en el microscopio invertido los objetivos son adaptados para trabajar a largas distancias debido a que el grosor de los recipientes impide el contacto estrecho entre el objetivo y la muestra. Adems los objetivos son corregidos para enfocar muestras sobre diferentes bases. El aumento de los lentes se identifica con un cdigo de colores; 4X - rojo, 10X amarillo, 20X verde, 32 o 40X azul. El objetivo de 100X no es disponible para este microscopio. Comercialmente los microscopios invertidos tienen dos presentaciones de objetivos; la primera con aumentos de 4X, 10X, 20X y 32X y la segunda con aumentos de 4X, 10X, 20X y 40X. -Revolver de portaobjetivos: Es un dispositivo donde se ensamblan los objetivos. -Otras piezas: Son los botones micro y macromtrico, tubo binocular o trinocular (en caso de poseer un fototubo para adaptar cmara fotogrfica), oculares, anillo de ajuste de dioptras (para la correccin de la diferencia de dioptras entre ambos ojos), botn para ajustar el bulbo de voltaje (regula la entrada de voltaje al microscopio prolongando su tiempo de duracin), receptculo para el cable de conexin comunicado con el fusible del microscopio. Algunas ventajas y desventajas del microscopio invertido. Una gran ventaja del microscopio de luz sobre el microscopio electrnico es la habilidad para observar organismos vivos y tejidos. Varios tipos de microscopios electrnicos requieren que el espcimen altamente preparado (lo cual incluye recubrimientos con oro) y vaco para la observacin. En los microscopios de luz se pueden observar temporalmente organismos vivos, lo cual permite determinar algunas funciones vitales, sin embargo las muestras se preparan con soluciones de alcohol o formaldehido, componentes que denaturan las protenas y los cidos nucleicos. Mientras un microscopio electrnico tiene una alta magnificacin y resolucin que un microscopio de luz (algunos producen espectaculares imgenes tridimensionales), slo produce imgenes de muestras muertas. A diferencia de estos microscopios, en el invertido los cultivos o muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables, se utilizan entonces, placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plsticas y de vidrio, lo cual permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparacin previa, se pueden adems observar grandes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite disminuir las condiciones de estrs. La primer desventaja es el costo. Los microscopios invertidos no estn en cualquier lugar, como si lo est un microscopio con una configuracin estndar por eso es poco competitivo para los fabricantes . Otra desventaja es su limitada magnificacin, pues el objetivo ms potente es de 60X, siendo poco frecuente en el mercado y de muy alto costo. Actualmente se estn comenzando a fabricar objetivos de 100X que se utilizan en aceite de inmersin, sin embargo son bastante costosos y escasos. Microscopio de campo oscuro Utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal. Fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados. Permite ver : - Partculas dispersas en un medio homogneo. - La observacin del movimiento Browniano de las partculas. - Se puede utilizar para la observacin de preparaciones vivas, sin colorear. - Visualiza los bordes destacados de las muestras. - Y microorganismos con dimetros superior a 0.2 um. Consta de un condensador especial que debe estar muy cercano a la preparacin y que lanza sobre la muestra un cono hueco de luz. Con esto se logra que, solamente los rayos que chocan con las estructuras sometidas a estudio y son reflejados hacia arriba, puedan ser visualizados a travs del objetivo.

Cmo funciona el microscopio de campo oscuro Debido al ngulo de incidencia del haz luminoso sobre el espcimen que se va a observar, permite que el fondo sea oscuro y los bordes de las clulas sanguneas aparezcan brillantes. Esto es posible gracias al tipo de condensador que lleva este tipo de microscopio. La luz se dispersa al chocar contra la clula o espcimen que se va a observar. Es como si en una habitacin oscura entra un pequeo haz de luz por una rendija de una ventana y en el fondo oscuro de la habitacin se iluminan las partculas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible. Para comprender como funciona la microscopa en campo oscuro hemos puesto un video que nos hace visualizar este tipo de tcnica. Microscopio Electrnico Es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 2 aumentos comparados con los de los mejores microscopios pticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles". Se utiliza para conocer el tamao, estructura y morfologa de los seres vivos. El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst Ruska, Max Knoll y Jhener entre 1925 y 1930, quines se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Limitaciones del microscopio electrnico El limitado dimetro de la apertura no permite que la informacin detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolucin. * El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al constraste de difraccin, provocado por la prdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes gruesos. * El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes finos. * Existen tambin distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmtica, esfrica y cromtica * El problema de la funcin de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema ptico a una imagen descompuesta en ondas cuadrticas. El material biolgico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vaco y la transferencia de energa. Para resolverlos, se utilizan distintas tcnicas dependiendo del tamao de la muestra: * Para muestras grandes como rganos, tejidos o clulas, se utilizan tres tcnicas: 1. La fijacin qumica o la criofijacin 2. La inclusin en resinas (criosustitucin) 3. La rplica metlica * Para muestras pequeas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes tcnicas: 1. La tincin negativa: los agentes de tincin ms usados son el molibdato amnico, el fosfotungstato sdico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactan mnimamente con la muestra y son estables en la interaccin con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusin, tienen un tamao de grano pequeo. 2. La rplica metlica: para construir la rplica metlica se evapora el metal (estao), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vaco, se disuelve. 3. La criomicroscopa Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (Transmission Electron Microscope, TEM) y el microscopio electrnico de barrido (Scanning Electron Microscope, SEM). Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espcimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Se coloca una placa fotogrfica o una pantalla fluorescente detrs del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Un microscopio electrnico de barrido crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o

provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque, al contrario que los TEM o los microscopios pticos, produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. Se han desarrollado otros tipos de microscopios electrnicos. Un microscopio electrnico de barrido y transmisin (Scanning Trasnmission Electron Microscope, STEM) combina los elementos de un SEM y un TEM, y puede mostrar los tomos individuales de un objeto. El microanalizador de sonda de electrones, un microscopio electrnico que cuenta con un analizador de espectro de rayos X, puede analizar los rayos X de alta energa que produce el objeto al ser bombardeado con electrones. Dado que la identidad de los diferentes tomos y molculas de un material se puede conocer utilizando sus emisiones de rayos X, los analizadores de sonda de electrones no slo proporcionan una imagen ampliada de la muestra, como hace un microscopio electrnico, sino que suministra tambin informacin sobre la composicin qumica del material. Para estudiar la estructura intema de los procariotas es esencial el uso del microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiacin de los electrones es mucho ms pequea que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada, la resolucin obtenda con el microscopio electrnico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio optico. Mientras que con el microscopio optico ordinario o el de contraste de fases las estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 0,2 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0,001 m. Con el microscopio electrnico es posible ver mucbas sustancias incluso de tamao molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados: si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico. Despus de la deshidratacin, la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales estn compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por elIo, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y; por tanto, se ven mejor. Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin negativa. Se aplica el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la microscopia electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico (fosfotngstico). Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio electrnico. Otra tcnica de la microscopa electrnica recientemente desarrollada es la de criocorrosin que evita la formacin de artefactos al eliminar la fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento qumico, y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que se eliminan porciones de las superficies de las clulas. Se hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose observar estructuras superficiales o internas de las clulas. La mayora de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos. | Mantenimiento del microscopio

* El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran daarlo. Mientras no est en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo con una bolsa plstica o campana de vidrio. * Las partes mecnicas deben limpiarse con un pao suave; en algunos casos, ste se puede humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc. Que hayan cado sobre las citadas partes. * La limpieza de las partes pticas requiere precauciones especiales. Para ello debe emplearse papel "limpiante" que expiden las casas distribuidoras de material de laboratorio. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso eliminarlas. Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con ter y luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro que queda sobre la lente frontal del objetivo de inmersin debe quitarse inmediatamente despus de finalizada la observacin. Para ello se puede pasar el papel "limpialentes" impregnado con una gota de xilol. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posicin ms baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Gurdese en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formacin de hongos. Ciertos cidos y otras sustancias qumicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio. Manejo y colocacin del microscopio. Si es posible, el microscopio debe dejarse permanentemente montado en el banco o mesa, cubierto con una tapa contra el polvo, cuando no se utiliza. Generalmente, la mayor parte de los desperfectos que sufre un microscopio son producidos por los continuos golpes que recibe al ser introducido y extrado de su estuche. Si no pudiera dejarse fijo, se proceder siempre a su movimiento con sumo cuidado, procurando cogerlo por el brazo o soporte rgido del mismo, a fin de evitar desajustes. La mesa para el microscopio debera ser lo ms slida posible. Cualquier vibracin impide una microscopa de precisin a altos aumentos. 1. Traslado. Se toma con la mano derecha el brazo del microscopio y con la mano izquierda la base. 2. El cordn se deber enrollar sobre si mismo , no alrededor del cuerpo del microscopio. 3. El microscopio se encender hasta que comience la observacin. 4. Ya encendido, no se apagar constantemente, sino hasta finalizar la observacin de todas las muestras que se indiquen en la prctica, mientras no se observe, se disminuir la intensidad luminosa. 5. Mientras permanezca encendido se evitar realizar cualquier movimiento brusco. 6. Se evitar manejarlo con las manos hmedas o mojadas. 7. Cuando no se est observando, deber eliminarse la lente ocular con el objeto de menor aumento. 8. El sistema ptico y de iluminacin nunca deber ser tocado con los dedos. 9. No se debern colocar los portaobjetos mojados sobre la platina. 10. Despus de usar el lente de inmersin se deber limpiar con un pao suave o con un papel higinico. 11. En las preparaciones en fresco siempre deber cubrirse con cubreobjetos. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: 1. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. 2. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 1. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de

percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 2. Empleo del objetivo de inmersin: 1. Bajar totalmente la platina. 2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. 3. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 4. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. 5. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. 6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 8. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. 9. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 10. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. Colocacin de las preparaciones Para un manejo correcto del microscopio conviene seguir los siguientes pasos: 1.-Preparaciones Los objetos que se pueden observar al microscopio han de ser transparentes para que la luz pueda atravesarlos. En muchas ocasiones se tien para poder observarlos mejor. Los objetos han de ser muy delgados para poder enfocarlos correctamente. 2.-Colocacin de la preparacin - El objeto a observar se pone sobre una lmina de vidrio llamada portaobjetos. - Generalmente se cubre con un vidrio ms delgado llamado cubreobjetos - La preparacin se coloca sobre la platina, bien centrada y se fija con las pinzas. 3.- Enfoque: se deben seguir los siguientes pasos Se pone el objetivo de menor aumento (es el de tamao ms pequeo) Mirando por fuera se sube la platina con el tornillo macromtrico hasta que el objetivo se halla a 1 cm del objeto Mirando por el ocular bajar la platina lentamente hasta ver la imagen Finalmente se afina el enfoque con el tornillo micromtrico. 4- Iluminacin Se realiza con el espejo o iluminador. Se corrige la cantidad de luz con el diafragma y lentes 5-Observacin a mayor aumento Sin desenfocar se da la vuelta al revolver hasta colocar en posicin el objetivo mediano Mirando por el ocular se enfoca nuevamente. Se regula la iluminacin si fuera necesario 6-Clculo de los aumentos Para calcular los aumentos con que se est observando una preparacin basta con multiplicar los aumentos del ocular por los aumentos del objetivo. Enfoque seco debil, fuerte y de inmersin Objetivos.- Son las lentes situadas cerca de la preparacin. Amplan la imagen de sta ltima. Existen tres tipos de objetivos con un diferente aumento cada uno: Seco Dbil (10x) Es el objetivo de menor aumento y se utiliza para hacer enfoques simples. Seco Fuerte (40x) Este objetivo es utilizado para ver preparaciones en fresco, como son la orina, la sangre, un exudado, etc... Inmersin (100x) El objetivo de mayor aumento, se utiliza para observar preparaciones fijas, debido a que es necesario para su enfoque, agregar unas gotas de aceite. Para enfocar en Seco Dbil: 1. Conectar 2. Colocar el objetivo de menor aumento 3. Localizar fuente de iluminacin

4. Encender en 3 o 4 5. Bajar el condensador completamente 6. Abrir la palanca del diafragma hasta que pase la mayor cantidad de luz 7. Colocar la preparacin ensamblando el portaobjetos con las pinzas de la platina 8. Hacer coincidir la preparacin con el orificio de la platina utilizando los tornillos para carro de la platina 9. Observando lateralmente subir la platina con el tornillo macromtrico 10. Observar a travs del ocular sujetando los anillos y ajustar la platina, primero con el tornillo macromtrico y al observar una imagen, darle nitidez utilizando el tornillo micromtrico. 11. Tomar los tornillos de carro de la platina e ir observando la imagen Seco Fuerte 12. Cambiar al objetivo de 40x y dar mayor nitidez a la imagen utilizando el tornillo micromtrico 13. Elevar el condensador para obtener suficiente iluminacin Inmersin 14. Cambiar a objetivo 100x 15. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el prtaobjetos 16. Elevar el condensador lo ms posible sin forzarlo 17. Abrir completamente el diafragma 18. Descender el objetivo 19. Dar nitidez. Com debe ser la iluminacin? Sistema de iluminacin La iluminacin del microscopio puede ser exterior pero, actualmente lo ms comn es que la iluminacin se consiga mediante lmparas halgenas incorporadas al propio microscopio. Esta luz debe recogerse y enfocarse en el objeto colocado sobre la platina. La iluminacin de la muestra que se observa al microscopio se realiza mediante un cono de luz concentrado por la accin de una lente condensadora situada directamente debajo de la platina. Ajuste de iluminacin (Iluminacin Kehler) La iluminacin koehler tiene como fin realizar una observacin ms correcta de un espcimen del microscopio, sta tcnica ayuda a lograr una iluminacin detallada del espcimen en el microscopio; con esta tcnica se puede observar con los objetivos de 10X, 40X y con el de 100X de inmersin, sin tener que enfocar otra vez. Para poder lograr la iluminacin koehler se requiere de un microscopio con tres diafragmas de iluminacin. Bibliografia -http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html -http://www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm -http://www.xuletas.es/ficha/microscopia/ -http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/minvertido.htm -www.uam.es/.../Guiones/Practica3.htm -http://www.mailxmail.com/curso-microscopio/mantenimiento-precauciones -http://www.cnb.csic.es/~fotonica/Diferencias.htm -httphttp://tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_iluminacion.htm -http://www.monografias.com/trabajos/microscopio/microscopio.shtml -http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto -http://danival.org/notasmicro/microscopio/microscop_20_microscop.html