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LABIOCEL

UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE MEDICINA

MANUAL DE TCNICAS EM HISTOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR DO LABORATRIO DE BIOLOGIA CELULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

CONSOLIDAO DOS PROCEDIMENTOS

2002

LABIOCEL

NDICE GERAL

Apresentao Protocolo para obteno e fixao de material a ser

processado no Laboratrio de Biologia Celular

I. Preparo de solues 1. Clculos 2. Instrues gerais 3.Solues mais usadas II. Tampes III. Microscopia de luz 1. Tcnicas de Fixao 2. Descalcificao 3. Incluso em Parafina 4. Microtomia 5. Preparao de lminas e colagem de cortes 6. Digestes enzimticas 7. Coloraes (tcnicas de uso corrente) IV. Mtodos histoqumicos 1. Metais e nions 2. Deteco de radicais qumicos em protenas 3. Lpides 4. Polissacardeos 5. cidos Nucleicos 6. Grnulos citoplasmticos 7. Fibras da matriz extracelular

LABIOCEL

V. Historesina VI. Processamento de Material para Microscopia Eletrnica de Transmisso VII. Uso do Microscpio Eletrnico VIII. Revelao e Ampliao de Micrografias IX. Arquivos e Registros no Laboratrio de Biologia

Celular X. Guia de Trabalhos Prticos

LABIOCEL

Apresentao

Este texto no pretende ser enciclopdico; assim reune, de forma sistemtica, a descrio de apenas aqueles procedimentos que so utilizados rotineiramente no Laboratrio de Biologia Celular (LIM/59) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Levou-nos a tomar a iniciativa de redigir este manual o fato de que os muitos profissionais das diversas reas de sade que fazem estgios no nosso Laboratrio utilizam grande parte do seu tempo para copiar nos seus cadernos pessoais as descries dos procedimentos que utilizamos rotineiramente e nos quais solicitaram ser treinados. Com o objetivo de que possam aproveitar o estgio mais racionalmente, deliberamos que seria mais apropriado fornecer a eles um texto que rena a descrio de todas as tcnicas e assim lhes permita concentrar-se preferencialmente no desenvolvimento de habilidades em lugar de desperdiar tempo em longas sesses de transcrio manuscrita de receitas. Sugere-se ao leitor que, ao consultar o texto na busca de uma informao, tenha o cuidado de ler toda a seo do captulo correspondente. No processo de redao tentou-se evitar repeties; assim, pode existir alguma informao essencial em itens complementares, logo acima ou abaixo do assunto procurado. Esta verso preliminar certamente poder ser aperfeioada com o tempo, atravs da experincia do seu uso e das sugestes que vierem, tornando-a mais sucinta e de melhor apresentao. Assim, esperamos contribuies para seu aprimoramento.
Profa. Dra. Elia Garcia Caldini Chefe do Laboratrio de Biologia Celular

PROTOCOL

PROTOCOLO PARA OBTENO E FIXAO DE MATERIAL A SER PROCESSADO NO LABORATRIO DE BIOLOGIA CELULAR

CUIDADOS: Tanto para microscopia de luz quanto para microscopia

eletrnica, deve-se tomar cuidado com: 1) no deixar o material secar enquanto est sendo

recortado. 2) usar sempre uma gilete nova para recortar o material. 3) o volume do fixador deve ser, pelo menos, 20 vezes

maior que o volume do fragmento a ser fixado.

1. MICROSCOPIA DE LUZ

O material dever ser fixado em paraformaldedo a 4% em tampo fosfato. Este fixador poder ser obtido no

Laboratrio de Biologia Celular. O material dever ter, pelo menos um dos lados, com, no mximo, 3 mm de espessura, Assim, o podendo fixador ter a forma de um no

paraleleppedo.

poder

penetrar

interior do fragmento. O material deve ser deixado no fixador por, no mnimo, 24 horas e, no mximo, 48 horas, devendo ser ento colocado no lcool 70 ou ser trazido para o Laboratrio de Biologia Celular para ser processado.

PROTOCOL

2. MICROSCOPIA ELETRNICA

material

dever

ser

fixado

em

glutaraldedo

2%

em

tampo fosfato 0,15M em dois frascos, sendo que, em um deles, deve-se dissolver cido tnico 0,1% no

glutaraldedo. O glutaraldedo deve ser guardado congelado at a hora da cirurgia. Na hora de usar, em um dos frascos colocar o cido tnico pesado na quantidade apropriada e, antes de colocar o glutaraldedo, etiquetar os frascos

GLUTARALDEDO e GLUTARALDEDO COM CIDO TNICO. Pouco antes de usar, descongelar o glutaraldedo apenas com o calor da mo e coloc-lo, na quantidade apropriada nos frascos. O material deve ter, pelo menos um dos lados, com, no

mximo, 1 mm de espessura. Aconselha-se a fazer com forma de um paraleleppedo de 10 mm x 1 mm x 1 mm. A fixao deve durar 2 horas. Deve-se anotar a hora em que o material foi colocado no fixador e entreg-lo no

Laboratrio de Biologia Celular antes de completar o tempo de fixao; se isto no for possvel, deixar o material na geladeira (no no congelador) e entreg-lo ao Laboratrio o quanto antes. Isto essencial, pois cada minuto a mais no fixador contribui para piorar a qualidade do material.

Entrar

em

contato

conosco

pelo

telefone

(852.2188

ou

851.4011 ramal 241) para combinar horrio de entrega.

PROTOCOL

PREP-SOL

I. PREPARO DE SOLUES

1. CLCULOS

1.1. CLCULO DA NORMALIDADE DE UM LQUIDO (ml/l) PESO MOLECULAR ------------------------------------VALNCIA x PESO ESPECFICO x concent. (densidade) (%)

1N=

Ex.: Ac. Sulfrico: 98,078 1N = -----------------2 x 1,83 x 0,96

= 28,032 ml/litro

1.2. CLCULO DA MOLARIDADE 1M = 1 mol/l = P.M./1 litro 1.3. CLCULO PARA DILUIO DE SOLUES Ex: para obterem-se 100 ml de soluo 0.15M a partir de uma soluo estoque 1M. Deve-se, primeiro, dividir a molaridade da soluo estoque pela molaridade da soluo desejada. O resultado representa o nmero de diluies. 1M/0.15M = 6.66 Em seguida, deve-se dividir o volume desejado pelo nmero de diluies. 100 ml/6.66 = 15,01 Portanto, necessita-se de 15,01 ml da soluo estoque 1M e 84,99 ml de gua para obter-se 100 ml da soluo a 0.15M.

PREP-SOL 2. INSTRUES GERAIS

- Em qualquer soluo que envolva a mistura de cido e gua, deve-se sempre ter o cuidado de jogar o cido na gua. - As diluies no alteram o pH de uma soluo; o que se altera quando se dilui uma soluo a sua molaridade. 3. SOLUES MAIS USADAS: 3.1. SOLUO SULFOCRMICA (PARA LIMPAR VIDRARIA) Bicromato de Potssio......... 50 g gua destilada................500 ml cido sulfrico conc......... 150 ml Dissolver o bicromato de potssio na gua destilada quente. Resfriar. Colocar o balo dentro da pia cheia de gua e adicionar lentamente o cido sulfrico. Deixar o material a ser limpo mergulhado na soluo por algumas horas ou de um dia para outro. 3.2. PREPARO DO COLDIO A 1% lcool Absoluto..............50 ml ter Etlico.................50 ml Celoidina em p...............1 g 3.3. NaOH 1 NORMAL NaOH pastilhas....................40 g gua destilada..................1000 ml 3.4. HCL 1 NORMAL cido clordrico comercial................82 ml gua destilada..........................1000 ml 3.5. LCOOL-CIDO cido clordrico....................1 ml lcool 70.........................99 ml

TAMPO II. TAMPES 1. PBS (SOLUO SALINA TAMPONADA) Cloreto de sdio............................9 g Tampo Fosfato 0,1M (pH 7,2 a 7,3).......100 ml gua destilada............completar para 1000 ml

2. TAMPO FOSFATO DE SDIO 0,1M a diferentes pHs. Soluo A: soluo 0,2M de fosfato de sdio monobsico (NaH 2 PO 4 H2 0; PM = 138,01): 27,6 g/1000 ml de gua destilada. Soluo B: soluo 0,2M de fosfato de sdio bibsico (Na2 HPO 4 ; PM = 141,98): 28,4 g/1000 ml de gua destilada. Misturando-se os volumes indicados na tabela abaixo e completando-se para 200 ml com gua destilada pode-se fazer tampo fosfato 0,1M a diferentes pHs. ml A 92,0 90,0 87,7 85,0 81,5 77,5 73,5 68,5 62,5 56,5 51,0 45,0 39,0 33,0 28,0 23,0 19,0 16,0 13,0 10,5 8,5 ml B 8,0 10,0 12,3 15,0 19,5 22,5 26,5 31,5 37,5 43,5 49,0 55,0 61,0 67,0 72,0 77,0 81,0 84,0 87,0 89,5 91,5 pH 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8

TAMPO 3. TAMPO VERONAL HCl

Soluo A: cido dietil barbitrico (sal disdico) 0,2M (PM= 206). Para obter-se a soluo A, pesar 2,06 g do cido e dissolver em 30 ml de gua destilada. Completar para 50 ml com gua destilada. Observao: deve-se usar sempre o cido dietil barbitrico e no o barbiturato de sdio, pois este no dissolve em gua. Soluo B: 0,2N de HCl (1,65 ml de HCl em 100 ml de gua). Para pH 8,8 misturar: 50 ml de A 4 ml de B 146 ml de gua destilada A molaridade final do tampo 0,05M.

4. TAMPO FOSFATO DE SDIO 0,02M, pH 4,7 com papana)

(para digesto

Soluo A: soluo 0,02M de NaH2PO 4 .H 2 O (PM= 138,01) pH 4,0: 0,276g/100 ml de gua destilada Soluo B: soluo 0,02M de Na2 HPO 4 .7H2O (PM= 267,98) pH 8,0: 0,536g/100 ml de gua destilada ou soluo 0,02M de Na2 HPO 4 .2H2 O (PM = 177,98) pH 8,0: 0,356g/100 ml Titular uma soluo com a outra at que o pH seja 4,7.

5. TAMPO FOSFATO DE SDIO 0,05M pH 8,9 (para digesto com tripsina) Soluo A: fosfato de sdio monobsico 1M Soluo B: fosfato de sdio bibsico 1M Misturar 0,25 ml da soluo A com 9,75 ml da soluo B e completar para 200 ml com gua destilada.

TAMPO 6. TAMPO FOSFATO SDIO-POTSSIO Soluo A: soluo 1M de KH 2 PO 4 (PM = 136,09): 13,6 g/100 ml de gua destilada 34,0 g/250 ml de gua destilada Soluo B: soluo 1M 17,8 g/100 44,5 g/250 ou soluo 1M 26,8 g/100 67,0 g/250 ou soluo 1M 35,8 g/100 89,5 g/250

de Na2 HPO 4 .2H2O (PM = 177,98) ml de gua destilada ml de gua destilada de Na2 4PO 4 .7H2O (PM = 267,98) ml de gua destilada ml de gua destilada de Na2 HPO 4 .12H2 O (PM = 357,98) ml de gua destilada ml de gua destilada

6.1. TAMPO FOSFATO SDIO-POTSSIO 0,1M; pH = 7,0 a 7,2 Soluo A 28,5 ml 14,25 ml 2,85 ml Soluo B 71,5 ml 35,75 ml 7,15 ml Completar com H2 O para 1000 ml 500 ml 100 ml

6.2. TAMPO FOSFATO SDIO-POTSSIO 0,15M; pH = 7,0 a 7,2 Soluo A 28,5 ml 14,25 ml 04,75 ml Soluo B 71,5 ml 35.75 ml 11,91 ml Completar com H2 O para 660 ml 330 ml 110 ml

TAMPO 6.3. TAMPO FOSFATO SDIO-POTSSIO 0,2M; pH = 7,0 a 7,2 Soluo A 57,0 ml 28,5 ml 14,25 ml 5,7 ml Soluo B 143,0 ml 71,5 ml 35,75 ml 14,3 ml Completar com H2 O para 1000 ml 500 ml 250 ml 100 ml

7. TAMPO TRIS-HCl pH 7,4 (para digesto com colagenase) Soluo A: TRIS 0,2M 2,42 g/100 ml de gua destilada Soluo B: HCl 0,1N: 0,8 ml/100 ml de gua destilada Para pH 7,4 misturar: 25 ml da soluo A 42 ml da soluo B 33 ml de gua destilada TRIS = hidroxi methyl-aminomethan (PM = 121,14)

8. TAMPO ACETATO 0,2M, pH 5,8 concentrao eletroltica crtica) Soluo A: cido actico 0,2M: 1,2 ml/100 ml de gua destilada

(para

Alcian

Blue

Soluo B: acetato de sdio 0,2M 1,64 g de acetato de sdio anidro (PM = 82)/100 ml de gua ou 2,72 g de acetato de sdio trihidratado (PM = 136)/100 ml de gua destilada. Medir o pH da soluo B e ir pingar nesta a soluo A, at atingir o pH desejado.

TAMPO 9. TAMPO SORENSEN pH 6,4 Soluo A: soluo 0,06M de KH 2 PO 4 0,816 g/100 ml de gua Soluo B: soluo 0,06M de Na 2 HPO4.12H 2 O 1,074 g/50 ml de gua.

Para 100 ml de tampo, misturar 70 ml da soluo A e 30 ml da soluo B.

III.

MICROSCOPIA

DE

LUZ

FIXAO 1. TCNICAS DE FIXAO

O volume do fixador deve ser sempre 20 vezes maior do que aquele da pea a ser fixada. A pea deve ter, pelo menos um dos lados, medindo 3 mm de espessura para que o fixador possa penetrar. 1.1. ACETONA-METANOL Partes iguais de acetona e metanol. 1.2. BOUIN Soluo saturada aquosa de cido pcrico......750 ml Formol 36-40%.................................250 ml cido Actico Glacial..........................50 ml Tcnica de fixao: Fixar pedaos de at 0,5 cm de espessura em Bouin durante 24 horas (5 horas no mnimo). Lavar de um dia para o outro, em gua corrente, dentro do prprio frasco onde foi fixado. Para isto, cobrir o frasco com uma gaze (amarrada ou presa com um elstico na borda do frasco) e coloc-lo sob a gua corrente. Cuidado com a intensidade do jato de gua para no danificar o material. Aps a lavagem, passar para lcool 70, onde pode ser deixado por muito tempo, se a pea no for ser emblocada. Observaes: a) cido Pcrico Saturado: soluo aquosa de cido pcrico com concentrao de 1,4%. b) Formol 36-40% o formaldedo lquido (como vem). c) Extrao do cido Pcrico de peas fixadas em Bouin: se a pea fixada pelo Bouin ainda ficar muito amarela, aps ser lavada em gua corrente a noite inteira, deix-la por 3 horas na soluo saturada de carbonato de ltio em lcool 50o . Em seguida, passar para lcool 70 o , desidratar e emblocar. Da mesma forma, se o corte histolgico ainda estiver amarelado depois da hidratao, deix-la alguns minutos numa soluo saturada de carbonato de ltio em lcool 50o . 1.3. CARNOY II (Carnoy dos patologistas) Etanol absoluto..............60 ml Clorofrmio..................30 ml cido actico...............10 ml Tcnica de fixao:

FIXAO

Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de lcool 100 de uma hora cada e prosseguir a rotina de incluso. 1.4. ETANOL-ACTICO lcool 95...............75 ml cido actico...........25 ml Tcnica de fixao: Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de lcool 100 de uma hora cada e prosseguir a rotina de incluso. 1.5. SOLUO SALINA DE FORMOL 10% Formol 36-40%.....................100 ml NaCl................................9 g gua destilada....................900 ml Tcnica de fixao: Fixar por 24 horas. 1.6. SOLUO NEUTRA FOSFATO TAMPONADA DE FORMOL Formaldedo 37-40%.........................100 ml gua destilada.............................900 ml Fosfato de Na monobsico (NaH2PO4.H 2O).......4,0 g Fosfato de Na dibsico anidro (Na 2HPO4)......6,5 g Tcnica de Fixao: Fixar durante 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da pea. 1.7. PARAFORMALDEDO A 4% EM PBS (pH 7.0) Tampo fosfato 0,1M...............100 ml NaCl.................................9 g paraformaldedo.....................40 g Colocar 800 ml de gua destilada para aquecer (no deixar ferver). Colocar o NaCl e o tampo. Por ltimo, dissolver o paraformaldedo. Completar para 1000 ml com gua destilada. Tcnica de fixao: Fixar o material de 6 a 24 hs. 1.8. METHACARN lcool metlico............60 ml Clorofrmio................30 ml

FIXAO Actico actico............10 ml Tcnica de fixao: Fixar por 24 horas. 1.9. GENDRE Soluo saturada de cido pcrico em lcool 90.......85 ml Formol 40%...........................................10 ml cido actico.........................................5 ml Tcnica de fixao: Fixar por 4 horas. O lquido de Gendre um fixador para glicognio 1.10. SOLUO DE FORMOL COM CLCIO Formol 40%.........................10 ml gua destilada.....................90 ml Cloreto de clcio anidro............1 g Este um fixador ideal para estudar lpides. 1.11. CLARKE-CARNOY (Carnoy dos citologistas) lcool 100....................... 75 ml cido actico.....................25 ml Fixador ideal para demonstrao de protenas. 1.12. HIDRATO DE CLORAL 25 g de hidrato de cloral 100 ml de lcool 50 Fixar por 24 a 48 horas.

Fixador ideal para mtodo de Nonidez para demonstrao de terminaes nervosas. 1.13. FORMOL BROMETADO 140 ml de formol 40% 20 g de brometo de amnia 1000 ml de gua destilada Fixador ideal para tecido nervoso que algum mtodo de impregnao pela prata. ser submetido a

FIXAO

DESCALC 2. TCNICAS DE DESCALCIFICAO

2.1. DESCALCIFICAO PELO EDTA Deixar o fragmento em soluo de EDTA a 5% em soluo salina (5 g de EDTA em 100 ml de soluo salina) at que a descalcificao esteja completa. Testar para verificar a descalcificao. Lavar abundantemente em gua corrente antes de iniciar-se a desidratao. EDTA = 372,24 Ac. Etilediamino Tetractico Sal Bisdico; PM =

2.2. DESCALCIFICAO PELO ACDO FRMICO Soluo A: soluo de citrato de sdio a 20% Citrato de Sdio 20% ......50 g gua destilada.............250 ml Soluo B: soluo de cido frmico 1:1 cido frmico a 50%.........125 ml gua destilada..............125 ml Misturar partes iguais das solues A e B. Colocar nesta mistura o fragmento sseo j fixado. Renovar a soluo a cada 48 horas e testar periodicamente para verificar-se a descalcificao. Aps a descalcificao lave o tecido em gua corrente durante 24 horas, pelo menos (para eliminar totalmente o cido), antes de iniciar-se a desidratao. Usando-se este mtodo, a descalcificao lenta, porm preserva melhor as estruturas.

2.3. TESTE PARA VERIFICAR A DESCALCIFICAO 5 ml da soluo descalcificante usada (que esteve contato com a pea durante pelo menos seis horas) 5 ml de soluo de oxalato de amnia a 5% 5 ml de hidrxido de amnia em

DESCALC

Agitar. Esperar 30 minutos. Se ficar turvo porque a descalcificao da pea no est completa ainda. Caso esteja pronta, lavar a pea abundantemente antes de iniciar-se da desidratao.

2.4. DESCALCIFICAO PELO CIDO NTRICO Colocar a pea em soluo aquosa de cido ntrico a 4%. um mtodo muito drstico. amolecimento da pea vrias vezes. Deve-se verificar o

INCLUSO 3. INCLUSO EM PARAFINA 3.1. TCNICA DE INCLUSO EM PARAFINA

Depois de completa a fixao, o material deve ser lavado, se for o caso, e deixado em lcool 70 durante duas horas, no mnimo. Fazer 3 passagens de duas horas cada uma em lcool 96. Fazer 3 passagens de 2 horas cada uma em lcool 100 (na ltima pode deixar de um dia para outro). Fazer 3 passagens de 30 minutos cada uma em xilol. Dar um primeiro banho de parafina na estufa 60C durante uma hora. Dar um segundo banho de parafina na estufa ( vcuo, de preferncia) durante uma hora. Incluir o material. Observaes: a) A parafina usada nos banhos deve ser filtrada antes de ser reutilizada. b) Para amolecer peas muito duras usar banhos de benzol em vez de xilol. c) Para diafanizar peas muito grandes ou muito pequenas calcular o tempo de diafanizao da seguinte maneira: deixar no primeiro banho de xilol at a pea ficar diafanizada (como que transparente). Os outros dois banhos de xilol que se seguem devem ter a mesma durao deste primeiro. d) Para peas muito fibrosas: depois dos banhos de lcool 100, dar 2 banhos com acetato amila ou ter. Em seguida, parafina + ter (1:1) a 38C e depois parafina pura a 60C. 3.2. PREPARAO DA PARAFINA 3.2.1. PARAFINA PURA Derreter a parafina Petrobrs na estufa, colocar para ferver, levantar a fervura trs vezes, recolocar na estufa e pronto. 3.2.2. FRMULA DR. CARDOSO DE ALMEIDA Parafina Petrobrs 145o ....1000 Estearina.....................25 Cera de abelha...............130 Vaselina lquida...............2 ml ou 780 g ml ou 21 g ml ou 104 g ml

3.2.3. FRMULA DO BENIGNO ARROYO (ICB-USP) parafina pura..............................800 g

INCLUSO cera purificada............................150 g cido esterico (ou estearina)..............50 g

MICROTOM 4. MICROTOMIA EM PARAFINA 4.1. PREPARAO DAS LMINAS

Deve-se limpar previamente as lminas onde sero colocados os cortes: retirar as lminas da embalagem e coloc-las em uma soluo de Extran a 1% em um recipiente grande. Deixar de um dia para o outro. Enxaguar em gua corrente abundantemente at que o detergente tenha sido totalmente retirado. Colocar em lcool 95. As lminas devem permanecer no lcool at o momento de serem utilizadas, quando ento devem ser secas com uma fralda. Se as lminas estiverem fungadas ou muito sujas, deixar de molho em soluo sulfocrmica ou em lcool-cido preparado da seguinte maneira: lcool 95 ou 100%...........1000 ml gua destilada................63 ml HCl..........................120 ml

4.2. OBTENO DOS CORTES Aparar lateralmente o bloco (deve-se aparar o mximo possvel, pois se ficar excesso de parafina dos lados da pea emblocada os cortes sairo enrugados). Cortar rotineiramente com 4 a 7 m. Com uma pina colocar fragmentos da fita de cortes em Banho-Maria com gua destilada a 45 a 50C. Colocar a superfcie brilhante da fita em contacto com a gua e faz-la caminhar sobre a superfcie da gua antes de solt-la da pina. Separar os cortes um a um usando delicadamente a pina. Deixar os cortes no banho-maria at esticarem e pesc-los com as prprias lminas que devem estar perfeitamente limpas e desengorduradas (ver "Preparao de lminas"). Depois de pescar, colocar as lminas com os cortes na estufa a 50 a 60 para secar, durante no mnimo duas horas, sendo que o melhor deix-las na estufa de um dia para o outro. Desta maneira, a parafina derrete bem e os cortes grudam satisfatoriamente na lmina.

PREP-LAM 5. PREPARAO DE LMINAS E COLAGEM DE CORTES 5.1. COMO DESPARAFINAR E HIDRATAR OS CORTES

Este procedimento deve ser seguido rotineiramente, a menos que para o tipo de colorao desejada exista determinao especfica em contrrio. Passar as lminas por: Xilol 1..........10 min. Xilol 2..........10 min. lcool 100.......5 min. lcool 95........5 min. lcool 70.......10' a 15 min. Lavar em gua corrente Corar. Observaes: a) Diversos fatores (tipo de parafina, a utilizao de cortes obtidos h muito tempo, a dimenso do corte) influem no tempo durante o qual as lminas devem permanecer no xilol para a retirada da parafina. Imediatamente aps colocar a lmina no lcool 100, retir-la e, olhando a lmina contra a luz, certificar-se de que toda parafina foi retirada pelo xilol; se isto no tiver ocorrido, voltar a lmina para o xilol. 5.2. MONTAGEM DA LMINA APS COLORAO Passar as lminas por: lcool 70.............5 min. lcool 95.............3 min. lcool absoluto........3 min. lcool absoluto........3 min. lcool-xilol (1:1)....10 min. Xilol diafanizante.....5 min. Xilol montagem........30 min. ou mais Colocar a lamnula usando o meio de montagem apropriado.

PREP-LAM 5.3. MODELO DE ROTULAO

Aps o meio de montagem estar seco, deve-se limpar a lmina para retirar o excesso deste que acumulou-se nas bordas da lamnula, limpando com um pano ou leno de papel com xilol. Em seguida, as lminas devem ser identificadas por etiquetas que contenham as seguintes informaes: nmero do bloco (correspondente ao nmero registrado no livro de autpsias), identificao da espcie animal, identificao do rgo e da colorao.

corte espcie lamnula nmero do registro rgo colorao

5.4. ESMERILHAMENTO DE LMINAS (PREPARO DE LMINA FOSCA) Com este procedimento consegue-se que uma das extremidades da lmina fique fosca, e assim pode-se escrever sobre ela com um lpis, facilitando sua identificao. 5.4.1. RECEITA DO PROF. JUNQUEIRA Soluo esmerilhadora: 150 g de fluoreto de amnia anidro 20 ml de cido sulfrico 150 ml de cido fluordrico 100 ml de gua destilada Adicionar o cido sulfrico, em gotas, ao fluoreto de amnia agitando com cuidado. Depois adicionar o cido fluordrico da mesma maneira e a gua por ltimo. Tcnica: Deixar as lminas durante 1 minuto na soluo esmerilhadora, retirar e lavar bem em gua corrente.

PREP-LAM

Observaes: a) essencial adicionar os reagentes na ordem indicada. b) No usar fluoreto de amnia hidratado. c) Tanto para a preparao como para estocar a soluo usar recipiente de polietileno de parede espessa, pois a reao exotrmica. d) A adio do cido sulfrico por gotejamento e sob constante agitao deve ser feita para evitar empedramento. e) Lembrar e avisar ao tcnico que a soluo ataca vidro em geral e no apenas as lminas. f) medida que a soluo for envelhecendo, aumentar o tempo para o esmerilhamento, controlando o processo observando a lmina contra luz. 5.4.2. RECEITA DA CLEUSA (ICB-USP) 150 g 30 ml 30 ml 75 ml 10 ml de de de de de fluoreto de amnia cido sulfrico cido fluordrico gua destilada goma arbica

Dissolver o fluoreto de amnia na gua; adicionar o cido sulfrico gota a gota; juntar o cido fluordrico e a goma arbica tambm gota a gota. 5.5. COLAGEM DE CORTES Os cortes podem ser pescados em lminas limpas (sem nenhuma substncia adesiva) quando pretende-se fazer coloraes rotineiras e que no agridam muito o material. Caso contrrio, deve-se promover a colagem do corte na lmina, dissolvendo-se a substncia colante no banho-maria ou pescando-se os cortes em lminas previamente preparadas. 5.5.1. GELATINA enzimtica) (para cortes que vo sofrer digesto

Gelatina em p..................1 colher caf Bicromato de potssio...........1 colher caf gua destilada..................200 ml Ferver, filtrar, colocar no banho-maria e completar com gua destilada. Trocar cada duas ou trs semanas. 5.5.2. GELATINA (usada rotineiramente) 0,1 g gelatina

PREP-LAM 0,1 g dicromato de potssio 1 litro gua destilada fervente 5.5.3. GELATINA (A Yara diz que esta colorao e que as outras interferem) no interfere

na

Dissolver na gua do banho-maria um quadradinho de 4cm x 4cm de gelatina em folha. 5.5.4. ALBUMINA (Luna, 1968) Clara de ovo...............50 ml Glicerina..................50 ml Misturar bem. Filtrar em uma gaze. Colocar uma pequena gota em uma das extremidades da lmina e espalhar de uma s vez com o dedo. Ateno: a albumina cora-se com muitos corantes, interfere no resultado final e a lmina torna-se fungada com o tempo. 5.5.5. SUPER-COLAGEM PARA DIGESTO ENZIMTICA Colar os cortes com albumina. Deixar secar e colocar as lminas apoiadas (com os cortes virados para baixo) sobre frascos contendo formol dentro da estufa a 60C durante 1 hora. Retirar os frascos de formol e deixar as lminas secando na estufa a 37C de um dia para outro antes de desparafinar. Desparafinar. Deixar de um dia para outro secando na estufa. 5.5.6. SUPER-COLAGEM PARA RETICULINA. Colar os cortes com albumina. Colocar nos vapores de formol a 60C durante uma hora (ver instrues na receita acima). Passar pela bateria de desparafinizao e hidratao: xilol 1, xilol 2 e lcool 100. Tirar do lcool 100 e colodionar os cortes, mergulhandoos em soluo de celoidina 0,5% (ou nitrato de celulose 0,1%) em lcool-ter (1:1). Deixar secar coberto, temperatura ambiente. Passar no lcool 70, na gua e proceder colorao desejada.

PREP-LAM

5.5.7. GELATINA PARA LMINAS AO CRIOSTATO (usada para digesto enzimtica e algumas reaes imuno-histoqumicas) Soluo A: Dissolver 1 g de gelatina incolor em 80 ml de gua quente. Soluo B: Dissolver 0,1 g de cromo alumen [CrK(SO4) 2.12H2O; PM = 499,40] em 20 ml de gua. Misturar as duas solues, imergir as lminas e deix-las enxugar verticalmente. Guard-las no congelador da geladeira em caixas fechadas. 5.5.8. Sigma) SILANE (3-aminopropyltriethoxysilane n A-3648

Usar lminas perfeitamente limpas e desengorduradas. Fazer uma soluo de Mergulhar a lmina 2 Mergulhar a lmina 2 Mergulhar a lmina 2 Secar em temperatura silane 2% em acetona pura. vezes nesta soluo. vezes na acetona pura. vezes em gua. ambiente.

5.5.9. SILANE (receita que o Gregorio deu) Preparar uma soluo de 0,5% de silane em acetona pura. Mergulhar as lminas nesta soluo por 10 a 15 segundos. Deixar secar de um dia para o outro. Lavar em trs ou mais banhos de gua destilada. Secar na estufa a 60C. 5.5.10. COLA TENAZ Dissolver um pouco (1 a 2 ml) de cola tenaz de rtulo azul em um recipiente com 50 ml de gua. Mergulhar as lminas. Coloc-las para secar na estufa (cerca de 15 minutos). Aps a secagem as lminas devem ficar praticamente transparentes, seno porque tem cola em excesso. Pode-se colocar a cola direto no banho-maria onde os cortes so pescados.

PREP-LAM 5.5.11. COLDIO

Esta tcnica permite a adeso de cortes que foram pescados em lminas sem nenhuma substncia adesiva, possibilitando assim submeter lminas j prontas a processos como hidrlise, acetilao, saponificao, metilao etc., que so muito agressivos e descolam os cortes. As lminas devem ser colodionadas no momento adequado para cada tratamento, segundo as indicaes especficas. Preparo do coldio a 1% ou 0,5% lcool absoluto.....................50 ml ter etlico........................50 ml Celoidina em p..............1 g.ou 0,5 g No decorrer dos diversos procedimentos, o coldio deve ser removido das lminas, passando-as por lcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de lcool-ter em partes iguais. 5.5.12. ADESO POR CALOR De modo geral, para todas as coloraes sejam elas agressivas ou no (exceto para digesto enzimtica, que neccesita de uma substncia adesiva), os cortes resistem muito bem se, aps a desparafinizao e passagem por lcool 100, as lminas forem colocadas para secar na estufa a 55,por uma ou duas horas. A seguir, voltar as lminas no lcool 100 e proceder a bateria de hidratao normal.

DIG-ENZ 6. TCNICAS DE DIGESTO ENZIMTICA 6.1. DIGESTO COM COLAGENASE

Fazer uma soluo de colagenase 0,1 a 0,4% (1 a 4 mg/ml) em Tampo Tris-HCl 0,05M (pH 7,4) contendo 0,0025M (2,5 mM) de NEM e 0,001M (1 mM) de CaCl2. Para 10 ml de soluo: 10 a 40 mg de colagenase 3,1 mg de NEM 1,1 mg de CaCl 2 Dissolver estes ingredientes em 5 ml de tampo e completar com o mesmo tampo para 10 ml. Pingar a soluo sobre os cortes e incubar a 37C durante 24 horas ou mais (testar o tempo de incubao para cada material). Observaes: TRIS = hydroxymethil-aminomethan PM 121,14. NEM = N-ethyl- maleidemide PM 125,13. O NEM atua como inibidor de outras proteases. Pode-se fazer a digesto sem o NEM, caso este no esteja disponvel. CaCl 2 PM= 110,99. 6.2. DIGESTO COM ELASTASE Fazer uma soluo de 0,5 mg de elastase por ml de tampo Veronal-HCl, pH 8,8. Pingar a minutos, Lavar em Proceder soluo sobre os cortes e deixar durante 30 a 60 temperatura ambiente. gua corrente. colorao desejada.

6.3.DIGESTO COM PEPSINA Fazer uma soluo de 2 mg de pepsina cristalizada por ml de HCl 0,02N (pH 1,6). Pingar sobre os cortes e proceder digesto a 37C, durante 15 a 60 minutos.

DIG-ENZ 6.4. DIGESTO COM RNASE

Fazer uma soluo de 1 mg de RNAse por ml de gua. Usar gua deionizada com pH acertado a 6,8. Acertar o pH da gua com soluo de fosfato de sdio bibsico ou monobsico (dependendo do pH que est a gua). Colocar 0,5 ml de soluo de RNAse sobre o corte. Incubar os cortes na RNAse a 37C durante 3 horas. Lavar e corar com Azul de Toluidina ou Galocianina. 6.5. DIGESTO COM TRIPSINA Tampo Fosfato 0,05M (pH 8,9)......1 ml Tripsina cristalizada............0,1 mg Dissolver a tripsina no tampo, pingar sobre os cortes e incubar a 37C por duas horas. 6.6. DIGESTO COM PAPANA Fazer uma soluo de papana 0,1% (1 mg/ml) em tampo fosfato 0,02M, pH=4,7, contendo 0,005M (5mM) de metabissulfito de sdio (PM=190,10) e 0,0005M (0,5mM) de EDTA (PM=372,24). Para 10 ml de soluo: 10 mg de papana 9,505 mg de bissulfito de sdio 1,86 mg de EDTA Dissolver estes ingredientes em uma quantidade de tampo suficiente para completar 10 ml. Desparafinar os cortes e lev-los at gua. soluo sobre os cortes e deixar temperatura por 2 horas. Lavar durante alguns minutos corrente. Realizar a colorao desejada. Sobre os cortes-controle pingar s a soluo de bissulfito + EDTA. Observao: a) Ver Guia de Tabalhos Colgeno-Proteoglicanos. Pingar a ambiente na gua tampo +

Prticos,

no

tem

Interao

DIG-ENZ 6.7. DIGESTO COM AMILASE (LISON, 1960)

Fazer uma soluo de amilase 0,1 a 0,5% em salina (1 a 5 mg/ml). Desparafinar e hidratar os cortes. Pingar a soluo sobre os cortes e incubar a 37C por duas horas. Os cortes controles devem ser submetidos soluo salina sem a enzima. Lavar em gua destilada. Corar pelo Mtodo do PAS. Resultado: Locais PAS positivos na lmina controle que diminuirem ou perderem a positividade na lmina digerida indicam presena de glicognio.

6.8. DIGESTO COM AMILASE Amilase a 2% em soluo aquosa de NaCl a 4%. Pingar a soluo sobre os cortes e deixar a 37C durante 30 minutos.

6.9. DIGESTO COM HIALURONIDASE TESTICULAR Fazer um soluo de hialuronidase mg/ml) em tampo Sorensen pH 6,4. testicular 0,1% (1

Desparafinar e hidratar 2 cortes (A e B). Submeter o corte A digesto enzimtica, enquanto que o corte B recebe apenas o tampo. Corar os dois cortes pelo Alcian Blue pH 2,5 ou Azul de Toluidina. Resultado: Diminuio ou perda da positividade ao Alcian Blue no corte A indica a presena de cido hialurnico e/ou condroitim-4 ou -6 sulfatado.

DIG-ENZ 6.10. DIGESTO COM NEURAMINIDASE

Fazer uma soluo de neuraminidase 500 U/ml em gua destilada. Diluir esta soluo em igual volume de tampo acetato 0,1M pH 5,5 contendo 1% de NaCl e 0,1% de CaCl2 . Desparafinar e hidratar os cortes. Incubar os cortes com a soluo enzimtica, a 37 C, por 16 a 24 horas. Os cortes controles devem ser incubados no mesmo tampo acetato a 0,05M. Lavar com gua destilada. Corar com Alcian Blue - PAS. Montar. Resultado: Locais menos corados pelo Alcian Blue no corte digerido indicam a presena de cido silico (sialomucinas).

COLOR 7. COLORAES (TCNICAS DE USO CORRENTE)

7.1. EOSINA (usar com hematoxilina de Harris) 0,25 g de eosina amarela em p (solvel em gua) 100 ml de gua destilada

7.2. EOSINA (para usar com Hematoxilina de Ehrlich) 2 g de eosina 1 g de bicromato de potssio 20 ml de soluo aquosa saturada de c. pcrico 20 ml de lcool absoluto 160 ml de gua destilada

7.3. HEMATOXILINA DE HARRIS 1 g de hematoxilina cristalizada 10 ml de lcool absoluto 20 g de almen de potssio ou de amnio 200 ml de gua destilada 0,5 g de xido de mercrio (vermelho) 8 ml de cido actico glacial (optativo) Preparo do corante: Dissolver a hematoxilina no lcool ligeiramente aquecido, dissolver o almen em gua aquecida. Misturar as solues e aquecer at ferver. Tirar do fogo e adicionar imediatamente e aos poucos o xido de mercrio (agitando para no explodir). Resfriar a soluo o mais rapidamente possvel, mergulhando o frasco num vasilhame (ou na pia) contendo gua fria. Acrescentar o cido actico e filtrar. Estocar em vidro escuro. Dura cerca de 3 meses. Deve-se filtrar a soluo toda vez que for usar.

COLOR 7.4. HEMATOXILINA DE EHRLICH 2 g de hematoxilina 100 ml de lcool absoluto 100 ml de glicerina 100 ml de gua destilada 10 ml de cido actico glacial 15 g de almen de potssio

A hematoxilina deve ser dissolvida no lcool; o almen deve ser dissolvido na gua. Misturar as duas solues e adicionar os outros reativos. Deixar amadurecer no sol por 1 ms. Dura muitos anos. Observaes: a) O amadurecimento pode ser apressado adicionando-se iodato de sdio, na proporo de 50 mg de iodato de sdio para cada grama de hematoxilina; porm o corante no dura muito tempo. b) til para corar tecidos que estiveram expostos a solues cidas; assim recomendada para corar tecidos que sofreram descalcificao ou que ficaram muito tempo no fixador. c) Usar associada eosina preparada com bicromato de potssio e cido pcrico.

7.5. HEMATOXILINA DE MAYER 0,2 g de hematoxilina 200 ml de gua destilada 0,4 g de iodato de sdio 10 g de almen de potssio 10 g de hidrato cloral 0,2 g de cido ctrico Dissolver a hematoxilina, o almen e o iodato na gua destilada. Isto pode ser feito a quente ou deixando de um dia para o outro temperatura ambiente. Aps a total dissoluo, adicionar o hidrato cloral e o cido ctrico. Ferver por 5 minutos, esfriar e filtrar. Pode ser usada imediatamente.

COLOR

Observao: a) Esta hematoxilina, por no precisar de diferenciao com lccol-cido, especialmente til como corante nuclear nos casos em que necessrio realar, por contraste, algum componente citoplasmtico que tenha sido demonstrado por um corante que sofre descolorao com a diferenciao em lcool cido (comum para outras hematoxilinas).

7.6. HEMATOXILINA-EOSINA Desparafinar e hidratar os cortes. Corar com hematoxilina, pelo tempo desejado, conforme o tipo e idade da hematoxilina; de modo geral: corar durante 15 a 20 minutos com hematoxilina de Mayer; corar de 2 a 10 minutos com a hematoxilina de Harris e corar de 2 a 10 minutos com a hematoxilina de Ehrlich. Lavar em gua corrente por 10 minutos. Caso necessrio, proceder diferenciao em lcool-cido: soluo alcolica de HCl a 1% (1 ml de HCl em 99 ml de lcool 70). Controlar a diferenciao ao microscpio at chegar intensidade desejada. Lavar rapidamente em gua corrente, aps a diferenciao. Corar pela eosina por 2 minutos. Lavar em gua corrente (at que a gua esteja limpa). Passar pela bateria de desidratao: passar rapidamente pelo lcool 70, passar pelo lcool 95, lcool 100, xilol e montar. Observaes: a) A hematoxilina cora os ncleos primariamente em vermelho e a posterior lavagem em gua corrente converte a colorao para o azul (processo de azulecimento da hematoxilina). b) O procedimento de diferenciao da hematoxilina em lcool-cido raramente necessrio e deve ser feito nos casos em que ocorre uma supercolorao. c) A eosina sofre diferenciao com o lcool 70; por isso esta passagem deve ser rpida. Se, por acaso, o corte ficar muito descorado ao ser passado pelo lcool 70 , pass-lo novamente pela gua e recoloc-lo na eosina. s vezes, prefervel pular a passagem pelo lcool 70, colocando diretamente em lcool 95.

COLOR 7.7. SHORR - HEMATOXILINA (para esfregaos vaginais) Pode-se usar o corante comercial ou prepar-lo: 0,5 g de Biebrich scarlat red 0,25 g de Orange G 0,075 g de fast green FCF 0,5 g de cido fosfotngstico 0,5 g de cido fosfomolbdico 1 ml de cido actico glacial 100 ml de lcool 50

Procedimento: Fazer o esfregao numa lmina e coloc-la imediatamente no lcool 95 para fixao. Deixar no lcool por 15 minutos (pode ficar at 72 horas). Lavar rapidamente em lcool 70. Lavar rapidamente em gua corrente. Corar pela hematoxilina por 30 segundos. Lavar em gua corrente por 5 minutos. Lavar em lcool 90. Corar no corante de Shorr por 5 minutos. Lavar em lcool 95. Desidratar e montar. Resultado: Reconhecimento das fases do ciclo estral de ratas: No diestro tardio o esfregao aparece tipicamente atrfico, consistindo de poucas clulas epiteliais pequenas, arredondadas e nucleadas, enorme quantidade de polimorfonucleares e muco. No comeo do proestro decresce em muito a quantidade de polimorfonucleares e o esfregao compe-se principalmente de clulas epiteliais arredondas ou ovaladas e nucleadas. No fim do proestro predominam as clulas poligonais grandes, achatadas e com ncleo picntico, sendo que j existem clulas anucleadas. Com a chegada do estro, o esfregao apresenta-se basicamente constitudo por clulas cornificadas (clulas poligonais, grandes, achatadas, anucleadas e acidfilas). No comeo do metaestro o esfregao constitui-se de clulas cornificadas, polimorfonucleares e muco. No metaestro tardio a imagem de muitas clulas epiteliais ovaladas ou arredondadas e nucleadas, associadas a polimorfonucleares e muco. A fase seguinte o diestro, onde nota-se que o esfregao torna-se cada vez mais atrfico: as poucas clulas epiteliais que aparecem so pequenas, arredondadas,

COLOR

nucleadas e sempre acompanhadas de grande quantidade de polimorfonucleares e muco.

IV. MTODOS HISTOQUMICOS

MINERAIS 1. MINERAIS

1.1. VON KOSSA (para clcio) Soluo corante: soluo aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 5% Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na soluo de nitrato de prata, sob luz do dia forte (porm no luz solar direta), durante 10 a 60 minutos. Lavar em gua destilada por 1 a 2 minutos. Deixar em gua destilada, sob luz difusa, por 10 a 60 minutos (esta passagem pode ser omitida). Reduzir a prata, imergindo os cortes em soluo de hidroquinona 0,5% ou soluo diluda 1:3 de qualquer revelador fotogrfico, durante 2 minutos, agitando sempre. Tratar com soluo aquosa de hipossulfito de sdio a 5% durante 2 a 3 minutos, para remover o excesso de prata (controlar ao microscpio). Lavar em gua destilada. Contracorar com safranina O a 0,2 a 0,5%, durante 20 a 30 segundos. Montar. Resultado: regies contendo carbonato ou fosfato de clcio aparecem coradas em negro; o mtodo demonstra a presena de clcio de maneira indireta, uma vez que, de fato, especfico para os ons fosfato e carbonato. Observaes: a) se os cortes estiverem descolando da lminas, colodionar com celoidina a 1%, depois do lcool absoluto de montagem, mergulhar no lcool 70 e seguir a montagem. b) a reao consiste em uma dupla troca entre o nitrato de prata e o fosfato ou carbonato de clcio, levando formao de carbonato e fosfato de prata insolveis. Estes compostos so fotossensveis e escurecem, sobre a ao da luz, formando um precipitado amarelo ou marrom. A passagem pela hidroquinona serve para reforar a cor destes precipitados, tornando-os negros. c) o material de eleio para esta colorao joelho de rato de 5 dias de idade, pois ainda pequeno e permite cortes sem descalcificao.

MINERAIS

d) se houver grande quantidade de clcio depositado, melhor corar pelo nitrato de prata, em bloco, antes de descalcificar, pois deve-se remover um pouco do clcio para poder cortar.

1.2. AZUL DA PRSSIA respectivamente)

TURNBULL

(para

Fe+3

ou

Fe+2 ,

Soluo corante: Preparar na hora de usar: a) para testar a presena Fe+3 : soluo de ferrocianeto de potssio [K 4 Fe(CN)6.3H2 O] a 1% em cido clordrico 0,5%. b) para testar a presena de Fe+2 : soluo de ferricianeto de potssio [K 3Fe(CN)6 ] a 1% em cido clordrico 0,5%. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Deixar na soluo corante por 60 minutos. Lavar em gua corrente. Contracorar os ncleos com corante nuclear vermelho. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: pigmentos de ferro coram-se em azul brilhante, ncleos em vermelho e citoplasma em rosa claro. Observao: a) a fixao do material dever ser feita em formol isotnico (preparado com salina ou PBS) ao pH fisiolgico, durante 24 horas. Fixadores cidos solubilizam os ons ferro e so, portanto, contra-indicados. b) material de eleio: bao e rim de rato ou cobaia injetados, intraperitonialmente, com sangue, durante 6 dias, na dose diria de 1 ml de sangue para cada 100 g de animal.

MINERAIS 1.3. DETECO DE TLIO Soluo de gs sulfdrico: 7,8 g de Na 2 S 0,56 ml de H2SO 4 100 ml de gua destilada

Soluo de sulfeto de amnia: Soluo aquosa de sulfeto de amnia [(NH4 )S] saturada com selnio preto (xido de selnio) Solues estoques para revelao: Preparar: soluo aquosa de goma arbica a 10% (preparada 7 a 14 dias antes e agitada diariamente com um basto de vidro) soluo aquosa de nitrato de prata a 10% (mantida 14 dias no escuro, antes de usar) soluo de cido ctrico a 5% soluo de hidroquinona a 2% Soluo reveladora de trabalho (lquido de Timm): 100 ml da soluo de goma arbica 1 ml da soluo de nitrato de prata 2 ml da soluo de cido ctrico 10 ml da soluo de hidroquinona Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Tratar pela soluo de gs sulfdrico por 15 minutos. Imergir na soluo de sulfeto de amnia por 10 minutos. Lavar em gua destilada. Passar em H2 O2 a 20% at descolorir. Colocar no lquido de Timm (soluo de trabalho), durante 20 a 30 minutos, no escuro. Parar a revelao quando os cortes estiverem marrons e no pretos. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: negros. depsitos de tlio aparecem como grnulos

MINERAIS

Observaes: a) Deve-se fazer junto cortes controles, omitindo-se o gs sulfdrico, o xido de selnio ou o procedimento de revelao. b) A prata e o mercrio podem interferir na colorao, mas podero ser identificados no controle sem o xido de selnio.

RADQUIM 2. RADICAIS QUMICOS EM PROTENAS

2.1. REAO PARA CITRULINA (Rogers, 1970) Preparo da soluo corante: 1 g de p-dimetil-amino-benzaldedo (reagente de Ehrlich) 4 ml de cido clordrico concentrado 23,38 g de NaCl gua destilada suficiente para completar 100 ml Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Coloc-los na soluo corante e montar no reao. Observar seguidamente ao microscpio at o uma colorao amarelada (demora cerca de 15 Fotografar, pois a preparao no pode maneira permanente.

prprio meio de aparecimento de a 20 minutos). ser montada de

Resultado: Locais ricos em citrulina, principalmente pilosos, coram-se em amarelho palha.

folculos

2.2. REAO PARA CISTENA (SH) Preparo da soluo corante: 30 ml de soluo aquosa de cloreto frrico (FeCl 3.6H2 O) a 1% 4 ml de soluo aquosa de ferricianeto de potssio [K 3Fe(CN)6 ] a 1 % 6 ml de gua destilada Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Deix-los imersos na soluo corante recm preparada, por 10 minutos, temperatura ambiente. Lavar em soluo de cido ctico a 1%. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: Locais ricos em radicais SH coram-se em azul.

2.3. REAO PARA CISTINA (SS) Barka e Anderson, 1963

RADQUIM

Preparo da soluo corante: 60 ml de soluo aquosa de cloreto frrico [FeCl 3.6H2 O] a 1% 20 ml de soluo aquosa de ferricianeto de potssio [K 3Fe(CN)6 ] a 1 % Preparo da soluo de iodoacetamida: 2 g de acetamida 0,5 d iodo ressublimado 100 ml de gua destilada Ajustar o pH para 8,5 com NaOH 1N Preparo do tioglicolato de sdio: 5 ml de cido tiogliclico 50 ml de gua destilada 50 ml de NaOH 1N Ajustar o pH para 8,5 com cerca de 5 ml de NaOH 1N Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Submet-los ao da iodoacetamida por 24 a 48 horas a 37C. Lavar em gua destilada. Deixar na soluo de tioglicolato de sdio por 4 horas. Lavar em soluo de cido actico 1% por 2 minutos. Colocar na soluo corante recm-preparada por 10 minutos, no escuro. Lavar demoradamente em gua corrente (cerca de 15 minutos). Montar. Resultado: locais em que houve a reduo dos grupos SS aparecem corados em pink, vermelho, lils e azulado.

2.4. DETECO DE PROTENAS BSICAS EM GERAL Soluo corante: naphtol yellow S...............1 g cido actico..................1 ml gua destilada...............100 ml

RADQUIM Soluo metiladora: HCl 1N...................0,8 ml lcool metlico...........100 ml

Procedimento: Desparafinar, levar at lcool absoluto e colodionar os cortes. Metilar o tecido, 60, por cerca de 3 horas. Lavar em lcool e levar at a gua. Imergir os cortes na soluo corante durante 20 minutos. Lavar em dois banhos de cido actico 0,1%, durante 1 minuto cada banho. Desidratar diretamente em lcool butlico tercirio, diafanizar e montar. Resultado: locais ricos corados de amarelo vivo. em protenas bsicas aparecem

2.5. DETECO DE HISTIDINA Soluo corante: naphtol yellow S...............1 g cido actico..................1 ml gua destilada...............100 ml Soluo metiladora: HCl 1N....................0,8 ml lcool metlico...........100 ml Soluo acetiladora: Anidro actico.............40 ml Piridina...................60 ml Procedimento: Desparafinar, levar at o lcool e colodionar os cortes. Metilar o material por 3 horas. Lavar em lcool absoluto. Recolodionar. Deixar na soluo acetiladora, por 24 horas. Lavar em piridina por 2 minutos. Lavar em lcool absoluto e levar at a gua. Corar pela soluo corante por 20 minutos. Lavar em dois banhos de cido actico 0,1%, durante 1 minuto cada banho. Desidratar diretamente em lcool butlico tercirio, diafanizar e montar.

RADQUIM

Resultado: locais ricos em histidina aparecem corados de amarelo vivo.

2.6. DETECO DE ARGININA Soluo corante: 2 ml de soluo aquosa de NaOH a 4% 2 gotas de gua sanitria, "cndida", soluo hipoclorito de sdio a 5% comercial 4 gotas de soluo de alfa naphtol a 1% em lcool 70 Misturar nesta ordem e imediatamente antes do uso.

de

Procedimento: Desparafinar, levar at o lcool e colodionar os cortes. Secar e mergulh-los em lcool 70. Levar at a gua. Colocar os cortes na horizontal e cobr-los com a soluo corante. Preparar nova soluo corante, desprezar a primeira e tornar a cobrir os cortes por 2 minutos. Montar no prprio meio de reao e observar imediatamente. Resultado: locais ricos em arginina coram-se em vermelho tijolo. Observao: a) a reao pode ser bloqueada nos cortes controles, bloqueando-se os radicais guanidil, atravs da acetilao, assim realizada: aps a passagem pelo lcool 70, lavar os cortes em piridina por 2 minutos e coloc-los na soluo acetiladora por 24 horas; em seguida, lavar em lcool absoluto, recolodionar os cortes e realizar a reao para arginina. Soluo acetiladora: Anidro actico.............16 ml Piridina...................24 ml

RADQUIM 2.7. DETECO DE TIROSINA Bensley & Gersh, 1933

Preparo do reativo de Millon: Preparar uma soluo aquosa de cido ntrico a 40%, dissolvendo o cido gota a gota na gua (40 ml de cido em 60 ml de gua). Deixar estabilizar por 48 horas. Diluir 40 ml desta soluo em 360 ml de gua, conseguindo-se assim 400 ml de uma soluo de cido ntrico a 4%. Deixe repousar por 24 horas. Saturar esta soluo com excesso de cristais de nitrato de mercrio. Filtrar e adicionar 1,4 g de nitrito de sdio e 4 ml da soluo aquosa de cido ntrico a 40% (aquela inicial). O reativo de Millon assim preparado pode ser guardado em geladeira por muito tempo. Procedimento: Desparafinar, levar at o lcool e colodionar os cortes. Secar e mergulh-los em lcool 70, por 3 minutos. Mergulhar em acetona anidra e deixar secar ao ar. Cobrir com o reagente de Millon. Levar chama do bico de Bunsen at o aparecimento da colorao tijolo. Lavar bem em soluo de cido ntrico a 2% a 37C. Resultado: locais ricos em tirosina aparecem em vermelho tijolo. Observao: a) a reao pode ser bloqueada nos cortes controles, atravs do bloqueio dos radicais p-hidroxi-fenil, por processo de iodao, da seguinte maneira (Landing & Hall, 1956): Aps colodionar os cortes, coloc-los diretamente na soluo de iodao por 24 horas; em seguida, lavar em gua corrente, voltar ao lcool absoluto, recolodionar os cortes e realizar o mtodo para tirosina, a partir da etapa da acetona. Soluo de iodao: Iodo.........................3 g Iodeto de potssio...........6 g gua destilada............100 ml

RADQUIM 2.8. DETECO DE TRIPTOFANO Solues corantes: Soluo de p-dimetiaminobenzaldedo concentrado

(DMAB)

5%

em

HCl

Soluo de nitrito de sdio a 1% em HCl concentrado. Os cristais de NaNO2 so postos no HCl imediatamente antes de se usar a soluo. Mergulhar as lminas enquanto est havendo formao de gs. Procedimento: Desparafinar e levar as lminas at lcool absoluto. Recobrir o corte com celoidina, imergindo-o em soluo 0,25% de celoidina em lcool absoluto e ter em partes iguais durante 1 minuto. Retirar o corte da celoidina e colocar diretamente na soluo de DMAB por 1 minuto. Colocar diretamente na soluo de NaNO2 por 1 minuto. Lavar em gua corrente por 30 segundos. Passar em soluo de lcool cido (HCl concentrado a 1% em lcool 70). Montar. Resultados: Locais contendo triptofano aparecem corados em azul. Grnulos de zimognio das clulas principais do estmago: moderadamente corados. granulaes eosinoflicas: fortemente coradas. queratina: no se cora. grnulos de zimognio do pncreas: muito corados. clulas alfa da ilhota pancretica: azul claro. clulas beta da ilhota pancretica: no se coram. clula de Paneth: fortemente corada. clulas absortivas do intestino: azul acinzentado claro. fibras elsticas das artrias: no se coram. Observaes: a) o cido clordrico puro extremamente corrosivo e fumegante; trabalhe com luvas e na capela. b) para demonstrar clulas de Paneth no intestino use animais que foram mantidos em jejum por um noite.

RADQUIM

c) pode-se bloquear a reao, utilizando-se o cido perfrmico, da seguinte maneira: Aps colodionar, mergulhar os cortes em soluo de formol a 10% em lcool 70 e em seguida, coloc-los na soluo de cido perfrmico por 2 minutos; lavar em lcool absoluto, recolodionar os cortes e aplicar a tcnica para triptofano. Preparo da soluo de cido frmico: cido frmico a 98%......................40 ml cido sulfrico a 65%...................0,5 ml gua oxigenada 100 vol....................4 ml Preparar 3 horas antes de usar e agitar por diversas vezes para remover o gs formado.

2.9. DETECO DE GRUPOS NH 2 (Yasuma & Ichikawa, 1953) Soluo corante: soluo aloxana a 1% em lcool absoluto Reativo de Schiff: ver mtodo de PAS, em Histoqumica de polissacardeos Soluo de gua sulfurosa: 10 ml de metabissulfito de sdio 10 ml de HCl 1N 180 ml de gua destilada Procedimento: Desparafinar os cortes e lev-los at o lcool absoluto. Mergulhar as lminas em soluo de aloxana por 24 horas. Lavar em lcool absoluto e levar at a gua. Colocar no reativo de Schiff por 30 minutos. Passar por trs banhos de gua sulfurosa de 2 minutos cada. Lavar em gua corrente por 15 minutos. Montar. Resultado: locais ricos em radicais livres NH 2 coram-se em vermelho.

RADQUIM

Observao: a) pode-se bloquear a reao, atravs do mtodo de Barka & Anderson (1963), utilizando-se o seguinte procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes, coloc-los na soluo bloqueadora por 24 horas; lavar em gua e realizar o mtodo da aloxana. Preparo da soluo bloqueadora: misturar, na hora de usar, partes iguais de soluo aquosa de cido actico a 12,5% e soluo de nitrito de sdio a 15% (ambas geladas).

LIPID 3. LPIDEOS

3.1. SUDAN BLACK B Preparo da soluo corante: Preparar uma soluo saturada de Sudan black em lcool 70 e filtrar. Procedimento: Usar cortes de material fresco ou fixado em formol. Cortar em congelao. Imergir os cortes por 10 minutos na soluo corante filtrada. Lavar em lcool 70 para retirar o excesso de corante ou at que os cortes controles estejam descorados. Lavar em gua corrente. Pode-se contracorar fracamente com hematoxilina. Montar em glicerina. Resultado: lipideos coram-se em negro. Observaes: a) a adio de clcio ao formol fixador contribui para a reteno dos lpides ao tecido. b) Sabe-se que os cristais de colesterol no se coram normalmente com o Sudan black; alm disso, os fosfolipdeos se dissolvem no lcool (que o solvente do corante). Estes dois problemas podem ser contornados usando-se uma soluo de brometo da seguinte forma: Obtidos os cortes, deix-los em uma soluo aquosa de brometo a 2,5%, por 1 hora e, em seguida, lavar em uma soluo aquosa de 0,5% de metabissulfito de sdio para retirar o excesso de brometo; lavar em gua corrente e imergir na soluo corante.

POLISS 4. POLISSACARDEOS

4.1. AZUL DE TOLUIDINA Soluo corante: Azul de Toluidina 0,5% em gua destilada Procedimento: Corar as lminas durante 1 a 2 horas. Lavar em gua destilada. Montar. Resultado: Cora estruturas cidas presentes no tecido: DNA, RNA e polissacardeos cidos, com diferentes intensidades de cor, conforme a quantidade de grupamentos cidos.

4.2. ALCIAN BLUE, pH 2,5 Mowry, R.W.; Ann. N.Y. Acad. Sci, 106 (2): 402-423, 1963. Soluo corante: Alcian Blue 8GX 1% em soluo aquosa de cido actico a 3% Preparo da soluo corante: 97 ml de gua destilada 3 ml de cido actico glacial 1 g de Alcian Blue 8GX Medir o pH da soluo e, se necessrio, acert-lo com HCl 1N ou NaOH 1N. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Pass-los em soluo aquosa de cido actico 3% durante 3 minutos. Corar pela soluo corante, por 2 horas. Enxugar o excesso de corante. Lavar em cido actico 3%, durante 3 minutos. Lavar em gua corrente. Montar.

POLISS

Resultado: Coram-se, em azul turquesa, carboidratos complexos ricos em grupos carboxilas, cido hialurnico, carboibratos fracamente sulfatados, carboidratos ricos em cido silico. Os carboidratos fortemente sulfatados coram-se fracamente ou no se coram.

4.3. ALCIAN BLUE pH 0,5 e 1,0 Soluo corante: soluo de Alcian Blue 1% em HCl 0,2 N. Preparo da soluo: 1 g de Alcian Blue 8GX 100 ml de HCl 0,2N (para pH 0,5) ou 100 ml de HCl 0,1N (para pH 1,0). Para 100 ml de HCl 0,2N: 1,65 ml de HCl em 98,3 ml de H 2 O. Para 100 ml de HCl 0,1N: 0,83 ml de HCl em 99,17 ml de H 2 O. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Passar no HCl 0,2N ou 0,1N, por 3 minutos. Corar na soluo corante por 30 minutos. Passar em HCl 0,2N ou 0,1N. Lavar rapidamente em gua destilada. Desidratar e montar. Resultado: Locais ricos em polissacardeos sulfatados coram-se em azul, portanto no cora cido hialurnico (no-sulfatado).

4.4. METILAO + SAPONIFICAO + ALCIAN BLUE, pH 2,5 O processo de metilao em alta temperatura promove bloqueio da basofilia dos polissacardeos sulfatados carboxilados; a saponificao posterior restaura basofilia somente dos polissacardeos carboxilados. Soluo para metilao: 99,2 ml de lcool metlico (metanol) 0,8 ml de HCl o e a

POLISS Soluo para saponificao: Soluo de BaOH a 4% em lcool 80 ou 1 g de hidrxido de potssio 70 ml de lcool absoluto 30 ml de gua destilada

Procedimento: Desparafinar trs cortes (A, B, C) e lev-los at lcool absoluto. Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, passar 5 minutos no lcool 70 e levar at lcool absoluto. Colocar os cortes A e B na soluo metiladora pr aquecida por 2 a 5 horas a 60C. O corte C deve permanecer em gua destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. Lavar em gua corrente e colocar todos os cortes em lcool 70. Tratar o corte A com uma das solues saponificadoras, por uma hora temperatura ambiente. Os cortes B e C devem permanecer em lcool 70. Lavar em gua corrente por 5 minutos. Remover o coldio de todas as lminas, passando-as por lcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de lcoolter em partes iguais. Lavar em gua, ou em soluo de cido actico a 3%, caso a manuteno do pH seja importante. Corar todos os cortes com Alcian Blue, pH 2,5, por 5 a 30 minutos. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: Corte C (Alcian): coram-se os polissacardeos carboxilados e sulfatados; Corte B (metilao + Alcian): bloqueia a colorao dos polissacardeos carboxilados e sulfatados; Corte A (metilao + saponificao + Alcian): coram-se somente os polissacardeos carboxilados.

POLISS

Interpretao: Caso o corte A fique to corado quanto o corte C: indica a presena de polissacardeos carboxilados somente. Caso o corte A fique menos corado que o corte C: indica a presena de polissacardeos carboxilados e sulfatados. Caso o corte A no se core pelo Alcian: indica a presena de polissacardeos sulfatos somente. Observaes: a) Sempre que realizar este mtodo colocar para correr junto trs lminas de um material j previamente testado com bons resultados. b) O coldio deve ser bem removido, pois ele se cora com o Alcian Blue, interferindo com o resultado.

4.5. MTODO DA HIDRLISE CIDA + ALCIAN BLUE (Quintarelli) Soluo para hidrlise: acetato de sdio a 0,02M: 0,164 g em 100 ml de gua 0,273 g , se for trihidratado. cido clordrico a 0,02N: 0,164 ml em 100 ml gua Misturar as duas solues em partes iguais. Medir o pH e acertar para 2,5. Procedimento: Desparafinar e levar at lcool absoluto dois cortes (A e B). Colodionar os cortes. Deixar secar, passar no lcool e gua destilada. Colocar o corte A na soluo de hidrlise, durante 2 horas a 60C. Acompanhar o procedimento com o corte B, coberto com gua destilada. Descolodionar os cortes com mistura de lcool-ter (partes iguais). Corar pelo Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos. Lavar em gua corrente. Montar. Resultados: Estruturas Alcian Blue positivas na lmina B, que diminurem ou perderem positividade na lmina A, indicam a presena de cido silico. Pode-se aumentar o tempo ou a temperatura de hidrlise para obteno de melhores resultados.

4.6. ALCIAN BLUE + PAS

POLISS

Desparafinar e hidratar os cortes. Coloc-los por 30 minutos em soluo de 2,5. Lavar em soluo de cido actico a 3%. Passar em gua destilada. Deixar por 10 minutos em cido peridico a Lavar rapidamente em gua destilada. Deixar por 1 hora no Reativo de Schiff reativo de Schiff no tem PAS, em Polissacardeos). Lavar em gua corrente por 10 minutos. Montar.

Alcian Blue, pH

1%. (ver preparo do Histoqumica de

Resultado: Glicognio e polissacardeos neutros em vermelho. Polissacardeos cidos em azul. A cor violeta representa associao de ambos.

4.7. ALCIAN BLUE + CONCENTRAO ELETROLTICA CRTICA Soluo corante: 0,05 g de Alcian Blue 100 ml de tampo acetato 0,2M, pH 5.8 Adicionar MgCl2 .6H 2 O (PM = 203,30) nas molaridades requeridas 0,3M, 0,65M, 0,9M e 1M.

diversas

Procedimento: Desparafinar e hidratar as lminas. Corar pelas solues de Alcian Blue com as diferentes concentraes de MgCl 2 , por 18 horas, temperatura ambiente. Lavar em gua corrente. Montar.

POLISS

Resultado: A presena de uma concentrao eletroltica maior na soluo corante proporciona uma colorao seletiva dos polissacardeos de acordo com o grau crescente de sulfatao. Com MgCl2 0,3M: coram-se todos os polissacardeos carboxilados e sulfatados. Com MgCl2 0,65M: coram-se todos os polissacardeos sulfatados. Com MgCl2 0,9M: coram-se heparina, heparam sulfato e queratam sulfato. Com MgCl2 1M: cora-se somente queratam sulfato.

4.8. REAO FERRO-COLOIDAL (Mowrey) Preparo da soluo estoque de ferro-coloidal: Preparar 5 ml de soluo de cloreto frrico a 29% (1,45 g de cloreto frrico em 5 ml de gua). Ferver 250 ml de gua destilada. Com a gua fervendo, adicionar 4,4 ml da soluo de cloreto frrico. Deixar ferver. Quando a soluo ficar vermelho escuro suspender a fervura e deixar esfriar. Dializar a soluo contra gua destilada gelada 18-24 horas duas vezes. Guardar a soluo estoque na geladeira. Dura muitos meses. Na hora de usar, diluir esta soluo estoque na seguinte proporo: 12 ml de cido actico 18 ml de gua destilada 10 ml soluo estoque de ferro-coloidal Preparo da soluo de ferrocianeto clordrica: Preparar 15 ml de soluo de ferrocianeto de potssio a 2%: 0,3 g de ferrocianeto de potssio em 15 ml de gua. Preparar 30 ml de cido clordrico 1%: 0,3 ml de HCl em 30 ml de gua. Misturar as duas solues na hora de usar. Procedimento para reao: Desparafinar e hidratar o corte. Lavar rapidamente em cido actico 10%. Colocar na soluo de ferro coloidal recm-preparada, durante 2 horas. Lavar em 3 banhos de cido actico 10%, 3 minutos cada.

POLISS

Colocar os cortes expostos ao ferro e os cortes controles (que ficaram na gua) durante 20 minutos na soluo de ferrocianeto-clordrica. Lavar em gua corrente 5 minutos. Montar. Resultado: Cora polissacardeos cidos em azul Observao: a) O ferro coloidal adsorvido pelos polissacardeos e visualizado com a subseqente converso para ferrocianetofrrico (azul da Prssia).

4.9. REAO DO FERRO COLOIDAL (Muller, 1966) Preparo da soluo estoque de hidrxido de ferro coloidal: soluo aquosa de cloreto frrico a 32%............12 ml gua destilada....................................750 ml Levar a gua ebulio e, quando ferver, ajuntar a soluo de cloreto frrico. Dura um ms, no mximo. Soluo de trabalho (preparar na hora de usar): soluo de hidrxido de ferro coloidal..........100 ml cido actico....................................10 ml Preparo da soluo de ferrocianeto de potssio: Ferrocianeto de potssio..............1 g HCl concentrado......................1 ml gua destilada......................99 ml Procedimento: Desparafinar os cortes e lev-los at a gua. Tratar com a soluo de trabalho de hidrxido de ferro coloidal, durante 10 minutos. Lavar 5 vezes em gua destilada. Tratar pela soluo ferrocianeto clordrica recm preparada, por 10 minutos. Lavar em gua destilada. Montar. Resultado: Coram-se os polissacardeos cidos em azul.

4.10. PAS (CIDO PERIDICO DE SCHIFF) Soluo de cido peridico a 1%:

POLISS Esta soluo pode ser preparada de duas maneiras: periodato de sdio ou potssio ............1 g cido sulfrico 1N.......................100 ml ou, a mais usada: cido peridico............................1 g gua destilada...........................100 ml

PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF: Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963 gua destilada........................192 cido clordrico concentrado............8 Fucsina Bsica (Color Index 42510)....0,5 Sulfito de sdio (Na2 SO 3 )...............5 Metabissulfito de sdio (Na2S 2 O5 ).....3,8 Carvo ativado........................0,5 ml ml g g ou g g

Dissolver a fucsina na gua adicionada de cido clordrico. Junte o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos at que a mistura esteja lmpida e de cor marrom avermelhado. Adicione o carvo ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e filtrar. O filtrado dever ser incolor. O reativo somente poder ser utilizado, no mnimo, 6 horas aps sua preparao. Guardar na geladeira. Observaes sobre o Reativo de Schiff: a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente lmpido; se no, rejeit-lo. b) Quando se coloca o carvo ativado no reativo este pode descolorir totalmente ou ficar com colorao amarelo palha; em qualquer dos casos est bom para ser utilizado. c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do mesmo em alguns mililitros de formol a 10%. Se a soluo ficar vermelho-prpura, o reativo pode ser usado.

POLISS

Procedimento para a realizao do mtodo PAS: Desparafinar e hidratar os cortes. Colocar no cido peridico, durante 10 a 15 minutos, na geladeira. Lavar em vrias trocas de gua destilada ou lavar 5 minutos na gua corrente e, em seguida, passar pela gua destilada. Colocar no reativo de Schiff durante 1 hora, no escuro, na geladeira ou durante 15 minutos, no escuro, temperatura ambiente. Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos. Montar. Resultado: Locais ricos em glicognio ou polissacardeos neutros, contendo grupos 1,-2 glicol, coram-se em vermelho. Os proteoglicanos no se coram. Observaes: a) Ao retirar-se do Reativo de Schiff pode-se passar pelas seguintes solues: bissulfito de sdio 2% durante 2 minutos ou vrios banhos de HCl 3N durante 2 minutos ou 3 banhos de gua sulfurosa de 2 minutos cada Preparo da gua sulforosa: Metabissulfito de sdio a 10% ...............10 ml HCl 1N.......................................10 ml gua destilada...............................180 ml De modo geral, estes banhos so desnecessrios. b) Para material includo em historesina o cido peridico deve ser a 0,4% e os cortes devem ficar no Reativo de Schiff por 30 minutos.

4.11. ACETILAO + SAPONIFICAO + PAS Soluo acetiladora: Anidrido actico..................32,5 ml Piridina..........................50,0 ml Soluo saponificadora: Soluo de BaOH a 4% em lcool 80

POLISS

10

Procedimento: Desparafinar trs cortes (A, B, C) e lev-los at lcool absoluto. Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, passar 5 minutos no lcool 70 e levar at lcool absoluto. Passar os corte A e B na piridina por 2 minutos. Colocar os cortes A e B na soluo acetiladora recmpreparada, durante 24 horas temperatura ambiente. O corte C deve permanecer em gua destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. Lavar em lcool absoluto. Recolodionar os cortes. Passar no lcool 70 por 5 minutos. Passar no lcool 80. Colocar o corte A na soluo saponificadora, por 4 a 5 minutos, a temperatura ambiente. Os cortes B e C devem permanecer no lcool 80. Lavar em gua destilada. Remover o coldio de todas as lminas, passando-as por lcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de lcoolter em partes iguais. Lavar em gua. Realizar o mtodo de PAS. Resultado: Corte C (PAS): coram-se o glicognio e os polissacardeos neutros. Corte B (acetilao + PAS): bloqueia a colorao dos polissacardeos neutros. Corte A (acetilao + saponificao + PAS): polissacardeos neutros bloqueados pela acetilao voltam a se corar.

4.12. P.A.S. + BOROHIDRIDO Soluo de borohidrido de sdio: Borohidrido de sdio (NaBH 4 ; P.M = 37,83)........0,1 g Na 2HPO 4 (anidro)..................................1,0 g gua destilada...................................100 ml Dissolver o fosfato de sdio na gua e ento acrescentar o borohidrido. Preparar soluo nova cada vez que for usar. O pH deve ser 9,4.

POLISS

11

Procedimento: Desparafinar trs lminas (A, B e C) e levar at a gua. Tratar a lmina A e B com cido peridico a 1%, por 30 minutos. A lmina C deve permanecer no cido peridico por 24 horas. Lavar bem as lminas em gua destilada. Tratar a lmina B com a soluo de borohidrido, por 30 minutos, enquanto a lmina A espera em soluo aquosa de Na 2HPO 4 .sem o borohidrido. Lavar as lminas em gua corrente. Tratar as lminas com Reativo de Schiff, por 15 minutos. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: Lmina A: somente os polissacardeos neutros e o glicognio aparecem corados em magenta (P.A.S. normal). Lmina B: bloqueio total da colorao dos polissacardeos neutros e do glicognio. Lmina C: coram-se, em magenta, tanto os polissacardeos neutros quanto os cidos (glicosaminoglicanas). Observao: a) Com o tempo maior de exposio ao cido peridico (24 horas) os grupamentos 1,2 glicol das glicosaminoglicas tambm do origem a aldedos e reagem com o Reagente de Schiff. b) o borohidrido serve para bloquear a positividade do P.A.S. c) Aconselha-se usar cortes colhidos em lminas com algum tipo de adesivo e/ou colodionar os cortes. d) O tempo durante o qual as lminas A e B permanecem no primeiro cido 30 minutos, ao invs dos 10 a 15 minutos do P.A.S. de rotina. Assim, as glicoprotenas neutras e o glicognio produzam o mximo de grupamentos aldedos neste estgio, para que sejam efetivamente bloqueados pelo borohidrido.

ACNUCL 5. CIDOS NUCLICOS

5.1. COLORAO DE ACRIDINE ORANGE (Ganter e Jolles) Soluo estoque de Acridine Orange: Acridine Orange....................1 g H 2 O destilada...................1000 ml Soluo de Trabalho: Soluo Estoque de Acridine Orange.........10 ml PBS (pH 6,0 a 6,5).........................90 ml Corar 15 minutos na soluo de trabalho de acridine orange. Lavar em PBS. Cobrir a lmina com glicerina e observar no microscpio de fluorescncia. Observaes: a) A fixao do material deve ser feita em Carnoy ou etanol actico; para esfregaos ou culturas de clulas a fixao deve ser feita em acetona metanol. b) O preparado descora e muda de cor depois de um tempo. c) Alguns autores recomendam, aps lavar no PBS, passar em uma soluo de cloreto de clcio 0,1M, por 1 a 2 minutos e, em seguida, lavar em PBS por 10 segundos, antes de montar. Resultado: nuclicos. coram-se as estruturas ricas em cidos

5.2. AZUL DE TOLUIDINA CIDO Soluo corante: Azul de Toluidina 0,5% em gua; pH 3,5 (acertar com HCl 0,1N) Procedimento: Corar as lminas durante 1 a 24 horas a 60C corante pr-aquecido a esta temperatura). Lavar em gua destilada. Imergir em molibdato de sdio ou potssio 1%, segundos, para evitar descolorao posterior. Montar.

(com

por

30

ACNUCL Resultado: Cora estruturas cidas polissacardeos cidos.

presentes

no

tecido:

DNA,

RNA

5.3. MTODO DE FEULGEN PARA DNA Soluo de cido clordrico 1N: 8,5 ml de HCl em 91,5 ml de gua destilada. Soluo aquosa de metabissulfito de sdio ou de potssio a 0,5%. Reativo de Schiff. PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963. gua destilada.........................192 cido clordrico concentrado.............8 Sulfito de sdio (Na2 SO 3 )................5 Metabissulfito de sdio (Na2S 2 O5 )......3,8 Fucsina Bsica (Color Index 42510).....0,5 Carvo ativado.........................0,5 ml ml g ou g g g

Dissolver a fucsina na gua adicionada de cido clordrico. Juntar o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos at que a mistura esteja lmpida e de cor marrom avermelhado. Adicionar o carvo ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e filtrar. O filtrado dever ser incolor. O reativo somente poder ser utilizado, no mnimo, 6 horas aps sua preparao. Guardar na geladeira. Observaes sobre o Reativo de Schiff: a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente lmpido; se no, rejeit-lo. b) Quando se coloca o carvo ativado no reativo este pode descolorir totalmente ou ficar com colorao amarelo palha; nos dois casos est bom para ser usado. c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do mesmo em alguns mililitros de formol a 10%; se a soluo ficar vermelho-prpura, o reativo pode ser usado.

ACNUCL

Procedimento para realizao do mtodo de Feulgen: Desparafinar e hidratar os cortes. Hidrolisar os cortes, a 60C, durante 5 a 20 minutos, no cido clordrico 1N pr-aquecido a esta temperatura. Interromper a hidrlise atravs de uma lavagem em gua destilada. Transferir para o Reativo de Schiff, durante 45 minutos. Lavar os cortes em trs banhos de metabissulfito de sdio ou potssio durante 2 minutos cada. Lavar em gua corrente. Montar. Resultado: O DNA nuclear cora-se em vermelho escuro. Os ncleos de microorganismos, como plasmdios, sarcospordeos, toxoplasma, histoplasma, etc., coram-se em vermelho plido devido ao seu baixo teor de DNA. Observaes sobre o mtodo de Feulgen: a) O metabissulfito utilizado deve ser ativo. Conhece-se pelo seu forte cheiro caracterstico. b) O tempo de hidrlise com cido clordrico varia com o tipo de fixador que foi usado e com o tempo de fixao. No caso do formol, o tempo de hidrlise ao redor de 8 minutos; para o Bouin, deve ser um pouco menor; para o Helly, deve ser ao redor de 5 minutos. Para obter bons resultados convm testar vrios tempos de hidrlise, entre 5 a 15 minutos para cada bloco utilizado. c) O mtodo de Feulgen baseia-se no fato de que o HCl quebra a ligao purina-desoxiribose formando grupamentos aldedicos, que podem ser visualizados pelo Reativo de Schiff pela formao de um novo composto de adio insolvel e de cor vermelho forte. O processo de hidrlise no afeta o RNA, de modo que o mtodo especfico para DNA. d) Se quiser, antes de montar, contracorar em soluo 0,01% Fast Green - FCF em lcool 95 durante alguns segundos. e) Se a lmina estiver colodionada, deve-se retirar o coldio antes de tratar pelo Reativo de Schiff.

ACNUCL 5.4. GALOCIANINA Soluo corante: 10 g de almen de cromo 0,3 g de galocianina 200 ml de gua destilada

Dissolver o lumen em 200 ml de gua e acrescentar a galocianina. Misturar por agitao e levar lentamente fervura. Ferver por 10 a 20 minutos. Esfriar lentamente. Filtrar e completar para 200 ml com gua destilada. A soluo deve ter pH 1,8. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na soluo corante por 24 a 48 horas. Lavar em gua destilada. Montar. Resultado: cidos nuclicos corados em azul profundo.

5.5. LTIO-CARMIN (de rth) Preparo da soluo corante: Preparar 100 ml de soluo saturada de carbonato de ltio (aproximadamente 1,25 g em 100 ml). Dissolver 2,5 a 5,0 g de carmin (C.C.) em 100 ml da soluo de carbonato de ltio e levar ebulio. Ferver durante 10 a 15 minutos. Quando esfriar, adicionar 1 g de timol e filtrar. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na soluo corante por 2 a 5 minutos. Transferir diretamente para o lcool-cido. Proceder a um ou mais banhos em lcool-cido para fixar o corante no ncleo e para diferenciao; controlar a diferenciao ao microscpio. Lavar em gua corrente. Desidratar em lcool 95 e 100. Montar. Resultado: ncleos em vermelho; citoplasma rosa claro ou descorado.

GRANUL 6. GRNULOS CITOPLASMTICOS

6.1. SIRIUS RED ALCALINO - HEMATOXILINA Soluo corante: Srius Red F3B .........................0,5 g lcool absoluto.........................50 ml Soluo aquosa de NaOH a 1%..............1 ml Soluo aquosa de NaCl a 20%.............4 ml gua destilada..........................45 ml Dissolver o Srius na gua destilada; acrescentar o lcool e, em seguida, o NaOH. Agitar vrias vezes at dissolver bem. Deixar repousar por duas horas; gotejar lentamente, agitando bem, o NaCl at obter um ligeiro precipitado; deixar repousar de um dia para o outro e filtrar; a soluo se conserva, na geladeira, por um ou dois meses. Procedimento: Desparafinar e levar at a gua. Corar pela hematoxilina por 2 a 3 minutos. Lavar em gua corrente por 5 minutos. Passar pelo lcool 70. Corar no Srius alcalino por 1 hora. Lavar em gua corrente por 10 minutos. Montar. Resultado: Coram-se em vermelho os eosinfilos e amilide. Observaes: a) Aps o acrscimo do NaOH, o pH da soluo ficar em torno de 12 e permanecer assim at o final. A receita original manda acertar o pH para 10,5, o que pode ser feito acrescentando-se gotas de HCl 1N nesta etapa. Para evitar-se o acrscimo de HCl, pode-se omitir o NaOH, pois, em qualquer das trs circunstncias, ou seja, com NaOH (pH 12), com NaOH e HCl (pH 10,5) ou sem nenhum dos dois (pH 11), o corante funciona perfeitamente.

GRANUL 6.2. LEISHMAN (para esfregaos de sangue) Soluo corante estoque: 0,2 g de Leishman 100 ml de lcool metlico p.a. O corante leva um ms para amadurecer e dura anos.

Soluo corante de trabalho: Na hora de usar, diluir o corante na proporo de 1 ml de corante para 3 ml de gua tamponada. Procedimento: Fixar o esfregao em metanol, por 2 a 3 minutos. Colocar sobre o esfregao a soluo corante de trabalho e deixar de 3 a 5 minutos. Lavar em gua tamponada. Secar ao vento. Examinar ao microscpio com leo de imerso. Resultado: grnulos dos eosinfilos: rosa alaranjado. grnulos dos neutrfilos: prpura a violeta. grnulos dos basfilos: violeta escuro. ncleo dos moncitos: violeta claro. citoplasma dos moncitos: cinza claro. grnulos centrais das plaquetas: violeta. grnulos perifricos das plaquetas: azul claro. eritrcitos: colorao variando de rosa amarelado a cinza, dependendo do pH. Observao: a) a gua tamponada deve ser feita adicionando-se 1 ml de tampo fosfato 0,1M (pH 6,5) para cada 30 a 40 ml de gua destilada. b) aconselha-se, aps a colorao, proceder a uma diferenciao com gua destilada (que ligeiramente cida) ou com cido actico muito diludo (0,05%) para retirar o excesso de azul, tornar as hemcias bem rosadas e realar os grnulos dos eosinfilos.

FIBRMATR 7. FIBRAS DA MATRIZ EXTRACELULAR

7.1. ALDEDO-FUCSINA (Gomori) Soluo corante: Fucsina bsica...........0,5 g lcool 70...............100 ml Dissolver a fucsina, se necessrio aquecimento. Deixar esfriar. Filtrar. Adicionar: cido clordrico concentrado ...1 ml Paraldedo......................1 ml

com

ligeiro

Deixar a soluo amadurecer temperatura ambiente (48 hs) ou a 50C (menos tempo), em recipiente fechado. A soluo passa de vermelho para roxo, quando estar em condies de ser usada. Quando guardada a 4C pode ser usada por vrias semanas. temperatura ambiente dura at 4 dias. Soluo Oxidante: cido per-actico a 40% encontrada comercialmente ou preparada da seguinte maneira: cido actico........................9,5 ml cido sulfrico.....................0,25 ml perxido de hidrognio a 30%........30,0 ml A soluo deve amadurecer por 1 a 3 dias e ser estocada em geladeira (4C). Colocar 4 mg de fosfato dissdico aps os 3 dias para estabilizar a soluo. Procedimento para colorao: Desparafinar e hidratar os cortes. Oxidar os cortes com a soluo de cido per-actico a 40% por 30 minutos. Lavar em gua corrente por 2 minutos. Corar com aldedo-fucsina por 10 a 20 minutos. Diferenciar os cortes: 4 trocas em lcool 95 por 2 minutos e uma troca em lcool 70 por 4 minutos; controlar ao microscpio. Desidratar, diafanizar e montar.

FIBRMATR

Resultado: Sistema elstico em prpura. Omitindo-se a oxidao dos cortes, coram-se apenas as fibras elsticas e elaunnicas. Outras estruturas que tambm se coram: algumas glicosaminoglicanas (como por exemplo, aquelas presentes na matriz cartilaginosa e nos grnulos dos mastcitos), queratina, grnulos de zimognio, clulas beta do pncreas e hipfise. Observaes: a) Recomenda-se fixar o material em fixadores aldedicos como o formol ou o Bouin que praticamente no do colorao de fundo. Fixadores com sais de mercrio (como Helly ou Zenker) do colorao de fundo lils plido. b) O aldedo-fucsina um corante transitrio. A fucsina bsica (vermelha) com paraldedo, sob condies cido-alcolica, forma gradualmente um corante violeta denominado aldedo-fucsina ( temperatura ambiente). O corante forma-se lentamente, e aps um perodo de 2 semanas ocorrem posteriores modificaes, quando as substncias formadas no so mais teis como corante. Para preservar por mais tempo o corante costuma-se mant-lo a 4C. Alguns autores acham que mesmo nesse caso o corante no muito confivel. c) Em vez de usar o cido per-actico prefervel proceder a oxidao com soluo 10% de OXONA, por 30 minutos (ver Tcnica da Resorcina-Fucsina de Weigert) ou oxidar com soluo de monoperssulfato de potssio, por 2 a 3 minutos; usar soluo recm preparada, de acordo com a seguinte instruo: 10 ml de permanganato de potssio a 2,5%: 0,25 g/10 ml de gua destilada 10 ml de cido sulfrico a 5%: 0,52 ml/10 ml de gua 80 ml de gua destilada d) Recomenda-se que o paraldedo usado na preparao do corante seja novo (no mais de 3 ou 4 meses).

FIBRMATR 7.2. CRESIL - VIOLETA (fibras oxitalnicas) Garotek & Jewemoka, 1964 (Cotta-Pereira) Soluo corante: soluo aquosa de cresil-violeta a 0,01% Soluo oxidante: soluo aquosa de Oxona tcnica da Resorcina Fucsina de Weigert) Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Oxid-los pela Oxona, por 40 minutos. Lavar 5 minutos em gua corrente. Corar 15 minutos na soluo de cresil-violeta. Montar. Resultado: Coram-se as fibras oxitalnicas. a 10%

(ver

7.3. IMPREGNAO ARGNTICA (Gomori) Solues necessrias: Soluo de prata amoniacal: Preparar 20 ml de soluo aquosa de nitrato de prata a 10%. Preparar 3,0 ml de sol. aquosa de hidrxido de potssio 10%. Preparar 50 ml de sol. aquosa de hidrxido de amnia a 28%. Misturar 10 ml da soluo de nitrato de prata em 2,5 ml da soluo de hidrxido de potssio. Adicionar, gota a gota, a soluo de hidrxido de amnia, agitando energicamente o frasco somente at o ponto em que o precipitado se dissolva. Em seguida, adicionar, gota a gota, a soluo de nitrato de prata, at que se forme um pouco de precipitado, o qual se dissolve facilmente com a agitao. Completar para o dobro de volume com gua destilada e estocar em vidro escuro. Filtrar antes de usar. Imediatamente antes de usar, diluir 1:8 em gua destilada. Soluo de Permanganato de Potssio a 0,5% Soluo de Metabissulfito de Potssio a 2%

FIBRMATR Soluo de Sulfato Frrico - Amoniacal a 2% Soluo de Formalina a 20% Formaldedo (37-40%)......20 ml gua destilada............80 ml Soluo de Cloreto de Ouro a 0,2%

Soluo de Cloreto de ouro a 1%.......10 ml gua destilada........................40 ml Para fazer a soluo de Cloreto de ouro 1% quebre a ampola de cloreto de ouro (15 gramas) em um bquer com 100 ml de gua destilada. Soluo de Tiossulfato de Sdio a 2%

Procedimento: Desparafinar e hidratar as lminas Lavar em gua destilada. Ateno: daqui para frente, pingar as solues sobre os cortes. Oxidar em permanganato de potssio, por 1 minuto. Lavar em gua corrente por dois minutos. Diferenciar com soluo de metabissulfito, por 1 minuto. Lavar em gua corrente por 2 minutos. Passar na soluo de sulfato frrico-amoniacal, por 1 minuto. Lavar em gua corrente, por 2 minutos. Lavar em duas passagens de gua destilada, 30 segundos cada. Impregnar na soluo de prata amoniacal, durante 10 segundos a 1 minuto. Mergulhar em gua destilada por 20 segundos. Reduzir na soluo de formalina, por 3 minutos, agitando suavemente durante o primeiro minuto. Lavar em gua corrente por 3 minutos. Passar em gua destilada (2 a 3 banhos). Fazer a viragem em cloreto de ouro, por 10 minutos (at ficar cinza). Mergulhar em gua destilada. Reduzir na soluo de metabissulfito de potssio, por 1 minuto. Fixar na soluo de tiossulfato de sdio, por 1 minuto. Lavar em gua corrente, por 2 minutos. Montar.

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Resultado- fibras reticulares em negro, fibras colgenas em castanho e colorao de fundo em cinza. Observaes: a) Este mtodo bastante complexo e deve ser seguido nos mnimos detalhes. b) Os frascos contendo as solues devem ser perfeitamente limpos. c) Todos os reagentes devem ser da maior pureza possvel e acuradamente medidos e pesados. d) Qualquer excesso de hidrxido de amnia na soluo de prata amoniacal provoca perda da sensibilidade do mtodo, resultando em preparados fracamente ou no corados. e) Devido ao fato dos reagentes empregados serem de natureza bastante alcalina, os cortes tendem a se soltarem da lmina. Assim sendo, deve-se proceder colagem dos cortes, tomando-se cuidado para no colocar colantes em excesso, pois resultam em formao de precipitados em lugares inadequados. f) Os reagentes devem ser sempre dissolvidos em gua destilada ou deionizada, para evitar precipitao de sais de prata insolveis. g) A soluo de tiossulfato de sdio serve para remover o excesso de prata que fica no tecido sob a forma noprecipitada. h) A impregnao pela prata deve ser, ao final, convertida em impregnao pelo ouro para resultar em um preparado permanente e produzir uma colorao negra de alta densidade. i) Se for utilizar solues preparadas h mais de um ms e estocadas na geladeira, antes de corar o material desejado, core um material j testado com bons resultados, pois alguma das solues pode no estar funcionando mais.

7.4. ORCINOL - NEOFUCSINA (mtodo usado por Cotta-Pereira para fibras elsticas) Fullmer & Lillie, 1956, 1958. Preparo da soluo de orcinol-neofucsina: Colocar em ebulio 200 ml de gua destilada. Adicionar 2 g de neofucsina (cuidado). Adicionar 4 g de orcinol (cuidado). Deixar em ebulio por 5 minutos. Adicionar 25 ml de soluo aquosa de cloreto 30%. Deixar em ebulio por mais 5 minutos.

frrico

FIBRMATR Deixar esfriar e filtrar. Descartar o filtrado e dissolver o depsito papel de filtro em 100 ml de etanol 95. Estocar na geladeira, por at 3 meses.

retido

no

Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar em soluo de orcinol-neofucsina, por 15 minutos, a 37C (com o corante pr-aquecido a esta temperatura). Passar em trs trocas de lcool 70, por 5 minutos em cada troca. Desidratar, diafanizar e montar.

7.5. ORCEINA Soluo corante: 1 g de orcena 100 ml de lcool 70 0,6 ml de HCl concentrado Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar com a soluo de orcena durante 30 a 60 minutos. Enxaguar em gua destilada. Secar a gua em excesso. Passar no lcool 95 para tirar o excesso de corante. Deixar no lcool absoluto durante 5 a 30 minutos at que o corte esteja castanho claro. Verificar ao microscpio se as fibras elsticas esto bem pretas. Descorar o fundo colocando os cortes no lcool cido: 1 ml de HCl em 99 ml de lcool 70; este procedimento deve ser feito, controlando ao microscpio, at que o fundo fique bem incolor. A descolorao obtida entre 2 a 10 minutos. Lavar em gua corrente durante 5 minutos. Montar. Resultado: fibras elsticas coradas em castanho-preto.

FIBRMATR 7.6. PICROSSRIUS - HEMATOXILINA Srius Red..............................0,2 g Soluo saturada de cido pcrico.......100 ml

Misturar e colocar um pouco de cido pcrico (em p) para que aparea um precipitado no fundo do frasco. Procedimento: Desparafinar e levar as lminas at gua. Corar durante 1 hora no Picrossrius temperatura ambiente. Lavar em gua corrente por 5 minutos. Corar pela Hematoxilina de Harris por 6 minutos (ou menos, se a hematoxilina for nova). Lavar por 10 minutos em gua corrente. Montar. Observaes: a) Trocar o corante uma vez por ms se este for muito utilizado. b) A soluo dever estar sempre saturada. c) Especificao do Sirius Red: F 3 B 200 (Mobay Chemical Co., Union, NJ). d) Para experimentos quantitativos deve-se omitir a contracolorao pela hematoxilina. e) Ler sobre o mtodo do Picrossrius associado digesto pela papana em DIGESTO ENZIMTICA.

7.7. RESORCINA-FUCSINA DE WEIGERT COM E SEM OXIDAO Soluo corante: Resorcina-Fucsina Soluo oxidante: Oxona 10% em gua destilada Preparo da Soluo corante: gua destilada ..............200 Fucsina bsica ................2 Resorcina .....................4 Cloreto frrico a 30%..........50 lcool 95.....................200 HCl concentrado ................2

ml g g ml ml ml

Adicionar a fucsina e a resorcina na gua destilada. Colocar esta soluo em ebulio. Adicionar o cloreto frrico. Continuar em ebulio por 4 minutos. Esperar esfriar e filtrar. Descartar o filtrado e deixar secar o depsito retido no papel de filtro. Dissolver este

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depsito em 200 ml de etanol 95 aquecido. Deixar esfriar e adicionar o HCl. Guardar a soluo na geladeira. Dura um ano ou mais. A) Procedimento para os cortes que no sero oxidados: Desparafinar e hidratar at lcool 95. Corar pela Resorcina-fucsina, por 1 hora, temperatura ambiente. A Resorcina-fucsina deve estar temperatura ambiente antes de colocar os cortes para corar. Lavar na gua corrente durante 5 minutos. Colocar em duas trocas de lcool 70durante 10 minutos no total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciao. Desidratar, diafanizar e montar. Se necessrio, depois do lcool 70,remover a colorao de fundo passando em uma soluo de lcool-cido a 1% (1 ml de HCl concentrado em 99 ml de lcool 70). Controlar ao ao microscpio tendo o cuidado de preservar a colorao das fibras mais finas; aps a diferenciao em lcool-cido lavar em gua corrente.

B) Procedimento para cortes que sero oxidados: Desparafinar e hidratar at gua. Pingar sobre os cortes a soluo aquosa de OXONA 10% e deixar oxidando durante 40 minutos (ver observao b.). Lavar em gua corrente por 5 minutos. Passar pelo lcool 70. Passar pelo lcool 95. Corar pela Resorcina-fucsina durante 1 hora, temperatura ambiente. Lavar na gua corrente durante 5 minutos. Colocar em duas trocas de lcool 70durante 10 minutos no total. Nesta etapa vai ocorrer a diferenciao. Desidratar, diafanizar e montar. Se necessrio, depois do lcool 70,remover a colorao de fundo passando em uma soluo de lcool-cido a 1% (1 ml de HCl concentrado em 99 ml de lcool 70). Controlar ao ao microscpio tendo o cuidado de preservar a colorao das fibras mais finas; aps a diferenciao em lcoolcido lavar em gua corrente. Resultado: nos cortes que no foram submetidos oxidao coram-se fibras elsticas e elaunnicas; nos cortes submetidos oxidao coram-se fibras elsticas, elaunnicas e oxitalnicas.

FIBRMATR

Observao: a) Se o cloreto frrico contiver impurezas, a colorao no sair bem; at mesmo o cloreto frrico novo pode ter sais ferrosos e pode ser substitudo por nitrato frrico que considerado livre de sais ferrosos. b) Referncia da OXONA: composto monopersulfato, Du Pont, Wilmington, Delaware, E.U.A.). 7.8. HEMATOXILINA FRRICA DE VERHOEFF Preparo da soluo corante: Hematoxilina..................................1 lcool 100..................................20 Soluo aquosa de cloreto frrico a 10%.......8 Soluo de Lugol..............................8 Preparo da soluo de Lugol: Iodo...........................2 g Iodeto de potssio.............4 g Completar para 100 ml com gua destilada. Preparo do Bouin: Soluo saturada aquosa de cido pcrico........750 ml Formol 36-40%...................................250 ml cido actico glacial............................50 ml Preparo da soluo diferenciadora: cloreto frrico...............1 g gua destilada...............50 ml Dissolver a hematoxilina no lcool. Adicionar a soluo de cloreto frrico. Misturar e adicionar o lugol. Procedimento: Desparafinar os cortes e levar at agua. Colocar na soluo de Bouin por 30 minutos. Lavar em gua corrente. Colocar na soluo corante por 20 a 30 minutos. Lavar em gua corrente. Diferenciar por poucos segundos na soluo de cloreto frrico, controlando ao microscpio at que estejam coradas somente as fibras elsticas; se diferenciar demais, voltar para a soluo corante. Lavar em gua corrente. Lavar em lcool 95 por 2 a 5 minutos para remover qualquer colorao devida apenas ao iodo. Lavar em gua corrente. Desidratar rapidamente atravs do gradiente alcolico.

g ml ml ml

FIBRMATR Diafanizar e montar.

10

Observaes: a) Prepare todas as solues na hora do uso e s core em soluo corante recm preparada. b) Se o cloreto frrico contiver impurezas, a colorao no sair bem; at mesmo o cloreto frrico novo pode ter sais ferrosos e pode ser substitudo por nitrato frrico, que considerado livre destes sais. c) O Bouin atua como mordente, aumentando o contraste das fibras elsticas aps a diferenciao.

7.9. TRICRMICO DE MALLORY Solues corantes: Soluo A: 0,5 g de fucsina cida 100 ml de gua destilada Soluo B: 0,5 g de azul de anilina 2,0 g de orange G 1,0 g de cido fosfotngstico Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar pela soluo A durante 2 minutos. Passar diretamente para a soluo B, corando durante 5 a 10 minutos. Lavar em gua corrente at tirar o excesso de corante. Passar pelo lcool 80 por alguns segundos. Desidratar e montar. Resultado: Tecido conjuntivo vermelho.

cora-se

em

azul

tecido

muscular

em

7.10. AZAN (modificado por Heidenhaim) Solues corantes: Soluo A (soluo de azocarmin): 0,25 a 1,0 g de azocarmin B 100 ml de gua destilada 1 ml cido actico glacial Se for usado o Azocarmin G, saturar 100 ml de gua destilada, por aquecimento, com 0,1 g do corante; esfriar e acidificar com 1 ml de cido actico glacial.

FIBRMATR

11

Soluo B (azul de anilina-orange G): Preparo da soluo estoque: 0,5 g de azul de anilina solvel em gua 2,0 g de orange G 8,0 ml de cido actico glacial 100 ml de gua destilada Dissolver o orange G na gua destilada; acrescentar lentamente e misturando sempre, o cido actico; adicionar o azul de anilina e filtrar. Preparo da soluo de trabalho: 33 a 50 ml da soluo B estoque misturados gua destilada que seja suficiente para 100 ml. Procedimento: Desparafinar e hidratar os cortes. Corar na soluo A, na estufa 50 a 55, por 30 a 60 minutos e, em seguida, continuar corando pela soluo, temperatura ambiente, por 1 a 2 horas. Lavar em gua destilada. Mergulhar em soluo de cido actico a 1% em lcool 95. Colocar em soluo aquosa de cido fosfotngstico a 5%, durante 30 minutos a 3 horas (mordente). Lavar em gua destilada durante 3 minutos. Corar na soluo B de trabalho, durante 1 a 3 horas. Lavar em gua destilada. Dar dois banhos de lcool 95, dois banhos de lcool 100 e dois banhos de xilol. Montar.

FIBRMATR

12

Resultado: vermelho: ncleo, ostecitos, eritrcitos, neuroglia, depsitos de imunocomplexos na membrana basal de alas capilares glomerulares. vermelho alaranjado: msculo. azul: membrana basal, fibras colgenas, fibras reticulares, fibrina, muco, saliva. Observao: a) a soluo A e a soluo estoque B devem ser guardadas em geladeira; a soluo de trabalho B deve ser descartada.

HISTORES

V. HISTORESINA

HISTORES

NDICE

1. FIXAO 2. DESIDRATAO 3. INCLUSO 4. MICROTOMIA 5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES 6. COLORAO 7. USO DO KNIFE-MAKER DO ADOLPHO LUTZ

HISTORES

1. FIXAO Uma das dimenses do material a ser fixado dever medir no mximo 1 a 2 mm para que o fixador penetre bem. A fixao dever ser feita em soluo de paraformaldedo a 4% em PBS neutro ou soluo de glutaraldedo a 2% isotnica e

neutra. O tempo de fixao dever ser de 6 a 12 horas (ideal 8 horas).

2. DESIDRATAO lcool 70, por uma noite (no mnimo por 2 horas); Deixar em acetona pura, por 2 a 3 dias, trocando-a

diariamente. A desidratao poder ser feita tambm da seguinte maneira: Desidratar em lcool 70, por uma noite; 2 banhos em lcool 95, de 30 minutos cada 4 banhos em lcool absoluto (total de 2 a 3 horas) rgos que contenham ar, como o pulmo, devem ser

colocados no vcuo por aproximadamente 30 minutos, durante a passagem no lcool 70.

3. INCLUSO O material de pode ser includo de em cpsulas ou de em gelatina forminhas

(formato

cpsulas

remdio)

retangulares de plstico, que se prestam mais pelo prprio formato e por permitirem mudar o plano de corte.

HISTORES

3.1. PREPARAO DA RESINA

Durante solues

o (A

processo e B)

de

incluso a

so

utilizadas do kit

duas para

preparadas

partir

Historesina adquirido comercialmente:

PREPARO DA SOLUO A: Soluo de perxido de benzoila a 1% em Tecnovit preparada 1 ou da

Historesin

(hidroxietil

metacrilato),

seguinte maneira: 0,15 g de perxido de benzoila 15 ml de Tecnovit 1 Agitar suavemente por 10 a 15 minutos. Usa-se a soluo A para a pr-incluso. Esta soluo estvel temperatura ambiente por 4

semanas. Esta quantidade suficiente para a incluso de 10 blocos em cpsulas de gelatina. Pode-se guardar na geladeira por at uma semana.

PREPARO DA SOLUO B: 5 ml da soluo A 0,33 ml do polimerizador (Tecnovit 2). Misturar cerca de 5 minutos. Esta soluo usada para a incluso propriamente dita e deve ser feita no momento de usar e colocada no gelo; caso

HISTORES

contrrio, polimeriza em cerca de 10 minutos. Pode ficar no gelo at por 1 hora sem polimerizar-se. Se a resina for velha, pode-se agregar mais polimerizador, at 0,46 ml em 5 ml da soluo A. Necessita-se cerca de para 0,5 ml por cpsula de gelatina.

3.2.PROCEDIMENTO PARA INCLUSO: Colocar o material numa mistura 1:1 de soluo A e acetona (ou lcool absoluto, caso a desidratao tenha sido feito nele), por 12 horas, girando. Colocar em resina pura, a 24 horas, girando. Encher as cpsulas de gelatina ou as forminhas de plstico com a soluo B recm-preparada; se usar forminhas de

plstico, unt-las com silicone antes de colocar a resina, para evitar que se ressequem e assim, duram mais. Colocar o material com a superfcie de corte prxima ao local que vai ser cortado; se a incluso em cpsula de gelatina, fundo da deve-se cpsula; colocar se a superfcie de de corte para o

forminha

plstico,

deve-se

colocar a superfcie de corte para baixo. Se o material se deslocar ou estiver dentro da em posio na

inadequada,

pode-se

posicion-lo

cpsula

posio desejada, com a ajuda de um alfinete ou palito de dente. Encher totalmente a cpsula com a resina ou a forminha de plstico plstico (at ficar abaulado) na e colocar este um pedao de

transparente

superfcie;

procedimento

HISTORES

serve para que a polimerizao ocorra de maneira homognea em todo bloco, pois se a superfcie ficar em contacto com o ar demora mais a se polimerizar. Deixar polimerizar a na estufa por 24 a 37 a no 45 (a estufa Aps de as

Junqueira

40),

horas,

mnimo.

primeiras 6 a 8 horas, retirar o plstico da superfcie para que a polimerizao se complete. Depois de polimerizar, retirar a cpsula de gelatina em que o bloco est envolto, mergulhando-a em gua morna,

quase quente; esfregar o bloco com os dedos at que este no esteja mais escorregadio; secar com papel absorvente. Em seguida, colocar na estufa para secar; interessante colocar slica na estufa, para absorver a umidade. Se a incluso for feita com forminhas de plstico, soltar os blocos como se retira o gelo da forma.

4. MICROTOMIA EM HISTORESINA Como regra geral, deve-se cortar um mesmo material em

vrias espessuras (1 m, 2 ou 3 m e 5 m) e pesc-los na mesma lmina. O mtodo para a microtomia varia de acordo com a incluso do material que pode ter sido feita em cpsulas de

gelatina (formato de cpsulas de remdio) ou em forminhas retangulares plsticas. No caso de incluso em cpsulas, a microtomia pode ser

feita tanto no piramitomo do Laboratrio de Microscopia Eletrnica, quanto no micrtomo do Laboratrio de

HISTORES

Microscopia ptica (LEIKA). Se for cortar no piramitomo as facas de vidro devem ser aquelas feitas no Knife-maker da Microscopia eletrnica (so mais finas); se for cortar no micrtomo deve-se usar facas de vidro mais grossas, feitas no Knife-maker da Microscopia ptica. No caso de incluso em forminhas plsticas, a microtomia deve ser feita sempre no micrtomo Leica ou no micrtomo de parafina, para o qual foi feito um adaptador para facas de vidro. As facas devem ser aquelas grossas, feitas no Knife-maker da Microscopia ptica. Caso necessrio, saiba que existe um Knife-maker do Dupond Instituto do Laboratrio Lutz, de que

Microscopia

Eletrnica

Adolfo

tambm faz facas grossas. Os blocos provenientes de incluso em forminhas de

plstico devem ser colados em cubinhos de madeira (2x2x2 cm), atravs de araldite.

4.1. Microtomia para blocos feitos em cpsulas A microtomia deve ser feita no piramitomo ou no micrtomo Leica, de acordo com as instrues de uso destes

aparelhos.

4.2.

Microtomia

para

blocos

includos

em

forminhas

plsticas As facas ser ou de vidro utilizadas no no micrtomo Leica da de de parafina

devem ptica

feitas no

knife-maker do

Microscopia Microscopia

Dupond

Laboratrio

HISTORES

Eletrnica resistentes, aquelas

do

Instituto serem no

Adolfo em

Lutz, vidro LKB

pois mais da

so grosso

mais que

por

feitas

feitas

knife-maker

microscopia

eletrnica. Porm, em ltimo caso, pode-se usar as facas de vidro feitas neste, adaptadas ao micrtomo de parafina. 4.2.1. Microtomia no micrtomo de parafina: Acopla-se o adaptador para facas de vidro ao micrtomo, deixando-o bem firme na posio desejada, apertando-se o parafuso A com a chave em forma de L. Desaparafusa-se o boto B, que solta o carro C. Neste, h uma fenda na ponta onde coloca-se a faca de vidro. Traz-se o carro C totalmente da o faca. boto para a direita para o carro facilitar carro C a C,

colocao

Prende-se B de

novamente que o

aparafusando imvel.

forma

fique

Desaparafusa-se

boto

que

uma

mobilidade

independente fenda. Coloca-se a faca de forma que o lado que no de corte fique rente ao lado inferior da fenda, e o lado maior fique sobre a base larga da fenda. Apertase bem o boto D, e assim, a faca e a fenda esto fixas. Solta-se novamente o boto B, leva-se o carro C para a

esquerda de forma a acertar a posio da faca na frente do bloco. Acerta-se o ngulo desejado observando a escala de papel E no corpo do adaptador; o ngulo melhor 7.

Aperta-se novamente o boto D, determinando-se a micragem desejada e pode-se iniciar a microtomia.

HISTORES

4.2.2. Microtomia no micrtomo Leica: Ligar o estabilizador de voltagem. Ligar o aparelho. Apertar o boto TRIM e ajustar a micragem desejada para trimar o bloco. Colocar o bloco no suporte. Ajustar a sua posio com a ajuda dos botes laterais aps destrav-los, girando a trava em forma de L que fica em cima esquerda. Colocar a faca e trav-la com a avalanca da direita no prprio suporte de faca. Verificar se o carrinho da faca est travado (boto na frente do aparelho). Regular a micragem desejada para o corte (boto preto direita do aparelho em cima). Programar o curso do canho (1, 2 ou 3). Proceder trimagem. Desligar o boto TRIM e comear a cortar com a micragem estabelecida. OBS: Tanto para comear ou parar de trimar ou cortar devese apertar o boto RUN/STOP. CUIDADO: o aparelho possui um sistema automtica de trava (boto vermelho esquerda) que serve para parar todas as suas funes em caso de emergncia. Para que isto ocorra deve-se apenas empurr-lo para dentro. Nada mais vai

funcionar at que este boto seja novamente puxado para frente com um leve giro para direita.

HISTORES

10

HISTORES

11

5. ESTIRAMENTO E PESCA DOS CORTES Tanto para materiais includos em cpsulas quanto para

aqueles includos em formas plsticas, os cortes obtidos devem ser esticados em gua limpa temperatura ambiente. Para cortes difceis de esticar, molhar a ponta de um

pincel em clorofrmio puro e encost-lo bem perto do corte na gua. Pesca-se grudar em lminas limpas. No Se necessrio quando o nada corte para est

os

cortes

nas

lminas.

flutuando perceber que h bolhas de ar embaixo, prender a ponta do corte (segurando com uma pina pela resina) e, passar um estilete debaixo do corte para que as bolhas

saiam; fazer isto com o corte flutuando sobre a gua o tempo todo. As lminas podem ser secas em estufa temperatura de

cerca de 37 C, caso no haja especificao em contrrio.

6. COLORAO

6.1. AZUL DE TOLUIDINA - FUCSINA BSICA Soluo aquosa corante de Azul de toluidina 0,1% em soluo

Preparo da soluo: 0,3 g de Toluidina

HISTORES

12

300 ml de gua destilada

Filtrar

no

dia

seguinte.

Deixar

frasco

imvel,

temperatura ambiente. Pode-se cortes usar o azul da de toluidina usado para corar porm os o

grossos

microscopia

eletrnica,

Junqueira no recomenda.

Soluo

corante

de

fucsina

bsica:

soluo

aquosa

de

fucsina bsica (pararosaniline ou fucsina diamante) a 0,1 ou 0,2%.

Preparo da soluo: 0,1 ou 0,2 g de fucsina bsica (pararosaniline da Sigma ou fucsina diamante) 100 ml de gua destilada Filtrar.

Procedimento para colorao:

Colocar a soluo de azul de toluidina sobre as lminas utilizando-se uma pipeta Pasteur comum e deixar corando por 1 a 4 minutos (conforme o material: por exemplo,

rgos como o bao, o fgado e pncres, devem corar por cerca de 1,5 minutos, enquanto que rgos cujas clulas tem pouco RNA devem ficar corando por mais tempo). O

frasco com o corante, depois de filtrado, deve ser mantido

HISTORES

13

imvel

(nunca

tir-lo

do

lugar,

nem

levant-lo,

nem

sacud-lo). Alm disso, deve-se tomar o cuidado de retirar a soluo sempre do meio do frasco: no enfiar a pipeta at o fundo do frasco e nem retirar o corante da

superfcie. Lavar jogando gua destilada sobre os cortes com uma

pisseta. Colocar uma gota de gua destilada e deixar sobre o corte por 30 segundos. Escorrer. Cobrir os cortes A com a soluo de fucsina, por 6 a 30 ligeiramente o azul de

segundos.

fucsina

diferencia

toluidina; assim sendo deve-se colocar a fucsina sobre o corte e ficar observando; quando comear a sair uma nuvem azulada retirar imediatamente a fucsina. Lavar jogando gua destilada sobre os cortes com uma

pisseta. Colocar uma gota de gua destilada e deixar sobre o corte por 30 segundos. Escorrer. A fucsina deve ser bem lavada para no formar uma semi-lua de corante em volta do corte. Depois de lavar, cobrir os cortes com uma soluo aquosa de molibdato de sdio a 0,1%, por 30 segundos; escorrer bem, agitando bem ao ar, para que no fique depsito. Secar, com um papel de filtro, ao redor do corte. Colocar na estufa a 37,para secar. Montar.

Resultado:

HISTORES

14

Coram-se nuclicos

em e

azul alguns

as

substncias de

cidas, secreo;

como

cidos em

grnulos

coram-se

fucsia as mitocndrias e outros grnulos de secreo.

HISTORES

15

Observao: a) Pode-se corar somente com o azul de toluidina, pulandose a colorao pela fucsina. Se no for corar pela fucsina deve-se deixar no azul de toluidina por somente 1 a 2

minutos, para no corar demasiadamente. b) importante passar pelo molibdato; caso contrrio, o azul de toluidina descora com o tempo.

7. USO DO KNIFE-MAKER LEICA

Este Knife maker deve ser usado para fazer facas de vidro grossas para microtomia de blocos de historesina que foram includos tanto em forminhas retangulares plsticas como em cpsulas de gelatina e que sero cortados no micrtomo Leica ou no micrtomo de parafina antigo usado com

adaptador. Manipular os vidros pegando sempre nas superfcies, nunca dos lados. Lavar as barras de vidro com detergente fraco em gua em gua fria e secar com leno de papel. Cortar (sempre as barras em retngulos at obter sucessivamente quadrados. menores isto

nas

metades)

Para

colocar o boto 1 na posio "barras". Levantar a alavanca 3; colocar e a barra de no deve forma a encost-la preto; para no pino que o a

esquerda risco do

encaix-la

suporte ficar

observe

fabricante

baixo.

Abaixar

HISTORES

16

alavanca 3 com um pouco de presso; puxar o riscador 2 e girar a alavanca 4, segurando-a com um pouco depresso at que o vidro se quebre. Como o vidro vai ficando cada vez menor e deve ser cortado sempre na metade usar os outros dois pinos guias para apoiar o vidro. Os quadrados devem agora ser cortados em tringulos, que sero mudar as o facas boto 1 de propriamente para um a ditas. Para isto, com deve-se barra

posio para

"losango o

uma

atravessando-o

lado

outro

totalmente";

levanta-se a alavanca 3; coloca-se o quadrado de vidro com a parte mais perfeita voltada para o aparelho e no para o operador; coloca-se a pina 6 sob o quadrado de vidro e abaixa-se a alavanca 3; traz-se com cuidado o boto 6 para a frente at encostar no vidro. Ajuste-se a alavanquinha 5 de modo a somente prender o vidro, sem apert-lo (este procedimento tem por funo segurar as facas para que no final elas no caiam e quebrem). Abaixe a alavanca 3 com leve presso dos dedos de cima o para vidro, devagar baixo na parte o 4

superior riscador

(branca); 2 para

risca-se

trazendo-se a alavanca

frente;

coloca-se

para a direita at que faca comee a quebrar; a partir da, esperar at que a faca se quebre sozinha.

8. USO DO KNIFE-MAKER DUPOND DO ADOLPHO LUTZ

Este

knife-maker

est

no

Laboratrio

de

Microscopia

Eletrnica do Instituto Adolpho Lutz e deve ser usado para

HISTORES

17

fazer

facas

de

vidro

para

microtomia

de

blocos

de

historesina que foram includos em forminhas retangulares de plstico.

Manipular os vidros pegando sempre nas superfcies, nunca dos lados. Lavar com detergente fraco em gua fria e secar os

retngulos de vidro (10x5 cm). Cortar os retngulos de vidro em quadrados grandes de 5x5 cm. Cortar os quadrados grandes em retngulos de 2,5 x 5 cm e estes, por sua vez, em quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

PROCEDIMENTO PARA CORTAR OS VIDROS: Passar pincel a superfcie do aparelho para eliminar

esqurolas de vidro. Centrar o retngulo grande no aparelho com a parte riscada pelo fabricante para baixo. Abaixar a alavanca (1),

rodando a manivela no sentido do relgio at encostar as borrachas laterais no vidro. Nesta altura a manivela

endurece. A partir da girar a manivela mais uma volta e meia, para prender bem o vidro. Trazer o controle (2) para fora. Puxar o riscador de vidro (3) para fora, apertar o boto desse riscador e impulsionar de maneira contnua e

ininterrupta o riscador para dentro. Esta etapa crtica; se o boto for apertado demais o risco ser fundo e

HISTORES

18

irregular e no se obtm facas boa; se apertar pouco, o vidro no risca. A intensidade do aperto do boto depende, pois, da experincia. Colocar a tampa de plstico (medida de segurana). Rodar o apertador de vidro (4) sempre em sentido horrio, gradualmente, por etapas at quebrar o vidro. Este

processo dever ser lento. Aps cortar o retngulo, virar a manivela (1) em sentido anti-horrio, e retirar o vidro. Nunca girar o apertador de vidro (4) em sentido anti-

horrio (ele volta posio inicial sozinho). Seguir sempre o mesmo procedimento de cortar o vidro at obter quadrados de 2,5 x 2,5 cm.

OBTENO DAS FACAS DEFINITIVAS: Colocar os quadrados de 2,5 x 2,5 com o canto mais regular e mais perpendicular olhando para o aparelho. A borda

irregular do vidro deve ser colocada para cima, isto , ao contrrio do que foi feito at agora. Centrar o quadrado na sua posio correta empurrando para a frente o centrador a faca, preto. prender Com o o centrador preto a

pressionando

quadrado,

girando

manivela (1) como descrito anteriormente. Apertar o controle (2) para dentro do aparelho, trazer o riscador (3) para fora, apertar o boto e riscar o vidro, colocar a tampa de plstico e girar o apertador (4)

lentamente at quebrar o vidro.

PROCE-ME

VI. PROCESSAMENTO DE MATERIAL PARA MICROSCOPIA ELETRNICA DE TRANSMISSO

PROCE-ME NDICE 1. FIXAO 1.1. Glutaraldedo 1.2. Tetrxido de smio 1.3. Acetato de Uranila 1.4. Rotina de Fixao 2. DESIDRATAO E INCLUSO 2.1. Em araldite 6005 2.2. Em Resapol 2.3. Em Medcast 2.4. Em Araldite CY-205 3. MICROTOMIA 3.1. Uso do piramitomo para desbastar o bloco 3.2. Uso do ultramicrtomo para desbastar o bloco 3.3. Obteno dos cortes finos 3.4. Colorao dos cortes finos 3.5. Obteno de cortes ultra-finos 3.6. Colorao de cortes ultra-finos 4. CARBONIZAO 5. PREPARAO DE TELAS 5.1. Lavagem de telas 5.2. Cobertura da tela com parldio

6. MTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAO DE ANTGENOS BACTERIANOS EM PREPARADO TOTAL

PROCE-ME 1. FIXAO:

Os

fixadores e

usados O

rotineiramente glutaraldedo

so: as

glutaraldedo, protenas, o

smio

uranila.

fixa

tetrxido de smio fixa principalmente lipdeos, enquanto que o acetato de uranila reduz a extrao de cidos

nuclicos, fosfolipdeos, protenas.

1.1. GLUTARALDEDO 2,0 % EM TAMPO FOSFATO DE SDIO E POTSSIO 0,15M, pH 7,2 1.1.1. PREPARO DO TAMPO FOSFATO SDIO-POTSSIO Soluo A: soluo 1M de KH 2 PO 4 (PM = 136,09): 13,6 g/100 ml de gua destilada 34,0 g/250 ml de gua destilada Soluo B: soluo 1M 17,8 g/100 44,5 g/250 ou soluo 1M 26,8 g/100 67,0 g/250 ou soluo 1M 35,8 g/100 89,5 g/250

de Na2 HPO 4 .2H2O (PM = 177,98) ml de gua destilada ml de gua destilada de Na2 4PO 4 .7H 2O (PM = 267,98) ml de gua destilada ml de gua destilada de Na2 HPO 4 .12H2 O (PM = 357,98) ml de gua destilada ml de gua destilada

Guardar as solues A e B no congelador.

PROCE-ME Na hora de usar, de descongelar com a as solues abaixo estoques para

4 e

mistur-las

acordo

tabela

fazer

soluo tampo sdio-potssio 0,15M; pH = 7,0 a 7,2

Soluo A 28,5 ml 14,25 ml 04,75 ml

Soluo B 71,5 ml 35.75 ml 11,91 ml

Completar com H2 O para 660 ml 330 ml 110 ml

Medir o pH do tampo e corrig-lo, se necessrio. Congelar de novo as solues estoques.

1.1.2. PREPARO DO GLUTARALDEDO:

Existem grandes

vrias de 250

embalagens ml e

de de

glutaraldedo: 10, o 25 e 70

frascos ml com pode

ampolas

glutaraldedo.

Nestas

embalagens

glutaraldedo

estar em diferentes porcentagens: 10, 25, 50 ou 70%. No caso de ampolas, deve-se lav-las bem com EXTRAN e

enxaguar abundantemente; deixar secar. Colocar luvas e quebrar a ampola envolvendo-a em uma gaze limpa, para no deixar a gordura da mo no vidro. Evitar qualquer contato manual. Deve ser feito em capela, pois txico. No caso de frascos com grande quantidade de lquido, devese retirar a quantidade de glutaraldedo desejada com um pipeta muito bem lavada (com Extran ou soluo

sulfocrmica), muito bem enxaguada e seca.

PROCE-ME 1.1.3. PREPARO DO GLUTARALDEDO A 2%:

Colocar

tampo

fosfato

0,15M,

pH

7,0

7,2,

em

uma

proveta e por cima despejar o glutaraldedo com um pipeta muito limpa, misturar e dividir em vidrinhos. Se a ampola de GA for a 70%, misture 10 ml GA em 340 ml de tampo; Se a ampola de GA for a 50%, misture 10 ml GA em 240 ml de tampo; Se a ampola de GA for a 25%, misture 10 ml GA em 115 ml de tampo. Estocar em vrios vidrinhos de tamanhos diversos (10 ml, 20 ml, 40 ml) e deixar rotulado (nome, data, pessoa que fez a soluo), no congelador. Observao: tinha na se no for diluir todo o o glutaraldedo muito que e

ampola,

deve-se

vedar

frasco

bem

colocar no congelador, rotulado. Porm, uma vez aberta a ampola, sempre melhor diluir todo o seu contedo e

estocar o glutaraldedo j a 2%.

PROCE-ME 1.1.4. FIXAO DE FRAGMENTOS DE TECIDO POR GLUTARALDEDO

Descongelar

os

vidrinhos

de

glutaraldedo,

imediatamente antes da cirurgia, aquecendo-os apenas com o calor da mo. Colocar os fragmentos em vidrinhos contendo glutaraldedo a 2% em tampo fosfato 0,15M, pH 7,2, e

deixar por 2 horas, temperatura ambiente. Se o material for usado para o estudo das fibras do sistema elstico deve-se dissolver 0,1% de cido tnico na soluo fixadora de glutaraldedo 2%, na hora de usar,

para aumentar o contraste. Em todo caso, deve-se sempre fixar fragmentos com e sem cido tnico. O fragmento a ser fixado deve ter um dos lados com 1 mm de espessura, para permitir a penetrao do fixador. Aconselha-se a cortar o material na forma de um palito de cerca de 3 a 5 mm de comprimento, 1 mm de lagura e 1 mm de espessura. Aps as duas horas, cada minuto a mais que o material ficar no fixador, s contribui para piorar sua qualidade; assim sendo essencial que ele seja submetido rotina de fixao (lavagem, tratamento pelo tetrxido de smio,

seguido de lavagem e colocao no acetato de uranila: ver ROTINA DE FIXAO). Se por acaso, o material for entregue ao Laboratrio no final da tarde e na impossibilidade de algum ficar por cerca de 1 hora a mais para seguir a rotina at o acetato de uranila, ento deve-se esperar completar as duas horas de fixao, lavar em soluo de lavagem por um minuto e deixar em soluo de lavagem por, no mximo, 40 horas,

tendo-se o cuidado de retomar o quanto antes a rotina de fixao.

PROCE-ME 1.1.5. FIXAAO DE CULTURA DE CLULAS

Tratar cada garrafa ou tubo de cultura com 2,0 ml de EDTA 0,02% em PBS, por tempo suficiente para descolar a monocamada. Colher a suspenso de clulas num tubo de ensaio, tipo "Ependorff" ou similar, centrifugar a baixa rotao para formar um "pellet". A centrifugao deve ser feita por 4 minutos a ponto da centrfuga CELM, cerca de 200 a 500 giros por minuto. Escoar o sobrenadante. Ressuspender, adicionando glutaraldedo 2% em tampo fosfato; com delicadeza, deve-se descolar o "pellet" das paredes do tubo; deixar no fixador por 5 minutos. Centrifugar novamente e seguir as demais etapas da rotina de fixao.

1.1.7. APROVEITAMENTO PARAFINA

PARA

ME

DE

PEAS

INCLUDAS

EM

Desbastar o bloco, retirando o mximo de parafina. Escolher a regio que vai ser includa para microscopia eletrnica. Com um bisturi, separar a regio escolhida do resto do bloco. Deixar overnight no xilol para dissolver a parafina. No dia seguinte, recortar para o tamanho adequado para Microscopia eletrnica e hidrat-lo, segundo a bateria a seguir: 1 banho de lcool 100 por 15 minutos. 1 banho de lcool 95 por 15 minutos. 1 banho de lcool 70 por 15 minutos. pos a hidratao, lavar em soluo de lavagem. Colocar no glutaraldedo a 2% em tampo fosfato. Seguir a rotina de fixao, desidratao e incluso.

PROCE-ME

1.2. TETRXIDO DE SMIO

Fazer uma soluo-me de tetrxido de smio a 4% (1,0 g de smio para 25 ml de gua deionizada). Para isto: Lavar bem a ampola de tetrxido de smio, com Extran,

lavar em gua corrente por 3 minutos (ou deixar de molho por 4 horas em soluo sulfocrmica e lavar por 1 hora em gua corrente). Passar por gua deionizada e deixar secar. Colocar 10 ml de gua deionizada no frasco onde ser feita a soluo-me, de colocar de a ampola dentro e quebr-la 15 ml de com gua

auxlio

basto

vidro.

Acrescentar

deionizada. No filtrar (deixar a ampola quebrada dentro do frasco). Colocar na geladeira e s usar no dia seguinte, quando

dever estar totalmente dissolvido. A soluo de tetrxido de smio deve ser guardada na

geladeira na seguinte embalagem: Dentro de um vidro coberto com papel alumnio, com tampa fechada com fita crepe e coberta com papel alumnio;

colocar este vidro dentro de uma embalagem hermtica. Rotular (nome, quantidade, data e quem fez a soluo). Sempre que usar, marcar quem usou, quantidade e data.

Soluo de trabalho de tetrxido de smio: Na hora de usar, preparar soluo de tetrxido de smio a 1%, diluindo a soluo-me 1:3 em soluo de lavagem.

PREPARO DA SOLUO DE LAVAGEM: NaCl.....................6,0 g Sacarose................73,0 g

PROCE-ME gua destilada......... completar para 1 litro GUARDAR NA GELADEIRA Verificar lavagem. se no tem fungo antes de usar a soluo

de

1.3. ACETATO DE URANILA PARA FIXAO

Fazer uma soluo me de acetato de uranila a 3% (3 g de acetato filtrar. Estocar sempre em vidro com tampa de rosca; no usar tampa de vidro para evitar contaminao. Guardar rotulado. na geladeira envolvido por papel alumnio e de uranila em 100 ml de gua deionizada). No

Soluo de trabalho de acetato de uranila para fixao: Na hora de usar, diluir a soluo-me para 1%, misturando 2 ml soluo de lavagem e 1 ml de uranila a 3%.

1.4. ROTINA DE FIXAO

Fazer toda a manipulao dentro da capela 1) Deixar o material na soluo fixadora de glutaraldedo 2% em tampo fosfato sdio-potssio 0,15M, pH 7,2, temperatura ambiente por 2 horas; jogar o fixador em um vidro de descarte de glutaraldedo. 2) Lavar 3 vezes em soluo de lavagem: tempo total de 1 minuto; jogar a soluo de lavagem usada no vidro de descarte de glutaraldedo.

PROCE-ME

10

3) Para cada vidro com material colocar 2 ml de soluo de tetrxido de smio a 1% e deixar 1 hora na geladeira. Jogar o descarte em um vidro de smio usado. 4) Lavar trs vezes em soluo de lavagem, 1 minuto cada lavagem, colocando o descarte num vidro de smio usado. 5) Para cada vidro com material colocar 2 ml de soluo de acetato de uranila a 1% e deixar "overnight" na

geladeira. 6) Lavar trs vezes em soluo lavagem.

2. DESIDRATAO E INCLUSO

Este processo deve ser feito em um nico dia, no podendo ser interrompido em nenhuma etapa. A incluso pode ser feita em diversos tipos e marcas de resina e o procedimento para a desidratao varia de

acordo com a resina. As resinas ficam estocadas na geladeira juntamente com o xido de propileno e devem ser retiradas da geladeira duas horas antes do uso. Enquanto o material est na estufa em resina pura, colocar resina nas forminhas prprias para incluso, de maneira a encher totalmente a barquinha. Neste vegetal momento, (ou coloque tambm com o um pedacinho do de papel do

manteiga)

nmero

registro

material; escrever com tinta nanquim ou lpis. Deixar temperatura ambiente. Retire os frascos da estufa e, com o auxlio de um palito de dente, retire o material e coloque-o nas forminhas na posio adequada (de acordo com a orientao desejada).

PROCE-ME Aps a polimerizao retirar os (ver blocos o da tempo para cada como tipo se

11 de

resina),

forminha

fossem

cubos de gelo; se estiverem grudados, deixe de um dia para outro temperatura ambiente. Se os blocos estiverem

grudando sempre, passe um pouco de silicone na forminha antes de colocar a resina. Arquive os blocos que no sero cortados imediatamente.

PROCE-ME 2.1. 6005 DESIDRATAO, INFILTRAO E INCLUSO COM

12 ARALDITE

2.1.1. Desidratao 1 banho de acetona 30, por 10 minutos 1 banho de acetona 70, por 10 minutos 1 banho de acetona 95, por 10 minutos 2 banhos de acetona 100, de 10 minutos cada 2 banhos de xido de propileno, de 15 minutos cada

2.1.2. Preparao do Araldite 6005 Quando o material estiver no primeiro banho de xido de propileno, prepare a resina. Esta receita d para a incluso completa de 4 frascos

contendo material a ser processado. 10 g de Araldite 6005 9,0 g de DDSA (plastificador) 0,46 ml de BDMA (endurecedor)

2.1.3. Infiltrao do Araldite 6005 Preparar uma soluo de resina diluda em xido de

propileno, na proporo de 1:2, em quantidade suficiente para colocar-se 2 ml desta soluo em cada frasco contendo material. Colocar esta soluo nos frascos contendo material e

deixar durante 30 minutos no girador. Aps este tempo, retire a soluo 1:2 e coloque 2 ml de soluo de resina diluda em xido de propileno, na

proporo de 1:1, em cada frasco. Deixar no girador por 2 horas. Aps as duas horas, retirar a soluo de resina diluda em xido de propileno e colocar cerca de 2 ml de resina pura,

PROCE-ME

13

em cada frasco de material. Deixar 40 minutos na estufa 58C. Incluir o material(Ver tem Desidratao e Incluso). Manter na estufa 58/60, por 72 horas, antes de cortar.

2.2. DESIDRATAO, INFILTRAO E INCLUSO EM RESAPOL

2.2.1. Desidratao 1 banho de acetona 30, por 10 minutos 1 banho de acetona 70, por 10 minutos 1 banho de acetona 95, por 10 minutos 2 banhos de acetona 100, de 10 minutos cada

2.2.2. Preparao do Resapol Fazer uma soluo que contenha 80% de Resapol 8001 (duro) e 20% de Resapol T208 (mole). Adicionar perxido de

benzoila anidro, na proporo de 0,5 g para cada 100 ml de resina. Fazer uma quantidade de Resapol que seja suficiente para colocar em cada frasco 5,5 ml de soluo at a fase

overnight e 0,4 ml de resina pura por bloco.

2.2.3. Infiltrao e Incluso em Resapol Colocar nos frascos com o material as seguintes solues, nesta ordem: Soluo de Resina Resapol + acetona (1:3), por 30 minutos Soluo de Resina Resapol + acetona (1:1), por 30 minutos Soluo de Resina Resapol + acetona (3:1), por 30 minutos Resina Resapol pura, na estufa a 55, por 12 horas. Incluir o material (Ver tem Desidratao e Incluso)

PROCE-ME

14

Deixar 3 a 4 dias na estufa 60 para endurecer, antes de cortar.

PROCE-ME 2.3. DESIDRATAO, INFILTRAO E INCLUSO EM MEDCAST

15

2.3.1. Desidratao 1 banho de acetona 30, por 10 minutos 1 banho de acetona 70, por 10 minutos 1 banho de acetona 95, por 10 minutos 2 banhos de acetona 100, de 10 minutos cada 2 banhos de xido de propileno, de 15 minutos cada

2.3.2. Preparao do Medcast Misturar nesta ordem: Medcast (resina)..........11,9 g (equivalente a 9,8 ml) DDSA (plastificador).......2,3 g (equivalente a 2,4 ml) NMA (endurecedor).........10,1 g (equivalente a 0,3 ml) DMP-30 (acelerador)........0,4 g (equivalente a 0,4 ml)

2.3.3. Infiltrao e Incluso em Medcast Colocar nos frascos contendo material uma mistura de xido de propileno e resina Medcast, na proporo de 1:1. Deixar por 1 hora, no girador. Em seguida, dar 2 banhos de resina Medcast pura, com a durao de 30 minutos cada, no vcuo. Incluir o material (Ver tem Desidratao e Incluso) Deixar 3 a 4 dias na estufa a 60, antes de cortar.

2.4. DESIDRATAO, INFILTRAO E INCLUSO EM ARALDITE CY205

2.4.1. Desidratao: 1 banho de acetona 30, por 10 minutos 1 banho de acetona 70, por 10 minutos

PROCE-ME 1 banho de acetona 95, por 10 minutos 2 banhos de acetona 100, de 10 minutos cada 2 banhos de xido de propileno, de 15 minutos cada.

16

2.4.2. Preparao do Araldite CY-205: Araldite CY-205...........10 g DDSA........................8 g DMP30......................0,6 ml Dibutil fitalato.........0,035 ml Misture na seqncia acima e coloque para homogeinizar na batedeira em rotao lenta (em torno de 30 ac.volts),para que no se formem bolhas. Esta receita suficiente para a incluso de seis

vidrinhos contendo material.

2.4.3. Infiltrao e incluso em Araldite CY-205: Colocar o material em uma mistura (1:1) de resina e xido de propileno e deixar no girador por 2 a 3 horas

temperatura ambiente. A sguir, retirar a mistura anterior dos vidrinhos, colocar resina pura e colocar na estufa a 37, por 1 hora. Retirar da estufa e incluir o material nas barquinhas (ver tem Desidratao e Incluso). Deixar na estufa a 60, por 72 horas.

3. MICROTOMIA

3.1. FAZER FACAS DE VIDRO NO KNIFE-MAKER LKB

3.1.1. Corte do retngulo maior:

PROCE-ME Lavar os vidros com detergente neutro (nunca

17 segur-lo

pelas laterais) e secar com leno de papel. O ngulo do Knife-maker deve estar entre 90 e 100 para que sejam obtidas facas de 50 graus, que so as que se usam normalmente para microtomia. Colocar o vidro do inteiro no para Knife cima, Maker o vidro que com o lado estar o na

serrilhado rente a e

fabricante bege de

deve

chapa a

plstico direita

(A), da

determina estar

ngulo, mesma

extremidade do

faca

deve

direo do

pontinho (B) no prprio Knife Maker do vidro (C). Nesta fase o boto

direita

suporte

seletor (1) acima do riscador deve estar nos risquinhos. Baixar a braadeira de presso (2) atravs da alavanca (3) fazendo uma leve presso segurando-a para no dar tranco sobre o vidro. Puxar o riscador (4), e girar o boto preto (5) para fazer presso at que se possa observar uma "barriguinha" no

interior do vidro; esperar; cortar e separar o retngulo em dois menores.

3.1.2. Obteno dos losangos Colocar um dos retngulos menores de vidro rente a chapa (A); conforme descrito do anteriormente, vidro deve estar do sendo que a no

extremidade primeiro

esquerda de

encostada

pininho

metal

esquerda

riscador (4) e

seguir normalmente como descrito anteriormente at que os losangos estejam prontos.

3.1.3. Obteno das facas Os losangos obtidos devem ser colocados no Knife Maker:

PROCE-ME

18

a) com o lado serrilhado do fabricante para baixo, e os 2 pontos observados no vidro do lado que foi cortado devem estar para cima, para esquerda e para frente. b) o boto seletor 25. c) a escala atrs do vidro deve estar sempre no 2. d) Encaixe do losango: prender o boto (6) que est na lateral do aparelho baixar a braadeira de presso (2) puxar o riscador (4) girar o botozinho de escala (35,45,55) (6) at final. fazer presso com boto preto (5) at que se possa (1) acima do riscador, deve estar no

observar a formao de "barriguinha" no vidro, o barulho que indica que o vidro quebrou deve ser seco e oco.

3.2. DESBASTAR O BLOCO

Primeiramente bloco.

deve-se

desbastar

excesso

de

resina

do

Para isto pode-se usar o piramitomo ou ento, prender o bloco no ultramicrtomo e apar-lo com uma gilete.

3.2.1. USO DO PIRAMITOMO PARA DESBASTAR O BLOCO Regras Gerais: Travar (LOCKED) 41, cada vez que for mexer nos

parafusos. Quando comear a aparecer vermelho na janela (33),

travar e com o 40 voltar tudo at o branco total. - Aps trimar cada face, recuar o brao pora-bloco; para isto, zerar a escala de espussura, travar o brao e voltar com o 40.

PROCE-ME Procedimento:

19

No caso do material ser pequeno, e portanto estar sobrando muita resina ao seu redor, antes de colocar no piramitomo, dar uma debastada com a serra ou lima retirando a resina ao redor do material e tambm da superfcie. Colocar o bloco no suporte do piramitomo (20) e prender bem, apertando os trs parafusos. Colocar o suporte na pea 22 do piramitomo. Colocar a faca de vidro (17) na pea 14 e olhando na lupa, acertar o fio da faca no eixo X. Aproximar a faca soltando alavanca 13, e empurrando todo o suporte (12) colocar a escala em 90 do lado esquerdo do aparelho. Dessa maneira expe-se o material a ser cortado. Colocar o 29 na posio indicada pelo diagrama mexendo o ltimo parafuso (30). Comear a cortar com a manivela 42, acertando a micragem desejada no pino da direita (39). Aproximar e cortar at chegar na pea. Afastar a faca. Acertar o cabeote com desenho da base menor na marca da esquerda. Para fazer as bases e os lados colocar sempre o suporte no 60 do lado esquerdo do aparelho. Faca a 60. Aproximar e cortar at que entre base maior e menor tenha 0,3 mm no aumento I (escala na objetiva da esquerda). Acertar cabeote com desenho de um dos lados de pirmide na marca da esquerda. Faca a 60. Aproximar e cortar at chegar bem perto da pea. Afastar a faca.

PROCE-ME

20

Mudar cabeote para a posio com o desenho do outro lado da pirmide na marca da esquerda. Ver esquema no interior da tampa do aparelho (38). Aproximar e cortar at chegar bem perto da pea e medir na escala, deixando entre um lado e outro 0,6 mm tomando por referncia a base maior (aumento 1 X). Afastar faca, retirar faca, retirar bloco, escovar

aparelho, desligar luz e cobrir o aparelho com o plstico.

3.2.2. USO DO ULTRAMICRTOMO PARA DESBASTAR O BLOCO Acoplar o bloco no suporte apropriado para blocos do

ultramicrtomo e, olhando na lupa, aparar a superfcie e as laterais com uma gilete.

3.3. OBTENO DE CORTES SEMI-FINOS So cortes de cerca de 1 a 2 m, tambm chamados de cortes grossos, e podem ser obtidos tanto no ultramicrtomo como no piramitomo.

3.3.1. NO PIRAMITOMO Coloca-se o bloco de maneira apropriada para cortar-se a superfcie, calibrar para cortes de 2 m e cortar. Colocar o corte na superfcie de gua destilada em uma cuba; o corte vai esticar. Juntar cerca de 4 a 5 cortes e colh-los mergulhando uma lmina sob os cortes; arrum-los com o auxlio de um pincel fino. Secar rapidamente a

lmina em chapa aquecida ou na estufa. Est pronta para a colorao.

PROCE-ME 3.3.2. NO ULTRAMICRTOMO

21

Acopla-se o bloco no suporte do ultramicrtomo e procedese microtomia, obtendo-se cortes esverdeados (cerca de 2 m). Os cortes cairo automaticamente na gua da barquinha acoplada prpria faca de vidro utilizada no ultramicrtomo. Com auxlio de uma ala de platina ou de um pelo duro (clio ou cabelo de japons) na ponta de um palito, colher os cortes em uma lmina. Secar e corar.

4. COLORAO DE CORTES SEMI-FINOS

Soluo

corante:

Azul

de

Toluidina

0,25%

em

soluo

aquosa de borato de sdio a 1% Preparo da Soluo: 1 g de Toluidina 4 g de Borato de Sdio 4 ml de lcool absoluto 400 ml de gua destilada Dissolver absoluto. Dissolver destilada. Misturar as 2 solues e filtrar. 4 g de borato de sdio em 400 ml de gua 1 g de Azul de toluidina em 4 ml de lcool

PROCE-ME Procedimento para colorao:

22

FRIO: Colocar 1 gota sobre os cortes (que devero estar sobre uma lmina de vidro) e deixar corar por cerca de 1 minuto. Lavar em gua destilada. Secar no papel de filtro. QUENTE: Colocar 1 gota sobre os cortes, aquecer na chapa rapidamente at formar um halo metalizado. Lavar em gua destilada. Secar no papel de filtro. Se quiser, pode montar a lmina com lamnula e resina de montagem.

5. OBTENO DE CORTES ULTRAFINOS (ULTRAMICROTOMIA)

Aparar

bloco

de

modo

conter

local

desejado

na

superfcie de corte. Colocar o bloco no porta-espcime e fix-lo no brao do ultramicrtomo. Colocar a faca (de vidro ou de diamante) no suporte. Verificar suporte da o grau faca: de para inclinao facas de na escala deve ao lado do

vidro

marcar

dois

traos a partir do zero e para facas de diamante deve-se seguir as instrues do fabricante da faca que esto na sua embalagem. Colocar gua destilada na barquinha da faca, acertando a quantidade de gua at obter uma superfcie espelhada em funo do ngulo de iluminao. Procure obter o mximo de superfcie espelhada

PROCE-ME

23

Para

aproximar na

faca

em do

relao bloco;

ao

bloco, isto

procure

o o

reflexo

superfcie

para

movimente

bloco e desloque a fonte de luz. Aproximar a faca lentamente em relao ao bloco,

utilizando sempre a lupa, at o reflexo na superfcie do bloco desaparecer. Procurar de novo a maior superfcie espelhada possvel na gua e cortar. Desprezar os primeiros cortes. Os cortes devero sair em tiras, de cor prateada. Pescar mais ou menos 4 a 5 cortes com o auxlio de uma pina em uma tela de cobre, coberta pelo Parldio (Ver PREPARO DAS TELAS). A faca de diamante s deve ser usada para quem j tem prtica em usar faca de vidro.

6. COLORAO DOS CORTES ULTRAFINOS

6.1 PRERARO DA SOLUO DE URANILA Uranila................0,4g Etanol 70%.............20 ml Estocar em geladeira.

6.2. PREPARO DA SOLUO DE REYNOLDS

PROCE-ME

24

Coloque num bquer limpo 500 ml de gua destilada e deixe ferver at chegar a 250 ml; deixe esfriar um pouco at ficar morna. Num balo volumtrico contendo 1,76 g de citrato de sdio e 1,33 g de nitrato de chumbo, colocar 30 ml de gua morna e agitar na mo por 30 minutos. Esta soluo dever ficar leitosa. Colocar 8 ml de NAOH 1,0N (preparada no momento do uso) e a soluo ficar transparente. Completar com

gua at 50 ml. Agitar sem fazer bolhas e medir o pH, que deve ser cerca de 12 ou 13. Guardar temperatura

ambiente; quando comear a ficar turvo jogar fora e fazer outro; antes de desprezar, precipitar o chumbo com algumas gotas de cido actico glacial.

PROCE-ME

25

6.3. PROCEDIMENTO PARA COLORAO Ateno: os cortes devem estar secos e tomar cuidado para no respirar sobre as telas. 1) Corar com uranila 2% em etanol 70%. Colocar numa placa de Petri parafinada uma gota da soluo de uranila para cada tela e enfiar a telinha na gota de maneira que fique coberta. Deixar 30 minutos no escuro. 2) Pegar a tela com uma pina e sobre um bquer ir

pingando gua destilada com uma pinseta, por cerca de 40 segundos. Isto deve ser feito pingando-se a gua sobre a pina de maneira que ela escorra da pina para a tela. 3) Deixar secar cerca de 5 minutos numa placa de Petri forrada com papel de filtro e tampada. 4) Corar com citrato de chumbo (soluo de Reynolds). Para isto, proceder como com a soluo de uranila,

deixando a tela mergulhada em uma gota de Reynolds por 15 minutos. A placa de Petri onde faz-se a colorao pelo chumbo deve conter umas 20 pastilhas de NaOH para absorver o CO2. 5) Como no caso da uranila, lavar as telas sobre um bequer durante cerca de 40 segundos. Ao final, colocar o bequer na pia e deixar escorrer

bastante gua. 6) Deixar as telas secarem em placa de Petri tampada por 30 minutos e carboniz-las.

PROCE-ME

26

4. CARBONIZAO

4.1. Uso do carbonizador (ou evaporador) 1) Apontar os carbonos e alinhar os suportes. Verificar a mola que pressiona os eletrodos para que as pontas dos carbonos estejam em contato. 2) Ligar a chave geral na parede 3) Ligar a gua 4) Colocar a vlvula 2 vias para cima 5) Ligar o marcador de tempo (Voltar o boto at zerar o timer) 6) Ligar a bomba mecnica (na segunda chave da esquerda

para a direita). Esperar 3 minutos. 7) Voltar com a vlvula 2 vias para a posio preliminar.

Esperar 5 minutos. 8) Colocar a vlvula 2 vias em vcuo bomba 9) Ligar a bomba difusora e esperar 2 a 3 minutos 10) Abrir vlvula alto vcuo 11) Ligar o vacumetro de vcuo preliminar e esperar

chegar no final da escala (seta verde) 12) Ligar o vacumetro de alto vcuo e esperar marcar

entre 10 -4 e 10 -5 na escala de cima (seta verde). At aqui gasta-se cerca de 45 minutos. 13) Desligar os dois vacumetros 14) Colocar o seletor em 2 15) Ligar a voltagem (Volt)

PROCE-ME

27

16) Girar lentamente o variador de voltagem at o n 32 e esperar sombra. 17) Desligar o variador de voltagem (girando rapidamente) 18) Desligar a voltagem 19) Voltar o seletor para o 0 20) Fechar a vlvula de alto vcuo 21) Desligar a bomba difusora e esperar 25 minutos 22) Colocar a vlvula 2 vias em preliminar 23) Desligar a bomba mecnica 24) Apertar o boto de entrada de ar (rapidamente no at a marca do carbono ficar semelhante da

incio e mais lentamente depois) at parar o barulho de entrada de ar. 25) Tirar a campnula, com cuidado para no bat-la nos suportes do carbono. 26) Desligar o marcador de tempo 27) Desligar a chave geral 28) Esperar 20 minutos e fechar a torneira da gua.

PROCE-ME

28

5. PREPARAO DAS TELAS:

5.1. LAVAGEM DE TELAS As telas utilizadas em microscopia eletrnica podem ser novas ou reaproveitadas e devem ser processadas da

seguinte maneira: Tela nova: Passar pela acetona 5 minutos e secar em papel de filtro

em placa de Petri. Deixar na estufa 1O minutos.

Tela reaproveitada: Ferver as telas a serem reaproveidas em Extran 2%. Colocar no Ultrasom, durante 5 minutos. Lavar bem em gua corrente. Colocar em amonaco 10% no ultrasom, durante 3 minutos. Lavar uma vez em gua corrente e duas vezes em gua

destilada. Passar em acetona pura, por uma vez. Secar em papel filtro na placa de Petri a 60 C, por 10 minutos.

5.2. COBERTURA DAS TELAS COM PARLDIO

No colocar os dedos no Parldio para no engordur-lo; pegar com luvas ou pinas.

PROCE-ME

29

Num frasco de vidro com tampa colocar: Parldio................................... 1 g Acetato de amila anidro (geladeira)........ 5O ml Ateno: quebrar as tiras deparldio sem contacto manual. Deixar de um dia para o outro para dissolver. Separar em frasquinhos de 5ml e deixar a temperatura ambiente. ATENO: o PARLDIO no pode ser jogado na pia. No dia de cobrir as telas com a pelcula, se for faz-lo na sala do microscpio da sala (no eletrnico, esquecer de desligar desligar o o ME ar e

condicionado

deixar o deumidificador ligado). A umidade relativa do ar dever estar em torno de 50%. Na capela da sala do ME, colocar dentro de uma bandeja de plstico um pirex com gua at a boca (at transbordar). Com uma fonte de luz ver se a gua est suja e limp-la passando um papel de limpeza de lentes (lens clean paper) sobre sua superfcie. Com uma pipeta Pasteur de ponta boa colocar uma gota de parldio na gua (desprezando as primeiras gotas na

bandeja). Na superfcie da gua vai se formar uma pelcula de parldio. Observe que a tela tem duas faces: uma brilhante e uma fsca. Entortar a tela ligeiramente, com auxlio de uma pina, de modo a fazer uma concavidade do lado brilhante. Colocar cerca de dez telas com o lado fosco em contato com a pelcula. Cobr-las com um pedao de Parafilm e com uma pina mergulhar as bordas do Parafilm de modo que o

PROCE-ME

30

parldio recubra todo o permetro do Parafilm. Puxar na direo da pessoa, de uma s vez, tirar sem gua e sem encostar no pirex. Evitar contaminar a gua com os dedos. Em uma placa de Petri com papel de filtro, colocar o

Parafilm para baixo, as telas para cima. Deixar secar at o dia seguinte, temperatura ambiente, coberto com tampa. Verificar se a pelcula est boa, olhando as telas no ME. Se quiser pelcula mais grossa, colocar 2 gotas de

PARLDIO na gua do pirex, em vez de uma s.

6. MTODO DA GOTA INVERSA PARA IMUNO-MARCAO DE ANTGENOS BACTERIANOS EM PREPARADOS TOTAIS

6.1. SUPORTE: - Montar uma cmara mida, contendo um suporte de papel parafilm ou parafina. Utilizar telas com de cobre de de "300 mesh" previamente

recobertas empregar

pelcula

formvar-carbono. Recomenda-se em gua destilada) como

Bacitracina

(0,01ug/ml

agente umectante. Empregar pinas e vidraria de boa qualidade, limpas,

pipetas descatveis e tubos Ependorff estreis.

PROCE-ME

31

6.2. SUSPENSES:

6.2.1. Bacteriana - Partir de uma suspenso de bactrias padronizadas por mtodo imunolgico (por exemplo Imuno DotBlot). Para o H. influenzae, utilizou-se uma densidade ptica

(DO) = 0,25 p/ 540nm, aps a diluio em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.2. Antissoro - Determina-se anteriormente a concentrao tima para se obter melhor para pelo ttulo, que soro por os mtodo stios imunolgico antignicos a de (Imunno estejam diluio fmbria

DotBlot), saturados 1:100 do

todos

policlonal. (sub-unidade

Empregou-se proteica

anti-25kD

bacteriana) em PBS 0,1M, pH 7,2.

6.2.3. Proteina A-Au (Sigma): Empregou-se a diluio 1:50 do complexo numa soluo

contendo BSA 1,0% em PBS 0,1M de pH 7,2 (nesta diluio o Au est em excesso e capaz de saturar, todos os stios Fc das Imunoglobulinas).

6.2.4. Soluo para contrastao Soluo de slico-tungstato de sdio (SST) a 1,0% em gua de pH 6,4 at 7,2.

PROCE-ME

32

6.3. PROCEDIMENTO

1)

Colocar e

uma sobre

gota ela

(40ul) uma

da

suspenso (filme o

bacteriana para

no a

suporte

tela

voltado

suspenso)

durante

30

minutos retirar

temperatura excesso com

ambiente papel de

(aproximadamente filtro;

25 o C);

2) Em seguida, colocar a grade sobre uma gota (10ul) antissoro temperatura especfico ambiente diluido, durante 60 minutos retirar

do o

(aproximadamente

25o C);

excesso com papel filtro; 3) Colocar imediatamente a grade sobre uma gota (10ul) da suspenso de Protenas A-Au diluida 1:50, durante 20

minutos temperatura ambiente (aproximadamente 25oC). 4) Lavar a preparao com PBS 0,1M de pH 7,2 durante 1 minuto, empregando-se um jato suave de pipeta Pasteur e logo em seguida com um jato suave de gua bidestilada ou deionizada durante 1 minuto. 5) Contrastar 7,2. Obs: A contrastao opcional uma vez que esta promove a remoo das partculas de ouro. 6) Recobrir com carvo e observar ao M.E. pelo slico-tungstato de sdio 1,0% de pH

GUIA-TP

X. GUIA DE TRABALHOS PRTICOS

GUIA-TP

ATIVAO ESPERMTICA, REAO DO ACROSOMA E FECUNDAO IN VITRO.

a) Obteno e manuseio de gametas in vitro Superovulao Injetam-se fmeas adultas de hamster com 25 u.i. de PMSG (Pregnant mare's Serum Gonadotropin) no dia de postestro (Orsini, 1961) e com 25 u.i. de HCG (Human Chorionic Gonadotrophin) na tarde do 3 dia aps a descarga de post-estro. As fmeas so sacrificadas por deslocamento cervical entre 12 e 16 horas aps a injeo de HCG. Procede-se a uma laparotomia atravs da linha medioventral, rejeitando as alas intestinais para um lado e expondo-se a via genital feminina. Uma vez isolados, os ovidutos so postos em uma placa de cultura de tecido contendo BMOC - 2 ou BWW (meios de cultura). Com um par de pinas de relojoeiro rompe-se a ampola do oviduto para que saiam os ovcitos com clulas do cmulo. Tambm pode-se lavar o oviduto com o mesmo meio usando uma seringa com agulha N 30 e de ponta romba. Se os vulos so recm ovulados, coloca-se a agulha na extremidade uterina do oviduto, porm se so passadas 24 horas ou mais aps a ovulao faz-se a lavagem desde a fmbria.

b) Remoo das clulas foliculares Prepara-se uma soluo de hialuronidase a 0,01% em BMOC2 na qual se colocam as massas do cmulo. Ao cabo de

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poucos minutos pode-se observar ao microscpio de contraste de fase que os ovcitos se desnudam das clulas foliculares. Os ovcitos devem ser manipulados com pipetas de vidro de 5 cm de comprimento e cujo dimetro distal no ultrapasse 0,2 a 0,3 mediante uma chupeta Com ajuda da pipeta ovos fecundados so mm. Pode-se usar a pipeta acionada (fig. 2) ou com a boca. com pouco fludo, os ovcitos ou colocados em uma lmina com dois

fios de parafina-vaselina paralelos. Coloca-se a lamnula sobre os fios de parafina, tendo cuidado para que a gota no se desloque para um dos extremos. Comprimem-se suavemente os fios de parafinavaselina, obtendo-se entre lmina e lamnula uma cmara de altura adequada para a observao (recomenda-se uma altura de 20 a 40 um). c) Obteno dos espermatozides Machos adultos de fertilidade comprovada so sacrificados por deslocao cervical. Com uma inciso mdio-ventral expem-se os testculos e respectivos epiddimos. Com um par de tesouras corta-se a poro mais caudal do epiddimo, evitando contamin-lo com sangue e logo coloca-se em uma placa de Petri contendo o meio de cultura cobrindo-se com azeite seguida, juntam-se 0,2 a 0,3 ml de meio de permitir a disperso dos espermatozides. min retiram-se os epiddimos ficando s a mineral. Em cultura para Aps 5 a 10 suspenso de um de de

espermatozides. Calcula-se a concentrao com hemocitmetro e ajusta-se para que na soluo incubao fique 106 espermatozides/100 microlitro meio. d) Capacitao dos espermatozides

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Incubam-se 10 4 espermatozides/1 ml de soro sanguneo (ver mais adiante) a 37 0 C por 3 ou 4 horas em uma placa de cultura. Cobrir com azeite mineral. Ao cabo desse tempo pode-se examinar os espermatozides com o microscpio de contraste de fases para avaliar a ativao e reao do acrosoma (ver Barros, 1974). e) Inseminao artificial Fmeas induzidas a ovular ou superovular so anestesiadas com Avertina, Nembutal ou ter e, atravs de uma inciso mdio-ventral, injetam-se nos cornos uterinos 0,2 ml de uma suspenso de espermatozides (2 epiddimos para 4 cornos uterinos). Em seguida liga-se o corno uterino cranialmente da entrada da agulha. Suturase o animal e, aos diferentes tempos desejados, obtm-se os ovos fecundados. Para uma maior segurana (no muita) convm inseminar umas 12 horas aps a injeo de HCG. f) Preparao do soro sanguneo 70oC Deixa-se coagular sangue humano obtido sem anticoagulante e depois o submete a centrifugao para a obteno do soro. Aquece-se em banho-maria a 70o C por 1 hora o soro obtido com a centrifugao. Passa-se este soro coagulado por homogenizador e centrifuga-se novamente a 15 000 rpm ( 27 000 g) durante 30 minutos. Obtm-se um sobrenadante fludo que, depois de ser esterilizado por filtrao, pode ser envasado em alquotas de 1cc a -40 o C. Uma vez descongelado, o soro s deve ser usado uma nica vez. g) Fecundao "in vitro"

GUIA-TP

Espermatozides capacitados (ver tem d) so utilizados para inseminar ovcitos "in vitro". O tempo de incubao durante o qual ficaro ambos os gametas depende do estgio da fecundao que se deseja,. Ao trmino da incubao observa-se com o microscpio de contraste de fase. REFERNCIAS ORSINI, M.W. (1961) The external vaginal phenomena

characterizing the stages of the oestrous cycle, pregnancy, pseudopregnancy, lactation and the anestrous hamster Mesocricetus auratus, Waterhouse. Proc. Anim. Car. Panel 11: 193. BARROS, C. (1974) - Capacitation of mammalian spermatozoa. En Physiology and Genetics of Reproduction, part B, captulo 27 (E.M. Coutinho & F. Fuchs, eds). Plenum Publ. Corp., New York.

GUIA-TP

TRANSFERNCIAS EMBRIONRIAS EM COELHOS

1- COLETA DE OVOS a) Superovulao: As coelhas doadoras superovulam quando procede-se injeo de gonadotrofinas combinadas da seguinte maneira: Primeiramente faz-se uma injeo intramuscular ou subcutnea de 150 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotrophin). Aps 66 a 72 horas procede-se inseminao artificial (ou pareamento natural com dois machos frteis) e aplica-se uma injeo endovenosa de 50 UI de HCG. Um outro procedimento que tambm provoca a superovulao a aplicao de duas injees dirias intramuscular ou sub-cutnea, durante 3 dias, de 0,5mg de FSH (Hormnio Folculo Estimulante). No 4 dia proceder inseminao artificial (ou pareamento natural) e aplicar uma injeo endovenosa de no mnimo 1,5mg de LH por quilo de peso do animal. Consegue-se assim cerca de 40 a 60 ovulaes. A sobre-estimulao reduz a porcentagem de recuperao embrionria pois os estrgenos endgenos influem sobre o transporte atravs do trato genital feminino. Alm disto, alguns ovos permanecem nos folculos. A superovulao tambm pode ser induzida em fmeas imaturas, por exemplo nos coelhos brancos neo-holandeses as 12 semanas de idade e nas fmeas holandesas listradas as 16 semanas de idade.

GUIA-TP

Os animais doadores so sacrificados por deslocamento cervical ou por comoo cerebral, golpeando a nuca com um pau ou com a mo. Os ovos podem ser recuperados (colhidos) entre 40 e 50 horas "post-coitum" (aps pareamento); extraem-se os ovidutos que so colocados em placas de Petri esterilizadas e a seguir lavados com uma soluo fisiolgica estril e soro homlogo. Tambm podem ser colhidos ovos de coelhos anestesiados, insertando uma cnula no orifcio infundibular do oviduto e injetando-se lquido pelo vrtice do corno uterino: os embries devem ser contados e examinados (para poder-se distinguir anomalias grosseiras) com a ajuda do microscpio estereoscpico binocular. Os blastocistos uterinos tambm podem ser recolhidos in vivo. b) Manipulao dos ovos: Tipos distintos de solues tm sido utilizadas para manipular ovos incluindo a soluo de Krebs e a soluo de Ringer-Dale tamponada com fosfato contendo glicose. As pipetas de vidro e todo material utilizado para manipular ovos devem estar esterilizados e mantidos entre 30 e 37 o C, seja em uma platina trmica ou em uma incubadora. Os ovos devem ser manipulados em uma placa de cultura parcialmente fechada e isenta de luz ultravioleta; deve-se tambm evitar, na medida do possvel, exposio ao sol ou luz eltrica. Para exposies prolongadas, recomenda-se a luz vermelha, pois as menores exposies luz ultravioleta podem inibir a segmentao. c) Seleo dos ovos: As anormalidades estruturais dos ovos podem resultar de fatores citolgicos, genticos, do meio circundante ou patolgicos; os trs primeiros so aparentemente os responsveis pela variao no xito do armazenamento dos ovos. As anormalidades dos ovos

GUIA-TP incluem: aberraes de tamanho, forma granulao ou pigmentao citoplasmtica. e grau

7 de

2- ARMAZENAMENTO DOS OVOS a) Meios de armazenamento: A maior parte dos meios de armazenamento so compostos de soluo salina, soro, protenas e antibiticos. Por curtos perodos, a soluo fisiolgica (0,9% NaCl aquoso) mantm a tonicidade do ovo; porm no sendo tampo e no contendo os ons orgnicos no apresenta uma tima presso coloidoosmtica. As solues fisiolgicas se utilizam como: 1. lquidos para lavar o tracto genital, que mantenham a tonicidade do vitelo; 2. tampo que mantm limite de pH fisiolgico (entre 7,2 e 7,6); 3. meios inicos aquosos imprescindveis para o metabolismo celular. Os meios de armazenamento rotineiros contm entre 25 e 50% do soro de coelho. Soro de outras espcies tambm tm sido utilizados: os de cavalo, cachorro, cobaia, rato e porco so adequados para ovos de coelhos, enquanto que o soro do homem, ovelha, vaca, cabra e aves contm um fator ovicida. O soro congelado, o soro reconstitudo depois de liofilizado, liquor de blastocistos e a soluo de gema de ovo citratada, podem substituir o soro fresco. O sangue do coelho se obtm por puno cardaca ou da veia marginal da orelha. Assim obtido, permite-se coagular temperatura ambiente (durante 30 minutos) antes de ser centrifugado por 20 a 3000 rotaes por minuto. O soro decantado, centrifugado, filtrado atravs de um filtro milipore de 0,45 u e, em seguida, a este volume de soro adiciona-se igual fisiolgica estril. volume de soluo salina

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Tudo isto se mantm entre 3 e 4 oC. Recomenda-se a adio de 7% de gelatina ao meio de armazenamento: prepara-se um meio de gelatina a 14% dissolvendo 14 g de gelatina em 100 ml de soluo fisiolgica e autoclavando-o imediatamente para evitar crescimento bacteriano; a este meio logo se junta soluo de soro: salina na concentrao de 1:1 (quer dizer volume a volume). Depois de armazenar em gelatina a 7% a porcentagem de implantaes dos ovos de coelho ainda se mantm em 53% at 7 dias, porm transcorridos 14 dias vai declinando gradualmente at 3%. A sobrevida dos embries no afetada pelo armazenamento a baixas temperaturas quando a soluo contm 7,5 mg de estreptomicina, 4 mg de cloromicetina, 6,5 mg de paranomicina e 23,9 mg de penicilina por mililitro de meio lquido. Porm, concentraes mais altas de antibiticos so txicas para os ovos. b) Recipientes para o armazenamento: Os ovos so armazenados em tubos de vidro de 4 ml de capacidade com um dimetro interno salina fisiolgica e aos tubos com cuidadosamente usando de 8 mm. o soro so seringas uma pipeta A gelatina, a soluo medidos e transferidos estreis. Mistura-se de vidro com chupeta de

borracha. Tem-se que ter o cuidado de evitar que se formem bolhas de ar. Se os tubos so cheios completamente at a boca, a evaporao e condensao do meio no vai acontecer durante o armazenamento. Em um destes tubos podem armazenar-se entre 10 e 100 ovos. Tambm usam-se ampolas de vidro seladas que contenham 0,3 ml de meio e entre 10 e 15 ovos. c) Temperatura e durao do armazenamento: A temperatura tima para o armazenamento 10o C. O choque "a frigori"

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reduz a viabilidade embrionria e isto pode ser evitado por aclimatao, ou seja, um esfriamento lento. A velocidade do esfriamento de 0,01o C por minuto pode ser obtida colocando-se os tubos de armazenamento (que contm ovos) dentro de um banho de 20oC, que colocado em um esfriador que o mantenha a 10o C constante. Os ovos de coelho so armazenados sem que percam sua vitalidade por perodos maiores que qualquer outro ovo de mamfero. Est claro que os ovos de coelho diferem daqueles da maior parte das outras espcies no fato de que durante seu transporte ao longo do oviduto so recobertos por uma camada de mucina. Ainda que no haja nenhuma evidncia que demonstre isto, pode ser que esta camada de mucina proteja os ovos de coelho durante sua manipulao e armazenamento in vitro. Depois de 5 dias de armazenamento aparece um acentuado declnio na porcentagem de sobrevida dos ovos de coelho, porm possvel armazenar-se ovos com este mtodo e com grande xito at 14 dias. 3- TCNICA DE TRANSFERNCIA Os ovos tm que ser examinados microscpicamente antes de serem transferidos a uma receptora apropriada, s, e de fertilidade conhecida. O estadio do ciclo reprodutivo do animal receptor deve corresponder ao estadio do desenvolvimento do ovo. Por exemplo, se na transferncia o ovo tem dois dias de idade, o receptor ter que ser injetado intravenosamente com 20 U.I de hormnio gonadotrfico corinico (HCG) dois dias antes da transferncia. O receptor deve ser anestesiado e os ovos transferidos ao oviduto por meio de uma laparotomia medial ou por duas incises nos flancos. As incises nos flancos so as mais recomendadas porque mais fcil encontrar-se o oviduto e o animal sofre menos trauma. O tecido adiposo

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que rodeia a ampola levado para fora da cavidade corporal o que expe o ovrio e o infundbulo. Transfere-se entre 3 e 6 ovos ampola utilizando uma pipeta pasteur cujos bordos tenham sido arredondados pelo fogo e que mantenham um dimetro de 2 mm na ponta. O volume do fluido que acompanha o ovo ter que ser o mnimo possvel. conveniente evitar a deposio de grandes bolhas de ar no oviduto, apesar de que pequenas bolhas possam ser utilizadas para marcar a posio do ovo na pipeta. Para transferncia ao tero usa-se uma pipeta cujos bordos no tenham sido arredondados pelo fogo. Assim pode-se picar a parede do tero para a deposio do ovo em seu lmen. Para transferir blastocistos grandes utiliza-se uma pipeta maior (de 3 mm de dimetro na ponta) e torna-se necessria uma pequena inciso da parede uterina para passar essa pipeta to grossa; a inciso deve ser fechada com catgut aps a transferncia. Os animais receptores so laparotomizados 8 dias "post-coitum" para contagem do n de implantaes e, em seguida, sacrifica-se na data que tenha sido planejada pelo experimentador, antes do nascimento, para contar-se o n de fetos viveis. Nas fmeas prenhas em que se desejam, ou que se necessitam as crias, pode-se permitir a pario. Para laparotomias e cirurgia menores imprescindvel conhecer algumas tcnicas de anestesias e manter a esterilidade cirrgica. ANESTESIA Os estudos sobre coelhos freqentemente requerem procedimentos cirrgicos para os quais necessitamos de uma anestesia adequada. O pentobarbital sdico injetado via intravenosa razo de 30 mg por Kg/peso. Pode ser utilizado apenas o pentobarbital ou associao com ter. Um simples catter pode sua ser

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utilizado para injeo intravenosa (quer dizer um tubo de polietileno de 30 cm de comprimento unido a uma agulha em uma ponta e na outra extremidade uma seringa). O barbiturato e/ou o ter podem produzir colapso respiratrio e/ou convulses que provocam fraturas nas vrtebras ou nos membros. Conseqentemente tanto a propiopromazina como o diazepam em combinao com o paraldeido so recomendveis para anestesia geral. Podese usar um tranqilizante e o nembutal. Paraldedo 1 mg por Kg/peso pode ser injetado intramuscularmente ou intraperitonealmente. O lugar preferido para a injeo a regio cranial da coxa. Utilizam-se o reflexo conjuntival e o reflexo do belisco para ver a profundidade da anestesia. Quando a conjuntiva do canto medial do olho tocada com o dedo o movimento das plpebras indica que o animal ainda no alcanou o plano cirrgico de anestesia. Se as almofadas plantares dos ps e das mos forem beliscadas com as unhas, um movimento de flexo dos membros indica que o coelho no est convenientemente anestesiado. H variaes individuais quanto as raas que so responsveis pelas acentuadas diferenas no que diz respeito aos anestsicos. LAPAROTOMIAS Os receptores so anestesiados e laparotonizados atravs de uma inciso medial. Cortam-se os msculos subperitoniais ao mesmo tempo expondo os rgos viscerais, os ovrios e os ovidutos se localizam afastando os rgos para fora da cavidade. Deve-se manipular o mesosalpinx e no tocar no oviduto. Para fechar a cavidade abdominal deve-se reunir os bordos peritoneais e os msculos abdominais e suturar

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com catgut cromado (00). Os bordos da pele devem ser reunidos com clips metlicos.

4- TRANSFERNCIA DE OVOS A OUTRAS ESPCIES O ovo de uma espcie pode temporariamente estar armazenado no oviduto ou tero de outras espcies e logo transferido a um receptor apropriado. Porm os ovos de furo dividem-se e desenvolvem-se apenas no oviduto de coelho e os ovos de coelho no sobrevivem nem no oviduto nem no tero de furo. Os ovos ovinos de dois blastmeros vivem pelo menos cinco dias e se desenvolvem at o estadio de blastocisto no tracto genital do coelho. Esses ovos sobrevivem melhor no coelho do que quando armazenados durante trs dias in vitro a 7oC. Esse "incubador" pelo que tem sido demonstrado til para transportar ovos ovinos de um continente a outro. 5- CULTIVO DO EMBRIO Existem vrios mtodos para cultivo de ovos "in vitro" que facilitam o desenvolvimento do ovo antes da implantao; estes mtodos tm sido especialmente utilizados para estudar o efeito dos hormnios e dos compostos que produzem antifertilidade sobre o ovo. Utilizam-se micropipetas acopladas a transplantar ovos cmara anterior do intra-oculares mostram desenvolvimento estgio de mrula, porm, se cultivados seringas para olho. Os ovos normal at o em uma cmara

rodeados por filtros de milipore, ou em placas de Petri cobertos por azeite mineral, se desenvolvem at o estgio de blastocisto.

BIBLIOGRAFIA

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Hafez,

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Reproduction

and

breeding Lea

techniques & Febiger,

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animals.

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OBTENO DA CAMADA MUSCULAR INTERNA DE INTESTINO DELGADO DE CACHORRO

I. MATERIAL NECESSRIO: 01 cachorro vivo anestesiado. 2 ampolas (0,5 mg cada) de atropina Recipiente com 300 ml de gua destilada a 37C Recipiente com 300 ml de salina a 37C mais 0,5 mg de atropina. ter etlico Gelo 1 seringa de 1 ml com agulha 1 seringa de 5 ml com agulha 1 seringa de vidro de 10 ml com agulha Material cirrgico (bisturi, tesoura, rato, pinas anatmicas) II. PROCEDIMENTO: Aplicar 1 ml de atropina no animal. Se for por via intramuscular deve ser aplicado 15 minutos antes do animal ser sacrificado. Se for por via intravenosa deve ser aplicado 5 minutos antes do sacrifcio. Para sacrificar o animal deve ser aplicado aproximadamente 10 ml de ter em seu pulmo. Caso o animal no morra deve-se aplicar um pouco mais de ter por via intravenosa em sua lngua. Assim que o animal tenha morrido, passa-se lcool 70% em seu abdomem evidenciando a linha mediana do corpo na altura do umbigo. O animal deve ser aberto nessa regio com um corte de aproximadamente 15 cm de comprimento, at alcanar a cavidade abdominal. Nesta encontra-se primeiramente o

pinas

dente

de

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epiplon que deve ser afastado ou retirado; a seguir encontra-se o intestino delgado de aspecto liso e claro. Com o auxlio de uma tesoura, retirar um pedao de aproximadamente 30 cm de intestino delgado e recort-lo em pedaos de aproximadamente 5 cm de comprimento. Esses fragmentos devem ser imediatamente lavados em gua a 37C. Aps a retirada do contedo intestinal, o material deve ser transferido para um recipiente com salina e atropina. Observando o relaxamento total do intestino este deve ser virado com o auxlio de uma pina dente de rato de tal modo que tenhamos a luz do intestino (mucosa) voltada para o lado externo. Depois deste procedimento todos os fragmentos devem ser mantidos sob baixa temperatura (gelo). A seguir, deve-se submucosa. Para isto, ao, um corte firme e tal maneira alcanar retirar a mucosa juntamente com a deve-se fazer, com uma lmina de pequeno no sentido longitudinal de a submucosa (de aspecto branco e

rgido; abaixo dela encontra-se a camada muscular interna que apresenta estriaes no sentido transversal em forma de anis). Assim que tenha alcanado a submucosa este corte deve ser prolongado no sentido longitudinal com o auxlio de duas pinas dente de rato que iro ampliando a separao da submucosa produzida pelo corte at obtermos o corte completo no sentido longitudinal. A camada interna deve ento ser desprendida da submucosa com o auxlio de uma pina anatmica. Em seguida, deve-se "revirar" o intestino, com auxlio de uma pina dente de rato, de tal modo que tenhamos a serosa do intestino novamente voltada para fora. Ento junto a poro onde estava inserido o mesentrio deve-se fazer um pequeno corte no sentido longitudinal (com cuidado para cortar somente a camada muscular externa, que apresenta estriaes no sentido longitudinal, enquanto a

GUIA-TP camada interna transversal. apresenta estriaes no

16 sentido

Aps esse pequeno corte a camada externa deve ser "rasgada" com auxlio de duas pinas e ser desprendida da camada interna com auxlio de uma pina anatmica. A camada interna obtida em forma de anis. O importante no deixar nenhum resduo da camada externa e da submucosa, podendo-se, para isto, at perder um pouco da camada interna.

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PROCESSAMENTO DE ENCFALO DE RATOS: CONGELAO E PARAFINA

I. SOLUES 1. Soluo Salina Tamponada - 9 g de cloreto de sdio - 100 ml de Tampo Fosfato 0,1 M Dissolver e filtrar. 2. Tampo fosfato 0,2M (ph 7,4) A: Fosfato de sdio monobsico (NaH2PO 4.H 2O) 12,5 g para 2 litros de H2O B: Fosfato de sdio Dibsico (Na2HPO 4.7H 2O) 83 g para 2 litros de H2O Misturar os dois e filtrar. 3. Corante de Nissl Tampo I: H 2O destilada - 994 ml c. actico glacial 6 ml Tampo II: Acetato de sdio 13,6 g H 2O destilada - 1000 ml (completar para) Soluo de Cresil Violeta: ...100 ml de H 2O destilada 1 g de cresil violeta Aquecer sem deixar ferver. Corante de Nissl: Tampo I.....................230 ml Tampo II.....................20 ml Soluo de Cresil Violeta.....12,5 ml

GUIA-TP 4. Subbing Solution

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250 ml de H 2O 0,16 g de Sulfato de Potssio e Cromo 1,25 g de gelatina Misturar temperatura de 70C e depois filtrar a soluo.

5. Soluo de Montagem 200 ml de H 2O aquecida 0,5 g de gelatina 50 ml de lcool absoluto 50 ml de Tampo Fosfato 0,1M 200 ml de Tampo Fosfato 0,2M Dissolver a gelatina em 200 ml de gua aquecida a 70C, acrescentando 200 ml de Tampo Fosfato 0,2M, 50 ml de Tampo Fosfato 0,1M e 50 ml de lcool absoluto. Filtrar. 6. Soluo de Sacarose a 30% 30 g de Sacarose 100 ml de Tampo Fosfato 0,1M Misturar os dois e filtrar. Autoclavar. II. MTODOS 1. Obteno do encfalo Perfundir o animal com Soluo Salina e posteriormente com Formol a 10% em H2O destilada. A perfuso feita pela aorta, fechando-se a veia cava. Com isso economizam-se as solues de perfuso e tempo, j que, dessa maneira, perfunde-se somente a parte de cima do animal. Gasta-se nisso, aproximadamente 200 ml de cada uma das duas solues. Essa perfuso melhor executada com a ajuda de uma bomba peristltica. Aps isso feito, retirar o crebro e mant-lo por 4 horas em Formol a 10%. Coloc-lo na soluo de sacarose, na geladeira, at o momento de ser cortado (no mximo um ms, porque funga).

GUIA-TP 2. Cortes por congelamento Preparao das lminas Lavar as lminas com sabo de cco Enxaguar com H2O corrente e depois com H2O destilada Deixar em lcool aps a lavagem Enxaguar em H2O destilada e secar com um pano limpo Passar as lminas na Subbing Solution Deixar secar por 24 horas

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Cortes no micrtomo de congelao O crebro retirado da soluo de sacarose aparado na regio posterior, de modo a que tenha uma base reta para poder ser fixado (com a soluo fixadora Tissue Tek ou com a prpria sacarose congelada) no suporte do micrtomo de congelao. Cobre-se o material com gelo seco triturado por, aproximadamente, 3 minutos. Esse processo de congelao deve ser repetido sempre que necessrio. Tirase o gelo da parte superior do crebro e inicia-se a microtomia (cortes de 3m). Os cortes obtidos so colocados, com a ajuda de um pincel fino, na soluo de montagem. Novamente, com a ajuda do pincel, pescam-se os cortes nas lminas previamente preparadas. Deixam-se as lminas secando em estufa a 37C por 24 horas. Corar com Cresil Violeta: Colorao dos cortes por congelamento: Passar os cortes por: - gua destilada - 3 a 5 - Corante de Nissl - 5 - gua destilada - lavar o excesso de corante - lcool 75 - 3 - cido Actico + lcool 95 (1:10) - diferenciar quanto se queira - lcool 95 - 3 a 5 - lcool Butlico + lcool Absoluto (1:1) - 3 - lcool Absoluto - 3 a 5 - Xilol - 5 - Montar as lminas

at

GUIA-TP 3.Incluso em parafina Fixao: - Formol a 10% - 24 h Desidratao H2O corrente - 3 h lcool 70 - 3 h lcool 95 - 12 h lcool Absoluto - 12 h lcool Absoluto - 12 h lcool Absoluto + clorofrmio (1:1) - 2 h Benzol (2 h) Benzol (2 h) Benzol (1 h)

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Incluso Parafina 58-60C (1,5 h) Parafina 58-60C (1,5 h) Parafina 58-60C (1,5 h) Incluir Cortar

Colorao de cortes em parafina - Desparafinar e levar at a gua - 20 no corante de Nissl - Deixar escorrer ( 2) - Lavar 3 vezes em gua - 10 fora - 3 vezes no lcool 70 (diferencia muito o corante. Devese passar rapidamente) - 3 vezes no lcool 96 - 3 vezes no lcool absoluto - 10 fora - 10 xilol - 10 xilol - 10 xilol - Montar

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INTERAO COLGENO-PROTEOGLIGANAS
1. Com cortes de parafina Usar 14 lminas: 7 controles e 7 digeridas pela papana. Proceder digesto pela papana. Corar as lminas pelo Picrossrius durante uma hora. Lavar em gua corrente. Lavar duas vezes com gua destilada. Deixar as lminas secarem bem, cobertas, na estufa. Raspar os cortes com uma gilete transferindo-os para pequenos tubos de ensaio. Retirar o corante dos cortes colocando NaOH 0,1N no tubo de ensaio. A quantidade de NaOH depende do tamanho dos cortes, porm deve-se colocar a mesma quantidade para os cortes controles e os digeridos. Esperar alguns minutos para que o corante reaja com o NaOH. Ler a absorbncia em espectofotmetro em comprimento de onda de 540 nm. Se possvel, ler alguns cortes controles e alguns digeridos com a papana em citofotmetro ou em um analisador de imagens digital. Para calcular a interao colgeno-proteoglicanas: Absorbncia digerido = 100% (mxima captao do Picrossrius pelo colgeno, sem bloqueio pelas proteoglicanas). Absorbncia do controle = X (captao do Picrossrius possvel, com bloqueio do colgeno pelas proteoglicanas) 100 - X = % de captao do Picrossrius que foi impedida pelas proteoglicanas, portanto este um ndice da interao do colgeno com as proteoglicanas.