CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA CH VERDE

Standard soluo Dissolver cerca de 40 mg da USP em p verde descafeinado RS Extrato de Ch em 10 mL de uma mistura de lcool e gua (8:2) por sonicao durante 10 minutos e centrifugar. Use o sobrenadante lmpido. [Note -Prepare fresco. Conservar abaixo de 20, se o armazenamento necessrio. ] Teste soluo proceder como para a soluo padro, exceto para uso extrato em p. Adsorvente-Use uma mistura de slica gel cromatogrfica com um tamanho mdio de partcula de 5 mM. Aplicao volume: 1 microlitro. Desenvolvimento de sistema de solvente Use uma mistura de tolueno, acetona e cido frmico (09:09:02). Imerso reagente Dissolver 140 mg de sal azul rpido B em 10 mL de gua, adicionar 140 ml de metanol e 50 mL de diclorometano, e misturar. [Nota -Prepare semanais e armazenar a 4 no escuro. ] Processo [note-Use uma cmara no saturada, e condicionar a placa para uma humidade relativa de cerca de 30%, utilizando um dispositivo adequado. ] Desenvolver o cromatograma usando o desenvolvimento do sistema solvente at a frente do solvente se moveu cerca de trs quartos da placa, a placa seca de 100, mergulhe no reagente de imerso, seca e examinar imediatamente a placa com visvel luz [note -se o cromatograma estvel at 30 minutos, depois disso, o fundo do prato escurece significativamente. ]: O cromatograma da soluo teste exposies principais bandas similares em posio e cor das bandas principais do cromatograma da soluo padro. O cromatograma da soluo teste apresenta quatro bandas principais laranja acastanhado, com valores de Rf de aproximadamente 0,38, 0,48, 0,52 e 0,62 correspondentes a () -epigalocatequina -3-O-galato ()-epigalocatequina, () -epicatequina3 -O-galato, e ()-epicatequina, respectivamente. A banda mais intensa a de () epigalocatequina -3-galato-O. A menos intensa banda a nica para () epicatequina. B: Os tempos de reteno dos picos de () -epigalocatequina, (+) -catequina, ()epicatequina, () -epigalocatequina -3-galato-O, ()-galocatequina -3-galato-O, () epigalocatequina -3-O-(3 -O-metil)-galato, e ()-epicatequina-3-O-galato no cromatograma da soluo teste correspondem aos do cromatograma da soluo padro 2, como obtido no teste para contedo de polifenis. Soluo A, a soluo B, fase mvel e sistema cromatogrfico -Proceder como indicado no ensaio de Teor de polifenis. soluo-padro Dissolver uma quantidade exatamente pesada de cido glico em soluo A para obter uma soluo com uma concentrao de cerca de 0,2 mg por ml.

soluo de teste-Transferncia de cerca de 500 mg do extrato em p, exatamente pesados, para um frasco de 25 ml, dissolver, diluir com a soluo A o volume, homogeneizar e centrifugar.

Procedimento: injetar, separadamente volumes iguais (aproxi madamente 15 mL) da soluo padro e da soluo de teste no cromatgrafo, gravar os cromatogramas e

medir as reas dos picos do cido glico. Separadamente calcular as percentagens de cido glico na poro do extrato pulverizado tomadas utilizando a frmu la: 2500 (C / W) (U / r S r) em que C a concentrao, em mg / ml, de cido glico na soluo padro; W o peso, em mg, do extrato em p tomadas para preparar a soluo de teste, e U r e S r so as respostas de pico obtidos para cido glico no teste d a soluo e da soluo padro, respectivamente: no mais que 1,0% encontrado.

Limite de cafena Soluo A-Prepare uma mistura filtrados e desgaseificados de gua, metanol, tetrahidrofurano, e cido fosfrico 85% (936.5:50:10:3.5).

Soluo B-Prepare uma mistura filtrados e desgaseificados de acetonitrila, metanol e cido fosfrico 85% (946.5:50:3.5).

Fase mvel-Use misturas varivel da soluo A e B da soluo, conforme indicado para o sistema cromatogrfico. Faa os ajustes se necessrio (ver Adequ ao do Sistema de Cromatografia em 621).

soluo-padro Dissolver uma quantidade de peso exacto RS USP cafena em metanol para obter uma soluo com uma concentrao de cerca de 0,1 mg por ml. Transferir 1,0 ml desta soluo para um balo de 100 ml, dil uir com metanol a um volume, e misturar.

soluo de teste-Transferncia de cerca de 10 mg de extrato pulverizado, exatamente pesados, para um frasco de 10 ml, adicionar 5 ml de metanol, dissolver, diluir com metanol o volume, homogeneizar e centrifugar. Especificacao do cromatografo sistema de cromatografia (ver Cromatografia 621) - O cromatgrafo lquido equipado com detector de 272 nm e um 4,6 mm 25 centmetros de coluna que contm 5 -L60 embalagem mM .* A vazo de cerca de 1,0 mL por minuto. A temp eratura da coluna mantida em 25 1. O cromatgrafo programado da seguinte forma. Time (Minutos) Soluo A (%) Da soluo B (%) Eluio 00-30 100 0 isocrtica 30-35 0 0 100 100 gradiente linear 35-40 0 100 isocrtica 40-45 0 100 100 0 gradiente linear 45-55 100 0 isocrtica Cromatgrafo a soluo padro e registrar as respostas de pico, conforme indicado para o procedimento: o desvio -padro relativo, determinado a partir do pico de cafena

para replicar injeces de capital no mai s do que 2,0%. Procedimento: injetar, separadamente volumes iguais (aproximadamente 15 mL) da soluo padro e da soluo de teste no cromatgrafo, gravar os cromatogramas e medir as reas dos picos de cafena. Separadamente calcular as percentagens de cafena na poro do extrato pulverizado tomadas utilizando a frmula: 1000 (C / W) (U / r S r) em que C a concentrao, em mg / mL, da USP Cafena RS na soluo padro; W o peso, em mg do extrato em p tomadas para preparar a soluo de teste, e U r e S r so as respostas de pico obtidos de cafena da soluo teste e da soluo padro, respectivamente: no mais que 0,1% encontrado.

Contedo de polifenis, Soluo A-Prepare uma mistura filtrados e desgaseificados de gua, metanol e cido fosfrico 85% (946.5:50:3.5).

Soluo B-Prepare uma mistura filtrados e desgaseificados de acetonitrila e metanol (95:5).

Fase mvel-Use misturas varivel da soluo A e B da soluo, conforme indicado para o sistema cromatogrfico. Faa os ajustes se necessrio (ver Adequao do Sistema de Cromatografia em 621).

Soluo-padro de 1 - Dissolva uma quantidade exatamente pesada da USP () RS epigalocatequina -3-O-galato em Soluo A para obter uma soluo com uma concentrao de cerca de 1,0 mg / mL. Transferir 1,0 ml desta soluo para um frasco de 10 ml, diluir com a soluo A com o volume, e misturar.

Soluo-padro de 2 - Transferncia de cerca de 20 mg da USP em p descafeinado Extrato de Ch Verde RS, pesada com preciso, para um frasco de 10 ml, adicionar 5 mL de soluo, dissolver, diluir com a mesma mistura de solventes a um volume, e. Transferir 2,0 ml desta soluo para um frasco de 10 ml, diluir com a soluo A com o volume, centrfuga, misturar e.

Teste soluo Proceder como diri gida a Soluo 2, com excepo de usar extrato em p.

sistema de cromatografia (ver Cromatografia 621) - O cromatgrafo lquido equipado com detector de 278 nm e um 4,6 mm 25 centmetros de coluna que contm a embalagem de 5 mM L1. A vazo de cerca d e 0,8 mL por minuto. A temperatura da coluna mantida em 25 1. O cromatgrafo programado da seguinte forma. Time (Minutos) Soluo A (%) Da soluo B

(%) Eluio 00-20 94 6 isocrtica 20-50 94 22 78 6 gradiente linear 50-70 78 38 22 62 gradiente linear 70-75 38 94 62 6 isocrtica 75-90 94 6 isocrtica Cromatgrafo a soluo padro 1, e gravar as respostas de pico, conforme indicado para o procedimento: o fator de cauda para o pico () -epigalocatequina -3-O-galato no seja inferior a 0,8 e no superior a 2,0 e desvio -padro relativo determinada a partir da (pico)-epigalocatequina -3-O-galato para replicar injeces de capital no mais do que 2,0%. Cromatgrafo a soluo Standard 2, e registrar as respostas de pico, conforme indicado para o procedimento: o cromatograma obtido similar ao cromatograma de referncia fornecido com o lote da USP em p descafeinado Extrato de Ch Verde RS sendo utilizados, e da resoluo, R, entre os () - pico epigalocatequina -3-O-galato e do pico anteri or no seja inferior a 1.

Procedimento: injetar, separadamente volumes iguais (aproximadamente 15 mL) da Soluo 1, a soluo Standard 2, ea soluo de ensaio no cromatgrafo, registro dos cromatogramas e medir as reas dos picos dos analitos. Usando o c romatograma da soluo padro 2 eo cromatograma de referncia fornecido com o lote da USP em p descafeinado Extrato de Ch Verde RS, identificar os tempos de reteno dos picos correspondentes aos diferentes polifenis. O tempo aproximado de reteno rela tivos dos polifenis so fornecidas na tabela a seguir: Analito Relativa Tempo de Reteno ()-Epigalocatequina 0,56 (+)-Catequina 0,68 ()-Epicatechin 0,98 ()-Epigalocatequina -3-O-galato 1,00 ()-Galocatequina-3-O-galato 1,09 ()-Epigalocatequina -3-O-(3 -O-metil)-galato 1,19 ()-Epicatequina-3-O-galato 1,27 Separadamente calcular o percentual de () -epigalocatequina, (+) -catequina, ()epicatequina, () -epigalocatequina -3-galato-O, ()-galocatequina -3-galato-O (), epigalocatequina -3- O-(3'-O-metil)-galato, e ()-epicatequina-3-O-galato de ()epigalocatequina -3-O-galato na poro do extrato em p devem ser colhidas utilizando a frmula: 5000 (C / W) (U / r S r) em que C a concentrao, em mg / mL, da USP () RS -epigalocatequina -3-O-galato na Soluo 1, W o peso, em mg do extrato em p tomadas para preparar a soluo de teste; r U o pico de resposta obtidos para cada um dos polifenis na soluo de teste e r S o pico de resposta obtidos para () -epigalocatequina -3-O-galato em soluo padro 1: no inferior a 40,0% () epigalocatequina - 3-galato-S encontrado. Adicione os percentuais calculados para os analitos individuais: no inferior a 60,0% dos polifenis, calculado como () -epigalocatequina -3-O-galato, encontrado.