Facult des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Universit Henri Poincar - Nancy 1

INITIATION A LA MANIPULATION
2me anne

Anne universitaire 2004-2005

Avertissement

Ce polycopi dinitiation la manipulation regroupe des informations prcieuses pour les divers TP de votre scolarit. Il sera dune grande utilit durant toutes vos annes dtudes et doit tre considr comme un outil de rfrence. A ce titre, conservez-le porte de main et au besoin, relisez-le. Il est recommand de venir la sance de TP ou de TD en ayant pris connaissance du contenu de la sance.

Pour les sances de Travaux pratiques, vous devez apporter: votre poly dInitiation la manipulation, votre cahier de laboratoire, une blouse blanche, un feutre-marqueur pour le verre, une calculatrice, et des feuilles de dessin format A4. En outre, les tudiants prsentant une allergie au latex doivent se procurer des gants de vinyle (en supermarch) pour pouvoir manipuler les produits dangereux.

Photo de couverture : Microscope du roi Stanislas Leszczynski, construit par Alexis Magny, en 1751. - Muse Lorrain, Nancy.

PLAN

1 - SUIVI ET RENDU DES RESULTATS

PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE APPRENTISSAGE DE LA REDACTION DUN COMPTE-RENDU RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL DINCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS EXERCICES DAPPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE

4
5 7

8 31

2 - REGLES DHYGIENE ET DE SECURITE AU LABORATOIRE

PRODUITS CHIMIQUES PRODUITS BIOLOGIQUES GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX

32
33 40 41 46

3 - MESURE DES VOLUMES ET DES MASSES

VERRERIE, PIPETAGE, PESEE VERRERIE ET VOLUMETRIE

47
48 59

4 MICROSCOPIE
LE MICROSCOPE A FOND CLAIR EXAMEN A LETAT FRAIS ET A LIMMERSION MICROMETRIE NUMERATION DELEMENTS FIGURES

60
61 72 74 76

5 METHODES DE SEPARATION ET DANALYSE QUALITATIVE

ELECTROPHORESE DE ZONE CENTRIFUGATION CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

79
80 86 87

6 - DOSAGES COLORIMETRIQUES ET NEPHELEMETRIQUES

NEPHELEMETRIE SPECTROMETRIE

95
96 97

7 - NOTIONS DE METROLOGIE, CALCULS DINCERTITUDE, CONTROLE DE QUALITE

APPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE

102
103 104

SUIVI ET RENDU DES RESULTATS

PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE

APPRENTISSAGE DE LA REDACTION DUN COMPTE-RENDU

RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL DINCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS

EXERCICES DAPPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE

PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE

V.PICHON

1. But
Cette procdure dfinit les rgles de base suivre pour llaboration, la rdaction et la bonne tenue dun cahier de laboratoire de travaux pratiques. Cest une initiation aux bonnes pratiques de laboratoire ainsi qu la tenue dun cahier de manipulations que le futur diplm sera amen mettre en pratique dans le cadre de ses fonctions professionnelles, aussi bien en recherche, en industrie, dans le milieu hospitalier ou lofficine. Ce cahier doit permettre ltudiant de garder une trace crite de ce quil fait en TP et dacqurir la rigueur indispensable la prise de notes lors dun travail exprimental. Il permettra galement de rdiger le compte rendu de TP correspondant. Les modalits particulires, rpondant des objectifs pdagogiques propres adapts certains TP, sont prcises dans le polycopi relatif chaque TP.

2. Etendue
Cette procdure sapplique lensemble des travaux pratiques du cursus des tudes pharmaceutiques.

3. Elaboration
Le cahier de laboratoire est un document de travail personnel dont le contenu doit pouvoir tre utilis par toute autre personne (cf paragraphe 3.2.). A ce titre il doit tre tenu sous une forme bien dfinie et tre rdig de manire claire et lisible. 3.1. Format Le cahier, fourni ltudiant au dbut de la 2me anne, sera de format 21,0 29,7 cm, broch (sans spirales), et toutes les pages devront tre numrotes. Son prix sera ajout la carte de polycopis. 3.2. Rdaction Sur la premire page (page 001), ltudiant indiquera : nom, prnom, anne dtude, anne universitaire. Les pages 002 005 seront rserves lcriture de la table des matires qui sera actualise au fur et mesure des sances. Ce cahier est un document de travail, il doit donc tre complt sur place et chaque sance, si besoin est. Le cahier de laboratoire doit tre suffisamment complet pour quon puisse sy rfrer et raliser nouveau lexprience dcrite dans les mmes conditions exprimentales et obtenir les mmes rsultats dans les limites derreur tablies. On pourra trouver dans ce cahier et pour chaque sance : - le titre de lexprience - la dmarche exprimentale - les conditions exprimentales - les observations - les mesures - un exemple de calcul et/ou un traitement prliminaire des donnes - ainsi que tout commentaire ou apprciation utile au bon droulement de la manipulation y compris les problmes rencontrs et les solutions apportes.

Tous ces lments sont indispensables la rdaction du rapport de TP correspondant la sance ; le but nest pas de recopier le polycopi. 3.3. Tenue Le cahier tant numrot, aucune page ne pourra tre arrache. Une encre ineffaable sera utilise la rdaction. Ecrire directement dans le cahier sans rien retranscrire, pas de feuilles volantes. Si une erreur est constate, il faudra la rayer proprement sans la faire disparatre et crire ct la correction ainsi que le motif.

4. Contrle
Les enseignants contrleront chaque cahier lors des travaux pratiques, vrifieront quil est rgulirement rdig et le viseront. A lissue des TP, sil a t constat que ce cahier est inexistant ou non tenu jour rgulirement, un retrait de points est prvu sur la note finale. Cette valuation est laisse lapprciation des enseignants responsables.

APPRENTISSAGE DE LA REDACTION DUN COMPTE-RENDU

CONSIGNES POUR LA PRISE DE CROQUIS

Les observations faites au microscope donnent lieu des dessins, vous permettant de conserver un souvenir prcis de ce que vous avez observ. Lexcution de ces dessins ncessite une observation et une interprtation trs prcises des prparations microscopiques. De plus, ils permettent la vrification du travail. Ils seront rendus ds la fin de la sance. Ces dessins, excuts uniquement au crayon de papier, doivent tre la reprsentation aussi exacte que possible des objets observs. C'est pourquoi il faut respecter les proportions relatives des divers lments, et reprsenter tous les dtails trs scrupuleusement. Le trait de crayon doit tre fin et net, les raccords imperceptibles. Les hachures et les autres symboles (croix, ronds) qui peuvent tre employs dans les schmas, doivent tre proscrits de tout dessin de dtail. Il est inutile de reprsenter l'observation au faible grossissement (sauf dans quelques cas qui seront signals au moment voulu) : apporter au contraire tous les soins l'observation au fort grossissement qui est, le plus souvent, la seule intressante. Les dessins doivent comporter une lgende prcise, comportant notamment le grossissement utilis, et des annotations dtailles (faire mention de la forme, de la couleur, de la quantit ventuellement). Des traits de rappel indiqueront tous les dtails intressants du dessin. Dans la mesure du possible, ils seront horizontaux et ne se recouperont pas. Ils seront placs droite du dessin bien centr. Les lgendes seront crites galement au crayon de papier. Les dessins seront faits uniquement du ct recto de chaque feuille.

RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL DINCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS NOTIONS DE METROLOGIE
V. PICHON On ne connat bien le phnomne que lorsquil est possible de lexprimer en nombres. Lord Kelvin La mtrologie est lart de la quantification, cest--dire la reprsentation numrique des phnomnes physiques qui peuvent alors tre compars, vrifis et reproduits. Les grandeurs sont mesures laide dunits qui constituent un systme. Celui-ci doit tre reconnu par tous les utilisateurs, il doit tre simple et cohrent ; cependant, il ne peut tre dfinitif car il est tributaire de lvolution des connaissances et des techniques. Depuis 1989, la Confrence Gnrale des Poids et Mesures a pour rle dtudier les problmes poss par la Mtrologie et dimposer un systme unique. En France, le seul systme lgal est le Systme International ou S.I.

1 - Les grandeurs
La notion de grandeur ne peut tre dfinie de manire irrfutable. Il sagit dentits qui reprsentent entre elles une analogie (masse, longueur, temps). Elles peuvent varier et on peut dfinir des quantits ou des tats. 1.1. Les grandeurs mesurables Une grandeur est mesurable si on peut dfinir le rapport de deux grandeurs de lespce considre. La mesure sera donc dpendante du choix de lunit. Ces grandeurs peuvent tre : - additives : il est alors possible de dfinir lgalit et la somme (exemple: la masse) - non additives : laddition na pas de sens physique (exemple: temprature, masse volumique) - individualit unique : elles ne sont pas susceptibles de variation. Il sagit des constantes universelles (constante de Planck, constante molaire des gaz parfaits) ; ces grandeurs nont pas dunit, mais leur valeur numrique dpend du systme utilis. 1.2. Les grandeurs reprables On ne peut pas dfinir le rapport entre deux grandeurs identiques. On peut seulement donner une hirarchie (intensit olfactive, chelle de duret de Mohs).

2 - Dimensions des grandeurs Units

2.1. Dfinition Il faut, pralablement cette tude, tablir une classification. a) Les grandeurs fondamentales Lanalyse dimensionnelle montre que lensemble des grandeurs na que trois degrs de libert. Il suffit donc de choisir trois grandeurs indpendantes lune de lautre pour dfinir toutes les autres. La longueur, la masse et le temps ont t retenus.

b) Les grandeurs principales Pour des raisons pratiques, le Systme International utilise non pas trois mais sept grandeurs de rfrence. - Longueur - Masse - Temps - Temprature - Intensit du courant lectrique - Intensit lumineuse - Quantit de matire On y ajoute : - Langle plan - Langle solide c) Les grandeurs drives Elles sont dfinies partir des grandeurs principales (surface, pression, capacit). 2.2. Dimensions A chaque grandeur principale a t attribue une dimension symbolise par une lettre (L - M T - - I C). Les grandeurs drives auront donc pour dimension une combinaison des symboles prcdemment tablie en fonction de la description physique de cette grandeur. Exemple : Pression = = = = = Force / Surface (Masse x Acclration) / Surface (Masse x Longueur) / (Temps x Temps x Surface) M L T-2 L-2 M L-1 T-2

On peut faire les remarques suivantes: - Une grandeur peut ne pas avoir de dimension (1 et non 0) si la somme algbrique de tous les exposants est gale zro. - Il nexiste pas de grandeur dont la somme algbrique des exposants est suprieure 4. - Une grandeur drive peut tre obtenue par la combinaison dautres grandeurs drives et tmoigner ainsi de linteraction des diffrents phnomnes physiques. Exemple: M L-1 T-2 Pression ML-1T2 Pression = = = = M L2 T-3 / L3 T-1 Puissance / Dbit M L T-2 / L2 Force / Surface

La premire quation correspond au fonctionnement dune pompe, la deuxime au manomtre soufflet. Si les deux membres dune relation traduisant des lois de la physique nont pas la mme dimension ( un facteur numrique sans dimension prs), cette relation est inexacte. 2.3. Units 2.3.1. Dfinition Cest une quantit de grandeur qui sert de rfrence pour exprimer la mesure de cette grandeur.

Elle est reprsente de faon plus ou moins arbitraire par un talon. Cette notion est volutive en fonction de la progression des connaissances et des techniques. Le choix des units, correspondant aux grandeurs principales dfinies prcdemment, dcrit le Systme International (J.O.Dcret 75.1200 du 4 dcembre 1975). - Longueur : mtre Longueur gale 1 650 763,73 longueur donde, dans le vide, de la radiation correspondant la transition entre les niveaux 2 p10 et 5 d5 de latome de krypton 86. - Masse : kilogramme Masse du prototype en platine iridi qui a t sanctionn par la Confrence gnrale des poids et mesures tenue Paris en 1989 et qui est dpos au Bureau international des Poids et Mesures. - Temps : seconde Dure de 9 192 631 770 priodes de la radiation correspondant la transition entre les deux niveaux hyperfins de ltat fondamental de latome de csium 133. - Intensit de courant lectrique : ampre Intensit dun courant lectrique constant qui, maintenu dans deux conducteurs parallles, rectilignes, de longueur infinie, de section circulaire ngligeable et placs une distance de 1 mtre lun de lautre dans le vide, produirait entre ces conducteurs une force de 2.10-7 newton par mtre de longueur. - Temprature : - kelvin Le kelvin, unit de temprature thermodynamique, est la fraction 1/273,16 de la temprature thermodynamique du point triple de leau. - degr Celsius La temprature Celsius t est dfinie par la diffrence t = T - T0 entre deux tempratures thermodynamiques T et T0 avec T0 = 273,15 kelvins. - Quantit de matire : mole Quantit de matire dun systme contenant autant dentits lmentaires quil y a datomes dans 0,012 kilogramme de carbone 12. - Intensit lumineuse : candela Intensit lumineuse dans la direction perpendiculaire dune surface de 1/600 000 mtre carr dun corps noir la temprature de conglation du platine sous la pression de 101 325 pascals. - Angle plan : radian Angle qui, ayant son sommet au centre dun cercle, intercepte, sur la circonfrence de ce cercle, un arc dune longueur gale celle du rayon du cercle. - Angle solide : stradian Angle solide qui, ayant son sommet au centre dune sphre, dcoupe sur la surface de cette sphre, une aire quivalente celle dun carr dont le ct est gal au rayon de la sphre.

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2.3.2. Multiples et sous multiples On utilise des prfixes et les symboles suivants :
Facteur multiplicatif 1018 1015 1012 109 106 103 102 101 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 Prfixe exa peta tra giga mga kilo hecto dca dci centi milli micro nano pico femto atto Symbole E P T G M k h da d c m n p f a

2.3.3. Ecriture a) Les noms des units sont grammaticalement des noms communs. Ils scrivent avec une minuscule et prennent un s au pluriel, sauf sils se terminent par s, x ou z (exception: quintal - quintaux). b) Les symboles des units sont exprims en minuscules romaines, sauf sils drivent dun nom propre (seconde : s ; newton: N) (exception: lohm : ) Le symbole nest pas suivi dun point. Il ne prend pas la marque du pluriel. c) Le nom et le symbole des multiples et sous-multiples de lunit de masse est appliqu au gramme et non au kilogramme. d) Les prfixes composs sont interdits (1 nm et non 1 mm). e) Le produit des symboles de plusieurs units est indiqu de prfrence par un point (N.m). Labsence de ce signe ne doit pas prter confusion. (Exemple: Nm (Newton.mtre) mais pas mN (millinewton). f) Les trois critures suivantes sont autorises : m/s ou m ou m.s-1 s Il ne peut y avoir plus dune barre oblique dans lexpression. Dans les cas compliqus des parenthses ou des puissances ngatives doivent tre utilises. m.kg/(s3. A) ou m.kg.s-3. A-1 et non m.kg/s3/A 2.4. Conversion dunits Lintroduction du systme S.I. a diminu la frquence des changements dunits. Cependant, dans la pratique, on rencontre encore des units non lgales. Le passage dun systme un autre systme cohrent (les grandeurs principales dfinissant toutes les autres) sobtient partir dun facteur multiplicatif. Celui-ci est gal au produit des rapports entre les units principales leves la puissance qui apparat dans lquation aux dimensions. 11

Exemple : soit un systme o les units principales sont le centimtre, le gramme et la seconde (systme C.G.S.) : la pression a pour unit la barye. Dans le Systme International, lunit de pression est le Pascal. Lquation aux dimensions de la pression est M L-1 T-2 : g M: = 10.10-3 kg L : cm = 10.10-2 m T: s =1 s Le facteur multiplicatif est : k = 10-3 x (10-2)-1 x 1 k = 1.10-1 -1 Une barye est donc gale 10 Pascal.

3 - Mesures et incertitudes
Une mesure est le rsultat dun processus comprenant un certain nombre dtapes : - production dun signal - transformation du signal - transmission - amplification - conversion pour la prsentation de la mesure - prsentation (enregistrement - indication visuelle - aiguille, etc...) Toutes ces phases ne se retrouvent pas ncessairement impliques dans une mesure. On utilise essentiellement les techniques hydrauliques, pneumatiques, lectriques, lectroniques, mcaniques, optiques et parfois acoustiques. On ne peut jamais affirmer que les rsultats sont rigoureusement exacts. Les mesures peuvent tre influences par lobjet, la mthode, les instruments et loprateur : La grandeur mesurer est dfinie avec une incertitude. 3.1. Prcision Elle sexprime en pour-cent. Cest la qualit globale de la mesure. Limprcision est due des erreurs. 3.1.1. Les erreurs accidentelles Elles sont dues loprateur ou au manque de fiabilit du matriel. Elles conduisent en gnral des rsultats absurdes. Le sens critique de lexprimentateur doit permettre leur limination. Pour cela, il est utile que celui-ci ait une ide de lordre de grandeur du rsultat. 3.1.2. Les erreurs systmatiques Elles sont dues linstrument de mesure et elles se reproduisent de la mme manire lorsque lon rpte plusieurs fois la mme mesure. - lerreur de parallaxe rsulte dune lecture en biais lorsque le repre et la graduation ne sont pas dans le mme plan.

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- lerreur dhystrsis

Lindication de la mesure (X) est en retard par rapport la variation de la grandeur (G).

Si la grandeur subit une variation priodique, on dcrit un cycle dhystrsis. Cette erreur est limine si on prend la moyenne de deux valeurs prises lune la monte et lautre la descente . - lerreur de dcalage
Correspond un cart de la valeur de la mesure. Il peut tre positif ou ngatif.

- lerreur de pente ou de calibrage

Dpend de manire linaire de la quantit mesure.

- lerreur de linarit La courbe de rponse X = f(G) nest pas rigoureusement linaire. Elle sexprime en pourcentage de ltendue de lchelle. Lexprimentateur ne peut corriger cette erreur que sil possde une courbe dtalonnage. - lerreur dtalonnage Due lerreur commise sur ltalon et sur les graduations lors de la cration de lappareil. Ces erreurs sont connaissables et peuvent ventuellement tre prises en compte. 3.1.3. Les erreurs alatoires On notera en particulier les erreurs dues aux causes suivantes : - le manque de mobilit Cest la consquence des frottements des jeux mcaniques de linertie. Ce type derreur se manifeste surtout lorsque la grandeur mesurer est stable. - linfluence des paramtres extrieurs tels que la temprature, la pression, lhumidit, lacclration, le temps, etc

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- le manque de rapidit Un appareil idal ne doit pas ignorer un phnomne fugace et doit suivre rigoureusement les variations de la grandeur mesure. - le manque de finesse Linstrument ne doit pas perturber la grandeur quil mesure. Cest le cas classique dun voltmtre qui modifie lintensit du circuit dans lequel il est insr. Ces erreurs conduisent des rsultats disperss. Si le nombre de mesures est important, on pourra appliquer les lois de la statistique. Les valeurs se rpartiront autour dune valeur relle suivant une loi normale. Le rsultat dun tir sur une cible permet de reprsenter ces erreurs : On constate une dispersion des points dimpact (plus ou moins groups) et lon peut imaginer un point dimpact moyen. - les tirs hors de la cible reprsentent les erreurs accidentelles. - la position du point moyen par rapport au centre de la cible correspond aux erreurs systmatiques - la dispersion correspond aux erreurs alatoires. Il est alors possible de rgler larme, donc de corriger les erreurs systmatiques, pour que le point moyen soit au centre de la cible. Le tir est dit juste. Plus les impacts sont groups, plus le tir est fidle. Pour quun appareil soit prcis, il doit tre juste et fidle. 3.2. Sensibilit Cest le rapport qui existe entre la variation de lindication de la lecture et la variation de la grandeur. Un appareil est linaire lorsque sa sensibilit est constante. Cette notion ne fait pas intervenir la prcision de la lecture. Il ne faut donc pas confondre la sensibilit et le pouvoir de rsolution (appel aussi pouvoir sparateur) qui est la plus petite diffrence dtat ou de quantit dune grandeur quun appareil peut dceler. Cest souvent cette dfinition qui correspond chez les constructeurs la sensibilit. Par exemple, la sensibilit dun galvanomtre scrit : rotation de l'aiguille = = variation du courant i et peut se calculer si la relation physique entre et i est connue. Elle ne dpend pas du dispositif ni de la prcision de la lecture. La sensibilit dfinie par le constructeur tiendra compte de lerreur due la non mobilit du systme, du dispositif de lecture (lunette de vise), etc... 3.3. Incertitudes 3.3.1. Erreur et incertitude absolue Lerreur absolue est la diffrence entre la valeur exacte Xo (qui est inconnue) de la grandeur G et de la valeur Xi donne par la mesure. Aussi prfre t-on introduire la notion dincertitude absolue X qui est lestimation de la limite raisonnable de lerreur telle que lon puisse affirmer : X - X < Xo < X + X Elle a bien sr les mmes dimensions que la mesure.

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3.3.2. Erreur et incertitude relative Cest le quotient X/X de lerreur ou de lincertitude absolue par la mesure. Cest un nombre sans dimension qui reprsente la qualit du mesurage. On peut donner un ordre de grandeur de lincertitude relative.
X/X 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 Informations Ignorance Evaluation Mesurage industriel Prcision Haute prcision

3.3.3. Incertitude sur une mesure directe Lexprimentateur doit chercher rduire ou corriger les erreurs systmatiques puis estimer lincertitude X sur la mesure. Pour obtenir de meilleurs rsultats, le mieux est de multiplier le nombre de mesures. En effet, sur un grand nombre de mesures releves, les valeurs se rpartissent dans la plupart des cas suivant une courbe de Gauss. On constate que lincertitude absolue maximum X est peu probable et on dmontre que la moyenne des rsultats dune mesure rpte un grand nombre de fois de faon indpendante tend vers la valeur relle, si on a pris soin dliminer toutes les erreurs non alatoires. Si est la valeur moyenne de la grandeur n = 1 i=1Xi n Lerreur apparente est alors gale : x i =Xi X Lerreur moyenne scrit : n x m = 1 i =1 x i n On dfinit galement lcart type : n = 1 i =1x i2 n

1 n (X X) 2 n i =1 i

N.B. : Dans lexpression de , utiliser (n-1) au lieu de n, si ce dernier est petit. Sur la courbe de Gauss, labscisse de correspond 0,607 fois la hauteur de lordonne maximum. On peut galement dfinir la probabilit P de commettre une erreur infrieure une certaine limite. Le tableau suivant donne P pour certaines valeurs remarquables de lerreur.
Limite de lerreur - xm + x m + - 2xm + 2xm - 2 + 2 - 3 + 3 - 4 + 4 P 0,573 0,682 0,690 0,954 0,997 0,999

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3.3.4. Incertitude sur une mesure indirecte Les incertitudes absolues et relatives dpendent souvent de plusieurs mesurages. Soit g = f (u, v, w), les grandeurs u, v et w tant des variables indpendantes sur lesquelles on commettra lerreur u, v et w. Si ces valeurs sont petites, on peut appliquer les rgles du calcul diffrentiel.

g g g , et tant les drives partielles, on peut crire : u v w g g g dg = du + dv + dw u v w g Nous ne pourrons connatre le signe des termes tel que .du , puisque lon ne connat pas le u sens de lincertitude. Il faut donc se placer dans le cas le plus dfavorable en faisant la somme des valeurs absolues de chacun des termes. g g g g= u + v+ w u v w Dune manire plus particulire si la fonction est de la forme : g = k1u + k2v + k3w k1 , k2 et k3 tant des nombres sans dimensions, il vient : g= k1 u + k 2 v+ k 3 w
Si la fonction est de la forme : g = k u v w g = u + v + w g u v w

Les cas les plus simples pourront tre rsolus en utilisant les deux thormes suivants : - lincertitude absolue sur une somme ou une diffrence de termes indpendants est gale la somme des incertitudes absolues sur chacun des termes. - lincertitude relative sur un produit ou un quotient de termes indpendants est gale la somme des incertitudes relatives sur chacun des termes.
3.3.5. Remarques a) Les cas des mesures non indpendantes ne sera pas trait ici. Le calcul de lincertitude dans ce cas conduit une valeur infrieure celle que lon obtiendra en appliquant les thormes prcdents. b) Lincertitude relative rsultant dune diffrence peut tre trs grande si les deux termes sont peu diffrents. c) Le fait que lerreur la plus probable est plus faible que lincertitude permet de vrifier la cohrence entre des rsultats diffrents. Il est en effet ncessaire (mais pas suffisant) que les intervalles dfinis par des rsultats encadrs de leur incertitude aient une partie commune pour quil puisse sagir de lexpression de la mme quantit de grandeur.

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A et B sont compatibles. A et C, B et C ne le sont pas. d) Les calculs dincertitude prcdents sappliquent dans le cas du calcul diffrentiel, ce qui suppose que les incertitudes sont petites et que les fonctions sont diffrentiables. Si ce nest pas le cas, il faut calculer la valeur maximum et la valeur minimum du rsultat (en choisissant pour u, v et w des valeurs algbriques correctes) et prendre pour incertitude absolue la valeur de leur demi diffrence. e) La connaissance dun rsultat parmi lensemble des rsultats possibles napporte aucune information sur la population concerne. En particulier, il est absurde de calculer une incertitude absolue en faisant la diffrence entre deux rsultats exprimentaux.

4 Expression des rsultats

4.1. Le rsultat Une mesure est reprsente par un nombre limit de chiffres significatifs qui traduisent la prcision de la mesure. Il nest pas indiffrent dcrire 1,0183 ou 1,02. Dans le premier cas, lerreur porte sur la quatrime dcimale, dans le deuxime cas, elle porte sur la deuxime. Le dernier chiffre significatif exprime le niveau de lincertitude absolue sur le rsultat.

Un zro situ la fin dun nombre peut faire exception et avoir plusieurs significations. Dans le cas dun nombre entier : par exemple 1200 Cette valeur peut tre considre comme ayant 2, ou 3, ou 4 chiffres significatifs ; dans ce cas il est prfrable dutiliser les puissances de 10 et crire selon le cas : 1,2.103 ou 1,20.103 ou 1,200.103. Cette difficult nexiste pas si on fait suivre le rsultat de son incertitude absolue : 1200 100, 1200 10 ou 1200 1. Dans le cas dun nombre dcimal, le zro doit tre crit sil correspond au niveau de prcision : 1,020 nest pas quivalent 1,02.
4.2. Lerreur Lincertitude absolue tant une estimation optimiste de la valeur maximum de lerreur, on comprendra que lon ne doit pas lui attribuer plus dun chiffre significatif (deux lextrme rigueur). Par exemple, on ne peut pas crire que lincertitude absolue est galement 101 units puisque le rsultat nest dfini qu une centaine prs. Il en rsulte les pratiques suivantes : Lors dun calcul dincertitude, on ngligera les erreurs sur les termes qui prsentent une incertitude relative dix fois infrieure celle du terme prsentant lincertitude relative la plus importante. Le rsultat sera toujours arrondi lunit suprieure pour ne pas minorer la valeur de lincertitude. Il est recommand de garder dans les calculs intermdiaires un nombre de chiffres suprieurs au nombre de chiffres significatifs pour viter dintroduire par le processus darrondissement des erreurs qui seraient du mme ordre que celles qui appartiennent aux mesures.

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Pour les nombres irrationnels tels que on utilisera un nombre de dcimales tel que lerreur relative sur ce nombre soit infrieure au dixime de lincertitude relative qui affecte le terme prsentant la meilleure prcision. Dans ces deux derniers cas, il est inutile de traner une quantit ridicule de dcimales.
4.3. Ecriture des rsultats On utilise la forme suivante : a b

signe

nombre

incertitude absolue

puissance 10

symbole de lunit

Seules les cases b et e sont obligatoirement prsentes lors de lcriture dune mesure. a) La case a ne contient le signe plus ou le signe moins que si la grandeur est oriente. b) La case b est remplie en respectant les rgles de lcriture des nombres : - La virgule spare la partie entire et la partie dcimale dun nombre. Elle ne figure dans les nombres que si elle est suivie de zros pour indiquer la prcision de la mesure. Il ny a quune seule virgule par nombre (les anglo-saxons remplacent la virgule par un point). - Les nombres sont spars par tranches de trois chiffres de part et dautre de la virgule. Un espace est utilis lexclusion de tout autre signe. - Le nombre comporte un nombre de chiffres significatifs correspondant la prcision. c) La case c contient la valeur de lincertitude absolue avec en principe un seul chiffre significatif auquel sajoute bien entendu le nombre de zros ncessaires. d) La case d nest utilise que si le nombre est trs petit ou trs grand. e) La case e contient soit le symbole de lunit utilise si le rsultat est exprim en chiffres, soit le nom si lnonc de la mesure est littral. Les rgles dcriture relates au paragraphe 2.3.3. doivent tre appliques. Cette prsentation imposant lutilisation du mme mode dcriture pour le nombre et son incertitude, permet la comparaison immdiate de ces deux valeurs.
4.4. Les indications Les reprsentations instantanes des mesures peuvent tre analogiques ou numriques. La lecture ne peut tre correcte que si la vitesse des variations nexcde pas une valeur compatible avec lappareil de mesure et les possibilits de lobservateur (exprimentateur ou systme dacquisition de donnes).

Les indications analogiques sont limites par : - le pouvoir sparateur de lil - le grossissement que peut donner un dispositif adquat - la possibilit dinterpolation directe ou laide dun vernier mais il faut noter que laugmentation du pouvoir de rsolution dun indicateur ne modifie pas la qualit de la mesure (rien ne sert dapprcier le dixime de milligramme si lincertitude absolue sur la pese est de lordre du milligramme). Les indicateurs numriques procdent toujours par troncature, aussi faut-il ajouter lerreur instrumentale lerreur due lincertitude portant sur le dernier digit (dernier chiffre).

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4.5. Reprsentation des rsultats dun ensemble de mesures 4.5.1. Le tableau Lorsquune grandeur physique dpend dune ou plusieurs autres grandeurs, il est utile de rassembler les rsultats sous forme de tableau. Afin de pouvoir comparer facilement les diffrentes valeurs, il faut veiller dans la mesure du possible lhomognit de lcriture des grandeurs appartenant une mme ligne ou une mme colonne. 4.5.2. La reprsentation graphique Lexploitation des rsultats en vue dtablir les lois des phnomnes physiques est facilite par les reprsentations graphiques. En gnral, on utilise un systme de coordonnes cartsiennes et parfois une reprsentation polaire.

Les mesures x et y suivant les axes X et Y tant incertaines, nous obtiendrons une ligne brise en joignant les diffrents points. En ralit si le phnomne est continu, la courbe ne doit pas prsenter de rupture de pente. Il faut donc tracer une courbe qui passe au mieux de tous les points. Les carts x et y entre un point pris sur la courbe et le point exprimental correspondant constituent une apprciation de lincertitude sur les mesures. On considrera quun point pris sur la courbe correspond une mesure amliore de x et de y. Ce type de reprsentation donne une vue gnrale du phnomne tudi et permet la mise en vidence de particularits (intersection avec les axes, point de rebroussement, surface sous la courbe, valeur de la pente et variations de celle-ci) ainsi que linterpolation et lextrapolation. Quelques rgles simples et logiques permettent de raliser un travail correct. - Toute courbe sera rfrence par rapport un systme daxes et une origine (pouvant tre diffrente du zro). - Le choix de lchelle doit permettre loccupation maximale de la surface rserve la courbe (celle-ci est en gnral un quadrilatre rectangle dont le rapport des cots est infrieur 1,5). - Elle doit tre choisie pour rendre aise la lecture des valeurs de X et de Y. En gnral, on prend une puissance de 10 prs, les rapports 1, 2 ou 5. - Les axes seront gradus de manire simple (1;2;3 1 ;5 ;10 ; 15 ; 10 ; 50 ; 100 ...). Les valeurs x, y correspondant aux valeurs exprimentales ne doivent pas figurer sur les axes. - Le trac des points exprimentaux doit tre suffisamment discret pour ne pas surcharger le graphique. Les traits de rappel seront proscrits sauf pour mettre une particularit en vidence. - Le trac de la courbe doit tre aussi propre et lisse que possible. Ceci suppose, faut-il le prciser, lutilisation dun systme dcriture pointe fine et lusage ventuel dun pistolet dessin. - La mesure de valeurs particulires obtenues partir dune reprsentation graphique ne doit pas utiliser les mesures x et y des points exprimentaux mais imprativement celles des points appartenant la courbe. - La dtermination de la pente dune courbe doit tre faite partir des accroissements de x et de y pris sur la tangente trace au point considr. En aucun cas, ces valeurs ne doivent tre prises sur la courbe, sauf bien entendu dans le cas dune droite. Pour diminuer lerreur graphique, on veillera choisir des accroissements aussi grands que possible. 19

4.5.3. Reprsentation des mesures par des formules La courbe reprsentative des variations de Y en fonction de X tant obtenue, on se propose de dterminer sil existe une relation Y = f(X) qui traduit une loi physique. Le seul cas ou lon puisse vrifier avec scurit la nature dune courbe est celui de la droite. On cherchera empiriquement un changement du systme de coordonnes.

Par exemple : * La courbe de la puissance lectrique P en fonction de lintensit I suggre de tracer la courbe de P en fonction de I2. Cette dernire est une droite qui vrifie la relation P = kI2. Il apparat que la pente mesure la rsistance du circuit. * Lintensit It transmise par une lame absorbante diminue rapidement avec lpaisseur e. On obtiendra une droite de la forme y = ax + b en traant la courbe log It = f(e). La pente de cette courbe mesure le coefficient dextinction, la valeur de lordonne pour e = 0 donne lintensit I0 du faisceau incident. Dans la ralit, lexprimentateur va obtenir, en raison des erreurs exprimentales, un certain nombre de points plus ou moins aligns. Il lui faudra alors choisir la droite la mieux adapte. La mthode la plus utilise est celle des moindre carrs. Cependant il est inutile dappliquer cette mthode si les points sont pratiquement aligns. Le trac se faisant facilement avec une rgle transparente place de manire ce que son bord passe le plus prs possible des points exprimentaux en laissant peu prs autant de points de part et dautre de la droite.
4.6. La mmorisation Ces techniques permettent ltude quantitative a posteriori dune ou plusieurs grandeurs enregistres simultanment. Lenregistrement analogique, dutilisation trs courante, est la mmorisation graphique sur un support (papier en gnral) des variations dune grandeur. En dehors des erreurs dues lenregistreur, il faut parfois tenir compte des variations dimensionnelles du support dues lhumidit par exemple. Actuellement, cette technique est concurrence par lenregistrement numrique sur un support magntique (bande, disque) ou optique (vido disque).

Il faut galement citer : - les mmoires lectroniques - les cartes et rubans perfors - la position dun index - les talons - une branche dun cycle dhystrsis - etc... Toutes ces mmoires posent trois problmes principaux - vieillissement et affaiblissement de linformation - lintroduction de parasites lors de la prise en compte des signaux - lintroduction de parasites lors de la restitution des signaux. Notons que les dispositifs numriques permettent de saffranchir de ces phnomnes. On peut en effet rgnrer priodiquement les mmoires et traiter lectroniquement les signaux pour discriminer les informations.

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EXERCICES DAPPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE

V. PICHON

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REGLES DHYGIENE ET DE SECURITE AU LABORATOIRE

PRODUITS CHIMIQUES PRODUITS BIOLOGIQUES GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX

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PRODUITS CHIMIQUES
M-H. LIVERTOUX - L. FERRARI CONNAISSANCE DES PRODUITS CHIMIQUES ET DES RISQUES

Actuellement, il existe des centaines de milliers de substances organiques et de produits minraux. Parmi eux, prs de 50 000 prsentent, divers degrs, un danger pour la sant et la scurit des manipulateurs. Les risques associs aux produits chimiques sont essentiellement de deux ordres : d'une part ces produits peuvent avoir une action nfaste sur l'organisme et c'est alors leur toxicit qui intervient ; d'autre part ces produits sont souvent inflammables.

1 Les rgles
1) CONTAMINATION PAR LES SUBSTANCES DANGEREUSES Les substances dangereuses peuvent : 1. contaminer la peau et les yeux par contact 2. contaminer l'air, sous forme de poussire, fume, gaz, vapeur et arosol 3. tre portes la bouche par mprise ou par les mains souilles. 2) VOIES DE PENETRATION DANS L'ORGANISME Les substances dangereuses peuvent entrer dans l'organisme par plusieurs voies la fois : la voie respiratoire : les gaz, poussires, vapeurs, fumes pntrant par inhalation dans les poumons et de l dans le sang les solides ou liquides sont avals dissous et rsorbs au niveau du la voie digestive : tube digestif plus ou moins totalement les liquides ou les gaz pntrent dans l'organisme travers la peau. la voie cutane : 3) RISQUES DES SUBSTANCES DANGEREUSES Chaque substance dangereuse a ses risques particuliers. On peut classer ces risques en se basant sur la nature des effets. La rglementation classe les diverses substances en : E Substances nocives Xn Substances explosives O Substances corrosives Co Substances comburantes F Substances irritantes Xi Substances inflammables T Substances dangereuses pour l'environnement D Substances toxiques selon le danger et la nature spcifique des risques. E O F T

Xn

Co

Xi

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4) IDENTIFICATION DES SUBSTANCES DANGEREUSES Une mesure importante qui permet de travailler en scurit avec des substances dangereuses est la mise au point d'un systme d'identification et d'information efficace qui doit permettre d'identifier rapidement les substances, de noter les risques dus ces produits et de recommander des mesures prventives. On trouve des listes de substances dangereuses avec leurs noms, symboles de dangers ventuels, catgories de risques : phrases R (risques) et S (scurit). 5) ETIQUETAGE L'objet de l'tiquetage est d'indiquer simplement la substance dangereuse qui est contenue dans n'importe quel produit et cette mention est en relation troite avec la surveillance mdicale et les conseils du mdecin du travail. L'tiquette sur tout emballage ou rcipient doit comporter les indications suivantes : 1. le nom de la substance 2. les mentions spcifiques de danger et/ou les symboles qui s'y rapportent 3. les phrases mentionnant les risques particuliers drivant de ces dangers : Phrases R (risques) 4. les phrases mentionnant les conseils de prudence destins pallier tous ces risques : Phrases S (scurit) 5. le nom et l'adresse du fabriquant ou de toute autre personne qui met cette substance la disposition des utilisateurs.

2 - Consignes gnrales de scurit

- Eliminer le risque. - Circonscrire le risque la source. - Prendre des mesures de prvention matrielle. - Utiliser des moyens de protection. - Au cours des manipulations de chimie, manipuler toujours au-dessus de la table : les souliers ne rsistent pas l'action des produits chimiques !

3 - Prcautions ncessaires
La manipulation des produits dangereux doit tre entoure de toutes les prcautions ncessaires : Porter des lunettes de protection. Ne jamais pipeter la bouche. Utiliser des pipettes automatiques pour les prlvements. Eviter le contact avec la peau. Porter des gants lors de la manipulation de produits corrosifs ou hautement toxiques par contact (produits allergisants). Travailler si possible sous une hotte ventile pour les produits volatils toxiques par inhalation, ou pour toute raction susceptible de dgager des gaz toxiques, et loin d'une source de chaleur ou d'lectricit statique. Ne jamais jeter l'vier des solvants toxiques ou inflammables. Se laver soigneusement les mains aprs la manipulation des produits toxiques. Ne jamais fumer, boire, manger, dans la salle de Travaux pratiques. 34

Pour utiliser des produits volatils, toxiques, il est indispensable de porter un masque de protection respiratoire. Ne pas stocker en laboratoire des quantits importantes : * de solvants * de ractifs susceptibles de se dcomposer spontanment temprature ambiante * de produits ragissant violemment avec l'eau * de produits toxiques, qui seront gards sous cl.
PREVENTION DES RISQUES D'INCENDIE ET D'EXPLOSION 1) Incendie et explosion

La dclaration d'un feu est conscutive la coexistence de trois conditions : a- prsence d'un combustible b- prsence d'un comburant c- prsence d'une source de chaleur. Le feu peut prendre un caractre explosif pour certaines proportions du mlange combustiblecomburant.
L'lectricit peut tre aussi l'origine d'incendie, d'explosion, de brlures ou d'lectrocution. Attention aux mains mouilles ! ! ! A partir de quelques milliampres, le courant peut tre dangereux ds l'instant o les tensions sont suprieures quelques dizaines de volts. Dans les conditions habituelles, la rsistance du corps humain est gnralement comprise entre 1000 et 2000 ohms. Un courant d'intensit 0,22A est largement suffisant pour entraner la mort.

La suppression du risque d'incendie ou d'explosion est associe la suppression de l'une de trois conditions (appeles cts du "triangle" du feu) : a- suppression du COMBUSTIBLE Une bonne ventilation permet d'empcher l'accumulation des vapeurs volatils combustibles qui peuvent s'accumuler dans la salle et former avec l'air un mlange explosif. La ventilation consiste avoir environ 3 ou 4 trous de 10 15 cm de diamtre rpartis en bas et sur toute la longueur de la salle. b-Suppression du COMBURANT On travaille en prsence d'air, il est difficile de supprimer ce risque. c- suppression de CHALEUR On doit viter toute surchauffe locale.
2) Moyens d'intervention a- Cas d'incendie Au laboratoire, les feux qui prennent accidentellement peuvent s'teindre rapidement si le poste de travail est bien ordonn et si nos ractions sont rapides et sres. b- Lutte contre le feu Pour arrter un incendie, il faut liminer l'un des trois cts du "triangle" du feu.

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c- Les types de feu Classe A Nature

B C D

Feux de matriaux solides (cellulose, bois, tisss, papier) dont la combustion se fait gnralement avec formation de braises. Ces feux sont parfois dits "feux secs". Feux de solides liqufiables ou de liquides (produits ptroliers, alcool, huiles, solvants organiques, graisses). Ces feux sont parfois dits "feux gras". Feux de gaz : mthane, propane, butane. Feux spciaux: mtaux, ..., phosphore.

d- Les extincteurs utiliss au laboratoire Les deux extincteurs les plus utiliss sont : - lextincteur poudre (d'hydrognocarbonate de potassium, de phosphate d'ammonium ...) propulse par du dioxyde de carbone - lextincteur dioxyde de carbone : lors de sa libration dans l'atmosphre, celui-ci subit une dtente qui s'accompagne d'un refroidissement, une partie passe l'tat solide et provoque un refroidissement et un touffement.

4 - Les rgles respecter GARDEZ VOTRE SANG FROID !

1) USAGE DE LA VERRERIE

Tenez un tube essais entre le pouce et l'index, prs de l'ouverture, jamais au milieu du tube. Ne tenez jamais le tube essais en dirigeant l'ouverture vers votre visage ou vers celui de votre voisin. Tenez le tube inclin selon le grand axe de la table, l'ouverture du ct du paroi, de la cloison, des fentres. Pour mettre un solide en poudre dans un tube essais, utilisez une spatule ou un papier pli en deux. Descendez lentement l'agitateur dans un tube essais. Ne remplissez jamais compltement un tube essais, surtout s'il faut chauffer : 2 cm de hauteur de liquide, ou un quart de cm de hauteur de solide, pas plus. [Pour enflammer un gaz qui se dgage d'un tube essais, mettez la main sur le ct du tube et prsentez l'extrmit de l'allumette juste au-dessus du tube. Attention aux flammes incolores, trs peu visibles, comme celles du dihydrogne (H2)].

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Pour enfoncer un tube de verre dans le trou d'un bouchon, saisissez-le dlicatement entre le pouce et l'index, travers un chiffon, prs de l'extrmit que vous voulez mettre dans le bouchon. Humidifiez lgrement le tube. Enfoncez-le en tournant. Si le tube est coud, ne mettez jamais la paume de la main sur la partie coude. Aprs usage, posez le tube dlicatement dans le portoir : tenez-le jusqu' ce que le fond touche le socle.
2) MANIPULATIONS DE LIQUIDES Pour verser un liquide d'un flacon dans un tube essais, ou d'un tube essais dans un autre, tenir les rcipients inclins. S'il s'agit d'un liquide corrosif, tenir le tube avec une pince. L'tiquette des flacons doit se trouver diamtralement oppose au ct o coule le liquide. Pour protger les doigts, tenir le flacon en mettant le pouce d'un ct de l'tiquette, l'index et le mdius de l'autre. Pour viter tout incident, verser lentement le liquide. Sil sagit dune dilution dacide ou de base concentr, verser lentement lacide dans leau, en remuant : la dilution de ces liquides dgage beaucoup de chaleur. Ne jamais verser deau dans un acide ou une base concentre. Il y a risque de projections. Ne jamais mlanger de liquides sans l'avis de lenseignant. Il y a risque de ractions brutales et de projections. Ne jamais verser un liquide froid dans un liquide chaud, il y aurait des projections brutales et corrosives. Refroidir d'abord le tube essais et son liquide chaud en le mettant dans le porte tubes. N'ajoutez surtout pas de liquide froid dans le tube chaud. Pour mlanger deux liquides, ne jamais retourner sur le pouce. Utiliser lagitateur rotatif ou boucher le tube avant agitation en maintenant le bouchon en place par pression de lindex. Certaines ractions entranent un dgagement gazeux : ATTENTION AUX PROJECTIONS ! Pour dceler une odeur, ne mettez jamais le rcipient sous le nez. Si le tube contient un produit chaud, il y a risque de brlures aux yeux et dans le nez, lorsque le gaz est corrosif et que le dgagement est abondant.

N'aspirez jamais aucun liquide corrosif ou toxique avec un tube effil dit "pipette". Pour prlever du liquide dans un flacon ou dans un tube, plongez la pipette dans le liquide. Lorsqu'il aura fini de monter, fermez la pipette avec l'index et tenez-la entre le pouce et le mdius. S'il faut absolument aspirer, utilisez de prfrence une pipette automatique. Tenez toujours la pipette contenant le liquide au-dessus de la table. Ne pas pipeter les solvants la pipette automatique ou pipette jetable en plastique, mais avec une pipette en verre.
3) CHAUFFAGE DE PRODUITS CHIMIQUES 1) Le brleur

Avant d'allumer le brleur, assurez-vous que le tube souple d'arrive du gaz est pos sur la table de manire telle qu'il ne risque pas de faire basculer le brleur. Pour allumer, fermez l'arrive d'air, ouvrez le gaz, allumez en mettant la main du ct du brleur, surtout pas au-dessus. Puis ouvrez progressivement l'arrive d'air jusqu'au moment o

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un cne bleu apparat dans la flamme. Fermez un peu l'arrive d'air pour faire disparatre le cne bleu. Vous devez avoir une flamme rgulire et incolore. Tenez-vous buste vertical, tte redresse. Maintenez vos cheveux. Eventuellement, faites un chignon ou portez un filet. Les cheveux pourraient s'enflammer. NE JAMAIS LAISSER LES CHEVEUX LIBRES. Maintenez le brleur l'cart du robinet d'arrive du gaz. Il arrive parfois que la flamme rentre dans le brleur, celui-ci ronfle, la flamme est verte. Attention, le brleur devient brlant en bas. Il enflamme parfois le tube souple. Fermez alors le robinet d'arrive du gaz. Si vous ne le pouvez pas, demandez lenseignant de fermer le robinet de la salle. Enfin arrosez abondamment avec de l'eau le tuyau souple s'il continue s'enflammer. Surtout ne soufflez pas. Lorsque le chauffage d'un tube ou d'un ballon est termin, mettez le brleur en flamme clairante, si possible, en fermant l'arrive d'air. Si la flamme reste invisible, virole ferme, teignez-la.
2) Chauffage de produits chimiques

Pour chauffer un liquide ou un solide dans un tube essais, tenez celui-ci prs de l'ouverture avec une pince tube en bois. Tenez-la par le manche. Ne mettez jamais la pince dans la flamme, elle charbonne ou s'enflamme. Pour chauffer un liquide dans un tube essais, et plus forte raison pour le porter l'bullition, ne chauffez jamais le fond du tube: placez la surface de sparation air / liquide dans la partie chaude de la flamme incolore et dirigez l'ouverture du tube essais vers la cloison ou les fentres. Pour chauffer progressivement, dplacez doucement le tube horizontalement dans la flamme. Si l'bullition est trop rapide, ou si la raction s'emballe, soulevez-le verticalement au-dessus de la flamme et baissez-le de manire obtenir un dgagement gazeux tranquille. Pour chauffer des produits chimiques dans un petit ballon (100 ou 125 mL), tenez-le avec une pince tube essais. Prenez les mmes prcautions que prcdemment. Pour chauffer un ballon fix un support de chimie, installez-le sur une toile mtallique en bon tat. Si le feu prend dans un rcipient, ne soufflez pas. Eteignez le brleur. Prenez une toile mtallique ou une soucoupe l'aide d'une pince tube et posez-la dlicatement sur le rcipient. Attendez que la flamme s'teigne. Najoutez pas d'eau qui risque de briser le rcipient et dtaler les flammes sur la table. On peut aussi prendre une serpillire mouille et la poser tranquillement sur le rcipient. Il y a peu de risques pour que les paillasses prennent feu.
4) NETTOYAGE

Les produits chimiques contenus dans les flacons doivent rester purs. Par consquent, ne remettez jamais dans un flacon un produit ou un mlange rest inutilis, qu'il soit solide ou liquide. A la fin de la sance de manipulation, videz et rincez tous vos tubes et ballons dans les bidons Dchets rservs cet effet. Quand vous utilisez le goupillon pour nettoyer un tube, sortez-le lentement et progressivement pour viter de recevoir des claboussures de produits chimiques. Nettoyez soigneusement la paillasse ou la table quand des produits chimiques y sont tombs. Prenez un chiffon ou un papier, ventuellement tenu avec une pince pour protger les doigts. 38

Surtout n'envoyez jamais des produits chimiques sur le sol et ne jetez pas de solides ni de liquides concentrs dans l'vier. Faites couler l'eau dans l'vier trs abondamment chaque fois que vous y aurez vid accidentellement des produits chimiques.
Ne pas verser le contenu des tubes et des fioles dans lvier mais dans les bidons DECHETS ORGANIQUES ou DECHETS AQUEUX prvus pour cela. Ramassez soigneusement tout ce qui tombe sur le sol. Pensez aux accidents dont les aides de laboratoire pourront tre victimes en faisant le nettoyage des tables, des viers et du sol.

LES REGLES DE BASE

LES INTERDITS FUMER, BOIRE, MANGER TRAVAILLER SEUL PORTER DES VTEMENTS INADAPTS (flottants ou inflammables)

LES OBLIGATIONS BLOUSE EN COTON CHEVEUX LONGS ATTACHS

LES UTILES GANTS LUNETTES DE SCURIT

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PRODUITS BIOLOGIQUES
A. PAVIS

Les laboratoires de Microbiologie et dHmatologie concentrent un certain nombre de risques infectieux bactriens, viraux, parasitaires, qui sont lis la manipulation dagents pathognes ou de produits biologiques contamins (sang et ses drivs, selles, urines). En consquence, diverses mesures de prvention doivent tre prises pour assurer la scurit au Laboratoire. Les agents biologiques pathognes * au laboratoire de Microbiologie : Larrt du 18 juillet 1994 fixe la liste des agents biologiques pathognes. La classification sappuie sur diffrents critres : pathognicit et virulence, mode de transmission, gravit de la maladie, potentiel pidmique, existence dune prophylaxie et/ou dune thrapeutique. Il existe 4 classes numrotes de 1 4 : - la classe 1 comportant des micro-organismes non pathognes pour lHomme - la classe 4 des agents pathognes provoquant des maladies graves pour lHomme, pour lesquelles il nexiste pas de traitement. * au laboratoire dHmatologie : essentiellement virus des hpatites B et C, virus du SIDA Les modes de contamination La transmission peut se faire par voie transcutane et cutano-muqueuse, arienne, digestive. - voie transcutane et cutano-muqueuse : par coupure, piqre, projection sur les muqueuses ou par contact dune peau lse avec des surfaces contamines - voie arienne : par inhalation darosols - voie digestive : risque essentiellement li au pipetage. Il existe diffrents systmes daspiration qui seront imprativement utiliss. Prvention du risque infectieux Considrer tout prlvement comme potentiellement contamin et prendre pour tous les prlvements les mmes prcautions Les stratgies de prventions sont multiples et leur application sappuie sur de nombreux textes rglementaires Le respect des rgles de bonnes pratiques dHygine, la formation et linformation des manipulateurs, la dcontamination et le nettoyage du matriel, des locaux et des paillasses, llimination des dchets font partie de la politique de prvention active.

LA SECURITE AU LABORATOIRE EST LAFFAIRE DE TOUS

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GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES

F. JORAND Toute activit humaine gnre des dchets divers. Certaines activits de recherche ou denseignement produisent des dchets dangereux (dchets chimiques toxiques ou inflammables, dchets biologiques pathognes, dchets radioactifs).

I - EVALUER LES RISQUES Les dchets prsentent au moins les mmes dangers que les produits neufs correspondants. A ces dangers peuvent sajouter les risques lis la transformation spontane ou provoque des produits sous linfluence dautres produits, de divers facteurs imprvisibles ou du temps (lumire, temprature, vieillissement). A ce titre, la gestion des dchets doit tre considre comme une composante fondamentale des expriences ralises dans les laboratoires de recherche et les salles de travaux pratiques. II - PREVENIR LES RISQUES La prvention relative aux dchets de diffrentes natures est identique celle dcrite pour les activits les ayant gnrs. Pour pouvoir tre limins sans porter atteinte aux personnes et lenvironnement, les dchets ncessitent des traitements spcifiques (dtoxications chimiques ou biologiques, incinration). III - GERER LES DECHETS
Dans les tablissements, il convient dorganiser la collecte, lentreposage et lvacuation des diffrents types de dchets, car le producteur en est toujours responsable. Pour les dchets industriels spciaux (DIS), il importe quau moment de leur remise au transporteur, leur confinement soit tel quil ny ait aucun risque de porter atteinte aux personnes charges de la collecte, du transport et de llimination. Chaque enlvement doit tre obligatoirement accompagn dun bordereau de suivi de dchets industriels (BSDI). CATEGORIE DU DECHET NATURE DU DECHET FILIERES DELIMINATION

Ordures mnagres Dchets produits exclusivement par les personnels logs, les caftrias, les restaurants Dchets inertes

Ramassage municipal ou collecteur priv Collecteur priv

Mobilier, gravats, encombrants

Dchets industriels Papiers, cartons, emballages, verres non Ramassage municipal ou souills, bois collecteur priv banals (DIB)

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DECHETS INDUSTRIELS SPECIAUX (DIS)

CATEGORIE NATURE DU DECHET FILIERES DELIMINATION

DECHETS CHIMIQUES (non infectieux, non radioactifs)

-Liquides Solvants halogns ou non, acides, bases, colorants, produits photographiques, huiles -Solides (y compris les conteneurs vides), rsidus de chromatographie, gants, lames de microscope, aiguilles Cas particulier de lamiante Flocage, cordons, plaques, poussires et tous matriaux contenant de lamiante Liquides Inactivs ou non Solides Inactivs ou non, dchets dactivits de soins, de recherche, tous objets piquants et coupants, cadavres danimaux, litires

Emballages appropris, rglementaires, et tiquets

Enlvement et traitement par une entreprise spcialise et agre, BSDI

Dchets en emballages spciaux, double enveloppe, tiquets

Enlvement et traitement par une entreprise spcifique spcialise et agre, BSDI spcifique

DECHETS BIOLOGIQUES (non radioactifs)

Emballages usage unique, inviolables et tiquets Ces dchets doivent tre soit incinrs, soit prtraits par des appareils de dsinfection Conteneurs rglementaires, tiquets fournis par lANDRA

Stockage temporaire en chambre froide ou conglateur Enlvement et traitement par une entreprise spcialise agre, BSDI Priode suprieure 100 jours Enlvement par lAgence Nationale pour la Gestion des Dchets Radioactifs (ANDRA)

DECHETS RADIOACTIFS

Solutions aqueuses (LA) Solvants organiques (LS) Solides putrescibles (SO) Solides compactables (SP) Flacons de scintillation en polythylne (SL) Flacons de scintillation en verre (SLV)

bonbonnes

fts mtalliques

Stockage en conteneurs appropris, tiquets et dats Aprs dcroissance : 10 priodes partir du dernier dpt, enlever le pictogramme radioactif

Priode infrieure 100 jours Grs selon leur nature comme des dchets banals chimiques biologiques

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SECURITE LES MINERAUX 1 - Oxydants fort concentrs risquant de donner des ractions explosives en prsence de rducteurs - Acides perchloriques - paractiques -priodiques persulfuriques (acide de caro) - Perchlorates - paractates - priodates -permanganates... De faon gnrale tous les persels et tous les paracides. 2 - Produits concentrs risquant de provoquer de trs fortes lvations de temprature - Anhydride sulfurique - Anhydride actique - Chlorure de sulfuryl - Chlorofluorure de sulfuryl... et de faon gnrale, tous les olums. 3- Produits risquant de senflammer au contact de leau - Sodium - Nitrure de sodium - Hydrure de sodium - Potassium... et tous les alcalins et alcalino-terreux sous forme mtallique. Produits risquant de senflammer au contact de lair : - En particulier, phosphore blanc.

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SECURITE MELANGES A EVITER DANS LES BONBONNES CEDILOR ORGANIQUES Tous les dchets pouvant prendre en masse dans les bonbonnes. Tous produits risquant de ragir spontanment de faon trs exothermique ou explosive. 1 - Composs vinyliques - Chlorure de vinyl - Chlorure de vinylde - Styrne - Acrylates, etc... 2 - Composs carbonyls - Anhydrides organiques - Chlorures dacides 3 - Produits azots - Tous nitrites et nitres de faon gnrale 4- Composs liaisons non satures conjugues - Butadine - Nitrite acrylique - Acroline - Crotonaldhyde, etc... 5 - Produits auto-ractifs - Ctne - Oxyde dthylne 6 - Paroxydes - Actylniques - Tous les peroxydes et tous les actylniques

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LISTE DES MELANGES A EVITER

01 Acides minraux 02 Acides organiques 03 Bases (ammoniaque exclu) 04 Amines et alkanolamines 05 Composs halogns 06 Alcools, glycols et thers de glycol 07 Aldhydes 08 Ctones 09 Hydrocarbures saturs 10 Hydrocarbures aromatiques 11 Olfines 12 Huiles de ptrole 13 Esters 14 Monomres et esters polymrisables 15 Phnols 16 Oxydes dalkylnes 17 Cyanohydrines 18 Nitriles 19 Ammoniac (NH3) 20 Halognes 21 Ethers 22 Phosphore lmentaire 23 Soufre ltat de mlange 24 Anhydrides dacide

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

mlange viter

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SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX

L. DIEZ A) Rappels

Loi (Code du travail) Responsabilits pnales Rappel sur l'organisation universitaire de l'Hygine et de la Scurit (Comit Hygine et Scurit)
B) Scurit des btiments

Plan de prvention Scurit incendie Savoir lire un plan et utiliser les renseignements fournis Respect des indications et des installations
C) Scurit au laboratoire

Rappel sur les BPL (port de blouse, lunettes, gants) Exigences des manipulations (hottes, paillasses) Les interdits Prvention - Responsabilit Que faire en cas d'incident ? Cahier Hygine et Scurit

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MESURE DES VOLUMES ET DES MASSES

VERRERIE, PIPETAGE, PESEE

VERRERIE ET VOLUMETRIE

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VERRERIE, PIPETAGE, PESEE

UTILISATION DES PIPETTES

J. COULON

1 Choix des pipettes utiliser

Ce choix s'effectue en fonction : - de la nature du liquide : ne pas utiliser de pipettes en plastique pour les solvants organochlors. Pour tous les liquides dangereux (acides et bases concentrs, toxiques), utiliser une propipette, ou une pipette automatique.
NE JAMAIS PIPETER A LA BOUCHE - du volume dsir : utiliser, dans la mesure du possible, des pipettes jauges deux traits. Il est par contre ncessaire dutiliser des pipettes gradues, lors du prlvement de liquide visqueux (exemple : sang total) ; dans ce cas, il est recommand de laisser le liquide scouler trs lentement, et de rincer la pipette une fois avec de leau distille ou un ractif de faon viter les pertes. Lors de lemploi de pipettes gradues, choisir une pipette dont le volume est lgrement suprieur au volume du liquide mesurer (exemple : mesurer 3,2 mL avec une pipette de 5 mL). Pour des volumes infrieurs 0,100 mL, utiliser de prfrence des micropipettes en verre ou automatiques.

2 - Utilisation des pipettes

2.1. Rgles gnrales Une pipette propre ou sale ne doit jamais rester sur une paillasse pour des raisons de propret et de scurit. Les pipettes propres doivent tre ranges sur un porte-pipettes. Aprs utilisation, les pipettes en verre doivent tre places dans un rcipient contenant une solution dattente de nettoyage (sulfochromique trs dilu ou dtergent). Les pipettes doivent y tre places pointes diriges vers le haut. En gnral, le rcipient cylindrique contient un panier amovible qui permet le transfert de toutes les pipettes dans un autre rcipient contenant du mlange sulfochromique pur. Aprs un passage bref (quelques heures) dans le mlange sulfochromique, le panier est transfr dans un laveur automatique et lensemble subit un grand nombre de rinages par de leau non distille. Ce rinage est assur par un systme de siphon qui permet la vidange intermittente et rapide de lensemble du bac, alors que lentre de leau est permanente, mais lente. Puis les pipettes sont sches individuellement par passage dair chaud (50C au maximum). 2.2. Rgles de pipetage - Vrifier que la pipette est propre, sche, non brche aux parties infrieures et suprieures

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- Pipeter le liquide jusqu' un niveau lgrement suprieur au trait de jauge - Essuyer l'extrieur de la pipette l'aide d'un papier absorbant - Ajuster le niveau suprieur en maintenant la pipette verticale, les yeux restant constamment au niveau du mnisque infrieur du liquide qui doit affleurer le trait de jauge - Laisser couler lentement le liquide jusqu'au trait de jauge infrieur - La pointe de la pipette repose dlicatement sur la paroi du rcipient qui est lgrement inclin, la pipette tant bien droite - Aprs avoir dlivr le volume choisi, rejeter le reste du liquide (sauf sil sagit dun ractif quil convient dconomiser ou dun ractif toxique ou polluant) - Placer la pipette sale dans une prouvette de plastique remplie deau. Ceci permettra dviter que les pipettes ne se bouchent.
Remarques : 1) Il est essentiel d'essuyer l'extrieur de la pipette, surtout lorsque l'on mesure de petits volumes ou que le liquide est visqueux. 2) On ne souffle dans une pipette que si elle est coulement total et d'un volume infrieur 1 mL. 3) Certains solvants sont volatils (ther, dichloromthane, ) ou plus denses que leau (solvants chlors). Laisser le liquide scouler plus rapidement que dans le cas dune solution aqueuse en vitant les pertes au moment du transfert.

3 - Utilisation des micropipettes

TRES IMPORTANT - Avant utilisation, CHOISIR LE BON INSTRUMENT en fonction du volume dsir, par exemple : * de 40 200 L : utiliser une P 200 (embout jaune) * de 200 1000 L : utiliser une P 1000 (embout bleu) Il est ABSOLUMENT INTERDIT d'utiliser les P 200 et P 1000 en dehors des "fourchettes" ci-dessus prcises. - Aucun liquide ne doit pntrer dans le corps de la micropipette. Les solutions prleves ne doivent tre en contact qu'avec les cnes de prlvement bleus ou jaunes. La micropipette doit toujours tre maintenue verticalement et l'extrmit infrieure vers le bas.

Suivre la squence suivante pour le pipetage (s'exercer quelques fois avec de l'eau distille avant de raliser votre premier prlvement) : - slectionner le volume dsir (tourner le bouton suprieur vers la droite ou la gauche), - bien enfoncer un cne bleu ou jaune l'extrmit infrieure de l'appareil, - presser le bouton suprieur au premier cran (cran intermdiaire) avec le pouce, - immerger alors une partie du cne dans le liquide prlever, - laisser remonter lentement le bouton suprieur vers sa position normale (ne pas lcher brusquement celui-ci) en exerant une lgre contre-pression avec le pouce, - vrifier qu'il n'y a pas de bulle(s) d'air au sein du volume prlev, - essuyer le cne plastique avec du papier filtre, - transfrer le liquide pipet dans le rcipient voulu en posant l'extrmit infrieure du cne sur la paroi du rcipient lgrement inclin (environ 60) et en appuyant sur le bouton suprieur de faon parvenir au premier cran puis au deuxime cran, c'est--dire fond. Aprs quoi, normalement, il ne doit pas subsister de liquide dans le cne. Toutefois, pour 49

des liquides viscosit leve, il restera toujours un volume rsiduel sur les parois qui se concentrera peu peu la base du cne. Dans ce cas, il est possible de limiter les erreurs de pipetage : a) en ralisant des aller-retours successifs avec le bouton suprieur. Pour ce faire, procder lentement pour viter que du liquide rentre dans le corps de la micropipette, b) en rinant 2 - 3 reprises l'intrieur du cne avec le mlange eau distille + solution visqueuse.

4 - Contrle des pipettes

Le contrle des pipettes fait partie des vrifications ncessaires en chimie. Deux procds sont utiliss : - le contrle gravimtrique Un bcher de volume appropri est tar sur une balance. La pipette est remplie deau distille qui est ensuite introduite dans le bcher. Cette opration est rpte 30 fois en moyenne. Les rsultats des peses sont ensuite analyses de manire statistique. Remarque : Contrler la temprature de travail car la densit des liquides dpend de la temprature. Eviter toute vaporation. - le contrle photomtrique Il consiste pipeter un volume donn dune solution colore, lintroduire dans un volume de diluant donn et mesurer labsorbance de la solution obtenue. On peut alors dterminer lexactitude et la prcision des pipettes :
- expression de la prcision La prcision reprsente la distribution statistique des valeurs obtenues par des mesures rptes, effectues sur un mme chantillon, dans des conditions constantes et dtermines. On calcule, partir de ces mesures, le manque de prcision ou imprcision . Celle-ci peut sexprimer par lcart type de la distribution de ces mesures, lcart type relatif la moyenne, ou par le coefficient de variation, qui est le plus classiquement utilis. - expression de lexactitude Lexactitude reprsente la qualit de laccord entre la valeur mesure et la valeur vraie, en dehors des erreurs fortuites. Linexactitude peut tre apprcie par la diffrence (positive ou ngative) entre la moyenne dune srie de mesures rptes et la valeur vraie. Dans le cas du contrle gravimtrique, la valeur vraie doit tenir compte de la valeur de la densit de leau la temprature utilise. Dans le cas du contrle photomtrique, la valeur vraie est donne par la valeur de labsorbance de la dilution prpare dans un volume final de 100 mL. Exemples Les valeurs de prcision et dexactitude varient en fonction du volume des pipettes. Le tableau ci-dessous, issu de spcifications de pipettes automatiques du commerce, en donne quelques exemples.

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Capacit 1 L 2 L 5 L 10 L 20 L 25 L 50 L 100 L 2500 L

Erreur de justesse 2,5 % 2,0 % 1,5 % 1,0 % 0,6 % 0,6 % 0,6 % 0,6 %

Erreur de rptabilit 1,8 % 1,2 % 0,8 % 0,5 % 0,2 % 0,2 % 0,2 % 0,2 %

Conditions opratoires : Eau distille Temprature de rfrence : 20C Nombre de mesures : 15 Ainsi, une pipette de 1 L dlivre, daprs ce constructeur, un volume compris entre 0,975 L et 1,025 L. Par contre, le volume (compris entre ces deux extrmes) est dlivr avec un coefficient de variation de 1,8 %. Il est noter que plus les volumes sont petits, plus les erreurs sont grandes.

5 - Utilisation des propipettes

La propipette est un systme utilis lorsque l'on veut pipeter des liquides DANGEREUX. Le modle utilis aux T.P. est le ballon pipettes "ASSISTENT" modle standard.

Le mode d'emploi est le suivant : 51

1-. Tenir le ballon dans le creux de la main, au moyen du pouce et de l'index, appuyer sur la soupape R et exercer une pression sur le ballon avec les doigts, pour en chasser l'air. 2-. Avec le pouce et l'index, appuyer lgrement sur la soupape A (Aspiration) pour recueillir la quantit de liquide dsire. 3-. Pour obtenir l'coulement du liquide, appuyer sur la soupape M avec le pouce et l'index. 4-. Pour l'coulement total et rapide, appuyer sur la soupape M et fermer l'orifice avec l'index de la main gauche en exerant une pression sur l'olive au moyen du pouce et du majeur.
Nota : Au cas o du liquide aurait pntr l'intrieur du ballon, prvenir de suite le responsable des T.P.

6 - Utilisation des distributeurs de ractifs

Le distributeur est un appareil destin dlivrer avec prcision, de manire rptitive, rapide et simple un volume dtermin. On lemploie pour les produits toxiques avec lesquels il ne faut pas tre en contact ou pour les travaux en srie qui ncessitent la rptition des oprations de pipetage. La plupart des distributeurs sont composs dun flacon rservoir contenant le liquide prlever sur lequel est mont un piston que lon fait courir jusqu une bute rglable. Les volumes dlivrs peuvent varis de moins de 0,1 plus de 50 mL selon les modles. La reproductibilit est de lordre de 5 %. Les parties de lappareil venant en contact du liquide sont en verre ou en PTFE ; ils peuvent convenir toutes sortes de ractifs, nanmoins les produits trop visqueux risquent de bloquer le piston. De mme, certains sels peuvent cristalliser dans la seringue.
POUR UTILISER LAPPAREIL : Lors de la premire utilisation, on ne se fiera pas aux volumes indiqus mais on talonnera soi-mme lappareil et on fixera la bute au volume dsir. Pour lutilisation en srie, on doit dabord orienter convenablement la pointe de la pipette vers le rcipient destin recevoir le liquide. On te ensuite le capuchon pour librer lorifice ventuellement, puis on soulve (ou on enfonce selon le modle) le piston jusqu la bute avec prcaution et on le laisse revenir sa place dorigine. La meilleure reproductibilit est obtenue en manuvrant lentement. On doit reboucher la pointe de la pipette aprs utilisation. Les distributeurs existent actuellement en trs grand nombre dans le commerce et tous les modes opratoires ne peuvent tre dcrits ici. Certains seront utiliss aux Travaux Pratiques. Leur contrle seffectue de la mme manire que pour les pipettes.

7 - Manipulation : initiation au maniement des micropipettes automatiques

7.1. Ralisation de gammes dtalonnage par diffrentes mthodes de dilution

- Matriel : - des micropipettes et cnes - des tubes hmolyse - un spectrophotomtre - un vortex - des cuves de spectrophotomtre de 1 mL en plastique

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- Mode opratoire : dilutions dans un volume final constant : - Dans des tubes hmolyse, introduire des volumes croissants de colorant une concentration donne: 10 L, 50 L, 100 L, 150 L, 250 L, 500 L - Complter un volume final de 1 mL.
7. 2. Contrle gravimtrique dune micropipette

- Matriel : - 2 bchers de 100 mL - eau distille temprature ambiante - une micropipette - une balance - Protocole : - tarer un bcher sur la balance - rgler la pipette sur un volume de votre choix - pipetter leau distille et ensuite lintroduire dans le bcher - rpter 15 fois la mesure - renouveler lopration pour un volume diffrent affich sur la micropipette. - Expression des rsultats : Calculer le coefficient de variation correspondant vos mesures pour un volume donn.

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PESE
F. BONNEAUX - J. COULON - D. DECOLIN - B. LEININGER-MULLER - C. ZINUTTI

La pese est lopration pharmaceutique de base par excellence. A lofficine, elle conditionne la qualit des prparations ralises. Nombreuses sont les recommandations des Bonnes pratiques de prparations officinales , normes officielles, qui sappliquent au bon usage des balances : Le matriel ncessaire la prparation est en bon tat de fonctionnement et de propret - La pese des principes actifs fait lobjet dune surveillance toute particulire du pharmacien : dans le cas des substances vnneuses notamment, le pharmacien procde une vrification de la pese Procdures gnrales : elles concernent notamment : .. la maintenance et lentretien du matriel (balance par exemple) . Nombreux sont les autres domaines dactivit pharmaceutiques concerns par la pese : la possession dune balance de prcision est obligatoire dans les laboratoires danalyse mdicale ; des peses prcises sont primordiales en recherche comme dans lindustrie

I Matriels
A Balances 1 - Paramtres dfinissant les qualits dune balance a) Justesse : cest--dire capable de fournir les mmes indications (maintien en parfait quilibre dans le cas dune balance flau) sous des masses gales quelles que soient leurs position et emplacement, aussi bien qu vide b) Fidlit : cest--dire capable de donner toujours les mmes indications avec les mmes masses c) Sensibilit : cest--dire capable de rpondre (dosciller dans le cas dune balance flau) avec une quantit minimum de masse. Ainsi, il existe des balances dites sensibles au milligramme, au centigramme d) La porte, qui est la masse maximale mesurable avec linstrument La vrification obligatoire et priodique des instruments de mesure a pour but prcisment de contrler la conservation de ces qualits essentielles. 2 Types de balances Au cours de vos tudes et dans votre vie professionnelle, vous rencontrerez essentiellement 4 types de balances. a) Balance de Roberval Cest la balance plateau la plus couramment employe pour mesurer les masses leves. Sa sensibilit est de lordre du gramme et peut supporter des poids maxima de 2 15 kilogrammes selon les modles. Pratiquement, on lui rserve, en pharmacie, les peses suprieures 5 g. Le flau est muni de 3 couteaux (1 mdian, 2 latraux) ; sur les flaux latraux, se trouvent 2 tiges verticales supportant les plateaux. Un contre-flau infrieur relie les 2 tiges verticales pour que celles-ci conservent toujours leur position. Un cadran central permet de suivre les oscillations. Au repos, cette balance est donc toujours en position oscillatoire. On lutilise avec des masses en laiton gnralement (de 1 g 1000 g).

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b) Trbuchet Cest un type de balance permettant des peses plus sensibles. Sa porte est gnralement de 100 g ou 200 g avec une sensibilit de 0,05 g ou 0,10 g. Le flau est reprsent par une barre horizontale rigide, le couteau central est perpendiculaire au flau ; aux deux couteaux latraux, sont suspendus les plateaux. Pour mnager larte des couteaux, les plateaux reposent sur un socle en bois et sont mis en suspension au moment de la pese par la manuvre dun levier ou dun bouton. On lutilise avec des masses en laiton gnralement (> 1 g), correspondant la porte de linstrument et avec une srie de lamelles mtalliques, en aluminium gnralement, pour les subdivisions du gramme. c) Balances lectriques Il sagit de balances mono-plateau. Les masses sont intgres dans lappareil et sont slectionnes manuellement. Leur mode de fonctionnement, leur porte et leur sensibilit varient selon le modle considr. d) Balances lectroniques et/ou analytiques Il sagit de balances mono-plateau. Lappareil fonctionne sans flau ni couteau et il possde un systme de tarage automatique (cf NB1). Leur porte et leur sensibilit varient selon le modle considr. Ce type dappareillage, le plus simple manier, supplante les autres balances de prcision. Nota : Pour une meilleure prcision des mesures, ces balances, except le type Roberval, peuvent tre protges par une cage transparente. B Petit matriel de pese En fonction de la nature de llment peser, on utilisera comme tare soit : - un verre de montre (cas le plus gnral) - un sabot de pese - un papier non absorbant, anti-humidit et souple (pas de papier filtre donc pour une pese prcise) - une feuille daluminium - un bcher - une fiole jauge En pratique, chaque fois que cela est possible, il est prfrable dviter le transfert de la substance pese, cest--dire quil est prfrable, soit de peser directement dans le rcipient dans lequel la substance doit tre utilise, soit dintroduire lensemble (substance pese + support) dans ce rcipient. Si un transfert est ncessaire, il conviendra le cas chant de bien rincer le matriel ayant servi la pese et de joindre les eaux de rinage la solution prpare, ou doprer une pese par diffrence (NB2). NB1 : La tare est la masse dun rcipient vide. Le tarage consiste amener la lecture 0 avec la tare pose sur la balance. NB2 : La pese par diffrence consiste mesurer lensemble tare + produit peser (m1), transfrer le produit peser, puis mesurer la tare (m2). La masse du produit transfr est la diffrence entre les 2 mesurer (m1 m2). NB3 : Dans le cas des peses prcises sur papier ou feuille daluminium, les dplacements dans le laboratoire sont prohibs.

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NB4 : Dans le cas dun liquide, connaissant sa masse volumique, il peut tre plus facile de mesurer un volume que de raliser une pese.

II Principes et mthodes de pese

Certaines mthodes sont spcifiques un matriel donn, tandis que des principes gnraux prvalent dans tous les cas. A Principes gnraux 1 - Ordre et propret Lordre et la propret simposent pour les peses comme pour toutes les oprations pharmaceutiques Nettoyage de la balance et de son environnement Protection des plateaux de la corrosion (ex : Iode, Nitrate dargent) par un papier Elimination de tout ce qui peut conduire une confusion ou une contamination 2 Qualit de la pese a) Le choix de la balance doit tre adapt la masse dterminer. Ainsi, il faut tenir compte de la porte maximale, de la porte minimale, de la sensibilit et de la prcision de linstrument. - il ne faut pas peser une masse infrieure la pese minimale, par exemple peser 20 mg quand la porte minimale de la balance est de 100 mg ; - il faut que la sensibilit de la balance permettre de lire le dernier chiffre significatif souhait, par exemple sil sagit de peser 100 mg, une balance dont la sensibilit est de 0,01 g ne permettra de peser que 0,10 g cest--dire 10 cg. Alors quune balance dont la sensibilit est de 0,001 g permettra de peser 0,100 g cest--dire exactement 100 mg ; - il faut veiller ce que la prcision de la balance soit suffisante. Par exemple, il ne faut pas peser 5 mg sur une balance dont lincertitude (m) est de 1 mg : dans ce cas, un affichage de 5 mg signifie que la pese est comprise entre 4 et 6 mg, ce qui reprsente (m) une incertitude relative m considrable (20 %). b) Il importe de rflchir au but de la pese. Un compos destin prparer un talon primaire ou une prise dessai pour un dosage devront tre pess avec le plus grand soin. A ce propos, on utilise parfois dans les polycopis de Travaux pratiques la formule peser environ exactement . Si on considre par exemple ltalonnage dune solution de KMnO4 environ 0,1 N, celui-ci est ralis laide dune solution talon de sel de Mohr 0,1 N (392,13 g/mole) quil convient de prparer extemporanment. Si on dsire prparer 100 mL de cet talon primaire, la pese idale devrait tre 3,9213 g. Dans ce cas, peser environ exactement signifie quil ne faut pas chercher avoir 3,9213 g (on peut y passer des heures), mais quil faut connatre avec prcision ce que lon a pes, cette connaissance permettant de calculer le titre exact de ltalon primaire (si on pse 3,9950 g, le titre de la solution de sel de Mohr sera de 0,102 N). c) Dans le cas de masses trs faibles (de lordre du mg), il vaut mieux peser une quantit plus importante et procder par dilution Cas n 1 : solution talon : prparer une solution mre partir de la pese et procder ensuite des dilutions successives de celle-ci. Cas n 2 : Incorporation de principes actifs marge thrapeutique troite en faible quantit : ralisation dune poudre mre.

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La Pharmacope dcrit la prparation dune poudre de digitaline au 1/100e par exemple : la masse de digitaline peser est de 1 g pour 100 g de mlange (ou 100 mg pour 10 g). La dilution est effectue par du lactose, additionn dun traceur en quantit dtermine, le carmin. Cette poudre mre est ensuite utilise la place du principe actif pour la suite des oprations, en tenant compte de la dilution effectue : sil faut 2 mg de digitaline dans la prparation magistrale, il sera ncessaire de peser 200 mg de poudre mre. d) En ce qui concerne la pese de composs utiliss comme ractifs auxiliaires au cours dune raction chimique ou dun dosage, on peut se contenter dune pese plus approximative. 3 Enregistrement des mesures La traabilit des mesures est dune grande importance. Ainsi, il conviendra de porter les valeurs mesures sur le cahier de laboratoire ; inscription manuscrite ou dition dun ticket de pese faisant mention de la mise zro notamment, dans le cas dune balance lectronique dote dune imprimante. B Mthode spcifique lusage dun modle de balance donn 1 Balance de Roberval 2 Trbuchet a) On ne doit jamais poser ou enlever les masses si les plateaux ne sont pas au repos. On doit donc veiller neffectuer les peses que dans ces conditions. b) On ne doit jamais effectuer une pese directement sur les plateaux. Il faut interposer des feuilles de papier quilibres. c) On ne doit pas se servir des masses au hasard mais en adoptant un ordre mthodique, cest--dire en commenant par les plus grosses ; les masses ne doivent jamais rester inutilises sur les plateaux. d) On ne doit jamais agir avec brutalit, mais au contraire avec dlicatesse, pour conserver les qualits de la balance utilise. e) Les balances et les masses doivent toujours tre dune propret mticuleuse. Les plus lgres, les subdivisions du gramme notamment, doivent tre manipules au moyen dune pince. 3 Balances lectriques et lectroniques Les points b et d concernant lutilisation du trbuchet sappliquent. Les spcificits demploi des balances lectriques figurent sur la notice dutilisation place proximit de lappareil.

III Rsultat
La faon dont sont rapports les rsultats dune pese est trs importante. La Pharmacope considre le dernier chiffre donn exact plus ou moins 5 units aprs le dernier chiffre indiqu. En consquence, lorsquon pse par exemple un gramme dune substance, crire 1 g na pas la mme signification qucrire 1,00 g (1 g : de 0,5 g 1,5 g ; 1,00 g : de 0,995 g 1,005 g). 57

Le rsultat peut tre accompagn de son incertitude absolue, par exemple : 1,00 g 0,005 g Dans le cas dune pese par diffrence, il ne faut alors pas oublier que lincertitude absolue correspond la somme des incertitudes absolues ralises sur les deux peses. Par exemple : Tare = 15,70 0,005 g Si prise dessai = 1,00 g, on lira : 16,70 g 0,005 g. Do, rsultat de la pese = 1,00 0,01 g.

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VERRERIE ET VOLUMETRIE
D. DECOLIN Chaque fois quun volume de liquide doit tre mesur, il convient de rflchir lincidence du matriel utilis sur le rsultat de la manipulation en cours. En dehors des pipettes qui sont voques prcdemment, on nutilisera pas indiffremment les fioles jauges, les burettes gradues ou les prouvettes gradues. Les fioles jauges Ce sont des rcipients en verre ou en pyrex portant un trait de jauge. Leur bouchage est ralis soit par un bouchon rod, soit par un bouchon en silicone.

Leur emploi rside essentiellement dans la prparation de solutions de concentration exactement connue et dans la dilution exacte de solutions talon ou doser. Avant dajuster le niveau dune fiole jauge, on prend soin de dissoudre compltement la masse du produit pes. Pour cela, aprs avoir ajout le produit, on verse une certaine quantit deau distille ou du solvant requis, on agite et on chauffe ventuellement trs lgrement, puis on ajuste aprs refroidissement. Lhomognisation de la solution seffectuera, fiole bouche, par de multiples retournements.
Les burettes gradues Ce sont des rcipients cylindriques trs allongs, gradus et munis leur extrmit infrieure dun robinet permettant linterruption du flux. Ce robinet peut tre rod, ce qui ncessite son graissage soigneux ; sil est en tflon, le risque de grippage est limin et aucun lubrifiant nest ncessaire.

Les burettes permettent la distribution avec prcision de volumes de ractifs titrs lors de dosages volumtriques ou lors de la prparation de gammes de concentration (capacit : 25 mL, prcision : 0,05 ou 0,1 mL). Le dosage est gnralement ralis la goutte prs, soit 0,05 mL. Pour remplir sans bavure les burettes, il est utile dutiliser un petit bcher de 50 mL par exemple. Aprs emploi, une burette doit toujours tre vide, rince avec de leau distille et stocke verticalement, robinet ouvert, et lenvers (pointe en haut).
Les prouvettes gradues Elles se prsentent sous la forme de rcipients cylindriques permettant la mesure de volumes de 5 mL 5 L. Leur prcision est trs nettement infrieure celle de pipettes ou fioles jauges et leur emploi doit se limiter aux seuls cas o la mesure approximative de volumes de ractifs est suffisante.

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MICROSCOPIE

PRINCIPE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

EXAMEN A LETAT FRAIS ET A LIMMERSION

MICROMETRIE

NUMERATION DELEMENTS FIGURES

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MICROSCOPIE OPTIQUE
Le microscope est un instrument trs utile dans de nombreuses disciplines : en Botanique, en Physiologie vgtale, en Pharmacognosie, comme en Parasitologie, en Histologie, en Hmatologie, en Biologie cellulaire, en Microbiologie, en Biologie molculaire Dans la pratique courante, on emploie un microscope fond clair. Toutefois, les laboratoires plus spcialiss utilisent des quipements permettant lexamen en fond noir, en contraste de phase, ou font appel de plus en plus la microscopie de fluorescence. Cette sance a pour objet de vous apprendre, ou de vous rappeler les principes de base du microscope fond clair (vus en 1re anne), ainsi que son mode demploi correct, et de faire quelques applications.

LE MICROSCOPE A FOND CLAIR

V. PICHON

1 BASES DOPTIQUE
A. LE TRAJET OPTIQUE La figure 1 montre le trajet optique : la source S envoie un faisceau lumineux sur lobjet O grce la lentille L1 appele condenseur. La lentille L2 ou objectif, donne de lobjet une image agrandie I1 ; une partie de cette image est reprise par la lentille L3 ou oculaire pour donner une image finale agrandie I2 (Fig. 1).

Fig. 1 : Trajet optique du microscope fond clair

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B. LES VALEURS CARACTERISTIQUES DU MICROSCOPE La limite de rsolution est dfinie par la relation dAbbe : 0,61 = n.sinu - est la limite de rsolution, cest--dire la distance minimale entre 2 points pouvant tre perus comme distincts par lil - est la longueur donde de la lumire incidente ; dans notre cas, il sagit de la lumire visible, entre 400 et 800 nm - n est lindice de rfraction du milieu situ entre lobjet et lobjectif. Sil sagit de lair, n = 1 - u est langle, exprim en degrs, de demi-ouverture de lobjectif sur lobjet. u est dautant plus grand que lobjectif est plus puissant. On utilise aussi les termes suivants : - = grandissement de lobjectif : il est gal au rapport de la taille de limage la taille de lobjet - G = grossissement de loculaire : il est gal au rapport entre langle sous lequel est vue limage de lobjet et langle sous lequel est vu lobjet lil nu une certaine distance dm (limite de vision distincte). Donc le grossissement total du microscope pour un objectif et un oculaire donns est : Gx Cette valeur doit toujours tre indique sur vos compte-rendus ct de chacun de vos dessins.

lments du microscope
oculaire objectif

microscope
platine

TP dinitiation la manipulation

condenseur clairage

1
microscope

2
microscope

Lobjectif
systme convergent constitu de plusieurs lentilles assimilable une lentille de courte distance focale de lordre du mm

Lappareil dclairage
La lampe incorpore Le diaphragme Fonction : slectionner les rayons lumineux Le condenseur Systme convergent Fonction : concentrer la lumire sur lobjet

Loculaire
systme convergent constitu de plusieurs lentilles quivalent une loupe (lentille) de distance focale de lordre du cm
3
microscope

4
microscope

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schma simplifi
oeil oculaire

microscope modlis
Oculaire Objectif F1 O1 F1 L1 O1F1 = - O1F1 = f 1 O2F2 = - O2F2 = f 2
5 6
microscope

F2

platine

objectif prparation condenseur diaphragme source lumineuse

O2

F2

L2

microscope

marche des rayons lumineux

Oculaire Objectif A2 B F1 A O1 F1 F2 A
1

position, grandeur, nature de limage

L1 A A1 objet rel image relle
1 1 1 = O1A 1 O1A O 1F' 1
1 = A 1B1 = O1 A1 AB O1 A

O2

F2

grandissement
L2 A A1 2 objet rel image virtuelle

B1

1 1 = 1 O2 A 2 O 2 A1 O 2 F2 '
2 = A 2B 2 = O 2 A 2 A 1B1 O 2 A1
8

grandissement
B2
7
microscope microscope

puissance du microscope
Pmicros = Pmicros = Pocu . obj
' = ' x A 1B 1 AB AB A 1B 1

ouverture numrique
O.N. = n sin u Limite de rsolution =

en dioptrie ()

grossissement
B A dm = AB
dm
9

Gmicros = ' = Pmicros . dm = Pocu . dm . obj = Gocu . obj Gcommercial = Gcom ocu . obj
microscope

0,61 n sin u

lentille frontale objet u platine

10
microscope

profondeur de champ
distance sparant deux points objets vu nettement

cercle oculaire
Image de lobjectif travers loculaire

11
microscope

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2 DESCRIPTIF DES MICROSCOPES OPTIQUES A FOND CLAIR

Tous les microscopes optiques sont composs du statif et de loptique. Leur dispositif dclairage est, en principe, indrglable. Les principaux microscopes fond clair (Fig. 2) que vous rencontrerez lors des divers Travaux pratiques au cours de vos tudes sont de 2 sortes : - les uns (type 1) comportent une platine fixe et une optique mobile - les autres (type 2) comportent, au contraire, une platine mobile et une optique fixe.

Fig. 2 : Les 2 types de microscope optique monoculaire Les microscopes peuvent tre mono ou binoculaires. Les microscopes monoculaires de type 1 peuvent tre penchs pour un emploi plus confortable, mais seulement lorsquon observe une prparation solide, cest--dire fixe. Les microscopes binoculaires (Fig. 3) permettent de travailler plus agrablement quand les observations sont longues ; lcartement des 2 oculaires est ajust lcartement pupillaire de lutilisateur en cartant ou rapprochant les deux manchons doculaires. Mais un seul des deux oculaires peut tre mis au point, lautre sera ensuite amen la bonne vision de lutilisateur en le tournant de manire obtenir deux images nettes et exactement superposes dans le champ de vision.

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Fig. 3 : Microscope binoculaire A. STATIF Cest lensemble de toutes les parties mcaniques du microscope. Le statif comprend : - le tube, dont la partie suprieure reoit loculaire et dont la partie infrieure est termine par une pice tournante : le revolver (R), sur lequel sont fixs dautres systmes optiques, les objectifs, au nombre de 3 ou 4. - la potence (P), qui supporte le tube et forme aussi la poigne. Elle comporte un mcanisme de mise au point macro et micromtrique, form dune crmaillre (C) et dun pignon command par 2 boutons molets B et b qui sont soit spars (type 1) soit concentriques (type 2). Ce mcanisme communique au tube (type 1) ou la platine (type 2) un mouvement vertical de grande amplitude pour la mise au point rapide (bouton B = vis macromtrique) ou au contraire de faible amplitude pour le rglage prcis (bouton b = vis micromtrique). Ces boutons sont situs sur le ct de la potence. - la platine (PL), place perpendiculairement la crmaillre, la base de la potence. Elle est perce dune ouverture circulaire permettant aux rayons lumineux darriver jusqu la prparation. Sur cette platine, se trouve soit simplement un dispositif ressort, les valets (V), soit un guide-objet (ou chariot) muni dune pince ou doigt mobile (Fig. 5), servant la fois maintenir et dplacer la prparation observer (Pr) selon les 2 dimensions, grce 2 boutons concentriques (CP). - le pied (Pi), pice lourde, qui assure la stabilit de lappareil et supporte tout lensemble.

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B. OPTIQUE Cest lensemble des systmes concourant la formation des images agrandies des objets examiner. Ces systmes sont au nombre de 3 : lobjectif, loculaire et lappareil dclairage. 1) Lobjectif (Ob) Cest un petit tube dispos prs de lobjet (do son nom) et dans lequel sont enchsses plusieurs lentilles simples ou composes ; leur nombre est dautant plus grand que lobjectif est plus puissant ou plus perfectionn. Les objectifs donnent de lobjet une image relle agrandie et renverse. La lentille infrieure qui est la seule que lon distingue est appele lentille frontale. Les microscopes utiliss couramment peuvent comporter 4 objectifs : 5, 40, 63 ou 80 et 100 ou alors 3,2 , 10, 40, 100 (lobjectif 100 tant, et lui seul, un objectif immersion). Les objectifs 3,2 ,5, 10 conviennent lexamen gnral de toute prparation. Les objectifs 40, 63 et 80 permettent dobserver un fort grossissement et sec les points intressants reprs avec les objectifs infrieurs, lors dune observation entre lame et lamelle (prparation ltat frais) ou pour une prparation fixe. Quant lobjectif immersion, il est utilis lorsque lobservation exige des grossissements importants et une dfinition particulirement bonne des images. Dans un tel objectif, la lentille frontale est amene au contact dune goutte de liquide qui a t dpose sur lobjet examin (prparation fixe uniquement). Ce liquide dimmersion est choisi pour avoir le mme indice de rfraction que le verre. Il permet une utilisation complte de louverture numrique ON de lobjectif. Remarques : Plusieurs chiffres sont gravs sur lobjectif (Fig. 4) :

Fig. 4 : Caractristiques des objectifs - le grandissement est indiqu, pour chaque objectif, par un chiffre : lobjectif 10 grandit 10 fois lobjectif 40 grandit 40 fois, etc Les objectifs 100 utiliss nos T.P sont en gnral marqus dun cercle rouge ou noir. Ils sutilisent avec immersion dans lhuile. - ct du grandissement est grav le n douverture numrique ON; par exemple : 0,30 pour un objectif 10, 0,65 pour un objectif 40, 1,30 pour un objectif 100.

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Plus ce chiffre est grand, plus petite est la limite de rsolution, cest--dire plus le microscope permet la sparation de points trs rapprochs. La limite de rsolution dun bon microscope de laboratoire mdical est denviron 0,25 m (alors que celui de lil humain normal est de 0,25 mm). Lhuile immersion permet dobtenir des ouvertures numriques plus importantes en empchant les pertes de lumire qui ont lieu par rfraction dans lair avec les objectifs sec. On emploie gnralement une huile synthtique ayant le mme indice de rfraction que la lamelle couvre-objet en verre, cest--dire 1,515. - dautres chiffres peuvent tre gravs sur les objectifs : * la longueur en mm recommande pour le tube du microscope ; le plus souvent 160, parfois 170 * lpaisseur en mm recommande pour la lamelle placer sur la lame porte-objet ; par exemple 0,17. 2) Loculaire (Oc) Cest un petit tube situ prs de lil (do son nom) et comprenant 2 lentilles. La plus petite de ces lentilles est la plus proche de lil. Loculaire gnralement employ est un n 10. Le grossissement total fourni par la combinaison des objectifs 5 et 40 avec loculaire est respectivement 50 et 400. Avec lobjectif immersion, on atteint un grossissement de 1000. 3) Lappareil dclairage Il comprend 3 parties : le condenseur (Co), la lampe incorpore (L) et le diaphragme iris (D). Le condenseur est un systme de lentilles convergentes qui concentre, sur la prparation, la lumire produite par la lampe installe dans laxe du condenseur, qui concide dailleurs avec celui du systme objectif-oculaire. Le condenseur peut tre rapproch plus ou moins de la platine au moyen dun bouton molet (Dc). Le diaphragme-iris se trouve juste en dessous du condenseur, il permet de rgler louverture du cne lumineux admis dans le systme optique du microscope et par consquent, dobtenir le maximum de pouvoir sparateur. Plus le grossissement est important, plus le diaphragme doit tre ouvert. Il existe parfois un logement pour un filtre color ou non. Les verres dpolis permettent, par diffusion, dliminer des images parasites provenant de la source lumineuse.

3 MODE DEMPLOI DU MICROSCOPE

A. INSTALLATION DU MICROSCOPE Le microscope doit tre install de prfrence lombre, loin dune fentre, sur une surface plane et stable. Pour certains modles, les plus anciens (type 1), la potence est tourne vers soi, pour les plus rcents (type 2), cest la platine qui est tourne vers soi. Pralablement toute observation, il est ncessaire de nettoyer avec un papier doux (papier Joseph) ou un linge fin non pelucheux, toutes les parties apparentes de loptique du microscope : la lentille frontale du condensateur, les lentilles frontales des diffrents objectifs et la lentille suprieure de loculaire. On place en premier lieu lobjectif ayant le plus faible grossissement dans le prolongement du tube en manuvrant le revolver jusqu sentir une encoche.

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B. REGLAGE DE LECLAIRAGE Il sagit dun systme dclairage lectrique incorpor. Aprs allumage de la lampe, on met lil trs prs de loculaire et on manuvre le diaphragme et le bouton du condenseur jusqu ce que le champ du microscope soit clair au maximum. Il est recommand de ne pas trop diaphragmer pour ne pas faire apparatre des phnomnes de diffraction parasites pouvant fausser linterprtation ; toutefois, dans le cas de prparations incolores liquides dans lesquelles les lments recherchs ont un indice voisin du milieu dans lequel ils se trouvent, il convient de diaphragmer jusqu ce quils deviennent nettement visibles (cas des examens de suspensions cellulaires ou bactriennes ltat frais et sans coloration). C. MISE EN PLACE DE LA PREPARATION Dgager laccs de la platine en la baissant au maximum (type 2) ou en montant le tube (type 1). Vrifier la propret de la lame et de la lamelle de lchantillon observer. Prsenter la prparation lendroit, lamelle et tiquette tournes vers le dessus, sans quoi il sera impossible de mettre au point avec les objectifs 40 100. Poser la prparation sur la platine en la faisant glisser bien plat avec le pouce de manire viter tout risque de rayure de la lentille frontale de lobjectif ou du condenseur. Il est rigoureusement interdit de prsenter la prparation en oblique sur la platine. Le coin de la prparation doit tre bien cal dans langle de lquerre fixe du chariot, sans cela la lame risque de sauter en cours dobservation.

Fig. 5 : Mise en place dune lame sur la platine D. MISE AU POINT

Il faut toujours commencer lobservation avec lobjectif le plus faible (objectifs 3,2 , 5 ou 10) avant de passer une observation dtaille laide des objectifs de plus fort grossissement (objectifs 40, 63, 80 ou 100). Afin de travailler correctement sans endommager le microscope, on suit systmatiquement les recommandations suivantes :

1) Observation au plus faible objectif Au moyen de la vis macromtrique, relever le tube (type 1) ou abaisser la platine (type 2). Poser la lame propre sur la platine en veillant ce que la lamelle couvre-objet soit bien au dessus. Caler la lame laide des valets ou du doigt mobile. 68

Cadrer la prparation au centre de la platine, au niveau de lorifice des rayons lumineux. En regardant lextrieur du microscope, abaisser le tube (type 1) ou remonter la platine (type 2) jusquau maximum (objectifs 3,2 , 5 ou 10). Attention, lobjectif ne doit pas toucher la lame. En regardant lintrieur du microscope cette fois, chercher lapparition de limage laide de la vis macromtrique en relevant lentement le tube (type 1) ou en abaissant lentement la platine (type 2) ; puis utiliser la vis micromtrique pour une bonne mise au point avec une image nette. Adapter le rglage du condenseur et celui du diaphragme, de manire ce que la lumire soit suffisante pour donner un bon contraste mais sans blouir. Si limage est floue, cest que loptique ou la prparation sont souilles ; procder leur nettoyage. A laide des boutons concentriques, dplacer la prparation sur la platine afin den examiner les diffrentes parties. Lorsque lendroit le plus intressant a t trouv, il faut le placer exactement au centre du champ du microscope avant de passer un objectif de grossissement suprieur. 2) Observation aux objectifs 40 ou 63 ou 80 Quand la mise au point a t faite correctement pour un objectif de faible grossissement, il est recommand de ne plus bouger la vis macromtrique lorsquon passe lobjectif suprieur ; en effet, les longueurs des objectifs sont choisies de manire ce quon puisse les placer sans endommager la prparation. Il suffit donc de placer lobjectif immdiatement suprieur en faisant tourner le revolver jusqu sentir le dclic ; puis on utilise uniquement la vis micromtrique pour affiner la nouvelle mise au point. 3) Observation limmersion : objectif 100 Quand la mise au point a t faite correctement avec lobjectif 40, ou 63, ou 80, et que la prparation est exactement centre sur le champ choisi, basculer lgrement le revolver et rester entre 2 objectifs sans toucher la vis macromtrique. Dposer une goutte dhuile immersion sur la lamelle couvre-objet, au centre de la prparation, en sassurant quil ny a pas de bulle dair. En tournant alors le revolver jusquau dclic, placer alors lobjectif 100 dans laxe du tube ; il doit toucher lhuile. La mise au point se fait en employant uniquement la vis micromtrique. Tout dplacement vertical du tube ou de la platine doit tre fait sans brusquerie et avec une extrme prudence, car il peut provoquer des rayures ou des clats irrparables sur lobjectif, et casser la prparation. Adapter le rglage du condenseur et du diaphragme : condenseur relev au maximum et diaphragme lgrement ferm. Quand lobservation est termine, on remonte le tube (type 1) ou on abaisse la platine (type 2) pour en librer laccs, on enlve la lame de la platine en la tenant horizontale et en la faisant glisser plat ; on la nettoie laide de papier absorbant imprgn dun peu dalcool ou de mlange alcool-ther (aa). On veille ne pas taler lhuile sur ltiquette de la prparation. On nettoie de mme lobjectif immersion qui ne doit pas rester couvert dhuile : il faut enlever dabord le maximum dhuile immersion avec du papier Joseph sec, sans appuyer, de manire ne pas faire rentrer de lhuile dans les ressorts de lobjectif, puis passer du papier Joseph imprgn dun peu dalcool-ther, de manire liminer toute trace rsiduelle dhuile

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 immersion. Ce procd sera mis en uvre chaque fois que vous aurez travaill immersion sur nimporte quel microscope.

E. ENTRETIEN DU MICROSCOPE On doit veiller la propret parfaite de toutes les parties optiques, notamment de la lentille frontale de lobjectif. Une simple empreinte digitale sur la lentille annule le contraste. Utiliser si possible du papier Joseph pour nettoyer les optiques, car il ne raye pas et ne peluche pas. On ne doit jamais dmonter les objectifs dun microscope. Loculaire, lui, peut tre dmont en cas de besoin pour tre nettoy ; il faut remettre les lentilles soigneusement en place ensuite. On vite de laisser le microscope en prsence de poussire, ou dans une atmosphre humide, ou au contact de vapeurs corrosives. Aprs utilisation, noubliez pas dteindre la lampe de votre microscope, aprs avoir replac lobjectif le plus faible dans laxe. Puis on protge le microscope en le recouvrant dune housse ou en le rangeant dans un coffret.

F. REMARQUES IMPORTANTES * Au cours de votre observation, il est ncessaire de manuvrer continuellement la vis micromtrique de manire percevoir les diffrents plans de lobjet, ce qui facilite la comprhension de sa structure. * Aprs un examen limmersion, on ne peut pas revenir un examen un objectif infrieur. Il faut alors procder au nettoyage de la lame avant de recommencer les mises au point successives, car les objectifs 40, 63 et 80 ne sont pas tanches et ne doivent absolument pas tre mis en contact avec de lhuile. * Si une prparation est mise au point limmersion, ne dplacez-pas votre microscope, car vous risquez de perdre le champ dobservation choisi.

4 APPLICATIONS
Faire une prparation microscopique consiste le plus souvent enfermer lobjet examiner entre 2 lames de verre, lune tant la lame porte-objet, lautre la lamelle couvre-objet. On dit que lobjet est mont entre lame et lamelle . Lobservation dune prparation peut se faire : ltat frais : soit sec, soit aprs montage dans un goutte de liquide appropri aprs coloration : soit une coloration vitale (lobjet est encore vivant quand on lexamine), soit aprs fixation. La fixation a pour but dimmobiliser les structures cellulaires, tissulaires... dans un tat aussi proche que possible de leur tat vivant. Aprs montage, pour viter la dessication et assurer une bonne conservation des prparations, on les lute en emprisonnant lobjet dans un ciment, ou lut (baume du Canada, Eukitt). Puis on tiquette la prparation : nature, coloration, date.

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Le microscope peut tre utilis pour dnombrer des cellules ou des lments. Dans ce cas, la suspension est introduite dans une cellule numration : chambre de Malassez, ou cellule de Thoma, ou encore cellule de Nageotte, de Neubauer qui possdent un quadrillage permettant de compter le nombre dlments prsents dans un volume dtermin. On peut aussi valuer la taille dlments grce au microscope. Au cours de cette sance, 3 ateliers vont vous permettre de vous familiariser avec lusage du microscope en abordant quelques applications.

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EXAMEN A LETAT FRAIS ET A LIMMERSION

M. ALBERT

1. Observation de cellules limmersion Exemple choisi : bactries fixes et colores par la mthode de Gram. Suivre les consignes prcites pour faire la mise au point. A lobjectif 100, la prparation, fixe et colore, montre des bactries de 2 sortes : - les bactries Gram positif apparaissent colores en violet fonc - les bactries Gram ngatif apparaissent colores en rose. Le microscope est remis en tat en commenant par passer du papier Joseph, ou dfaut du papier absorbant, sur les objectifs quon emploie sec, puis sur les oculaires, puis sur la platine. Ensuite, il faut nettoyer lobjectif immersion : enlevez dabord le maximum dhuile immersion avec du papier Joseph sec, sans appuyer, de manire ne pas faire rentrer de lhuile dans les ressorts de lobjectif, puis passez du papier Joseph imprgn dun peu dalcool-ther, de manire liminer toute trace rsiduelle dhuile immersion. 2. Observation de cellules ltat frais Exemple : cellules de lpiderme interne dune caille dOignon. Sectionner loignon : on voit de nombreuses cailles, entourant un bourgeon central. Prlever un lambeau de lpiderme interne dune caille, cest--dire la membrane qui tapisse sa face concave ; mettre contre la lame la partie de lpiderme qui a t coupe. Dposer dessus une goutte deau, puis une lamelle couvre-objet. Suivre les consignes prcites pour faire la mise au point. - Au faible grossissement, on voit un rseau de cellules bien dlimites par leur paroi pectocellulosique, et, lintrieur de chaque cellule, un globule rfringent : le noyau. - Passer ensuite lobservation lobjectif 40 ou 63 ; centrer sur une cellule et observer : la paroi pecto-cellulosique le noyau, sphrique, ou aplati contre la paroi le cytoplasme formant une mince couche autour de la cellule, contre la paroi la vacuole, qui occupe la quasi-totalit du volume cellulaire. 3. Observation de cellules aprs coloration vitale Exemple : cellules de lpiderme interne dune caille dOignon. Le Rouge neutre, tant un colorant vital, pntre dans la cellule sans laltrer. La cellule est vivante et on peut observer les organites intracytoplasmiques en ltat.

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Placer un fragment dpiderme doignon dans une solution de Rouge neutre pendant quelques minutes. Monter entre lame et lamelle. Suivre les consignes prcites pour faire la mise au point. Observer la vacuole colore en rouge, et le cytoplasme, non color. 4. Observation de cellules aprs coloration par le ractif de Lugol Exemple : cellules de lpiderme interne dune caille dOignon. Le ractif de Lugol va fixer les cellules (elles sont donc mortes) et colorer le noyau, les nucloles et le cytoplasme en jaune. Dposer quelques gouttes de ractif de Lugol sur la prparation, et observer la fixation progressive des cellules et la coloration des constituants cellulaires. On ne discerne pas la vacuole, car elle nest pas colore.

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MICROMETRIE
C. GANTZER

Les mesures de longueur laide du microscope reprsentent souvent le seul moyen pour dterminer avec prcision la taille dun lment. Le domaine dapplication de cette technique concerne notamment la mesure dobjets infiniment petits (cellules, agents infectieux), ou inaccessibles avec les moyens de mesure habituels (mesures effectues dans un creux), ou encore dobjets risquant dtre altrs par un instrument de mesure inadquat (prparations botaniques, cristaux fragiles). Pour ces mesures, on se sert dune chelle gradue dispose dans loculaire et appele : micromtre oculaire. Loculaire complet muni de son micromtre se nomme : oculaire micromtrique. Le micromtre oculaire mis votre disposition est un petit disque en verre poli optiquement, et muni dune chelle gradue de 10 mm divise en 100 parties. La valeur dun intervalle compris entre 2 divisions de lchelle, parfaitement dfinie pour lil, varie avec le grossissement de lobjectif, et dun microscope lautre. Cest pourquoi, avant de commencer, il est ncessaire dtalonner le microscope afin de dterminer la valeur dune division du micromtre oculaire pour chaque objectif (5, 10, 40). On se sert pour cela dun micromtre-objet. 1. Etalonnage du microscope Vous disposez : - dun oculaire micromtrique (A, sur la figure 6), comprenant une chelle gradue de 10 mm divise en 100 parties - dun micromtre-objet (B) : cest une lame de verre munie dune chelle de 2 mm divise en 200 parties (valeur dun intervalle : 10 m), que vous posez sur la platine du microscope comme une prparation. Mettez au point en suivant les consignes prcites. Vous devez voir en mme temps et distinctement lchelle gradue de loculaire micromtrique (A) et celle du micromtre-objet (B). En dplaant le micromtre-objet (B) sur la platine, et en tournant loculaire micromtrique (A), faites correspondre les 2 zros des chelles gradues, comme indiqu sur la figure 6.

Fig. 6 : Etalonnage du microscope Recherchez alors la graduation la plus loigne du zro du micromtre oculaire (A) correspondant exactement une graduation du micromtre-objet (B).

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Sachant quune division du micromtre-objet correspond 10 m, calculez la valeur dune division du micromtre oculaire. Exemple : Pour un objectif donn (grossissement 40 par exemple), on constate que 70 divisions du micromtre oculaire correspondent 0,4 mm (400 m) du micromtre-objet. Par consquent, une division = 5,7 m. Ainsi, un lment dont la taille correspond 3 divisions de ce micromtre oculaire mesure 17 m. Etalonnez le micromtre oculaire pour chaque objectif du microscope.

2. Mesure dlments figurs Le micromtre oculaire tant talonn, retirez le micromtre-objet de la platine et placez-y la prparation observer. Mettez au point en suivant les consignes prcites. A laide du micromtre oculaire et en tenant compte de lobjectif utilis, dterminez la taille de llment microscopique mesurer.

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NUMERATION DELEMENTS FIGURES

M. BEAUD

Il existe diverses chambres de comptage (chambre de Malassez, cellule de Thoma, cellule de Nageotte) qui permettent de dnombrer des lments figurs dans un volume dtermin, de manire pouvoir tablir leur concentration. Ces chambres, ou cellules, ont des quadrillages et des volumes diffrents et appropris leur utilisation. Elles ont en commun la fragilit et doivent tre manipules avec beaucoup dattention. Lors de cette sance, vous utiliserez une chambre de Malassez (Fig. 7) pour dterminer la concentration dune suspension de Levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae.

Fig. 7 : Aspect de profil et de face dune chambre de Malassez La chambre de Malassez est une plaque de verre pais munie de 2 ergots et de 2 rigoles dlimitant une surface transparente au centre de laquelle est grav un quadrillage. Les cts extrieurs de ce quadrillage central, visible lil nu malgr sa finesse, dlimitent un grand rectangle dont la surface est de 5 mm2 (Fig. 8). Lorsquon dispose une lamelle plane sur les ergots, et quon la monte correctement, elle amnage ainsi un espace de 0,2 mm de haut, ce qui, au niveau du grand rectangle extrieur du quadrillage, correspond un volume de : 0,2 x 5 = 1 mm3

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Si lon remplit cet espace avec une suspension dlments figurs, il suffit de compter le nombre dlments prsents dans ce volume de 1 mm3 (donc au-dessus du quadrillage) pour dterminer leur concentration. N.B : en Biologie, les concentrations sexpriment soit en units S.I, soit en sous-multiples du litre : le microlitre L est trs utilis. En fait, trs souvent, on compte les lments figurs dans des volumes plus petits amnags par le quadrillage, pour amliorer la prcision et diminuer le temps dexcution de cet examen.

Fig. 8 : Schma du quadrillage dune chambre de Malassez Le grand rectangle extrieur est divis par le quadrillage en 100 rectangles plus petits, ayant chacun une surface de 0,05 mm2 Chacun des 100 rectangles correspond donc un volume de 0,01 mm3 Pour plus de commodit, 25 des 100 rectangles sont sous-quadrills en chacun 20 petits carrs, ayant une surface de 25.10-4 mm2 et correspondant un volume de 5.10-4 mm3 Pour effectuer une numration, il suffit donc de remplir lespace central form par la lamelle plane et la surface centrale, entre les rigoles, avec la suspension examiner, et de dnombrer les cellules en saidant du quadrillage qui dlimite un volume exactement dtermin. 1- Montage de la chambre de Malassez : Humidifiez les ergots, positionnez la lamelle plane et faites-la glisser laide de vos pouces par des mouvements de va-et-vient jusqu ce quelle ne bouge plus. Aprs montage correct, des irisations doivent apparatre, tmoignant de ladhrence de la lamelle aux ergots. 2- Remplissage de la chambre avec la suspension de levures : Homognisez soigneusement votre suspension de levures, car elle sdimente trs vite. Prlevez-en une certaine quantit et, en posant le bout de la pipette sur la partie centrale transparente, contre le bord de la lamelle, remplissez tout lespace central de la chambre. La suspension doit dborder lgrement dans les rigoles latrales, ce qui garantit que tout le 77

volume central est parfaitement rempli, et constitue une rserve de liquide contre la dshydratation. 3- Comptage sous le microscope : Placez la chambre sur la platine du microscope en la tenant horizontalement, et positionnez-la de telle sorte que le quadrillage soit situ dans laxe de lobjectif. Cherchez laide de lobjectif 10 le quadrillage de la chambre. Il faut rduire lintensit lumineuse pour le voir, car ce quon observe est transparent (pas de coloration). Passez ensuite lobjectif 40 pour faire le comptage, qui seffectue sur 10 rectangles sous-quadrills. Remarque : on ne compte dans un rectangle que les cellules comprises dans ce rectangle, et celles qui sont situes cheval sur les cts droit et infrieur. On ne compte pas celles qui sont situes sur les cts suprieur et gauche, de manire quilibrer les valeurs. 4- Dtermination de la concentration de la suspension de levures : Calculez le nombre de levures par mm3, puis par millilitre de suspension. 5- Nettoyage et rangement : Les lamelles des cellules de Malassez sont planes optiquement et ne se jettent pas, contrairement aux lamelles ordinaires employes pour les autres prparations microscopiques. Elles doivent tre rendues non casses, non rayes, et indemnes de souillure. Les levures collent ; pour les liminer efficacement, il faut passer la chambre de Malassez et la lamelle plane leau du robinet en les frottant doucement entre vos doigts. Puis schez-les laide de papier absorbant, et reposez-les dans leur emballage respectif. Noubliez pas dteindre la lampe de votre microscope, aprs avoir replac lobjectif le plus faible dans laxe. NB : les cellules de numration permettent de faire une estimation quantitative dune population dlments, mais aussi une observation qualitative de lchantillon : aspect des cellules, taille rgulire ou non, forme, prsence dlments trangers, rpartition homogne ou non sur le quadrillage

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METHODES DE SEPARATION ET DANALYSE QUALITATIVE

ELECTROPHORESE DE ZONE

CENTRIFUGATION

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

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ELECTROPHORESE DE ZONE
J-C. CHEVIN

Support: actate de cellulose 1. Gnralits

Sous l'action d'un champ lectrique, les particules charges dissoutes ou disperses dans une solution lectrolytique migrent vers l'lectrode de polarit oppose. Le compos charg est soumis une force: o F=E.e.z z = lectrovalence de l'ion

E = champ lectrique ; e = charge lmentaire et

La force tant constante, le mouvement serait uniformment acclr, mais la particule en se dplaant est freine par la viscosit du milieu. La force de frottement est donne par la loi de Stockes: o F' = 6 r v

= viscosit du milieu; r = rayon de la particule et v = vitesse de la particule Eez

Les deux forces s'quilibrent et le mouvement devient uniforme. La vitesse de la particule ou vitesse lectrophortique est: v = 6r La sparation des particules charges va, dans des conditions opratoires donnes, dpendre de leurs charges et de leurs dimensions. v On dfinit la mobilit lectrophortique: = m2.V-1.s-1 E Le dplacement a lieu dans une veine liquide emprisonne dans un solide relativement inerte et homogne qui sert de support. La mthode est appele lectrophorse de zone (mthode employe dans cette manipulation). De nombreux supports sont utiliss en analyse et sparation des protines, des acides nucliques et des ions minraux: - l'actate de cellulose prsente une porosit uniforme et une bonne rsolution. Ce support peut tre transparis et les spots pourront tre lus par densitomtrie - le papier, mthode simple, prsente une forte adsorption utile la sparation des petits ions - les gels d'agarose, de glose, d'amidon, de polyacrylamide permettent une sparation selon la charge et la dimension des particules (tamisage molculaire). En outre, l'utilisation de tube capillaire en silice (lectrophorse capillaire de zone) permet d'obtenir des sparations rapides avec une trs grande efficacit et de dtecter de nombreux composs.

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2. Mthode
2.1. Principe

Quel que soit le support, les principes et les facteurs influenant la migration sont les mmes. Une bande d'actate de cellulose est sature avec une solution tampon qui sert d'lectrolyte de migration. Une petite quantit de produit analyser est dpose en spot ou en ligne fine sur la bande, un endroit dtermin. Une diffrence de potentiel lectrique continu est applique aux extrmits de la bande et chaque composant migre selon sa mobilit lectrophortique. Aprs un temps appropri, on sche la bande et on note la position des composants aprs action d'un rvlateur appropri. SCHEMA DE L'APPAREIL couvercle support

plaque de verre lectrolyte

2.2. Facteurs influenant la migration 2.2.1. Temprature - flux capillaire

lectrode de platine

Le passage du courant lectrique entrane par effet joule, un chauffement de l'lectrolyte et du support. Cette lvation de temprature augmente la mobilit lectrophortique par diminution de la viscosit. Les pertes de liquide par vaporation crent un flux capillaire de remplacement de la solution tampon, flux qui augmente ou diminue la mobilit lectrophortique selon la position de l'ion sur le support et sa charge. Ce flux capillaire est aussi appel rhophorse. vaporation flux capillaire

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Si le courant est trop intense, l'vaporation, qui n'est plus contrebalance par le flux capillaire, entrane une augmentation de la concentration de l'lectrolyte, de sa conductivit et la mobilit lectrophortique diminue. En pratique, on diminue l'vaporation en utilisant une enceinte ferme et en refroidissant si besoin la plaque support.
2.2.2. Electroosmose

L'interface liquide (lectrolyte) - solide (support) conduit une polarisation lectrostatique. Le support, immobile, se charge ngativement la plupart des pH et la veine liquide se charge positivement. En prsence d'un champ lectrique, on observe un flux liquide vers la cathode appel flux d'lectroosmose ou lectroendosmose. Il augmente avec le pH et diminue avec l'lvation de la force ionique du milieu. Il est possible d'valuer le flux capillaire et le flux d'lectroosmose en observant la migration d'une substance mobilit lectrophortique nulle: dextran, glucose, ou tout autre molcule neutre. La mobilit lectrophortique corrige c d'un compos A s'crit: = = d A d neutre Et

neutre

dA et d neutre = distances de migration en cm E = champ lectrique en V.cm-1 t = dure de l'exprience en s

2.2.3. Adsorption

Les ions se fixent sur le support, ce qui entrane un retard dans la sparation, avec effet de trane. L'actate de cellulose prsente une adsorption assez faible. Le papier est plus adsorbant et les tranes sont parfois assez marques.
2.2.4. Diffusion

C'est la migration des composs dans toutes les directions du support avec talement et largissement du dpt. Elle est plus importante pour les petites molcules, acides amins, ions minraux, que pour les grosses (protines). Pour limiter la diffusion, on utilise une tension leve, ce qui diminue le temps de l'lectrophorse.
2.2.5. Choix de l'lectrolyte

La sparation des constituants dpend de: - force ionique du milieu = 1/2 [i].zi2 o [i] = concentration de l'ion i et zi = valence de l'ion i 82

Une force ionique leve entrane une bonne sparation mais une mobilit lectrophortique faible. De la force ionique, lie la concentration, dpend la conductibilit du milieu qui doit rester faible pour limiter l'intensit du courant. Un bon compromis est une force ionique de 0,05 0,1. - pH et pouvoir tampon: au contact des lectrodes, il se produit une lectrolyse avec variation de pH; l'lectrolyte devra prsenter une capacit tampon suffisante pour maintenir un pH constant au cours de l'lectrophorse. - concentration: elle doit tre suffisamment grande pour que la variation locale de la conductivit due au dpt de la substance analyser soit ngligeable, mais pas trop leve pour limiter l'intensit du courant et l'effet Joule. - nature: elle est dtermine par la substance analyser qui doit y tre soluble.

3. Partie exprimentale
3.1. Matriel

Le Laboratoire dispose de diffrents matriels. Se reporter la fiche de manipulation. Description du matriel: - gnrateurs 100 1200 V, 200 500 mA - cuves lectrodes de platine spares - plaques de verre 20 x 20 cm - actate de cellulose en feuilles - volume total d'lectrolyte: environ 1 L

3.2. Produits analyser

Nous nous proposons de sparer les cations d'un mlange aprs complexation avec les constituants de l'lectrolyte et de les caractriser ensuite par coloration. La complexation forme des ions de polarit et de taille diffrentes. Ions proposs: Mn2+ ; Co2+ ; Cu2+ ; Zn2+ ; Cd2+ la concentration de 0,1 mol.L-1. Substance neutre: bleu dextran (colorant neutre ne ncessitant pas de rvlation), dextran ou glucose
3.3. Prparation des lectrolytes

- Solution tampon Tris-glycine.

Cette solution est dj prpare.

Composition: - Tris (tri(hydroxymthyl) aminothane NH2-C-(CH2OH)3 ; pKA = 8,8) 6 g 28,3 g - glycine (glycocolle NH2-CH2 -COOH ; pKA1 = 2,4 ; pKA2 = 9,6) - H2O 1 L - HCl 1 M qs pH = 8,3 Ligne de dpt: ligne mdiane Dure de migration: 20 ou 30 min selon la dimension de la feuille. Consulter la fiche. Rvlateur: dithizone (diphnylthiocarbazone)

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3.4. Prparation du support de migration

- Dimensions, indications et dispositions des bandes: consulter la fiche de manipulation. - Il est ncessaire d'imprgner les bandes avec l'lectrolyte pendant 15 min. Pour gagner du temps, cette opration a t faite avant la sance. - Ne jamais toucher les bandes d'actate de cellulose avec les doigts, utiliser des pinces en inox ou en matire plastique. Attention, les bandes sont fragiles. - La face de dpt est mate et devra se trouver au dessus; le coin coup sert de repre. - Placer une plaque de verre sur la feuille quadrille servant de plan de situation, dposer la bande sur la plaque de verre. - Utiliser un crayon bille noir pour indiquer: - une extrmit de la bande: une polarit et un signe distinctif votre convenance. - sur un bord: la situation de la ligne de dpt. - Remplir au mme niveau les compartiments de la cuve avec l'lectrolyte appropri. - Reprer les polarits sur le couvercle: le fil rouge correspond l'anode (+), le fil noir la cathode (-). - Poser la plaque de verre avec sa bande dans la cuve, en respectant les polarits. - Placer les bandes de conduction en papier filtre aprs trempage dans l'lectrolyte. - Essorer lgrement le tout en posant une feuille de papier filtre. - Procder soigneusement aux dpts.
3.5. Migration

- Fermer le couvercle. - Les gnrateurs prsentent des sorties en parallle qui doivent tre branches en mme temps.
ATTENTION: COURANT D'ENVIRON 500 V

- Brancher les fils. Alimenter le gnrateur. Ne pas manipuler les fils pendant l'lectrophorse. - Laisser migrer le temps indiqu. Noter les tensions et courants en dbut et en fin d'lectrophorse. Observer les bulles sur les lectrodes. - Pendant la migration, dposer, sur une feuille de papier filtre pralablement imprgne de l'lectrolyte et sche, une srie de spots tmoins de chaque solution talon. - En fin de migration, couper l'alimentation, attendre 10 s, dbrancher les fils du gnrateur. - Oter le couvercle.

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3.6. Schage et rvlation

- Retirer avec prcaution les bandes de conduction, sortir la plaque de verre, essorer avec un morceau de papier filtre sans dcoller les bandes d'actate de cellulose du verre et procder au schage. - Rvler les taches par pulvrisation sous hotte ventile du produit appropri en mme temps que la feuille de spots tmoins. - Vidage des compartiments: * prlever, par aspiration la seringue, une partie de solution d'un compartiment et la dposer dans un bcher, mesurer le pH puis verser cette solution dans le flacon tiquet ; y ajouter, toujours par aspiration, le reste de solution du mme compartiment. Faire de mme avec la solution de l'autre compartiment. Ne pas jeter l'vier. * rincer deux fois les compartiments la pissette d'eau distille, vider par aspiration. Ne pas frotter ni essuyer.

4. Interprtation des rsultats

Indiquer, dans le cahier de laboratoire, pour chaque lectrophorse : - le pH de l'lectrolyte avant migration et dans chaque bac aprs migration - le temps rel de migration - les tensions et intensits en dbut et fin de migration - la rfrence du gnrateur de courant - la composition du ou des mlanges inconnus. Calculer la mobilit lectrophortique corrige de l'ion manganse pour chaque lectrophorse.

5. Commentaires et discussion de fin de sance

- Ecrire la formule des composs migrants. - Action des flux capillaires, lectroosmotiques et du champ lectrique: indiquer de faon schmatique l'aide de flches plus ou moins longues le sens et la vitesse de migration des substances en fonction de la position du dpt (milieu, ct anode). - La mme manipulation ralise sous une tension d'environ 200 V conduit la migration de tous les composs du ct de la cathode. Comment expliquer le phnomne? - Observation des effets de bord. - Caractristique de la micropipette utilise pour les dpts. - Expliquer pourquoi doit-on remplir, dans cette manipulation, les cuves au mme niveau - Indiquer la nature des gaz produits au contact des lectrodes. Consquences pour la sparation. - Ouverture aux autres techniques d'lectrophorse.

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CENTRIFUGATION
M. WELLMAN-ROUSSEAU B. LEININGER-MULLER

Les principes thoriques de cette mthode sparative ou analytique ayant t abords en cours de Physique et en Travaux dirigs de Biologie cellulaire lors de la 1re anne, nous ne les rappellerons pas. Les manipulations se font sur : 1. centrifugeuse angle fixe 2. centrifugeuse godets mobiles 3. ultracentrifugeuse 4. centrifugeuse de paillasse

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CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE [C.C.M.]

B. MOREAU

Travaux pratiques concerns : - 2me Anne : T.P. Biochimie gnrale (J. COULON)
T.P. Chimie organique (C. PERDICAKIS T. HUMBERT) -3
me

Anne : T.P. Chimie thrapeutique : Synthse des mdicaments (F. BONNEAUX) Essais physico-chimiques des mdicaments (J-L. MONAL) T.P. Pharmacognosie (B. MOREAU) T.P. Toxicologie (M-H. LIVERTOUX - L. FERRARI)

INTRODUCTION

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une mthode de sparation physicochimique particulirement indique pour la recherche analytique : - analyse de drogues en pharmacie - recherche toxicologique sur milieux biologiques aprs extraction - contrle de puret des matires premires et de produit fini - cintique de raction lors de synthses de mdicaments. Cette technique chromatographique requiert peu de substances analyser et un appareillage rduit aux travaux pratiques. Elle utilise un support poreux le long duquel une phase liquide entrane irrgulirement les divers constituants de l'extrait analyser.
I GENERALITES

Plusieurs mcanismes physico-chimiques peuvent intervenir lors du dplacement des substances dans le support poreux : - l'adsorption sur le support - le coefficient de partage entre une phase fixe (ou stationnaire) retenue par le support et la phase mobile circulant travers celui-ci - l'change d'ions, o une substance ionise peut remplacer un ion du support, se fixant ainsi sur ce dernier. Dans la CCM sur silice, c'est le phnomne d'adsorption qui domine gnralement. La CCM met en jeu 3 lments : la phase stationnaire, lluant et la substance chromatographie. La phase stationnaire est constitue d'un matriau adquat, tal en une couche mince uniforme, fixe sur un support (plaques ou feuilles) de verre, de mtal ou de plastique. La solution du mlange inconnu est dpose sur la ligne de dpart. La plaque est introduite dans une cuve tanche contenant l'luant appropri (phase mobile). La sparation des constituants du mlange s'effectue grce au dplacement par capillarit de la phase mobile le long de la phase stationnaire (dveloppement ou migration). Puis les substances non colores sont rendues visibles (dtection).

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1) Phase stationnaire

Diffrents matriaux sont utiliss en fonction de la substance analyser : gel de silice (Kieselgel, Kieselguhr), oxyde d'aluminium, cellulose et polyacrylamides. La fabrication et la teneur en humidit influencent fortement leur pouvoir de sparation. On choisit donc un standard : le Kieselgel G (Merck) suivant Stahl, le plus utilis. On trouve dans le commerce des plaques prtes l'emploi. Pour viter que les plaques ne s'abment pendant le transport, on ajoute trs souvent des liants spciaux qui peuvent modifier le pouvoir sparateur. Pour des temps de migration trs longs, les zones deviennent diffuses et les sparations mauvaises. Pour le travail de laboratoire du pharmacien et pour les travaux pratiques, les plaques prtes l'emploi sont toutefois fort utiles. Au moment de l'emploi, les plaques peuvent tre actives par chauffage 100-105C pendant 1 heure.
2) Phase mobile : luant, solvant de migration

La phase mobile est le moyen de transport et est constitue d'un ou de plusieurs solvants. Elle monte par capillarit le long de la phase stationnaire, c'est--dire la couche poreuse. Des solvants "pour analyse" sont seuls utiliss comme luants. Ceux-ci sont aussi simples que possible. La composition du mlange est donne en parties par volume, la somme des diffrents volumes atteignant 100. Dans la chromatographie par adsorption, les solvants sont placs suivant le pouvoir d'lution (srie luotrope). Comme le montre le tableau suivant, le pouvoir d'lution augmente avec la polarit du solvant. Ainsi l'hexane, non polaire, a un faible pouvoir luant, le chloroforme a un pouvoir luant plus marqu et le mthanol, polaire, prsente un pouvoir luant lev.
Srie luotrope de systmes un ou deux solvants
(Les chiffres indiquent des volumes. La colonne de droite est la suite de celle de gauche)
A U G M E N T A T I O N D E L A F O R C E D ' E L U T I O N

Ether de ptrole Cyclohexane Ttrachlorure de carbone Trichlorthylne Tolune Benzne Benzne/chloroforme (1:1) Chlorure de mthylne Chloroforme Cyclohexane/actate d'thyle (8:2) Chloroforme/actone (95:5) Benzne/actone (9:1) Benzne/actate d'thyle (8:2) Chloroforme/ther (9:1) Benzne/mthanol (95:5) Benzne/ther (6:4) Cyclohexane/actate d'thyle (1:1) Chloroforme/ther (8:2) Benzne/actone (8:2) Chloroforme/mthanol (99:1) Benzne/mthanol (99:1) Benzne/mthanol (9:1) Benzne/mthanol (9:1) Chloroforme/actone (05:15)

Benzne/ther (4:6) Benzne/actate d'thyle (1:1) Chloroforme/ther (6:4) Cyclohexane/actate d'thyle (2:8) Actate de butyle Chloroforme/mthanol (95:5) Chloroforme/actone (7:3) Benzne/actate d'thyle (3:7) Actate de butyle/mthanol (99:1) Benzne/ther (1:9) Ether/mthanol (99:1) Ether Ether/dimthylformamide (99:1) Actate d'thyle Actate d'thyle/mthanol (99:1) Benzne/actone (1:1) Chloroforme/mthanol (9:1) Dioxane Actone n-Propanol Ethanol Mthanol Dioxane/eau (9:1) Eau

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Pour les sparations de substances amines basiques (alcalodes, mdicaments) on ajoute une faible quantit d'amine protonable (ammoniac, dithylamine...) qui a pour fonction de neutraliser les groupements acides du gel de silice.
3) Relations rciproques en chromatographie

La vitesse de migration est fonction de la viscosit de lluant et de la structure de la phase stationnaire. Les adsorbants retiennent fortement l'eau et les alcools infrieurs. Les molcules seront plus ou moins fortement adsorbes suivant les groupements fonctionnels qu'elles comportent. - Les hydrocarbures saturs sont peu ou pas adsorbs ; leur vitesse de migration est donc la plus grande. Les hydrocarbures non saturs sont d'autant plus adsorbs que le nombre de doubles liaisons est grand et que celles-ci sont plus conjugues. Pour une bonne sparation on choisira un adsorbant actif et un luant peu polaire. - La prsence de groupements fonctionnels fixs sur un hydrocarbure influence l'intensit d'adsorption dans l'ordre dcroissant suivant : -COOH, -OH, -C=O, O-alkyl, -CH3, -H Sur couches de Kieselgel ou d'oxyde d'aluminium par exemple et en utilisant le tolune comme luant, les thers et les esters apparaissent la partie suprieure du chromatogramme, les ctones et les aldhydes environ au milieu, suivis par les alcools tandis que les acides restent au point de dpart. La squence de sparation est donc fonction de la polarit des liaisons. Les acides organiques et les bases fortes peuvent tre chromatographies sous forme de leurs drivs peu polaires ou en utilisant des luants acides ou basiques. Les principes de la chromatographie d'adsorption et les relations rciproques entre les trois facteurs (phase stationnaire, phase mobile et substances sparer) peuvent tre reprsents par le schma triangulaire de Stahl :

Le triangle hachur peut pivoter. Par exemple, pour un mlange d'hydrocarbures, on place un sommet du triangle sur H.C. (en pointill), les deux autres sommets (en pointill) montrent qu'il faut utiliser un luant non polaire et un adsorbant actif. Inversement, pour des mlanges de substances polaires, les deux sommets libres du triangle montrent la ncessit d'employer des luants polaires et des adsorbants peu actifs.

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4) Essais prliminaires

Un essai prliminaire peut tre ralis afin d'obtenir rapidement, pour un support donn, des indications utiles sur : - la vitesse de migration de la substance analyser dans diffrents solvants, - le pouvoir sparateur de ceux-ci face un mlange de substances. Cet essai consiste dposer une goutte de la solution examiner sur une plaque de CCM. Aprs avoir sch le dpt, on soumet celui-ci l'action luante d'une petite quantit de solvant. Pour chacun des solvants choisis, on observe le comportement de la solution analyser. Lorsqu'on a faire des mlanges de composition inconnue, on commence par tester un solvant peu polaire : - Si les substances ne se dplacent pas (cas du dveloppement par le cyclohexane, dans le schma ci-dessous), on choisit un solvant dot d'un pouvoir d'lution plus lev (ex. : tolune), ou on ajoute au solvant employ des quantits croissantes d'un luant plus actif (ex. : mlange cyclohexane/chloroforme). - Lorsque les vitesses de migration sont trop leves (cas du dveloppement par le chloroforme, dans le schma ci-dessous), ou ne sont pas assez diffrencies, c'est--dire si les substances se trouvent proximit de la ligne frontale, on ajoute un luant moins polaire (ex. : mlange tolune/chloroforme). Dans l'exemple choisi, l'essai prliminaire sur le comportement chromatographique du mlange X sur gel de silice a montr que le tolune se prte au dveloppement de celui-ci.

1 X

2 X

3 X

1 = dveloppement par le cyclohexane 2 = dveloppement par le tolune 3 = dveloppement par le chloroforme

X = dpt du mlange de substances sparer

5) Dveloppement

Par dveloppement, on entend la rsolution de la solution inconnue en ses divers constituants grce au dplacement de l'luant sur le support. La distance normale d'lution (dpart, front de solvant) est de 10 cm. A ct du dveloppement simple (1 x 10 cm), le plus classique, on pourra, pour amliorer le pouvoir de sparation, procder : - un dveloppement multiple : un dveloppement double consiste faire migrer deux fois successivement sur 10 cm avec schage intermdiaire complet, - un dveloppement en escalier : l'aide de deux luants de pouvoir d'lution diffrent et des hauteurs d'lution diffrentes (la premire fois sur 5 cm, la deuxime fois sur 10 cm), - un dveloppement bidimensionnel : l'aide d'luants diffrents ou non, migration horizontale puis verticale partir d'un dpt en coin.

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6) Dtection des substances spares

Il existe diffrentes possibilits permettant de mettre en vidence des substances incolores sur un chromatogramme.
A l'aide d'une lampe UV: Attention : les UVB-UVC sont dangereux pour les yeux. 254 nm : les substances contenant deux ou plusieurs doubles liaisons, ainsi que les drivs aromatiques (par exemple ceux du benzne) prsentent une absorption plus ou moins forte entre 250 et 300 nm. Pour les identifier sur la plaque, on ajoute un indicateur de fluorescence (= F 254) qui prsente une fluorescence intense aux environs de 254 nm. Sur ce type de "plaque fluorescente" jaune vert les substances ci-dessus se reconnaissent par une diminution ou une extinction de fluorescence, donc par l'apparition de taches sombres, grises ou violettes. 365 nm : certaines substances prsentent une fluorescence propre.

A l'aide de raction chimique : Le ractif est caractristique d'une classe chimique, plus ou moins spcifique d'un groupement donn, et peut tre utilis de diffrentes manires : - par pulvrisation sous forme trs disperse, en "nuage" et non "en pluie". On utilise frquemment un vaporisateur manuel dont le rservoir arosol et le rcipient en verre pour le ractif peuvent tre facilement renouvels. Aprs avoir vrifi la rgularit du jet, on asperge la plaque de manire rgulire sans la "tremper". La rvlation a lieu temprature ambiante ou aprs chauffage. Pour obtenir une coloration maximale, il est souvent ncessaire de porter quelque temps le chromatogramme une temprature dtermine, dans une tuve temprature rglable ou sous un courant d'air chaud. - par immersion de la plaque dans le ractif. - sous forme de vapeurs dans une cuve sature. 7) Analyse qualitative : identification des substances.

Les constituants chimiques sont ainsi visualiss sur le chromatogramme et leur position est exprime en Rf (Rapport frontal) :
Rf = Distance parcourue par la substance (centre de la substance) -----------------------------------------------------------------------

Distance parcourue par le solvant (front du solvant) La valeur du Rf est comprise entre 0,00 et 1,00 et est donne avec une prcision de deux chiffres aprs la virgule. Comme elle est troitement lie aux conditions opratoires (temprature, pression, lumire...), elle doit tre considre comme une "valeur d'orientation". Ce Rf tant difficilement reproductible, on identifie la tache inconnue par comparaison une solution de rfrence (solution tmoin) de concentration connue et prpare si possible avec le mme solvant que la solution analyser. Les solutions de rfrence et inconnue tant soumises aux mmes conditions opratoires, il sera possible d'identifier la tache inconnue par comparaison du Rf et de la couleur.

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II PRATIQUE DE LA CCM 1) Mthode classique - Matriel utilis : . support prt l'emploi : gel de silice sur plaque de verre, feuille d'aluminium, film plastique : 10 x 20 cm ; 20 x 20 cm . solvants organiques purs ou en mlange : 100 mL . cuve de verre tanche . micropipettes capillaires de 5 L ou pipettes Pasteur - Prparer le solvant de migration, mesurer exactement la quantit ncessaire Placer la cuve labri des courants dair et des sources de chaleur. - Prparation de la plaque de CCM : Pointer dlicatement lemplacement des dpts, laide dun crayon papier, 15 mm des bords latraux et du bord infrieur et espacs de 10 mm.

Avec une micropipette, dposer des quantits croissantes de solution analyser en ayant soin dappliquer la pipette perpendiculairement et doucement sur la couche mince sans labmer. Dposer les extraits bien concentrs sous forme de trait et non de point et en plusieurs fractions. Bien laisser vaporer le solvant de la solution dpose entre chaque application du capillaire afin de concentrer les dpts. Intercaler les dpts inconnus et les dpts de rfrence (tmoins), ceux-ci ntant jamais situs en bord de plaque. Tracer la limite du front de solvant 10 cm de la ligne de dpt. Les indications sur la nature des dpts sont inscrites au crayon papier sur la partie suprieure libre de la plaque, au-del du front du solvant mais jamais leur niveau. A chaque nature de dpt correspond une micropipette. Aprs usage, la nettoyer, si ncessaire, avec le solvant du produit dpos. micro CCM
T1 X2 2X1 T2 2X2

CCM classique front du solvant 10 cm

X1
4 cm

0,5 cm 0,5 cm 1,5 cm

1,5 cm

ligne de dpt

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- Dveloppement : Dposer dlicatement la plaque dans la cuve sans la laisser tomber. Fermer rapidement la cuve avec le couvercle rod et laisser migrer jusquau front de solvant. Si on travaille avec plusieurs plaques par cuve, les introduire au mme moment, le plus rapidement possible. En aucun cas ne dplacer la cuve pendant toute la dure de la migration.

Aprs migration, sortir rapidement la plaque et la placer plat lair sous hotte aspirante. Refermer la cuve immdiatement. Faire vaporer le reste de solvant de la plaque sous courant dair chaud (sous hotte) ou en tuve. En fin de sance, vider les cuves CCM dans un bidon poubelle-solvant , jamais dans lvier. Ne pas rincer leau, laisser vaporer les solvants rsiduels sous hotte.
- Rvlation - Interprtation : Rvler le chromatogramme avec la lampe UV ou un ractif appropri. Entourer les taches apparues dun trait de crayon et noter avec soin couleur et Rf. Par comparaison du Rf et de la couleur entre tmoins et inconnus, identifier les substances prsentes dans les extraits. Effectuer toujours la rvlation physique avant toute rvlation chimique.

2) Micromthode - Matriel utilis : . gel de silice sur film plastique 5 x 5 cm . micropipette de 1 L ou pipette Pasteur . mini cuve de verre tanche . solvants organiques purs ou en mlange : 3 ou 4 mL. - Dpts des solutions : 0,5 cm du bord infrieur et des bords latraux . dpts croissants de 1 5 L de solution inconnue par fraction de 1 L et schage entre chaque dpt . dpts de 1 L de solution tmoin entre chaque dpt inconnu. - Dveloppement : tracer le front du solvant 4,5 cm du bord infrieur et faire migrer sur 4 cm. 1 seule plaque par cuve. - Rvlation Interprtation :
identique la mthode classique.

III REDACTION DUN RAPPORT

Si les techniques utilises sont dtailles dans le polycopi, il est inutile de les citer dans le rapport. Par contre ce document doit comporter les rsultats obtenus, les commentaires et les conclusions qui en drivent :

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sujet de ltude, CCM en prcisant les conditions opratoires : nature de la phase stationnaire, de lluant, nature et quantit des dpts, rvlation(s), description du profil chromatographique et calcul des Rf, dans un tableau, schma : recopier le chromatogramme obtenu dans tous ses dtails (en couleur). Ne pas oublier la lgende. Fixer, si possible, la plaque de CCM sur votre feuille. conclusion gnrale. T1 X2 2X1 T2 2X2

X1

X1: 2 L solution inconnue 1 T1: 1 L tmoin 1 X2: 2 L solution inconnue 2 2X1: 4 L solution 1 T2: 1 L tmoin 2 2X2: 4 L solution 2

IV APPLICATION = CCM dune huile essentielle (H.E.) de Menthe

Phase stationnaire et support: . gel de silice sur film plastique (5 cm x 5 cm) Dpts : . tmoins : . menthol : T1 1 L dune solution 1 % m/V dans tolune . menthone : T2 1 L dune solution 1 % V/V dans tolune . actate de menthyle : T3 1 L dune solution 1 % V/V dans tolune . H.E. : E1 : 1 L - E2 : 2 x 1 L - E3 : 3 x 1 L de lchantillon dilu Eluant : . Tolune Actate dthyle (95/5) 4 mL par cuve, exactement mesurs la pipette. Migration : sur 4 cm Rvlation : . vanilline sulfurique chaud : aprs avoir pulvris la plaque avec le ractif, placer celle-ci ltuve 110 pendant 5 minutes, jusqu ce que les couleurs apparaissent (raction de condensation avec les aldhydes : la vanilline, en milieu acide, fixe un proton et donne un ractif lectrophile susceptible de se condenser sur un noyau aromatique). Identification : Observer la coloration verte de T1, bleue de T2 et bleue fonce de T3. Calculer les Rf. Comparer valeurs de Rf et couleurs avec lH.E. Reproduire le schma de la CCM sur la feuille de rapport.

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DOSAGES COLORIMETRIQUES ET NEPHELEMETRIQUES

NEPHELEMETRIE

SPECTROMETRIE

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NEPHELEMETRIE
J-L. MONAL

Cette technique est conduite comme les autres techniques de la spectromtrie, la diffrence que la solution est stabilise et trouble. Elle sera applique au dosage des ions sulfate dans une eau, selon la norme AFNOR en vigueur.

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SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION DANS LULTRAVIOLET ET LE VISIBLE

P. LEROY

1. Principales notions fondamentales

Ce chapitre a pour objectif dindiquer les notions fondamentales utiles pour la ralisation des travaux pratiques dinitiation la manipulation ainsi que les autres manipulations utilisant cette mthodologie ralises dans les diffrentes disciplines denseignement du cursus pharmaceutique.
Pour une description complte de cette mthodologie, se reporter lenseignement de Physique et dInstrumentation.

- Le domaine du spectre ultraviolet (UV) utilisable en analyse stend denviron 200 400 nm et celui du spectre visible (vis.) denviron 400 900 nm. - Un chromophore est une fonction ou groupe datomes modifiant la frquence de londe UV ou vis. ainsi que lintensit dabsorption. - La lumire polychromatique issue dune source lumineuse est dcompose en radiations monochromatiques par rflexion sur un rseau. Aprs avoir slectionn la radiation monochromatique correspondant au maximum dabsorption de la solution analyser, cette radiation traversera lchantillon plac dans une cuve faces planes et parallles et sera partiellement absorbe. Le matriau de la cuve doit tre transparent aux radiations utilises (quartz en UV, verre ou plastique dans le vis.) - La radiation incidente dintensit I0 subit une attnuation dintensit ; soit I lintensit de la radiation transmise. - La transmittance T est gal au rapport I/I0 et est exprime en pourcentage (solution transparente : T = 100 % ; solution opaque : T = 0 %) - Labsorbance A est le logarithme dcimal de linverse de la transmittance :
A = log (1/T) = log (I0/I).

- Labsorbance mesure A est proportionnelle la longueur de la cuve l et la concentration c du solut absorbant cette (loi de Beer-Lambert) :

A=axlxc
- Le coefficient de proportionnalit a est gal : - , absorbance molaire, si l est exprim en centimtres et c en moles par litre (M-1.cm-1), - A1%1cm , absorbance spcifique, corrrespond labsorbance dune solution dune substance dissoute 10 g/l sous une paisseur de 1 cm. A une longueur donde dtermine, labsorbance molaire ou spcifique est caractristique dun solut dans des conditions exprimentales dfinies (temprature, solvant, pH).

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- La loi de Beer-Lambert est largement applique lanalyse quantitative. - La loi de Beer-Lambert est applicable dans les conditions suivantes : - le milieu doit tre transparent, - la temprature doit tre constante, - la solution ne doit pas tre trop concentre (valeurs lues ne dpassant pas 1 unit dabsorbance), - la substance ne doit pas donner lieu des ractions chimiques sous leffet du rayonnement incident, ni des associations variables avec le solvant, - le faisceau lumineux doit tre monochromatique. - La loi de Beer-Lambert est une loi additive (contribution labsorbance totale des diffrents chromophores absorbant une mme longueur donde). - Les solvants utiliss ne doivent pas absorber dans la zone de longueurs donde tudie (exemple : le dichloromthane ne peut tre utilis quau dessus de 220 nm). Attention : ne pas utiliser des solvants organiques (solvants chlors, actone,) avec des cuves en plastique. - Un spectrophotomtre comprend les lments principaux suivants : - des sources lumineuses polychromatiques UV (lampe au deutrium), vis. (lampe incandescence type tungstne) ou UV-vis. (lampe au Xnon pulse), - un monochromateur : dispositif dispersif de la lumire polychromatique mise par la source permettant de nenvoyer vers lchantillon quun intervalle de longueurs donde trs troit appel bande passante ; ce dispositif peut tre motoris afin de faire varier en continu lors dun trac de spectre. - un dtecteur, en gnral une photodiode. - Il existe diffrents types de spectrophotomtres UV-vis. : mono-, double faisceau , barrette de diodes. - Les spectrophotomtres utiliss aux Travaux Pratiques sont de type mono-faisceau : ils comportent un monochromateur constitu dun rseau par rflexion suivi dune fente. Grce un miroir semi-rflchissant, une partie de lnergie du rayonnement est envoye sur un premier dtecteur (I0) et une partie gale vers lchantillon ; la lumire transmise par lchantillon absorbant (I) est reue par le second dtecteur. - Le trac dun spectre UV et/ou vis. (A = f ()) dune substance dissoute, laide dun spectrophotomtre mono-faisceau ncessite lenregistrement pralable du spectre du blanc (solvant pur, tous les ractifs sauf la substance doser en spectrophotocolorimtrie). Ce spectre sera mmoris par lappareil et le spectre de la substance tudie correspondra la diffrence entre le spectre de la solution contenant celle-ci et celui du blanc . - Il en est de mme pour la mesure dabsorbance une seule valeur de . - Les intrts de la spectrophotomtrie UV-vis. sont multiples : identification de composs organiques et inorganiques et leur dosage, dtermination de constantes dquilibre (exemple : pKa ; complexation) dtection en chromatographie liquide haute performance et en lectrophorse capillaire.

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2. Manipulation
2.1. Proprits spectroscopiques UV du paractamol 2.1.1. Principe La dtermination des caractristiques spectroscopiques UV dun compos organique (max, coefficients de la loi de Beer Lambert) prsente un intrt sur le plan de lidentification de ce compos ainsi que celui de son dosage (spectrophotomtrie UV directe ou couple une mthode sparative : chromatographie liquide haute performance, lectrophorse capillaire,). 2.1.2. Ractifs et solutions talons Acide chlorhydrique (HCl) 0,1 M Solution prte lemploi Solution mre de paractamol (Mr = 151,2) Paractamol 50 mg Mthanol q.s.p. 100 ml Solution prte lemploi Solution fille de paractamol solution mre de paractamol 1,0 ml HCl 0,1 M 0,5 ml Mthanol q.s.p. 100 ml Solution prparer extemporanment et protger de la lumire (envelopper la fiole jauge de papier aluminium) 2.1.2. Mode opratoire Enregistrer le spectre UV (de 210 380 nm) de la solution fille de paractamol. Pour ce faire, utiliser des cuves en quartz* et enregistrer la ligne de base en utilisant comme rfrence du mthanol. Se reporter la fiche dutilisation simplifie de chaque spectrophotomtre. * Prcautions demploi : - Manipuler avec prcaution les cuves en quartz - Remplir au la cuve avec la solution tester et essuyer avec un papier doux les 4 faces ainsi que le fond de la cuve - Placer la cuve dans le porte-cuve du spectrophotomtre en veillant ne pas renverser la solution et placer les faces transparentes sur le trajet du faisceau lumineux - Tracer le spectre - Nettoyer la cuve au moyen dune pissette deau distille - Noter la longueur donde maximale dabsorption (max) ainsi que la valeur dabsorbance correspondant ce max - Calculer les valeurs dabsorbance molaire et dabsorbance spcifique du salicylate de sodium max

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2.2. Dosage spectrophotocolorimtrique du salicylate de sodium 2.2.1. Principe Le salicylate de sodium donne en milieu acide et en prsence dions Fe3+ une coloration violette qui sera utilise pour son dosage spectrophotocolorimtrique . Cette raction colorimtrique est utilisable pour lidentification des salicylates et pour le dosage des salicyls libres et totaux (aprs hydrolyse) dans des milieux biologiques en toxicologie. 2.2.2. Ractifs et solutions talons Acide chlorhydrique (HCl) 1 M Solution prte lemploi Ractif ferrique Fe(NO3)3, 9 H2O (Mr = 404) 40 g HCl 1 M 120 ml eau distille q.s.p. 1000 ml Solution prte lemploi Solution mre de salicylate de sodium (Mr = 160,1) 14,5 mM salicylate de sodium 232 mg eau distille q.s.p. 100 ml Solution prte lemploi Solution fille de salicylate de sodium 2,9 mM solution mre de salicylate de sodium 20 ml eau distille q.s.p. 100 ml Solution prte lemploi 2.2.3. Mode opratoire Dans une srie de tubes essai bouchs, verser successivement : Tube n 1 2 3 Solution fille de salicylate 0 0,6 1,2 de sodium (ml)* Solution doser (ml)** Eau distille (ml)* 3,0 2,4 1,8 r Ractif ferrique (ml)*** 15 15 15 * : utiliser une burette gradue au 1/20me de ml ** : utiliser une pipette jauge de prcision (classe A) *** : utiliser un distributeur automatique 4 1,8 1,2 15 5 2,4 0,6 15 6 3,0 0 15 7 2,0 1,0 15

- Agiter immdiatement pendant 30 s au moyen dun vortex et laisser reposer pendant 5 min. - Enregistrer le spectre visible (de 400 800 nm) de la coloration obtenue en utilisant le tube n 4. Pour ce faire, utiliser des cuves en plastique* et enregistrer la ligne de base en utilisant comme rfrence la solution correspondant au tube n1. Se reporter la fiche dutilisation simplifie de chaque spectrophotomtre.

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* Prcautions demploi : - Remplir au la cuve avec la solution tester et essuyer avec un papier doux les 4 faces et le fond de la cuve - Placer la cuve dans le porte-cuve du spectrophotomtre en veillant ne pas renverser la solution et placer les faces transparentes sur le trajet du faisceau lumineux - Faire la lecture, retirer la cuve, la vider dans le rcipient prvu cet effet - Jeter les cuves aprs emploi. - Noter la longueur donde maximale dabsorption (max) et rgler le spectrophotomtre sur cette valeur de . Mesurer labsorbance pour chacun des tubes (n 2 7) en utilisant comme rfrence la solution correspondant au tube n1. - Diluer, si ncessaire, la solution doser afin dobtenir une absorbance situe entre celles mesures pour les tubes n 2 et n 6. - Reporter les valeurs de concentration en salicylate de sodium (x) et dabsorbance (y) dans le tableau Excel fourni (ne pas reporter les valeurs du tube n 1 ou blanc ) et calculer : - lquation de la droite par rgression linaire ainsi que son coefficient de corrlation (reprsenter graphiquement cette droite dtalonnage) - la concentration (en g.l-1 et en molarit) de salicylate de sodium dans la solution doser (tenir compte du volume de la prise dessai et de la dilution effectue). - Reporter le valeurs de concentration en salicylate de sodium (x) et dabsorbance (y) sur une feuille de papier millimtr, tracer la droite dtalonnage et calculer la concentration (en g.l-1 et en molarit) de salicylate de sodium dans la solution doser (tenir compte du volume de la prise dessai et de la dilution effectue). Les rsultats (valeurs, graphiques) seront consigns dans le cahier de laboratoire et comments en fin de sance en prsence dun enseignant.

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NOTIONS DE METROLOGIE, CALCULS DINCERTITUDE, CONTROLE DE QUALITE

APPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE

QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE

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APPLICATION DES CALCULS DINCERTITUDE

V. PICHON (voir le premier chapitre Suivi et rendu des rsultats )

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QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE

Igor CLAROT

1. LA QUALITE DANS UN LABORATOIRE

QUALITE : Ensemble des proprits et caractristiques dun produit ou service qui lui confrent laptitude satisfaire des besoins explicites ou implicites dun client. CONTRLE QUALITE : processus qui vise garantir que le niveau de qualit dfini par un fabricant pour un bien ou un service donn est bien respect. LAssurance Qualit peut se rsumer en une dmarche qui : tend vers le zro dfaut ou Qualit Totale ; et prvient lerreur ou le dfaut plutt que davoir le constater a posteriori.

La Qualit, OUI, mais pas nimporte comment ! ! Il existe des normes de gestion de la Qualit (ISO 9000, 9001, 9002 ou EN 29000,), ces normes reprsentent une dfinition commune des rgles et des pratiques qui assurent ou garantissent la Qualit.
Certification / Accrditation : la certification sadresse lAssurance Qualit de lentreprise alors que laccrditation comprend en plus sa comptence et sa fiabilit.

Un systme essentiel pour les laboratoires : Les Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL). Il sagit dun ensemble de rgles se rapportant au mode dorganisation et aux conditions dans lesquels les essais de laboratoire sont planifis, effectus, contrls, enregistrs et diffuss. La description complte de ces BPL est parue au Journal Officiel des Communauts Europennes (1999). Un rfrentiel majeur pour lanalyse pharmaceutique La Pharmacope Europenne . Le rle de ce document est de participer la protection de la Sant publique par le biais de llaboration de spcifications communes reconnues, destines tre utilise par les professionnels de la sant et, de faon gnrale, par tous ceux que concerne la qualit du mdicament. Ce rfrentiel indique les mthodes et les techniques utiliser pour chaque substance (Monographie). Lutilisation de techniques analytiques implique un appareillage rpondant aux attentes de lutilisateur mais surtout celles de la Pharmacope. Il devient donc primordial de travailler avec des matriels propres tre utiliss et donner un rsultat fiable, ces matriels sont dit Qualifis .

2. LA QUALIFICATION DEQUIPEMENT
La Qualification dEquipement est un processus formel qui fournit la preuve documente quun quipement de mesure est appropri lutilisation laquelle il est destin et quil est 104

maintenu un niveau de performance adquat pour cette utilisation grce un suivi mtrologique. Ce processus est ncessaire pour garantir la fiabilit des rsultats de mesure obtenus. En particulier, elle fournit lassurance quun quipement fonctionne correctement indpendamment de lapplication ou de la mthode utilise.
Phases de Qualification dEquipement

Un processus complet de Qualification dEquipement se divise en 4 tapes :

Qualification Fonctionnelle : cette qualification traduit les exigences de lutilisateur en termes de spcifications. Cette premire partie est utilise le cas chant par lacqureur pour soumettre un appel doffre (slection dun quipement chez un fournisseur, processus dachat). Qualification dInstallation : cette qualification est conduite sur site au moment de linstallation. Elle documente tous les aspects de linstallation conformment aux spcifications du constructeur. Qualification Oprationnelle : cette qualification est effectue la suite de linstallation et doit tre rpte suivant un intervalle de temps prcis. Elle vrifie que tous les modules de lquipement fonctionne correctement sur les plages dutilisation spcifies. Qualification de Performance : cette qualification permet dtablir que lquipement est appropri aux types de mesures analytiques envisages et doit tre ralise par lutilisateur. Classement de linstrumentation

En fonction de lutilisation qui en est faite, lquipement peut tre divis en trois grands groupes : Equipement ncessitant une maintenance Equipement ncessitant un talonnage Equipement ncessitant un test de performance

Equipement ncessitant une maintenance : tout quipement utilis pour des travaux analytiques, mais ne comportant pas dlments optiques, lectronique ou mcanique susceptible de se drgler. Equipement ncessitant un talonnage : tous les appareils effectuant des mesures doivent tre priodiquement inspects, calibrs et ajusts aux normes de tolrances et spcifications de prcision et dexactitude laide de substance de rfrences ou de matriels certifis. Equipement ncessitant un test de performance : tous les appareils comportant des pices dusure et/ou pour lesquels il nexiste pas de substance de rfrence permettant de raliser un talonnage doivent tre soumis un test de performance rptitif.

Pour tre efficace, un programme de qualification doit clairement identifier les tests effectuer sur chaque type dappareil, sappuyer sur des bases techniques scientifiquement tablies et utiliser des tests statistiques. La totalit du parc dappareil doit tre sous contrle. 105

EXEMPLE 1 (EXEMPLE THEORIQUE)

Les questions sont en italique avec .

SPECTROPHOTOMTRIE DABSORPTION DANS LULTRAVIOLET ET LE VISIBLE (Pharmacope Europenne 4me Ed. 2.2.25.) Dtermination de labsorbance. Labsorbance (A) dune solution est le logarithme dcimal de linverse de la transmittance (T) pour un rayonnement monochromatique. Elle sexprime par lquation

T = I/I0, I0 = intensit du rayonnement monochromatique incident, I = intensit du rayonnement monochromatique transmis. En labsence dautres facteurs physico-chimiques, labsorbance mesure (A) est proportionnelle lpaisseur (b) de la couche traverse et la concentration (c) de la substance dissoute, en accord avec lquation :

= absorbance molaire, si b est exprim en centimtres et c en moles par litre.

Lexpression reprsentant labsorbance spcifique dune substance dissoute, se rapporte labsorbance dune solution 10 g/l sous une paisseur de 1 cm une longueur donde dtermine do :

Sauf indication contraire, mesurez labsorbance la longueur donde prescrite sous une paisseur de 1 cm 20 1 C. Sauf indication contraire, effectuez les mesures par rapport au mme solvant ou au mme mlange de solvants. Labsorbance du solvant, mesure par rapport lair et la longueur donde prescrite, ne doit en aucun cas dpasser 0,4 et doit tre Pourquoi ? de prfrence infrieure 0,2. Tracez le spectre dabsorption en portant en ordonnes les valeurs dabsorbance ou toute fonction de celle-ci et en abscisses la longueur donde ou toute fonction de celle-ci. Lorsque la monographie donne une seule valeur pour la position dun maximum dabsorption, il est admis que la valeur obtenue peut sen carter de 2 nm.
Appareil. Les spectrophotomtres utiliss pour ltude des rgions ultraviolette et visible du spectre sont constitus par un systme optique, susceptible de fournir un rayonnement monochromatique dans la rgion de 200 nm 800 nm, et par un dispositif appropri la mesure de labsorbance. Donner les limites en nm des rgions ultraviolette et visible.

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Contrle des longueurs donde. Vrifiez lchelle des longueurs donde en utilisant les maximums dabsorption de la solution de perchlorate dholmium R [1043101], la raie de la lampe hydrogne ou au deutrium ou les raies de larc vapeur de mercure indiques dans le tableau 2.2.25.-1. La tolrance admise est de 1 nm pour la rgion de lultraviolet et de 3 nm pour la rgion du visible.

Tableau 2.2.25.-1. Maximums dabsorption pour le contrle de lchelle des longueurs donde 241,15 nm (Ho) 253,7 nm (Hg) 287,15 nm (Ho) 302,25 nm (Hg) 313,16 nm (Hg) 334,15 nm (Hg) 361,5 nm (Ho) 365,48 nm (Hg) 404,66 nm (Hg) 435,83 nm (Hg) 486,0 nm (D) 486,1 nm (H) 536,3 nm (Ho) 546,07 nm (Hg) 576,96 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)

Pour un contrle avec une solution de perchlorate dholmium, quelles sont les raies caractristiques prendre en considration ? Quelle est la tolrance sur chacune de ces raies ? Contrle de labsorbance. Contrlez labsorbance au moyen de filtres appropris ou de solution de dichromate de potassium R [1069500] aux longueurs donde indiques dans le tableau 2.2.25.-2. Pour chaque longueur donde, la valeur prcise et les valeurs limites de labsorbance spcifique y figurent. La tolrance admise pour labsorbance est de 0,01. Pour le contrle de labsorbance, utilisez une solution de dichromate de potassium prpare comme suit : desschez au pralable le dichromate de potassium R [1069500] 130 C jusqu masse constante ; dissolvez une prise dessai de 57,0 mg 63,0 mg de substance dessche dans de lacide sulfurique 0,005 M et compltez 1000,0 ml avec le mme acide. Tableau 2.2.25.-2 Longueur donde (nm) 235 257 Absorbance spcifique 124,5 144,5 Tolrance max 122,9 to 126,2 142,8 to 146,2

313 350

48,6 107,3

47,0 to 50,3 105,6 to 109,0

Pourquoi desscher le dichromate ? Sachant que pour une solution contenant 59,0 mg de dichromate prpare comme indiqu, labsorbance lue sous 1 cm 235 nm est 0,734, dterminer labsorbance spcifique correspondante de deux manires diffrentes et conclure. (Mr K2Cr2O7 = 294,2) Limite de lumire parasite. La lumire parasite peut tre dcele une longueur donde donne laide de filtres ou de solutions appropris ; par exemple, labsorbance dune solution de chlorure de potassium R [1069100] 12 g/l mesure sous une paisseur de 1 cm augmente de faon abrupte entre 220 nm et 200 nm et est suprieure 2 une longueur donde comprise entre 198 nm et 202 nm, lorsquelle est compare leau comme liquide de compensation.

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Pouvoir de rsolution (analyse qualitative). Lorsque la monographie lexige, effectuez comme suit la mesure du pouvoir de rsolution de lappareil : enregistrez le spectre dune solution de tolune R [1091300] 0,02 pour cent V/V dans lhexane R [1042600]. Le rapport minimal entre labsorbance au maximum 269 nm et labsorbance au minimum 266 nm est indiqu dans la monographie. Quest ce que ce test implique au niveau du spectrophotomtre ? Largeur de la fente spectrale (analyse quantitative). Pour viter des lectures errones dues la largeur de la fente spectrale, lors de lutilisation dun instrument largeur de fente variable la longueur donde choisie, la largeur de la fente doit tre faible par rapport la demilargeur de la bande dabsorption mais, en mme temps, elle doit tre aussi large que possible pour obtenir une valeur leve de I0. Toutefois, la largeur de fente est choisie de telle faon que toute nouvelle diminution de largeur ne modifie pas la lecture de labsorbance. Cuves. La tolrance dpaisseur des cuves utilises est de 0,005 cm. Remplies du mme solvant, les cuves destines contenir la solution examiner et le liquide de compensation doivent prsenter la mme transmittance. Si tel nest pas le cas, une correction approprie doit tre apporte. Veillez soigneusement lentretien et au nettoyage des cuves. Quels sont les lments qui permettent de choisir les cuves appropries ?

EXEMPLE 2 (EXEMPLE PRATIQUE)

CONTROLE DES PERFORMANCES DES pH METRES ANALYTIQUES

I. Extrait du Guide de Mthodologie pratique, Assurance de la Qualit, dit par MERCK, Mars 2000. 1 - VERIFICATION DE L'ELECTRODE
1.1 Vrification de la pente de llectrode Matriel ncessaire pH mtre capable deffectuer des mesures en millivolts, Electrode indicatrice de verre et de rfrence au calomel satur Solutions tampons pH = 4,00 et 7,00

Lorsqu'on mesure des ions H+ (n = +1), la pente 25 C (298 K) a pour valeur 59,16 mV. Elle est dsigne par facteur de pente idal. Il en dcoule que pour une variation de pH d'une unit, un systme de mesure idal enregistrera une variante de tension gale 59,16 mV. Pourquoi ? Cette mesure du facteur de pente est indicatrice de la qualit du systme d'lectrode.

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Mettre le pH-mtre sous tension, rincer soigneusement les lectrodes avec de leau distille. Immerger les lectrodes dans une solution tampon de pH 7,00. Laisser les lectrodes squilibrer pendant 5 minutes et lire le potentiel de llectrode (EpH7) (bouton pH/mV).
La valeur lue doit tre comprise entre +10,00 mV et 10,00 mV.

Si la valeur lue scarte de ces spcifications, il convient de changer llecrolyte de llectrode de rfrence puis de rpter ce test avant de continuer. Rincer soigneusement les lectrodes puis les immerger dans une solution tampon de pH 4,00. Laisser les lectrodes se stabiliser pendant 5 minutes puis lire la valeur du potentiel. (EpH4) La diffrence des potentiels ainsi obtenue (EpH4 - EpH7) doit se situer entre 170 et 178 mV. Calculer la valeur de la pente par unit de pH.
Cette valeur doit tre comprise entre 56,20 et 62,12 mV par unit de pH.

Lorsque la valeur de la pente tombe en dessous de 56,20 mV par unit de pH (efficacit de la pente de 95 %) ou si la drive du point zro dpasse 20 mV, un conditionnement peut rtablir le niveau de qualit requis de l'lectrode, mais il peut s'avrer ncessaire de remplacer l'lectrode afin d'assurer des mesures de pH prcises.
1.2 Vrification du temps de rponse de llectrode

Rincer soigneusement llectrode dans la solution tampon de pH 4,00. Laisser llectrode squilibrer 2 minutes. Noter la valeur du potentiel. Rincer llectrode avec de leau distille. Immerger llectrode dans une solution tampon de pH 7,00 et noter le potentiel aprs 1 minute, puis aprs 2 minutes.
La valeur du potentiel lue aprs une minute, ne doit pas diffrer de plus de 3 mV de celle lue aprs deux minutes.

Si le temps de rponse est plus long, nettoyer llectrode lacide fluorhydrique 1% (m/v) pendant 1 minute.
Justifier le choix de lacide et la limitation du temps de contact.

2. Vrification du PH mtre. ( ne pas raliser cette partie pendant la sance, partie grise)

Raccorder le gnrateur de tension par un cordon appropri au pH mtre tester. Gnrer des tensions qui correspondent aux valeurs de potentiel dlectrode pour des valeurs de pH de 2.000, 4.000, 7.000, 9.000, 12.000.

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Tension exprime en mV

Valeur thorique de pH

Limites dacceptation de la valeur releve sur lafficheur.

+ 295.8 + 177.5 + 0.00 - 118.3 -295.8

2.00 4.00 7.00 9.00 12.00

1.95 2.05 3.95 4.05 6.95 7.05 8.95 9.05 11.95 12.05

Lire les valeurs de pH indiques par le pH mtre pour chacune des tensions. Effectuer 3 mesures pour chacune des tensions.
Vrification de l'exactitude du pH mtre. Dtermination de l'erreur de gain

L'erreur de gain est estime par l'cart absolu de la pente par rapport 1, cet cart tant exprim en pourcentage. Soit y = f x dans laquelle : y = valeur du pH lue sur le pH mtre x = valeur thorique du pH (valeur indique par le fabricant) On obtient une courbe d'quation y = ax + b dont la pente a devrait tre gale 1. Dterminez a ainsi que lerreur sur le gain. L'erreur de gain est gale :
Eg = 100 a 1 [%]

L'erreur de gain ne doit pas tre suprieure 1,5 pour cent.

II. Etalonnage automatique

Suivre la procdure dtalonnage prsente cot de chaque pH-mtre. Comparer la valeur de pente obtenue avec la mthode prcdente. Que pensez vous de la mthode automatique dtalonnage ?

3. REFERENCES
- Lassurance qualit dans les laboratoires agroalimentaires et pharmaceutiques Max Feinberg, Ed. Tec et Doc, Paris, 1999. - Directive 1999/11/CE de la Commission du 08 mars 1999 : Journal Officiel des Communauts Europennes, 23.3.1999, L77/9. - Assurance de la Qualit, Guide de Mtrologie Pratique G. Gaspar, P. Jonvel et T. Maisonneuve, Merck S.A. France, Mars 2000. - Pharmacope Europenne, 4me Ed., Conseil de lEurope, Strasbourg, 2002. - La Qualification dEquipement pour Instruments de Mesure en Chimie Analytique, Radiometer Analytical S.A.

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