1 EVALUACIN DEL CIDO ALFA-HIDROXIPROPINICO (CIDO LCTICO) AL 88% EN PROPILENGLICOL COMO PROTOCOLO DE CASTRACIN QUMICA EN PERRO Salvo, Natalia

MV 1; Gutirrez, Lus MV1.

1

. Departamento de ciencias clnicas, Universidad de Concepcin, Av. Vicente Mendez 595, Chilln, Chile.

Resumen
El objetivo del presente estudio fue producir azoospermia en perros y como consecuencia, esterilidad, mediante la inyeccin de cido lctico al 88% con propilenglicol en el parnquima testicular. Se seleccionaron 15 perros enteros, sexualmente maduros, que fueron divididos en 3 grupos de 5 individuos, un grupo A o grupo control que fue inyectado con suero fisiolgico, un grupo B que fue inyectado con propilenglicol y un grupo C que fue inyectado con cido lctico al 88 % con propilenglicol. Se realiz una coleccin de semen previa a la inyeccin, y luego a los 7, 14, 21, 28 y 42 das postinyeccin. En los grupos A y B no se produjo azoospermia ni cambios significativos en la produccin de espermios, en cambio en el grupo C se produjo azoospermia en todos los perros a la tercera semana post-inyeccin. Dos animales del grupo C fueron castrados quirrgicamente y los testculos fueron utilizados para realizar un estudio histolgico con el fin de demostrar la ausencia de espermatozoides al momento de la castracin quirrgica realizada al da 45 post aplicacin del agente esclerosante. La aplicacin de cido lctico al 88% con propilenglicol es un mtodo efectivo, rpido, prctico y econmico para la castracin de perros machos, lo cual podra ser utilizado en campaas de esterilizacin masivas para el control de la sobrepoblacin de sta especie. De igual forma se requieren de estudios adicionales que comprueben que la azoospermia se mantiene en el tiempo. Palabras clave: esterilizacin, orquiectoma, testculo.

Introduccin
Existen diversos mtodos para controlar la sobrepoblacin canina. Anualmente mueren millones de perros debido al nacimiento no deseado de stos, los cuales son eliminados ya sea a travs de abortos inducidos, de sacrificios masivos o de propietarios que deciden no conservarlos (1,2,3). Adems los perros vagos tienen un alto impacto en la salud humana, debido al estrecho contacto con los hombres, son los responsables de la propagacin de enfermedades zoonticas como la leptospirosis, echinococcosis, salmonelosis, rabia, entre otras enfermedades que pueden ser transmitidas al hombre, ya sea por contacto directo o a travs de secreciones (3,4,5,6,7). Las estrategias que se deben utilizar para el control de la sobrepoblacin deben incluir leyes de tenencia responsable de mascotas, educacin de los propietarios y la esterilizacin de los animales. En muchos pases en desarrollo se utiliza como mtodo de control la eutanasia de los perros para lograr la reduccin de la densidad y evitar as la transmisin de enfermedades zoonticas, sin embargo, sta estrategia no es eficaz a largo plazo, sin la aplicacin de leyes y la educacin de las personas. Para lograr un

2 control permanente es necesario incluir en las estrategias seleccionadas el control de la reproduccin canina (5,8). Para evitar el sufrimiento innecesario de los animales y para controlar a nivel de salud pblica el crecimiento de la poblacin de perros vagos, se han empleado diversos mtodos en el control de la capacidad reproductiva de esta especie, las cuales se enfocan mayoritariamente en las hembras caninas. Sin embargo, el macho tambin cumple un rol prioritario en la reproduccin, ya que tiene el potencial de producir un mayor nmero de hijos que las hembras (6), por lo tanto, los mtodos contraceptivos quirrgicos o qumicos tambin deberan aplicarse en machos con la misma frecuencia (2,3). Castracin qumica La castracin qumica es un mtodo no quirrgico de esterilizacin en machos, que presenta grandes ventajas al ser econmico, seguro y de mayor rapidez que los mtodos tradicionales de castracin quirrgica. La mayor desventaja que presentan los mtodos tradicionales como la vasectoma y orquiectoma es en el postquirrgico, ya que durante este perodo son necesarios cuidados especiales debido a la inflamacin que se produce en la zona de incisin, adems de presentar riesgos de complicaciones como la dehiscencia de puntos o infeccin (9,10), tambin edema y hematomas que son muy comunes en la castracin quirrgica (11). Esto hace que los mtodos tradicionales sean poco prcticos en los programas de control masivo de la natalidad (2,12). El mtodo de castracin qumica se realiza a travs de la inyeccin de agentes esclerosantes en distintos sectores anatmicos relacionados con el testculo de los caninos, tales como intratesticular o en el epiddimo, ya sea en la cola de ste o en su cuerpo (2,13). Un agente esclerosante va a ser aquel que produce endurecimiento de los tejidos o del rgano, debido a un reemplazo del tejido noble por tejido conectivo. La aplicacin de esterilizantes qumicos dentro del testculo, conducto deferente o epiddimo resulta en azoospermia (14), alteracin en la composicin fsica del testculo y alteracin en la produccin de testosterona (10,15). Uso de agentes esclerosantes Para realizar una castracin qumica se han propuesto diversos agentes esclerosantes tales como: formaldehido, cidos (lctico y actico), sales (plata y zinc) (12), clorhexidina, cloruro de calcio, etanol, fenol, permanganato de potasio y metacrilato (1,11,13,16,17), sin embargo, ninguno de stos agentes ha demostrado ser efectivo, ya que slo producen oligoespermia como el formaldehido o el etanol, son muy dolorosos para el animal como el metacrilato o no producen cambios en la produccin de espermatozoides ni en el volumen del eyaculado como el cloruro de calcio (1,12,16), es por ello que el presente estudio quiere probar al cido lctico como agente esclerosante para producir azoospermia, ya que es uno de los pocos agentes que ha demostrado ser efectivo en animales como novillos y ratas (18,19). El estudio realizado por Cabezas (1993) muestra que la castracin qumica realizada en terneros con cido lctico provoca la esterilizacin de los animales, causando una atrofia testicular, junto con la falta de espermatognesis activa. El cido lctico, gracias a este estudio, se utiliza hoy en da como protocolo de castracin en campos, donde realizar cirugas es difcil, lento y de un elevado costo, debido a la gran cantidad de animales que se trabajan (19). Por ste motivo, es necesario probar en especies menores s los resultados de

3 castraciones con cido lctico permite utilizarlo como protocolo de castracin para stos animales y as lograr un control sobre su masa.

Hiptesis
La inyeccin intratesticular nica de cido lctico al 88% en propilenglicol produce azoospermia en perros.

Objetivo general
Evaluar el efecto de una inyeccin intratesticular de cido lctico al 88% en propilenglicol sobre la espermatognesis de perros machos sexualmente maduros.

Objetivos especficos:
Evaluar el efecto del cido lctico en la concentracin espermtica y en el volumen del eyaculado. Evaluar cambios fsicos del testculo despus de la inyeccin de cido lctico con propilenglicol. Determinar el efecto del propilenglicol en los testculos. Determinar posibles reacciones adversas de los agentes qumicos a utilizar. Determinar posibles cambios histopatolgicos testiculares por efecto del cido lctico en propilenglicol.

Materiales y mtodo
Animales. El estudio se realiz con 15 perros machos, sin distincin de raza, enteros, sexualmente maduros, entre 1.5 y 6 aos de edad determinados por cronologa dentaria y de peso entre 10 y 30 kg. Grupos de experimentacin. Se utilizaron 15 perros machos, seleccionados segn los rangos normales para su especie, de su respuesta eyaculatoria y de su concentracin espermtica. Se dividieron en 3 grupos de 5 individuos c/u: A = Grupo control, 5 perros que fueron sometidos a una inyeccin nica de 0,5 ml de suero fisiolgico intratesticular en cada testculo. B = 5 perros que fueron sometidos a una inyeccin nica de 0,5 ml de propilenglicol intratesticular en cada testculo. C = 5 perros que fueron sometidos a una inyeccin nica de 0,5 ml de cido lctico al 88% en propilenglicol intratesticular en cada testculo. Exmen fsico testicular A cada grupo se le realiz un exmen fsico testicular donde se evaluaron los siguientes parmetros: Sensibilidad testicular : ausente, presente Consistencia testicular : dura, moderada, blanda Grado de movilidad escrotal : normal, moderada, nula.

4 Se realiz el examen fsico todos los das durante la primera semana despus de la inyeccin intratesticular de cido lctico, luego se repiti el examen fsico una vez a la semana hasta la sexta semana post-inyeccin. Tcnica de extraccin de semen La extraccin de semen en el perro fue realizada por manipulacin digital. Se realiz en un lugar tranquilo, sin espectadores innecesarios y evitando sensaciones de miedo o dolor ya que podran haber impedido que el perro lograse una completa ereccin y eyaculacin. Inyeccin intratesticular de cido lctico La inyeccin se coloc en la regin dorso-craneal del testculo al lado de la cabeza del epiddimo, se introdujo desde el polo superior hasta el mediastino, depositando el producto a nivel del tercio medio (9). La dosis a inyectar por testculo fu de 0,5 ml de cido lctico al 88% en propilenglicol para el grupo C, 0,5 ml de propilenglicol slo al grupo B y 0,5 ml de suero fisiolgico al grupo A testculo (FIGURA 1 Y 2) (7,20). Anlisis de semen El anlisis se realiz de forma peridica, donde cada vez se hizo toma de muestras, esto fue analizado en los siguientes perodos: 24 horas pre-inyeccin (semana 0 o basal) = tiempo 0. (De esta forma se conoci la concentracin espermtica basal de los perros) 1 semana post-inyeccin = da 7. 2 semanas post-inyeccin = da 14. 3 semanas post-inyeccin = da 21. 4 semana post-inyeccin = da 28. 6 semana post-inyeccin = da 42 Parmetros de anlisis de semen Macroscpicos. Volumen: Se evala el semen en mililitros, considerando que solo fue extrada la primera y segunda fraccin espermtica (valor normal: 1,20,7 ml. por eyaculado) (21). Aspecto: Acuoso, lechoso o grumoso (22). Color: Blanco, amarillo, verde (22). Microscpicos. Concentracin: Es el nmero de espermios por mililitro. Se realiza por conteo directo con microscopio en una cmara de Neubauer (23). La concentracin normal de espermatozoides en un mL de eyaculado en perros maduros es de 299,6127,9 (106/mL) (21). Para diagnosticar una azoospermia permanente es necesario tomar muestras de semen en forma peridica por un mes aproximadamente ya que sta se debera producirse entre la primera y segunda semana post inyeccin (2).

Anlisis Histopatolgico Se castraron quirrgicamente 2 perros del grupo C elegidos al azar. Los 4 testculos obtenidos se pusieron en frascos con formalina al 10% tamponada durante 24 Hrs. y luego se realizaron cortes de 0,5 m. para su posterior anlisis histopatolgico. Se evaluaron los testculos izquierdos de cada perro, realizando 3 cortes en cada testculo, un corte (coe) transversal al testculo pasando por la cola del epiddimo, un corte (ce) transversal al testculo pasando por la cabeza del epiddimo y un corte (pt) longitudinal en el parnquima testicular (FIGURA 4). Anlisis estadstico Los grupos de ensayo fueron comparados mediante la prueba no paramtrica de Kruskall Wallis. Se hicieron comparaciones de los tres grupos a la vez con la concentracin espermtica, del volumen del eyaculado, sensibilidad testicular, movilidad testicular dentro del escroto y consistencia de las gnadas. Para la realizacin de grficos se tomaron en cuenta los promedios de los resultados y las medianas. Resultados Examen fsico testicular Anlisis de sensibilidad. La sensibilidad a la palpacin testicular estuvo presente en todos los grupos tratados durante 3 a 5 das post inyeccin, luego de la primera semana la sensibilidad desapareci. No se encontr diferencia estadsticamente significativa entre los grupos (TABLA 1). Anlisis de consistencia testicular. Inicialmente todos los grupos tuvieron una consistencia normal, lo que fue variando en el grupo C post-inyeccin, de moderada a dura durante la semana 1 y 2, lo que fue volviendo a la normalidad de forma paulatina a partir de la 3ra semana. En los grupos A y B no hubo cambios de consistencia significativos (TABLA 1). Anlisis de movilidad testculo-escrotal. La movilidad se alter en todos los grupos tratados durante la semana 1, lo que fue disminuyendo hasta volver a la normalidad durante la 2da semana en los grupos tratados A y B; en el grupo C la movilidad fue disminuyendo ms an durante la 2da semana hasta llegar a nula y tornndose regular desde la 4ta semana hasta el fin del estudio (TABLA 1). Alteracin macroscpica testicular: En un caso de los 5 perros tratados del grupo C, se produjo una reaccin local unilateral en el sitio de la inyeccin comenzando con una gran inflamacin lo que continu con necrosis y desprendimiento de piel, dolor e incomodidad, lo que se clasific como un dao local sin compromiso de la actividad general; se procedi a una castracin quirrgica inmediata, obtenindose una respuesta favorable. Este tejido no fue analizado microscpicamente. Los dems perros tratados en todos los grupos, no presentaron complicaciones. Anlisis de semen El color del semen en los tres grupos se mantuvo normal (blanco opalescente) durante todo el estudio; en cambio el aspecto fue cambiando desde la tercera semana de lechoso a acuoso en el grupo C.

6 El anlisis de la concentracin espermtica, segn la prueba de Kruskall Wallis, demostr que en todas las semanas, los grupos tenan distinta concentracin espermtica (todos con todos), siendo la diferencia no significativa entre los grupos A y B al trmino del estudio; en el grupo C se ve una diferencia significativa con respecto a los grupos A y B, donde la concentracin espermtica va disminuyendo cada semana significativamente hasta llegar a cero (TABLA 2 y FIGURA 5). En el anlisis de Kruskall Wallis del volumen del eyaculado no se encontraron diferencias significativas entre los grupos tratados, en ninguna de las semanas del ensayo, al mantenerse los volmenes normales de un eyaculado de perro durante todo el estudio (TABLA 3 y FIGURA 6). Morfologa testicular Al realizar la castracin quirrgica de perros del grupo C para el anlisis histopatolgico, se not que la forma de los testculos no era normal, stos no tenan una forma ovoide o redonda sino que eran amorfos e irregulares. (FIGURA 7) Anlisis Histopatolgico En los testculos de los perros tratados con cido lctico en propilenglicol al 88% y luego castrados quirrgicamente para su posterior anlisis, se obtuvieron resultados parecidos, siendo lo ms caracterstico que en el lugar de la inyeccin ocurri una destruccin total del tejido, donde se distingue una esclerosis generalizada con el depsito de colgeno intertubular (FIGURA 8 y 9). En las zonas que continan al sitio de la inyeccin, el tejido se encuentra daado, el lumen no se distingue claramente y no hay produccin de espermatozoides (FIGURA 10). En las zonas aledaas al sitio de inyeccin el tejido testicular presenta una escasa formacin de clulas productoras de espermatozoides (espermatogonias), el lumen de los tbulos seminferos se encuentran vacos o limpios, sin alteraciones (FIGURA 11). En cambio en las zonas alejadas al sitio de inyeccin se encontraron los tbulos seminferos intactos con presencia de espermatogonias y nueva produccin de espermatozoides (espermatognesis activa), el lumen de los tbulos se encuentran sin espermatozoides pero con presencia de eritrocitos (FIGURA 11). En la histologa del epiddimo se encontr el lumen sin espermatozoides y con presencia de eritrocitos (FIGURA 12). En el corte histolgico C del perro 2 se encontr un comportamiento distinto de las clulas, el lumen de los tbulos seminferos se encuentran llenos de espermatozoides y hay clulas multinucleadas (FIGURA 13).

Discusin
Se realiz la administracin intratesticular de cido lctico al 88% utilizando como vehculo propilenglicol en perros. La dosis fu extrapolada de la dosis utilizada por Mora et al., 1991 y Nishimura et al., 1992, obteniendo resultados positivos con la dosis mnima de 0,5 ml. por testculo en la zona de aplicacin, sin embargo, para producir azoospermia en todo el tejido testicular, probablemente se requiere una mayor cantidad en ml., lo cual hace que se necesiten estudios posteriores para calcular la dosis adecuada. La administracin del agente esclerosante debe realizarse por la zona de la cabeza del epiddimo, lo ms cerca posible de ella, debido a que esta ubicacin coincide con la

7 proximidad de la rete testis que facilita la difusin de la solucin por el testculo y el epiddimo (17). Examen de las gnadas Con respecto al examen de las gnadas, estas se vuelven sensibles por el slo hecho de inyectarlas intratesticularmente ya que tanto en el grupo control, en el grupo tratado slo con propilenglicol y en el grupo tratado con cido lctico aumenta la sensibilidad durante los 3 primeros das (12). Esto se debe a la inflamacin que se produce (24). Adems en los perros tratados con cido lctico ocurren cambios en la consistencia, desde blandos a duros y la movilidad testicular disminuye. Esto es atribuido al grado de esclerosis ocurrida en el interior del testculo, lo que no ocurre en los perros controles ni en los tratados con propilenglicol, datos que concuerdan con los resultados obtenidos por Mora et al. (1991). Dicha reaccin tambin fue observada por Canpolat et al. (2006) al utilizar etanol en toros. Se discute que una aplicacin de cido lctico en el testculo induce a una respuesta inmunolgica debido a la interrupcin de la barrera conformada por las clulas de Sertoli, adems de la inflamacin local que produce la liberacin de antgenos del testculo (17), en conjunto se produce inflamacin testicular, sin embargo, esta no interfiere con el comportamiento general del perro ya que contina activo, su apetito se mantiene normal y no presenta problemas para caminar (18) Uno de los perros tratados con cido lctico, present necrosis testicular, por lo que fue necesario realizar la extirpacin total del testculo y del escroto, la causa de esto fue una mala maniobra por parte del operador al momento de colocar la inyeccin intratesticular, dejando caer contenido del cido lctico en el escroto, lo que provocara esta reaccin. Este acontecimiento es una de las desventajas de este procedimiento y coincide con lo observado en experiencias realizada en novillos (19). Es necesaria una tcnica adecuada al momento de colocar la inyeccin intratesticular, porque una fuga del cido lctico hacia el escroto puede producir un grave dao en los tejidos, se debe desinfectar la zona de inyeccin, cambiar la aguja despus de llenar la jeringa con la solucin de cido lctico en propilenglicol por una aguja nueva, para colocar el producto en el testculo (7,24) Examen de semen En cuanto a los resultados observados en el examen de semen, el parmetro significativo en este estudio, fue el de la concentracin espermtica, que en el caso del grupo control y de los perros tratados slo con propilenglicol se mantuvieron dentro del rango normal para la especie canina (23). Sin embargo, las variaciones experimentadas en los perros tratados con cido lctico revelaron una disminucin estadsticamente significativa, la que se desarroll a lo largo del estudio en forma gradual y progresiva hasta llegar a cero (azoospermia). Los resultados indican que la inyeccin intratesticular es un mtodo relativamente fcil (16), que requiere de un mnimo entrenamiento del operador y es efectivo, ya que ocasion azoospermia en todos los perros tratados a diferencia de otros trabajos realizados que slo logran hasta un 50% de animales azoosprmicos o muchos de ellos slo presentan oligospermia (16), lo que puede ser causado a que el grado de esclerosis y dao de las clulas germinales fue insuficiente, ocasionando que sea irreversible o que slo disminuya la produccin de espermatozoides.

8 La esterilidad producida se presenta en su totalidad a los 21 das post-inyeccin, lo que se asemeja a los resultados encontrados por otros autores como Mora et al. (1991) y Cabezas (1993) en terneros. La disminucin en la produccin de espermatozoides ha sido atribuida al dao de clulas germinales y al epitelio germinal, produciendo la disminucin y depresin total en la espermatognesis (13). El volumen de semen no se vi afectado significativamente en ninguno de los grupos tratados, esto se puede explicar porque la composicin del eyaculado no slo est formada por la secrecin testicular de espermios, sino que la principal contribuyente en el volumen es la secrecin prosttica, la que adems desemboca a nivel del conducto deferente, es decir posterior a la salida del epiddimo (23,25) Por otro lado, el aspecto del semen se present lechoso, de color blanco al principio del estudio en los 3 grupos tratados, lo que fue cambiando con el paso del tiempo en el grupo C llegando a tener un aspecto ms acuoso y transparente, esto se explica por la disminucin de la fraccin espermtica que es de color blanca y adems es la que presenta los espermatozoides (13). Es importante destacar que los perros podran seguir siendo frtiles despus de la inyeccin por un perodo de aproximadamente un mes, esto es debido a las reservas de espermatozoides que se encuentran en el epiddimo (26) y a partir de la sexta semana se producir la esterilidad segn lo descrito en el presente estudio. Histopatologa Segn Nishimura et al. (1992), la inyeccin intratesticular de un agente esclerosante conduce a una respuesta inmunolgica debido a la ruptura de la barrera hemato-testicular, con la consecuente inflamacin local y liberacin de antgenos testiculares, lo que conlleva a la destruccin permanente del epitelio seminfero del testculo lo que produce finalmente la esterilidad de los animales. En este trabajo, en los perros del grupo C, ocurri una fibrosis o esclerosis de los tbulos seminferos y espacios intersticiales en la zona de inyeccin de cido lctico dejando a los tbulos seminferos sin actividad espermatognica lo que concuerda con lo documentado por Nishimura et al. (1992), esto tambin ha ocurrido en otros estudios con diversos agentes como son el cloruro de calcio (9) y el Zinc (15). Que los tbulos seminferos no hayan sido afectados de manera uniforme puede deberse a una baja dosis del producto, esto tambin ocurri al utilizar cloruro de calcio donde se vi que con dosis bajas no era afectado todo el parnquima testicular de manera uniforme (9,17), tambin justific que los cambios histopatolgicos fueran mayor en reas cercanas al sitio de la inyeccin debido a la concentracin y cantidad del producto. A pesar de que los cambios histolgicos fueron menores en zonas alejadas de la regin de la inyeccin, la espermatognesis se vi afectada considerablemente, esto se caracteriza por la presencia reducida de clulas germinales y baja produccin de espermatozoides que probablemente sean inviables. Por otro lado, la presencia de eritrocitos dentro del lumen, de los tbulos seminferos observados en los cortes histolgicos es debido a la ruptura de los vasos sanguneos y del efecto irritativo de la sustancia esclerosante, esto es lo que contribuye a una disminucin drstica de los espermatozoides, adems del hecho de que el pH disminuye (menor a 6,3) dentro del lumen condicin generalmente mortal para los espermatozoides (2).

9 Despus de la realizacin de este estudio se puede concluir lo siguiente: 1. 2. 3. 4. 5. La inyeccin intratesticular de cido lctico al 88% con propilenglicol es eficaz para producir la esterilizacin en perros adultos. El cido lctico intratesticular afecta la espermatognesis, produciendo azoospermia y no produce cambios en el volumen de eyaculacin. Con la castracin qumica con cido lctico en propilenglicol, ocurren cambios fsicos testiculares dejando a los testculos sin motilidad y de consistencia dura. El propilenglicol es utilizado solamente como vehculo para el cido lctico, ya que no afecta a la produccin espermtica. El producto, administrado de forma correcta, no produce reacciones adversas como dolor que pueda afectar el comportamiento normal del perro, requiere de conocimientos para administrarlo ya que puede producir reacciones indeseadas como inflamacin y necrosis de tejido. La administracin del cido lctico produce cambios histopatolgicos como esclerosis y disfuncionalidad de las clulas germinales de los tbulos seminferos.

6.

Referencias Bibliogrficas 1. Galvn M, Pramo R, Esquivel C, Valencia J. Esterilizacin en el perro por inyeccin de metilcianoacrilato en la cola del epiddimo. Vet. Mx. 1994; 25(3): 261-265. Goicochea J, Ureta E, Chavera A. Control de la capacidad reproductiva del perro con la aplicacin de sustancias esclerosantes. Investig.Valdizana [Seriada en lnea] 2007; 1(1):14-20. Disponible en: http://www.unheval.edu.pe/investigacion/revista/Revista%20Virtual.pdf Consultado Septiembre 20, 2008. Bowen R. Male contraceptive technology for nonhuman male mammals. Anim. Reprod. Sci; 2008, 105(1-2): 139-143. Tepsumethanon V, Wilde H, Hemachudha T. Intratesticular injection of a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs. J. Med. Assoc. Thail. [Seriada en lnea] 2005; 88(5): 686-689. Disponible en: http://www.mat.or.th/journal/readpdf.php?link=files/Vol88_No5_686.pdf Consultado Octubre 18, 2008. Ortega-Pacheco A. Reproduction of dogs in the tropics with special reference to the population structures, reproductive patterns and pathologies, and a non-surgical castration alternative. Doctoral thesis, Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala, Sweden; 2006.

2.

3. 4.

5.

10 6. Jana K, Samanta P. Sterilization for male stray dogs with a single intratesticular injection of calcium chloride: a dose-dependent study. Contraception 2007; 75(5): 390-400. Soto F, Viana W, Sousa A, Pinheiro S, Mucciolo G, Hosomi F, Azevedo S, Dias R. Evaluation of zinc gluconate, either associated or not to dimethyl sulfoxide, as contraceptive method for male dogs. Anim. Reprod. 2007; 4(3-4): 119-124. Howe L. Surgical methods of contraception and sterilization. Theriogenology 2006; 66(3): 500-509. Jana K, Samanta P, Ghosh D. Evaluation of single intratesticular injection of calcium chloride for nonsurgical sterilization of male black bengal goats (Capra hircus): a dose-dependent study. Anim. Reprod. Sci. 2005; 86(1-2): 89-108. Jana K, Samanta P. Evaluation of single intratesticular injection of calcium chloride for nonsurgical sterilization in adult albino rats. Contraception 2006; 73(3): 289300. Emir L, Dabali M, Sunay M, Erol D, Caydere M, stn H. Chemical castration with intratesticular injection of 20% hypertonic saline: a minimally invasive method. Urology Oncology: Seminars and Original Investigation 2008; 26(4): 392396. Gunn M, Allen P, Bonneau M, Byrne D, Cinotti S, Fredriksen B, Hansen L, Karlsson A, Linder M, Lundstrm K, Morton D, Prunier A, Squires J, Tuyttens F, Velarde A, Von Borell E, Wood J. Welfare aspects of the castration of piglets EFSA. [Seriada en lnea] 2004 Disponible en: http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale1178620753812_1178620775386.htm Consultado Septiembre 15, 2008. Moreno A. Castracin qumica en perro con gosipol. Memoria de ttulo, Md. Vet. Universidad de Concepcin, Fac. Med. Vet. Chilln, Chile; 2001. Bloomerg M. Surgical neutering and nonsurgical alternatives. J. Am. Vet. Med. Assoc; 1996, 208(4): 517-519. Oliveira E, Moura M, Silva V, Peixoto C, Saraiva K, Cavalcanti M, Douglas R, and De Pinho A. Intratesticular injection of a zinc- based solution as a contraceptive for dogs. Theriogenology 2007; 68(2): 137-145. Canpolat I, Gur S, Gunay C, Bulut S, Eroksuz H. An evaluation of the outcome of bull castration by intra-testicular injection of ethanol and calcium chloride. Revue Md. Vt. (Toulouse) 2006, 157(8-9): 420-425.

7.

8. 9.

10.

11.

12.

13. 14. 15.

16.

11 17. Santos E. Esterilizao de ces com injeo intratesticular de soluo a base de zinco. Tese, Doutor em Cincia Animal, Universidad Federal de Minas Geras, Esc. Vet. Belo Horizonte, Brazil; 2007. Nishimura N, Kawate N, Sawada T, Mori J. Chemical castration by a single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs. J. Reprod. Dev. [Seriada en lnea] 1992; 38(4):263-266. Disponible en: http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php? cdjournal=jrd1992&cdvolaaaaaa=38&noissue=4&startpage=263&lang=en&from=j nltoc Consultado Octubre 18, 2008. Cabezas, O. Dinmica de los niveles plasmticos de testosterona, LH y GH en terneros enteros y castrados qumicamente. Memoria de ttulo, 1993. Md. Vet. Universidad de Concepcin, Fac. Med. Vet. Chilln, Chile. Mora G, Quezada M, Bonati C. Estudio clnico y morfopatolgico de la castracin qumica en terneros con cido alfa-hidroxipropinico. Av. Cienc. Vet. 1991; 6(1): 55-61. Andrade A. Influencia en la calidad espermtica de la adicin de distintas concentraciones de crioprotectores para conservacin del semen canino. Memoria Grado Doctor. 2005. Universidad Complutense de Madrid, Fac. Vet. Madrid, Espaa. Fontbonne A, Gurin P. Abord de L`infertilit du chien male. Rec. Md. Vt. 1998 ; 174(3-4): 39-55. Navarrete Y. Castracin qumica en perros machos con digluconato de clorhexidina al 3% en dimetil sulfxido al 50%. Memoria de ttulo, Md. Vet. Universidad de Concepcin, Fac. Med. Vet. Chilln, Chile; 1997. Levy J, Crawford P, Appel L, Clifford E. Comparison of intratesticular injection of zinc gluconate versus surgical castration to sterilize male dogs. Am. J. Vet. Res. 2008; 69(1): 140-143. Pineda M, Reimers T, Faulkner L, Hopwood M, Seidel G. Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the caudae of the epididymides. Am. J. Vet. Res. 1977; 38(6): 831-838. Kutzler M, Wood A. Non-surgical methods of contraception and sterilization. Theriogenology 2006; 66(3): 514-525.

18.

19.

20.

21.

22. 23.

24.

25.

26.