Simultaneous PKC and cAMP activation induces differentiation of human dental pulp stem cells into functionally active

neurons
Marianna Kirly et al. (2009) Neurochen Int. Semmelweis University, Budapest, Hungary

Ativao simultnea de PKC e AMPc induz a diferenciao de clulas tronco da polpa dental humana em neurnios funcionalmente ativos.
Marianna Kirly et al. (2009) Neurochen Int. Semmelweis University, Budapest, Hungary

Conc itos bsicos

Polpa d ntal clulas tronco:

Introduo
Clulas tronco da polpa tem potncial neurognico. Caractersticas de pseudo neurnios o servada em odonto lastos de polpa dental. Protocolo anteriormente testado no foi eficiente pois resultou em uma diferenciao neuronal incompleta.
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Introduo
Neurnio funcional: canais de sdio e potssio voltagem dependentes.

Adenosina monofosfato cclico ( AMPc) Protena Kinase C (PKC)

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Introduo
Fator de crescimento de fi ro lasto sico ( FGF), Fator de crescimento epitelial (EGF) Neurotrofina-3 (NT-3) Fator de crescimento de nervos (NGF) Di utiril cclico AMP * Vimentina Nestina
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Protocolo utilizado
Foram seguidos 3 passos:
Primeiro: Pr-tratamento
Uso do composto composto 5-azacitidina (desmetilao), Fator de crescimento de fi ro lasto sico

Segundo:Induo
Uso do Fator de crescimento de fi ro lasto sico( FGF), Fator de crescimento de neurnios ( NGF) Neurotrofina-3 (NT-3) que protena marcadora de neurnio e a estimulao consecutivas das vias de cAMP e PKC.

Terceiro: Maturao
Os nveis de cAMP foram aumentados, assim como Neurotrofina-3 e outros fatores neuroprotetores.

Resultados e Discusso
Figura 1 Diferenciao osteognica, com mtodo (protocolo) j estudado anteriormente. (A) Clulas tronco da polpa antes de se aderirem a superfcie. (B) Colnia aps 1 semana de cultivo (C) Aps 3 semanas (D) Clulas formando emaranhado (E) Mostra os depsitos mineralizados. Indicio de formao ssea. (F) Populao controle, de clulas no induzidas.
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Resultados e Discusso
Figura 2 Diferenciao neuronal de clulas tronco da polpa (A) Clulas tronco da polpa controle( no induzidas), em superfcie co erta com poli-Llisina . (B) Aps 24 h de induoArredondamento. (C) Um dia aps a remoo do meio indutor, tem inicio o processo de maturao, as clulas comeam a se tornar esfricas e desenvolver processos neuronais. (D) Aps 3 dias de maturao, as clulas j apresentam morfologia tpica de neurnio, com complexos processos neuronais.
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Resultados e Discusso
Figura 2 Diferenciao neuronal de clulas tronco da polpa (E) Aps 10 dias de diferenciao, a maioria das clulas apresentou formas tanto multi quanto ipolares, e clulas achatadas, que formaro componentes gliais. (apontada pelas setas) (F) Retirada dos componentes elevadores de atividade para cAMP intracelular (G) Retirada do PKC (H) Cultura usando o protocolo previamente descrito, formao de pequena populao neuronal em comparao com o atual protocolo usado neste 10 tra alho.

Resultados e Discusso
Figura 3 Via ilidade Celular seguindo os trs passos do atual protocolo de diferenciao. Usado o ensaio MTT (para contagem de clulas viveis) (A) Controle (B) Pr tratamento (C) Induo aps 1 dia (D) Induo aps 3 dias (apenas 40% das clulas viveis iniciais.) (E) Maturao aps 1 dia (F) Maturao aps 3 dias
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Resultados e Discusso

Teste RT- PCR (RNA DNA transcriptase reversa.) Eletroforese de pares de ase para a codificao das protenas citadas e o servadas nas clulas nos estgios descritos. Beta actina usada como controle, pois expressa em todas as clulas. A - DPSCs no induzidas, B - depois de 2 dias de pr-tratamento, C - no 1 dia de induo, D - no 3 dia de induo, E - depois de 24h na mistura de maturao F- depois de 3 dias de maturao 12

Resultados e Discusso

Figura 5 Padro de expresso do RNAm de marcadores neuronais. NSE= enolase glicoltica especfica de neurnios NF-M = filamento intermedirio neuronal GFAP = protena do filamento intermedirio glial.
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Resultados e Discusso
Figura 6 Aps 10 dias de diferenciao as clulas apresentam marcadores neuronais. (A)N-tu ulina (B) NF-M (C)GFAP (D)Protena de ncleo neuronal.
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Resultados e Discusso
Figura 7 Registros de voltagem na tcnica patch clamp . (A) Correntes de sdio e potssio ativadas por voltagem. (B) Bloqueio de canais de sdio por TTX (tetrodotoxina) (C) TEA ( tetraetilamonio) loqueadora de canais de potssio. (D) e (C) Avaliao dos tipos 1 e 2 de clulas diferenciadas.

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Concluses
Importncia do composto 5-azacitidina, AMPc e PKC. Via ilidade e numero final de clulas. Populao final heterognea. Importncia do estudo: clulas pluripotentes na polpa, podem derivar clulas mesenquimais ou no mesenquimais, clulas com fentipos neuronais distintos, podendo ajudar a compreender o repertrio molecular da diferenciao neuronal.
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