Você está na página 1de 15

Reporte Separacin de aminocidos por cromatografa

Introduccin.

A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminocidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metablicos como en las investigaciones de la estructura de las protenas. En esta prctica se pretenden identificar los componentes de una disolucin; para ello el mtodo a utilizar ser la cromatografa. Con este mtodo experimental podremos separar los componentes de una disolucin desconocida para luego compararlos con diferentes disoluciones patrn. El nombre de la tcnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de plantas como la clorofila, los cuales tienen colores definidos. Estos primeros pasos los dio el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas.

Segn la definicin dada por Keulemans la cromatografa es un mtodo de separacin en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de amplio desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a travs o a lo largo del lecho estacionario.

La cromatografa es un mtodo fsico para separar e identificar compuestos gracias a las afinidades diferenciales entre los diversos compuestos de una mezcla y una matriz slida o lquida. Se basa en que cualquier sustancia, al ser disuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relacin entre las solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denomina Coeficiente de Reparto.

Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Mvil) sobre el primero. Las sustancias a

cromatografiar se vern sometidas a una distribucin entre las fases estacionaria y mvil de modo que las ms solubles en la fase mvil avanzarn ms que las que sean retenidas por la fase estacionaria.

Esto se debe a que las afinidades ya sea por la fase estacionaria o por la fase mvil, son diferentes para cada compuesto.

Un compuesto que no tenga afinidad por la fase estacionaria y se disuelva bien en la fase mvil, eluye junto con ella; los otros compuestos lo harn a diferentes velocidades dependiendo de su fijacin a la fase estacionaria. Eventualmente un compuesto pegado a la fase estacionaria podr ser eludo (desplazado) por la fuerza del flujo de la fase mvil. El absorbente puede ser simplemente un papel filtro (cromatografa en papel) o esferas de slica-gel empacadas en una columna (cromatografa de columna). Las sustancias

separadas pueden hacerse visibles en un papel al emplear un colorante o pueden cuantificarse empleando deteccin fluoromtrica, electroqumica, etc. De acuerdo con el mecanismo que produce la separacin, se puede hablar de distintos tipos de cromatografa:

- Cromatografa de reparto La fase estacionaria suele ser agua, mantenida fija mediante un soporte inerte poroso (papel o celulosa). La fase mvil suele ser una mezcla de disolventes medianamente miscibles con el agua. Cuanto ms soluble en agua la sustancia a cromatografiar, ms retenida y retrasada quedar en el desarrollo cromatogrfico.

- Cromatografa de adsorcin La fase estacionaria retiene con ms o menos poder a las sustancias a cromatografiar por un fenmeno de adsorcin en superficie. Para ello se utiliza almina, gel de slice, etc.

La cromatografa de afinidad es un tipo de cromatografa de adsorcin en la que la fase estacionaria tiene afinidad biolgica por la sustancia que se quiere separar, por lo que no intervienen propiedades fsicas o qumicas. Se utilizan as parejas antgeno-anticuerpo, enzima-inhibidor etc.

En la Cromatografa de intercambio inico, la fase estacionaria retiene a las sustancias por su carga inica, ya que posee multitud de restos inicos de un solo tipo H+ en resinas cidas y OH- en resinas bsicas. Las sustancias con carga opuesta quedarn retenidas en la fase estacionaria, mientras que las de la misma carga que la resina sern arrastradas por la fase mvil. Las sustancias que quedan unidas a la resina pueden eluirse cambiando las condiciones de la fase mvil (variando el pH, fuerza inica etc.). Este tipo de cromatografa se hace slo en columna y los soportes utilizados son polmeros tales como celulosa o poliestireno carboxilados o poliaminados etc.

De acuerdo con el soporte fsico sobre el que se realiza la separacin, se puede hablar de dos tipos de cromatografa:

1.- Cromatografa en capa fina: cuando la fase estacionaria se extiende sobre una placa. 2.- Cromatografa en columna: cuando la fase estacionaria se empaqueta en una columna

En ambos casos, la fase mvil es un lquido. Si la fase estacionaria est en una columna y se utiliza gas como fase mvil, se denomina Cromatografa de gases. El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el nmero y la cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los anlisis cuantitativos es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos.

Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna

En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo que permite la elucin posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra.

Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como protenas, carbohidratos

y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.

La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf(factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.

La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En general,

aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringes u uso rutinario. La composicin qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin que pueden aplicarse satisfactoriamente.

En la actualidad la cromatografa ms empleada es la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls: High Performance Liquid Cromatography) efectuada en una gran diversidad de columnas.

Los aminocidos libres (por ejemplo de un hidrolizado de una protena) pueden separarse por cromatografa o por electroforesis. Esto puede hacerse en base a sus cargas elctricas netas, las cuales pueden predecirse a partir de los valores de pK de los grupos ionizables y del pH de la fase mvil. Un analizador de aminocidos es un instrumento que los separa automticamente empleando cromatografa de intercambio inico y determinando sus relaciones molares.

Justificacin.

A travs de esta prctica, podremos aprender y practicar la cromatografa para la separacin de los componentes de distintas sustancias, en este caso, un aminocido, una mezcla de aminocidos y orina, adems de que gracias a esto, aprender a calcular el Rf de las soluciones y en base a esto, y conociendo el rf de los diferentes aminocidos, poder llevar a cabo la identificacin de los aminocidos componentes.

Objetivos.

y y

Entender las bases e importancia de la cromatografa. Comprender las aplicaciones clnicas que tiene sta.

Llevar a cabo la separacin e identificacin de los aminocidos de una sustancia.

Aprender las definiciones y aplicaciones de los frentes de solvente y de aminocidos.

Calcular el rf para poder identificar aminocidos.

Hiptesis.

H1: A partir del conocimiento acerca de la cromatografa y aminocidos aprenderemos a hacer o realizar procesos de separacin de aminocidos mediante la cromatografa utilizando papel filtro. Para esto debemos tambin conocer antes los conceptos de frente del solvente y frente de los aminocidos para poder explicar la relacin entre ellos y el mtodo de separacin de aminocidos mediante la cromatografa.

Material

y y

4 cajas de Petri 4 hojas de papel filtro circular con un recorte radial de una tira a manera de lengeta

y y

Pipeta capilar o varilla de vidrio Estufa incubadora y estufa desecadora que alcance 90100 C

Soluciones patrn de aminocidos

Solvente cromatogrfico (cido actico-acetona-butanol y agua)

y y

Muestras de orina Lpiz y una regla escolar graduada en milmetros y

Solucin reveladora de ninhidrina

Mtodo

1. Por el extremo unido al centro, doble la tira recortada del papel.

2. En el centro del crculo dibuje, con punta fina de lpiz, un pequeo crculo de unos 4 mm de dimetro. 3. Con la pipeta capilar o varilla de vidrio aplique una gota (o unas gotas, segn se indica ms adelante) de la solucin a analizar. Esto debe hacerse sobre el crculo trazado. 4. Para efectuar correctamente la aplicacin de la(s) gota(s): a) Moje la pipeta, escrrala y toque con la punta de la pipeta un trozo de papel filtro para prueba. Si el crculo de la mancha es muy grande hay que tocar otra vez el trozo de papel y repetirlo hasta tener un crculo de dimetro adecuado (3-5 mm). b) Conseguido lo anterior, hay que hacer el toque definitivo de la muestra en el papel filtro correspondiente. 5. El nmero de gotas debe ser: a) Una gota de la solucin patrn de un aminocido (diferente para cada equipo) (Filtro I) b) Una gota de la solucin de la mezcla de aminocidos (Filtro II) c) Tres gotas de orina (dejar secar brevemente cada gota antes de aplicar la siguiente) (Filtro III) d) Cinco gotas de saliva (dejar secar brevemente cada gota antes de aplicar la siguiente) (Filtro IV) 6. Seleccione un sitio nivelado y firme, coloque con cuidado ah cada una de las cuatro cajas de petri. Agregue a cada una 10 ml de solvente. 7. Coloque los crculos de papel filtro cuidadosamente sobre el borde superior de cada una de las cajas que contienen al solvente. El papel debe sobresalir apenas de la circunferencia de la caja. 8. Compruebe que la lengeta del papel filtro se sumerja en el solvente. 9. Disponga cuidadosamente la otra tapa (de la caja de petri) de igual dimetro encima del crculo de papel dispuesto en la primera tapa. El papel debe quedar presionado entre ellas. 10. Inmediatamente fije las tapas con un objeto encima de ellas para que se mantengan presionadas.

11. Abandone en reposo hasta que el frente del lquido haya avanzado ms de 2/3 del radio del filtro, lo que transcurre en un tiempo de de hora aproximadamente. 12. Al retirar los filtros de la caja, procure presionar con los dedos las orillas del papel filtro de arriba abajo, con el objeto de levantar el centro del papel. 13. Tan pronto como sea posible, marque con un lpiz el lugar hasta donde lleg el solvente. Esto es lo que se conoce como frente del solvente, el cual va a ser posteriormente medido. 14. Seque las hojas de papel sin sobrecalentar y de la manera que sigue: a) Al ambiente (hasta que casi haya desaparecido el olor del solvente). b) En la estufa a 37C por 5 minutos. 15. Retire los filtros de la estufa, djelos enfriar y trtelos con solucin de ninhidrina, rociando uniformemente y sin saturar las hojas de filtro. 16. En seguida secar, primero al ambiente, luego a 37 C por 3 minutos y posteriormente de 90-100 C por 5 a 8 minutos. 17. Medir el Fa y el Fs: a) Mida y anote la distancia en cms. desde el punto de colocacin de la gota de la muestra al centro de cada una de las manchas. Esta distancia se llama frente del aminocido (Fa). b) Mida y anote la distancia desde el punto de colocacin de la muestra al frente del solvente. Esta distancia se llama frente del solvente (Fs). 18. Calcule la relacin de los frentes (Rf) (velocidad de avance de cada aminocido), dividiendo Fa/Fs. 19. Calcule el Rf para el aminocido patrn que le toc a su equipo y pase el resultado a los otros equipos. 20. Calcule la Rf de los aminocidos presentes en la mezcla de aminocidos, en saliva y en orina y trate de identificarlos con base en los Rfs de los aminocidos patrones. 21. Ilustre por medio de una grfica los Rf determinados en cada uno de sus filtros.

Resultados

Separacin de aminocidos por la cromatografa Relacin de frentes de los aminocidos Equipo Patrn Rf Tiempo en minutos Rf 1 2 3 4 5 6 7 8 .69 .7 .28 .33 .64 .42 .55 .22 50 40 40 60 40 41 47 40 .30 .30 .23 .25 .27 .33 .36 .30 Rf .41 .36 .32 Rf .66 .66 .65 50 40 40 50 40 41 47 40 Mezcla de aminocidos Tiempo en minutos Rf .14 .03 .04 .25 .14 Rf .20 .13 .36 .45 .29 Rf .32 .26 .57 Rf .44 .46 50 40 40 50 40 41 47 40 Orina Tiempo en minutos

.416 .72 .45 .40 .46 .65 .62 .7 .76 -

.55 .625 .94 .68 .60 .80

.178 .428 .75 .27 .15 .39 .46 .53 .73

Tabla 1. Resultados del saln.

Solvente cromatogrfico Ac. Actico Acetona Butanol Agua 10% 35% 35% 20%

Aminocido Metionina Tirosina Histidina Ac. Asprtico

Rf 0.77 0.60 0.12 0.17 0.20

Anlisis

Para llevar a cabo esta prctica y realizar la cromatografa, utilizamos un papel filtro y distintas soluciones, un patrn de aminocidos, una mezcla de aminocidos y orina. Primero colocamos las soluciones en el papel filtro, para posteriormente colocarlas en las cajas de Petri con solvente. Nuestro equipo dej las soluciones en el solvente alrededor de 40 minutos, y en el grupo estuvo entre 40 y 50 minutos, pero en nuestro caso, en la mezcla de aminocidos, cometimos el error de sacar la solucin antes de tiempo, y por lo tanto, no dejamos que la muestra fluyera adecuadamente, y por lo tanto, nos falt un aminocido para la identificacin, en las dems muestras, el tiempo s fue suficiente. Como ya se mencion, en el caso del patrn de aminocido, el tiempo que permaneci en el solvente s fue suficiente, por lo tanto, despus de terminar el procedimiento (calentarlas en la estufa, y luego tratarlas con la Ninhidrina) pudimos calcular su rf, que nos dio como resultado 0.22, por lo que este suponemos que este aminocido corresponde a cido asprtico. Despus, en lo que respecta a la mezcla de aminocidos, slo obtuvimos el rf de 2 aminocidos, pues como ya se mencion, cometimos un error en la cromatografa; en este caso, en general todo el grupo obtuvo resultados similares. Al final obtuvimos los resultados de la muestra de orina, todos los equipos obtuvimos resultados muy variados en lo que respecta al rf de los distintos aminocidos que buscbamos encontrar, pero creemos que esto se debe a que no se utiliz una muestra de orina para todos, sino que cada equipo utiliz una muestra diferente, y quiz a esto se deban los diferentes valores que obtuvo cada equipo.

Conclusin

Con esta prctica aprendimos a realizar una tcnica de cromatografa para separar e identificar aminocidos, adems de que para esto, tambin aprendimos

a calcular el Rf de los aminocidos en base a los factores de solvente y factor de aminocido que obtuvimos durante el proceso; adems de que en nuestro caso en particular, vimos la forma en que afecta el no dar tiempo suficiente para que fluya el aminocido, puesto que si lo quitamos antes del solvente, no se va a separar en el papel filtro y no podremos identificarlo.

Aplicacin Clnica

Anfotericina B

Determinacin en diversos fluidos biolgicos por cromatografa lquida. Aplicacin a estudios farmacocinticos y de estabilidad qumica

La incidencia de infecciones fngicas ha aumentado en los ltimos aos debido al incremento de situaciones clnicas que comportan alteraciones en los mecanismos de defensa del organismo tales como neoplasias, pacientes portadores de un trasplante y tratados con frmacos inmunosupresores o sndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA), entre otros. La anfotericina B (AnB), comercializada en 1956, contina siendo el frmaco de eleccin para el tratamiento de las micosis sistmicas, aunque su utilizacin no est exenta de toxicidad. Las nuevas formulaciones lipdicas de AnB comercializadas a partir de 1995, han supuesto en la prctica clnica una mejora en la optimizacin de la terapia ya que su administracin ha demostrado estar asociada a una menor incidencia de reacciones adversas. Antes de la comercializacin de stas, ha sido frecuente la utilizacin de AnB vehiculada en un excipiente de caractersticas lipfilas como es el Intralipid 20%, preparada como formulacin magistral en el momento de la infusin endovenosa por no disponer de estudios de estabilidad. La aspergilosis pulmonar invasiva es una infeccin fngica que puede aparecer como complicacin en la clnica de pacientes inmunodeprimidos cuya profilaxis con la formulacin de AnB en solucin acuosa para inhalacin, ha demostrado una buena eficacia clnica exenta de los efectos adversos y toxicidad asociados a la

administracin endovenosa. En esta memoria se presentan los resultados de tres trabajos en formato de publicaciones en los cuales se estandariza y valida un mtodo para la determinacin de AnB en muestras biolgicas (suero, secreciones respiratorias) y muestras lipdicas con aplicacin a estudios farmacocinticos y de estabilidad qumica de AnB cuando sta se administra en diferentes formas farmacuticas.

Bibliografa

y y

Microsoft Corporation, Microsoft Encarta 2008. Monografas.com, http://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.shtml, Anlisis del

contenido de los aminocidos en alimentos con fines nutricionales, (28/11/08) y y Nuffield Foundation, Qumica. Ed. Revert, 239 Textos http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia, (21/11/08) y UCO, http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolcientficos.com, Cromatografa,

mol/pdfs/10%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20PAPEL%20AAs.pdf, Cromatografa en papel de aminocidos, (21/11/08) y Universia Biblioteca.net, http://biblioteca.universia.net/ficha.do?id=19235, Anfotericina B: determinacin en diversos fludos biolgicos por cromatografa lquida. Aplicacin a estudios farmacocinticos y de estabilidad qumica, (27/11/08)

Ejercicios

1. Mencione los factores que determinan los Rfs de los aminocidos (y en general de cualquier sustancia)

Solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica

2. Cmo reacciona la Ninhidrina con los aminocidos y que otras reacciones se pueden emplear para identificar aminocidos

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminocidos en medio cido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dixido de carbono y un complejo de color prpura azulado. Todos los aminocidos primarios forman el mismo complejo tras su reaccin con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatizacin

Cromatografa en capa fina: Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinin de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna

Electroforesis: La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partculas coloidales) se separan en funcin de su distinta velocidad de migracin en un campo elctrico.

Cromatografa de gases: Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografa de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales mtodos, an no se utiliza de forma rutinaria para el anlisis de aminocidos en muestras biolgicas.

Cromatografa de reparto en fase reversa: La cromatografa en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase mvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas ms sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retencin cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatogrfico simple y amplio campo de aplicacin.

Cromatografa de intercambio inico: La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la determinacin de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio inico.

3. Si dos sustancias tuvieran el mismo tiempo de retencin que podra hacerse para que se separaran

Si existe la posibilidad de interferencia, las condiciones de separacin (columna empacada o capilar, temperatura, etc.) deben modificarse para evitar el problema.

4. La cromatografa separa compuestos pero para cuantificarlos se requieren detectores: uv / visible, fluoromtrico o electroqumica investigue como trabajan estos detectores.

El principio de la espectroscopia ultravioleta-visible involucra la absorcin de radiacin ultravioleta visible por una molcula, causando la promocin de un electrn de un estado basal a un estado excitado. La longitud de onda (l) comprende entre 190 y 800 nm.

La espectroscopia ultravioleta-visible es la ms limitada para la informacin de compuestos. Los compuestos que tengan un cromforo o instauraciones son visibles en esta regin. Un cromforo es cualquier grupo de tomos que absorben luz independientemente de que presente color o no, aunque tambin puede presentar un grupo auxcromo que es el que ampla la conjugacin de un cromforo mediante la comparticin de electrones de no enlace. La mxima absorcin se debe a la presencia de cromforos en una molcula. Este tipo de espectroscopia sirve principalmente para el anlisis de compuestos aromticos, carboxlicos (a y b insaturados), principalmente Son detectores electroqumicos amperomtricos aquellos en los que la propiedad medida suele ser intensidad o corriente lmite (que es proporcional a la concentracin de la sustancia electroctiva en el seno de la disolucin). Los detectores electroqumicos se basan en las propiedades del soluto que no presenta la fase mvil

5. Se quiere separar al compuesto X

de una mezcla de sustancias. Se

emplea un detector electroqumico cmo se podra asegurar que lo que eluye en el tiempo del compuesto X, es este compuesto y no otro que podra tener el mismo tiempo de retencin?

Comparando sus corrientes limites (proporcional a la concentracin de la sustancia electroctiva en el seno de la disolucin)

Você também pode gostar