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Imunologia Prática

Imunologia Prática

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IMUNOLOGIA Expressão da ligação Ag-Ac

Há vários tipos de reacção Ag-Ac, segundo a natureza do Ag, a classe do Ac e a forma de detecção da união • • • • • • Reacção de precipitação Reacção de aglutinação Reacção de neutralização Fixação do complemento Reacção com elementos marcados Provas cutâneas

As reacções de precipitação e aglutinação fora as primeiras a ser descobertas

IMUNOLOGIA Expressão da ligação Ag-Ac
• Reacção de precipitação Baseia-se na capacidade que alguns Acs (precipitinas) têm para formarem com Ags solúveis, macromoléculas suficientemente grandes para precipitarem É mais eficaz para detectar Ags do que Acs Permite determinar títulos de Acs quando se coloca uma quantidade fixa de Ag em solução perante diluições sucessivas da amostra A precipitação só se observa quando se obtém um ponto de equivalência de concentrações do Ag e do Ac (Fenómeno de prozona)

IMUNOLOGIA União Ag-Ac

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
1. Imunodifusão passiva – Difusão em gel • Técnica de Ouchterlony (1948) Realiza-se em poços perfurados num gel de agar onde se colocam soluções de Ags e Acs A difusão de ambos na espessura do agar levará ao seu encontro produzindo bandas de precipitação

IMUNOLOGIA Padrões de reacção em imunodifusão dupla
(Técnica de Ouchterlony)

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
1. Imunodifusão passiva – Imunodifusão radial (IDR) • Técnica de Mancini (1965) Utiliza um gel de agar em que se incorporou um Ac Poços feitos no agar servem para acrescentar Ags ou factores do complemento A difusão do Ag provoca um halo de precipitação em volta do poço O diâmetro do halo é directamente proporcional à concentração do Ag, que é calculada face aos diâmetros dos halos produzidos por soros de concentração conhecida

IMUNOLOGIA Imunodifusão radial (IDR)

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
2. Imunoelectroforese É um excelente método para detectar diversos sistemas Ag-Ac sobre um gel de agar ou outro meio sólido, tendo por base uma separação electroforética prévia das várias proteínas de uma solução antigénica complexa que depois se põe em contacto com os Acs para dar as linhas de precipitação

IMUNOLOGIA Técnica de imunoelectroforese

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
3. Imunodifusão activa – Contraimunoelectroforese Usa uma placa de gel de agar com 2 poços em oposição onde se coloca Ag num e Ac no outro Submetida, a placa, a uma corrente eléctrica Ag e Ac migraram ao encontro um do outro para dar uma linha de precipitação Boa para detectar Ags bacterianos em líquidos orgânicos Ex.º Ags de meningococo ou de pneumococo no LCR quando não são visíveis na coloração de Gram

IMUNOLOGIA Técnica de contraimunoelectroforese

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
3. Imunodifusão activa – Electroimunodifusão a duas dimensões

Tecnicamente consegue-se que o Ac permaneça fixo e é o Ag que migra no gel Com este método consegue-se que os precipitados tenham uma forma de ponta de lança A altura dos precipitados é proporcional à concentração do Ag Com um pH adequado pode fazer-se o contrário

IMUNOLOGIA

IMUNOLOGIA Modificações da reacção de precipitação
3. Imunodifusão activa – Electroforese cruzada de Laurell

Começa-se por realizar uma electroforese de proteínas Uma vez concluída a separação, a placa de agar adere-se a outra que tem os Ags e submete-se a uma electroforese cruzada Também permite uma quantificação

IMUNOLOGIA Técnica de Laurell

IMUNOLOGIA Expressão da ligação Ag-Ac
• Reacção de aglutinação Possibilidade de alguns Acs ( aglutininas) provocarem aglutinação com Ags particulados (eritrócitos, bactérias, partículas de látex, etc.) Os Acs mais aglutinantes são os da classe IgM Está também sujeita aos fenómenos de prozona e pode utilizar-se como técnica qualitativa, semiquantitativa e quantitativa, em que o título da reacção corresponderá à maior diluição em que ainda se observa a aglutinação Consoante a forma de se realizar, assim é: – Directa – Passiva

IMUNOLOGIA Reacção de aglutinação
1. Reacção de aglutinação directa Consoante o tipo de Ag que se empregue assim o resultado da união Ag-Ac se pode observar de maneira diferente No caso de bactérias, observa-se a formação de pequenos depósitos finamente granulares que se ressuspendem sem se desmancharem. Podem ser de tipo somáticos ou flagelares Nos casos em que o Ag está representado por células inteiras como as hemáceas, produz-se o fenómeno de hemaglutinação, com a formação de grumos

IMUNOLOGIA Reacção de aglutinação
2. Reacção de aglutinação passiva Por adsorção de Ags solúveis sobre a superfície de uma célula (GV) ou de uma partícula sintética (Látex), consegue-se converter uma prova de precipitação em reacção de aglutinação, melhorando a sua sensibilidade Uma vez sensibilizadas põem-se em presença do soro problema e observa-se se há ou não aglutinação É possível uma semiquantificação da taxa de Acs

IMUNOLOGIA Reacção de aglutinação passiva

IMUNOLOGIA Expressão da ligação Ag-Ac
• Reacção de neutralização Neste tipo de reacção vai observar-se o fenómeno fisiológico de inactivação de um processo biológico A união do Ag-Ac revela-se pelo desaparecimento de determinadas propriedades biológicas como sejam: – Neutralização de vírus – Neutralização de toxinas in vitro – Neutralização da mobilidade

IMUNOLOGIA Imunoensaios
(Ensaios de ligação)

1.

Ensaios heterogéneos

Existe separação entre a fase ligada e a fase livre Doseia-se a fase ligada

2a. Competitivos (Ag*) 2b. Imunométricos (Ac*)

2.

Ensaios homogéneos

Não há separação e ocorre uma modulação da actividade da substância marcada Só doseiam Ag EMIT FPIA -Enzyme multiplied immuno assay technic -Fluorescente polarization assay

IMUNOLOGIA Imunoensaios
(Ensaios de ligação)

1. •

Ensaios heterogéneos Tipo de marcadores (*)
– – – – Radioisótopos Enzimas Compostos fluorescentes Compostos luminescentes

IMUNOLOGIA • Ensaios heterogéneos Competitivos
RIA EIA FIA LIA -Radio immuno assay -Enzyme immuno assay -Fluoro immuno assay -Luminescente immuno assay

[Ac fixo em fase sólida + Amostra (Ag a dosear) + Ag*] A probabilidade que o Ag* tem de se ligar ao Ac é inversamente proporcional à concentração do Ag não marcado que interessa dosear

IMUNOLOGIA • Ensaios heterogéneos imunométricos
(Ensaio tipo Sandwich)

IRMA IEMA IFMA ILMA

-Immuno -Immuno -Immuno -Immuno

radio metric assay enzymo metric assay fluoro metric assay luminescente metric assay

[Ac fixo em fase sólida + Amostra (Ag a dosear) + Ac* ] A fracção ligada é directamente proporcional à concentração na amostra
ELISA -Enzyme linked Immuno Sorbent Assay (IEMA)

IMUNOLOGIA
Sífilis (Lues) Testes inespecíficos:
• Reacção de VDRL • RPR (rapid plasma reagin) - VDRL clássico, mod. Servem para pesquisar a reaginas sifilíticas e usam como Ag a cardiolipina-lecitina Títulos sugestivos se > 1/16 Útil para monitorização da terapêutica

Testes específicos:
• FTA-Abs – (Fluorescent Treponema Antibody-Absorption) Usa uma técnica de imunoflorescência • TPHA – É uma reacção de hemaglutinação passiva, visto que usa GVs de galinha revestidos com Ag treponémico • TPI – É um teste de imobilização treponémica • EIA e Western-Blot

IMUNOLOGIA

Transição materno-fetal

IMUNOLOGIA
Brucelose (Febre de Malta) • Hemocultura (Método de Castañeda) • Reacção de Huddlesson – reacção de aglutinação rápida em lâmina para detecção de Acs anti-Brucella abortus • Reacção de Wright - reacção de aglutinação lenta em tubo para detecção de Acs anti-Brucella abortus
Títulos de 1:80 a 1:160 são indicativos e os de 1:320 são conclusivos a partir da 2ª semana

• Reacção de Rosa Bengala – reacção de aglutinação rápida em lâmina que usa uma suspensão tamponada de Brucella abortus corada com Rosa Bengala
Dá resultados qualitativos e é útil em estudos epidemiológicos em larga escala Revela a brucelose aguda 4 a 6 dias depois da R. de Wright, mas permanece um pouco mais tempo positiva nos casos de brucelose antiga

IMUNOLOGIA
Febre tifóide
• Hemocultura (Kayser) • Coprocultura (meio de Wilson–Blair com verde brilhante) • Reacção de Widal – em lâmina ou em tubo é uma prova de aglutinação para detecção de Acs contra:
Salmonella typhi - O (somático) e H (flagelar) Salmonella paratyphi A – AH (flagelar) Salmonella paratyphi B – BH (flagelar)

Esperar grandes aumentos entre o 8º e 15º dia da doença Os Ags O são os primeiros a subir e declinam rapidamente com o tratamento Os Ags H sobem mais lentamente e persistem denunciando uma infecção antiga ou vacinação Títulos de 1:160 em O e de 1:80 em H são indicativos Nos casos positivos, a demonstração do Ag Vi (superficial ou de virulência) interessa para o despiste de portadores. Títulos ≥20 já são suspeitos

IMUNOLOGIA
Mononucleose infecciosa

• Reacção de Paul-Bunnell-Davidsohn – reacção de hemaglutinação para detecção de Acs heterófilos ou de Acs inespecíficos de tipo Forssman

• Monoteste – teste de aglutinação em lâmina em que antes da adição de Ag EBV, se adiciona a uma parte da amostra Gvs de boi para adsorverem os Acs heterófilos e, a outra parte, rim de cobaia para adsorver os Acs inespecíficos

IMUNOLOGIA
Febre escaro-nodular (Febre da carraça) • Reacção de Weil-Félix – em lâmina ou em tubo é uma prova de aglutinação para detecção de Acs anti-Proteus usando suspensões bacterianas coradas e inactivadas de:
– Ag Proteus OX2 – Ag Proteus OXK – Ag Proteus OX19

Prova obsoleta por inespecífica A doença é causada pela Rickettsia conorii e o vector é a carraça do cão

IMUNOLOGIA
Hidatidose (Quisto hidático) É uma Equinococose (Echinococcus granulosus) em que o cão é o hospedeiro definitivo albergando o parasita adulto • Reacção de Wienberg – que é uma reacção de fixação do complemento • Reacção de Casoni – intradermoreacção

IMUNOLOGIA
Artrite reumatóide • RA Teste (Factores reumatóides) O termo Factor reumatóide (FR) engloba um grupo heterogéneo de auto-Acs (na sua maioria IgM), que são capazes de reagir com diferentes epítopos da região Fc da IgG humana A pesquisa pode fazer-se por:
• Reacção de aglutinação em lâmina • Imuno-turbidimetria • Nefelometria

IMUNOLOGIA
Artrite reumatóide • Reacção de Waller-Rose É uma técnica de hemaglutinação que utiliza glóbulos de carneiro sensibilizados por imunoglobulinas de coelho anti-eritrócitos de carneiro Em presença de FR, observa-se a hemaglutinação
Ac

coelho anti-GV

GV carneiro

• Imuno-turbidimetria • Nefelometria • ELISA e RIA

Outras técnicas:

IMUNOLOGIA
Lúpus eritematoso disseminado (LED) • LE teste (fenómeno LE) O teste é uma reacção de aglutinação em lâmina em que partículas de látex revestidas com (DNP) desoxiribonucleoproteínas, aglutinam se o soro do doente tiver Acs anti-DNP • Pesquisa de células LE Em 1948 descobriu-se que o fenómeno da célula LE era devido à fagocitose, por neutrófilos, de núcleos celulares opsonizados por auto-Acs

IMUNOLOGIA
Infecção estreptocócica No homem, os estreptococos dos grupos A, C e G de Lancefield podem causar faringite, mas praticamente só os do grupo A ocasionam febre reumática e glomerulonefrite Estes estreptococos elaboram um grande número de produtos extracelulares como: • Estreptolisinas O e S (ASO/TASO) • Desoxiribonuclease B (DNAse) • Hialuronidase A pesquisa pode fazer-se por:
• Reacção de aglutinação em lâmina • Imuno-turbidimetria • Nefelometria

IMUNOLOGIA
Gravidez • DIG (Diagnóstico Imunológico de gravidez) Teste presuntivo de gravidez que faz a detecção de hCG, se esta estiver acima de determinado nível de sensibilidade do teste (25 mUI/mL) A pesquisa pode fazer-se por:
• Teste de aglutinação em lâmina • Teste imunocromatográfico

• Doseamento de β-hCG

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