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Sebenta de Fisiologia I (06-07)

Sebenta de Fisiologia I (06-07)

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz

Fisiologia I

Fisiologia I Sebenta Teórica

Professor Doutor Armando Sena Versão 2006 / 2007
2006/2007 -1-

Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Fisiologia Geral das Biomembranas

Fisiologia I

I. Evolução do Conceito de Membrana Biológica: Os Modelos da sua Organização Molecular • R. Hooke (1665) – introduz o termo “célula”. • T.Schwann (sec. XIX) – enuncia que “as partes elementares dos tecidos são as células, que são na generalidade semelhantes, mas que diferem na forma e função”. • K. Nägeli (1855) – introduz o termo “membrana citoplasmática” (plasma membrane), responsabilizando-a pelas propriedades osmóticas da célula. • C. Overtone (1899) – verifica que quanto mais polar é uma molécula mais lenta é a sua entrada na célula. Propõe para a membrana uma natureza “LIPÓIDE”, responsável pela regulação da entrada de substâncias na célula. • Gorter e Grendel (1925) – os lípidos extraídos das membranas eritrocitárias dispostos numa mono-camada na interface ar-água, ocupam uma área aproximadamente dupla da área de superfície total dos eritrocitos intactos. Propõem que os lípidos membranários estão dispostos numa dupla camada.

Figura: a) parte apolar; b) grupos polares. • 1930 – 1950 - Desenvolvimento da microscopia electrónica e descoberta das estruturas membranárias INTRACELULARES. • Danielli Davson (1935) e Robertson (1966) – “A dupla camada está disposta em “sandwich” entre duas camadas proteicas” fundamentada em grande parte nos estudos em ME e de difracção dos RX na MIELINA.

Figura: Dupla camada lipídica.

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Robertson propõe a teoria da unidade membranária, pela qual TODAS as membranas teriam uma idêntica ESTRUTURA TRILAMELAR. • MODELO EM MOSAICO e MODELO EM MOSAICO FLUIDO: O modelo em mosaico (Singer e Wallach, em meados dos anos sessenta) propõe proteínas globulares embebidas na matriz lipídica. O modelo em mosaico fluido (Singer e Nicolson, 1972; Nicolson, 1976) desenvolve o modelo em mosaico acentuando ASPECTOS DINÂMICOS DA ESTRUTURA MEMBRANÁRIA.

Figura: Modelo em mosaico.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz II. Estrutura e Dinâmica das Membranas • Modelo de Singer e Nicolson (1972); Nicolson, (1976):

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As cadeias de oligossacáridoss das glicoproteínas e glicolípidos estão sempre voltadas para o exterior. O ÁCIDO SIÁLICO é frequentemente o seu último radical, desempenhando função primordial no reconhecimento do mundo exterior. A esta topografia assimétrica das PROTEÍNAS e GLICOCONJUGADOS acrescenta-se a das FOSFOLÍPIDOS (por exemplo a fosfatidiletanolamina predommina frequentemente na camada interna e a fosfatidilcolina na externa) e do COLESTEROL. A membrana é uma estrutura dinâmica. As CADEIAS OLIGOSSACÁRIDAS interagem por pontes de hidrogénio e catiónicas. Os lípidos são passíveis de DIFUSÃO LATERAL rápida (podem alterar posição 1.000.000 vezes por segundo) e de uma movimentação VERTICAL inter-camada geralmente muito lenta (inferior a uma por mês) – flip-flop. As proteínas são também passíveis de uma movimentação lateral e vertical. Um sistema contráctil, o CITOESQUELETO, que inclui microtubulos (complexos de tubulina), actina e miosina, contribui ainda para o comportamento dinâmico da membrana citoplásmica.

Figura: Estrutura e Dinâmica Membranária: a) matriz extracelular; b)citoplasma.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz III. Os Lípidos das Membranas

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A) As membranas são muito diversas quanto à quantidade e qualidade dos lípidos que contêm.
Razão Proteína / Lípido Mielina Fígado (murganho) Bastonetes (bovino) Eritrocitos (humano) Matriz Mitocondrial Externa Amiba Retículo Sarcoplasmático Matriz Mitocondrial Interna 0,23 0,85 1,0 1,1 1,1 1,3 2,0 3,2

Tabela: Razão proteína / lípido em diversas membranas de eucariotas.

A Composição Lipídica de Algumas Membranas Eritrocito (humano) Eritrocito (bovino) Eritrocito (porco) Eritrocito (rato) Matriz Citoplasmática do Fígado 55,2 (rato) (citoplasma do hepatócito?) Mielina (humano) 43,1 Mielina (rato) 44 Fosfolípidos 73 70 63,6 67,4 Esterol 25 30 28 24,7 22 27,7 27,3 Glicoproteínas <5 <5 12 – 14 8,3 8 27,5 31,5

Tabela: A composição lipídica de algumas membranas
A Composição Fosfolipídica de Algumas Membranas Citoplasmica Nuclear R.E.R. Lisosomal F.C. 20,0 52,2 51,8 23,4 F.E. 11,5 19,3 15,8 12,4 F.S. 5,1 3,0 2,8 6,2 F.I. 4,2 7,3 7,6 6,2

Tabela: A composição fosfolipídica de algumas membranas (tirado de rato) • Existe uma topologia assimétrica dos lípidos nas membranas: - FE, FS, AG insaturados predominam na face citoplasma - FC, Esfingom., glicolípidos (xxxgiosidos) predominam na face externa

B) A dupla camada de fosfolipidos

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• Moléculas Anfipáticas – têm domínios limitados de superfícies polares e apolares, e em meio aquoso formam MICELAS, em que as superfícies hidrofóbicas se agregam minimizando a exposição das superfícies apolares à superfície – incluem os detergentes e os lípidos complexos. • Moléculas anfipáticas com resíduos polares e apolares em quantidades comparáveis tendem a formar estruturas lamelares em dupla camada. Os FOSFOLÍPIDOS, lípidos predominantes nas biomembranas, têm estas propriedades e as membranas uma estrutura lamelar. Contudo, fases hexagonais podem ocorrer nalgumas situações. - A fase hexagonal I forma micelas (como a fase lamelar) em meio aquoso. - A fase hexagonal II forma “micelas invertidas” em solventes apolares.

Figura: Estados de agregação ou “fases” na interacção de lípidos complexos com a água; a) hexagonal I; b) lamelar; hexagonal II. Cada fosfolípido tem um RAIO DE CURVATURA INTRÍNSECO (Ro) que reflecte o raio do canal formado pelos grupos polares na fase hexagonal II. A formação da fase hexagonal II é favorecida por um valor de Ro pequeno (como para a fosfatidiletanolamina, sendo quase infinito para a fosfatidilcolina devido à mutilação das aminas), o aumento da insaturação dos ácidos gordos e o aumento da temperatura. • Importância patológica: os lisofosfatídeos (efeito de fosfolipases de certos venenos) geram fases hexagonais - lise da membrana. A fase hexagonal II é imunogénica, podendo induzir auto-anticorpos nalgumas doenças; Importância funcional: a fusão de membranas, que ocorre em fenómenos de endocitose, tranporte vesicular, secreção, infecção viral,

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etc., exige desidratação parcial entre duas membranas e modificação transitória da sua estabilidade estrutural – o que poderá envolver formação de fase hexagonal II. A abundância de fosfatidiletanolamina nas membranas, fosfolípido que favorece a formação de fase hexagonal II, poderá ter um papel regulador na morfologia membranária. A presença de diacilglicerol nas membranas, molécula que reduz a temperatura de transição de fase lamelar / fase hexagonal II, poderá regular a geometria e estabilidade membranária. (Os gangliosidos são moduladores de transição lamelar / hexagonal II com efeito duplo, dependendo das concentrações). Em conclusão, o metabolismo lipídico poderá regular o equilíbrio de factores favorecendo as fases lamelar e hexagonais, com consequências que podem ser protectoras ou desestabilizadoras (patológicas) para a célula. C) A fluidez da membrana e a função do esterol nas membranas

Figura: Fluidez membranária A baixas temperaturas, os fosfolípidos hidratados existem numa fase de gel ou estado cristalino de reduzida mobilidade física (medida pelo parâmetro de microviscosidade, ou seu inverso, a fluidez). A partir de uma determinada temperatura, que varia com o lípido, a temperatura de transição de fase, Tc, as cadeias hidrocarbonadas, e mais gradualmente os grupos polares, dos fosfolípidos adquirem bruscamente mobilidade., originando um estado cristalina-líquido. A temperatura Tc de um dado lípido varia conforme o COMPRIMENTO e GRAU DE INSATURAÇÃO dos ácidos gordos. As membranas biológicas têm em geral uma razão molar esterol : fosfolípidos de (0,5/1):1. A razão próxima da unidade parece estar favorecida na maioria das circunstâncias. Nesta razão, próxima da unidade, o colesterol (o esterol nas células animais) tem a capacidade de aumentar a desordem dos

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fosfolípidos abaixo da temperatura Tc e de aumentar a sua ordem acima dessa temperatura. Resulta assim que, às TEMPERATURAS FISIOLÓGICAS, o colesterol mantém as membranas num estado relativamente fluido ou de gel intermediário, regulando a sua permeabilidade, actividade enzimática e receptora. A sua distribuição assimétrica será influenciada pela assimetria de composição lipídica e proteica da membrana.

Deteminantes da fluidez membranária Determinantes Temperatura Lípidos Proteína Variável ↑ ↑ comprimento AG ↑ insaturação AG ↑ esfingomielina ↑ colesterol ↑ Efeito na fluidez ↑ ↓ ↑ ↓ ↑↓↓ ↓

Tc depende da composição do grupo polar e dos AG dos fosfolípidos Tc (ºC) F. Col 0.0 23.5 41.3 - 20.0

AG 12:0 14:0 16:0 18:0

F. Etan 30.0 48.3 62.6 -16.0

Efeitos da fluidez nas proteínas da membrana Exemplo Mobildade Proteica • Mobilidade lateral • Mobilidade rotacional • Mobilidade vertical Permeabilidade de Substratos e Ligandos Actividade Catalítica de Enzimas Especificidede e Afinidade de Receptores - Receptores con. A - Ca2+ ATPase - Proteínas eritrocitárias UDP – glucoronil transferase (subs. UDP ác. glucorónico) Na+ e K+ ATPase Receptor da insulina e da seratonina

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Temperatura (ou ponto) de fusão (TF) dos ácidos gordos 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 W9 18:2 W6 20:4 W6 20:5 W3 22:6 W3

Exemplos + 54 ºC + 63 ºC + 1 ºC + 70,1 ºC + 16, 3 ºC - 5,8 ºC - 49,5 ºC - 54,4 ºC - 44,5 ºC

Tabela: A temperatura teórica de fusão dos ácidos gordos dos fosfolípidos, como medida de fluidez da membrana.

Temperatura Teórica de Fusão (TTF) TTF= ∑ (% dos AG x TF) 100

Notar que a simples adição de uma dupla ligação afecta profundamente as propriedades físicas do ácido gordo. O ponto de fusão depende por vezes mais da posição do que do número de duplas ligações. Notar que a maioria das AGPI são fluidas a temperaturas muito inferiores às compatíveis com a vida, e à conservação a -20ºC - detrioração dos fosfolipidos (…)

• “Raft”: Organização lateral dos lípidos e colesterol das membranas em plataformas móveis, nas quais estão associadas proteínas específicas; Representam-se no modelo três tipos possíveis de proteínas (P1 – P3).

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Deste modo, os “rafts” lipídicos regulam o tráfico membranário de certas proteínas, para além doutros processos – como o metabolismo da proteína percursora do amilóide ou a polarização da motilidade celular, a transdução de sinal e a endocitose para certas proteínas. • Cavéolas Subtipos de rafts lipidicos, com a característica de possuirem proteinas especificas, as caveolinas (1,2,3). Implicações funcionais: • Transdução de sinal (factores de crescimento) e função de proteínas ligadas ao GPI, desenvolvimento e transmição sinaptica • Endocitose independente de clatrina – não leva à fusão com os lisossomas. • A deficiência em caveolina-3 (mutações), específica muscular, resulta em patologia humana. A deficiência em caveolina-1 (presente nas células não musculares) no murganho, resulta em problemas cardiovasculares e respiratórios. • Medeia a endocitose para moléculas patogénicas e microorganismos, evitando a sua degradação pelos lisossomas. Exemplos:

IV. As proteinas da membrana A. Medeiam a maior parte das junções ENZIMÁTICAS DE TRANSPORTE E RECEPTORA das membranas. 2006/2007 - 10 -

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O conteúdo proteico varia considerávelmente com o tipo de membrana, reflectindo os seus diferentes níveis de actividade.
“Em média” 20% Água ~ 40% Lípidos ~ 60% Proteínas ~ 1-10% Glúcidos Proteínas Mielina 20-30% Memb. Citop. ~ 50% M.Mitoc.In. 75%

- Classificam-se em dois grandes grupos: PROTEÍNAS PERIFÉRICAS, EXTRÍNSECAS, EXTERNAS OU “ASSOCIADAS” Facilmente dissociadas com tratamentos suaves, como manipulando a força iónica e o plt. São libertadas em forma solúvel não agregada, livres de lípidos contaminantes e que podem ser purificadas segundo as técnicas “standard” de fraccionamento proteico. PROTEÍNAS INTEGRAIS OU INTRÍNSECAS Em geral, só isoladas em tratamentos mais agresivos, envolvendo a ruptura da membrana poe detergentes caotrópicos (agentes que rompem as ligações hidrofóbicas nas membranas, podendo ser moléculas orgânicas como a ureia ou iões inorgânicos com grandes raios de hidratação como o Li+ e o Cl-. O fraccionamento das proteínas integrais tem sido mais difícil mas é hoje possível aplicando técnicas de cromatografia e electróforese.

B. Funções das proteinas das membranas citoplasmáticas • • Estruturais, enzimáticas, de transporte De sinalização ou alterações do meio externo - canais iónicos - receptores - moléculas de adesão celular

CANAIS IÓNICOS – a passagem ou fluxo de iões pode depender das novas concentrações nos meios, da voltagem, da estimulação/deslocação mecânica ou outros mecanismos reguladores. Nalguns casos, a regulação do fluxo iónico é dependente de ligandos, fazendo o canal iónico parte de um complexo proteico designado RECEPTOR IONOTRÓPICO. Um outro tipo de receptor está dependente das proteinas G para a sua sinalização: RECEPTOR METABOTRÓPICO. Existem ainda OUTROS TIPOS de receptores, em particular para factores de crescimento ou Tróficos.

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IONOTRÓPICO

METABOTRÓPICO, acoplado a canal iónico

METABOTRÓPICO, enzima

acoplado

a Com actividade tirosina cinase ou activando tirosinas cinases citoplasmáticas

Os receptores metabotrópicos e o ciclo das proteinas G

α, β, γ – subunidades da proteína G (heterotrimérica) SINAL – É mais frequente um ligando de natureza molecular (hormona, neurotransmissor, molécula odorífica, por exemplo), mas pode ser de outra natureza (a luz/fotão, para os receptores rodopsina, na visão). C. Moléculas de Adesão Celular São proteínas membranares de extrema importância nas interacções da célula com outras células e a matriz extracelular – no desenvolvimento (proliferação, diferenciação e migração), função e patologia de vários tecidos. 2006/2007 - 12 -

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Elas estão agrupadas em famílias ou classes, nas quais os seus membros estão relacionados por aspectos comuns estruturais ou funcionais. • Interacções homofílicas – de idênticas moléculas • Interacções heterofílicas – de diferentes moléculas Sinalizam informação de fora para dentro (mensageiros intracelulares, citoesqueleto, expressão genética) ou de dentro para fora (indutoras de migração celular, por exemplo) As quatro principais famílias são: • A super família das imunoglobulinas (Ig CAMs); • as selectinas; • as integrinas; • as caderinas. Outra, menos bem defenida é a família de quatro domínios transmembranares, que inclui a proteína proteolipídica da mielina, as conexinas (complexos de junção) e o receptor rianodina, entre outras. A maioria intrevêem exclusivamente na interacção celular ou membrana – membrana (Ig CAM, caderinas). Outras interagem principalmente com componentes da matriz extra-celular (integrinas). Como cada família é definida por semelhantes sequências aminoácidas e aspectos estruturais comuns, os seus membros partilham de identicos requisitos de ligação, destintos entre as classes. Exemplos: Ig CAMs – independentemente do Ca2+ , frequentemente homofílica, pode ser heterofílica Integrinas – dependente de catiões (Ca2+, Mg2+), sempre heterofílica Caderinas – dependente do Ca2+, geralmente homofílica Ig CAMs Embora com junções distintas das imunoglobulinas, definem-se por terem sequências similares com as Igs designadas “domínios Ig”. Há 3 subclasses de “domínios Ig” definidos pelas semelhanças com a região variável (V) ou constante (C) das Igs. Exemplos: Ver Anexo. Outras, no sistema nervoso, por exemplo a MAG (myelin associeted glycoprotein) e as NCAM (neuronais). Um exemplo da sua importância está no processo de adesão e transmigração endotelial dos leucocitos. (Anexo) Integrinas Receptores constituídos por 2 subunidades α e β, de ligação não-covalente. Na sua porção citoplasmática interagem com muitas proteínas, incluindo do citoesqueleto. Conhecem-se hoje pelo menos 8 subunidades β e mais de 12 subunidades α. Exemplos: Com β1 (VLA-1, etc.) com β2 (LFA-1, Mac1). Outras com β3, com β2+ β3, etc.

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Exemplos da sua importância são a deficiências de adesão leucocitária (LAD tipo1), com infecções repetidas, devido a défice na subunidade β2 (CD18). Elas estão implicadas no processo de adesão e transmigração leucocitarias. Selectinas Possuem domínios tipo lectina, tipo EGF e tipo complemento. São de 3 tipos, específicas: • linfócitos (selectina – L), • plaquetas e endotélio (selecrina – P) • endotélio (selectina – E). Não são expressas pelos neurónios e pela glia. Um exemplo da sua importância é a implicação nas fases iniciais da adesão leucocitária ao endotélio. Caderinas Superfamilia de moléculas de adesão com funções no reconhecimento celular, morfogénese e supressão tumoral. As Caderinas “ clássicas” incluem: • neural (caderina-N) • epitelial (caderina-E) • placentaria (caderina – P) • retiniana (caderina–R). A sua distribuição não é limitada a esses tecidos. Por exemplo: o tecido nervoso contém mais de 20! Todas possuem uma junção extra celular NH2 – terminal com 5 domínios, um só domínio transmembranário e uma porção citoplasmática COOH- terminal. Esta última interage com as proteínas Cateninas ( Beta e Alfa). A α-catenina liga a β-catenina à actina do citoesqueleto. Exemplo da importância do complexo caderina-catenina está na regulação que oferece à normal manutenção da adesividade inter-celular nos vários tecidos e na oncogénese. (Há uma expressão reduzida da α-catenina e caderina-E nos tumores do cólon-recto).

Moléculas de adesão celular

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Moléculas Adesão FAMILIA DAS INTEGRINAS Subfamilia β 1 ( CD 29) VLA-1 VLA-2 VLA-3 VLA-4 VLA-5 VLA-6 Subfamília β2(CD 18) LFA-1 Mac- 1 SUPERFAMILIA DAS IMUNOGLOBULINAS LFA-2 LFA-3 ICAM-1 ICAM-2 VCAM-1 FAMÍLIADAS SELECTINAS Selectina –E Selectina_L Selectina-P FAMILIADAS CADERINAS

Nomenclatura (CD)

Ligando

Distribuição

CD49a/Cd29 CD49b/CD29 CD49c/CD29 CD49d/CD29 CD49e/CD29 CD49f/CD29 CD11a/CD18 CD11b/CD18

Lamin,colag. Lamin,colag. Lamin.,colagen Fibronect ;VCAM-1 Fibronect Laminina ICAM-1,ICAM-2 ICAM-1, C3b Leucócitos Macrofágos,granulócitos

CD2 CD58 CD54

LFA-3 LFA-2 LFA-1,Moc-1 LFA-1 VLA-4

Células T Endotélio vascular Endotélio vascular

CD 62

Endotélio vascular Leucócitos Plaquetas,endotélio vascular

N ( neural), E ( epitelial), P( placentario), R ( )

Figura: Representação de uma integrina, imunoglobulina, selectina e caderina.

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Figura: Representação esquemática de proteínas na membrana da célula endotelial e do leucócito.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz A Adesão e Migração Trans-endotelial de leucócitos

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Figura: Adesão dos leucócitos

Figura: Migração Trans-Endotelial de leucócitos Descrição da imagem: 1- Contacto/deslizamento dos leucócitos não-activados pelo endotélio, mediado pelas selectinas; 2- Secreção de quimiocinas (o) nos locais de inflamação (infecção, antigénio, tumor) pelas células do tecido, leucócitos residentes e por células endoteliais activadas por citocinas ( IL-1, TNF-α) e outras mediadores próinflamatórios. 3- Activação dos leucócitos – pelas quimiocinas retidas na proteoglicana de sulfato de heparano da superfície endotelial. 4- Firme aderência e trans-migração dos leucócitos – mediado pelas integrinas dos leucócitos activados e moléculas de adesão IgCAM( ICAM1,VCAM-1) expressas no endotélio activado. Defesa da sub β2 da integrina na defesa adesão leucócitos tipo1.

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5- Os leucócitos recrutados são reactivados pelas citocinas pró-inflamatórias, mas tornam-se dessensibilizados à activação pelas quimiocinas (altas concentrações). 6- O receptor antigénio Duffey (eritrócitos) remove as quimiocinas da circulação mantendo um gradiente rico nos locais de inflamação no tecido. D. O Complexo Glicoproteico associado à Distrofina (Músculo esquelético e cardíaco)

Através da distrofina, o aparelho contráctil (sarcómero) está estrutural e funcionalmente associado à matriz extra-celular. De grande importância patogénica em distrofias musculares e cardiomiopatias.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz O Complexo LAD e Proteinas Relacionadas em Miopatias

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A - Distrofias musculares congénitas (AR) – Merosina (lamininas α2) ; receptor da laminina integrina α7; Na do musculo-olho-cerebro (MEB) e na de tipo Fukuyma não há glicosilação da α- distrofina ( explica “ lisencefalia em mármore”). B - Distrofias musculares do tipo Duchene e Becker (Xp21) – Distrofia C - Distofia muscular de Rmery -Dreijus – Emerina ( lig.x) ; Lamina A / C (AR,D). D - Distrofias das cinturas(AR) – sarcoglicanas Disferrina (AD); Caveolina 3. E - Distrofias distais - Disferrina (AR). F - Cardiomiopatias – frequentemente associadas às distrofias musulares . NOTA ( *) Miopatias esqueléticas e/ou cardíacas podem associar-se a difíceis de outros tipos e proteínas ( mitocôndrias, enzimáticas, ionóforos,etc).

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz V. Transporte Passivo e Transporte Activo

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A. Transporte Passivo Transporte possibilitado por uma diferença de concentração (para substâncias sem carga) ou por uma diferença de concentração e de potencial eléctrico (para substâncias com carga). Tende a dissipar as diferenças que lhe deu origem e a distribuição final entre a célula e o meio de um estado de equilíbrio. 1. Transporte e distribuição da água. Pressão osmótica

Figura: Pressão osmótica A pressão osmótica é tanto maior quanto o número de partículas de soluto: Pi =RT ( c) Pi = Pressão osmótica de soluto; R = Constituinte dos gases; T = Temperatura absoluta; c= Concentração do soluto em moles / litro (molaridade). Para solutos que se dissociam deve ser multiplicada pelo número de partículas da molécula dissociada, a OSMOLARIDADE da solução. 1 osmol de uma substância é a mesma massa desta que proporciona, em solução, o mesmo número de partículas que 1 mol de uma substância não dissociável. 1 osmol = 1 mol de glucose 1osmol de NaCl = 0,5 mol de NaCl Geralmente a pressão osmótica da célula é idêntica à pressão osmótica do meio que a rodeia. Contudo, a membrana biológica pode ser muito permeável a alguns solutos.

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A PRESSÃO OSMÓTICA OU OSMOLARIDADE EFECTIVA é aquela determinada pelos solutos que são incapazes de atravessar a membrana ou fazem-no com uma velocidade menor que a água. B. Transporte Passivo de iões A força impulsora originada das diferenças de concentração adiciona-se a que provêm das diferenças de potencial eléctrico de modo que a tendência para dissipar as diferenças de concentração pode ser contrariada pelas diferenças de potencial.

Potencial electroquímico Mede a energia livre de um ião em solução, em função da sua concentração e do potencial eléctrico. A temperatura e pressão constantes (como nas células), dois sistemas estão em equilíbrio quando a sua energia livre tem o mesmo valor, quer dizer, quando se iguala o potencial electroquímico ião em ambos os compartimentos. Equação de Nernst
E IÃO = RT / 2F . ln [ ião] out / [ ião] in E = potencial de equilíbrio F= Constante de Farenday 2 = valência do ião

A equação de Nernst permite, para qualquer ião de carga conhecida, distribuído entre a célula e o meio, determinar: a) Conhecendo-se a relação de concentração - A DIFERENÇA DE POTENCIAL necessária para manter aquela relação em equilíbrio

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b) Conhecendo-se a diferença de potencial - A DIFERENÇA DE CONCENTRAÇÃO , que corresponde a uma distribuição em equilíbrio Nas células, a maior parte dos A- intracelulares são proteínas incapazes de atravessarem a membrana, enquanto que os B+ predominante é o K+ . Em consequência, as células possuem uma DIFERENÇA DE POTENCIAL em relação ao exterior, que se aproxima do valor experimental da relação entre K+ intra e extracelular - é o potencial de membrana ou potencial de repouso. C. Equilíbrio de GIBBS-DONNAN IN AB+ EX AB+
Todas as células contêm A- incapazes de atravessar a membrana enquanto que os Ae B+ do meio podem fazê-lo

[K+]Cel [Cl-]cel = [K+]Ext [CL-]Ext

Exemplo: AK+ Clk+

-

+

Se a distribuição dos iões se realiza apenas por transporte passivo, na situação de equilíbrio devem igualar-se os produtos das concentrações dos iões disponíveis em ambos os dados da membrana. (em moles) equilibrio EXTRA CEL. INTRA CEL 15 150 7 Na+ K+ Cl - 60 mV - 90 mV - 70 mV Potencial de

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Embora o EK seja o principal determinante do potencial da membrana, não é o único. O potencial de membrana (Vrepouso) da maioria das células não está no potencial de equilíbrio para o K+ indicando que outros iões são também permeáveis - sobretudo o Na+ e também o Cl-. O Vrepouso real será resultado duma combinação das concentrações e permeabilidades para os três iões e caberá entre os três potenciais; EK , ENa , ECL. A equação de Goldman* é uma modificação da equação de Nernst que toma em consideração um dado estudo de concentrações iónicas dentro e fora da célula e as relativas permeabilidades da membrana para esses iões, como determinantes do V repouso

VR=

RT ln . PK [K+]OUT + Pna [Na+ ]OUT + PCl [ Cl- ]IN F PK [K+]IN + Pna [Na+ ]IN + PCl [ Cl- ]OUT

P= Relativa permeabilidade das membranas para a cada ião D. Pressão Coloidosmótica Seguindo o princípio da electronegatividade: • • • no comportamento INTRA No comportamento EXTRA [A- ] + [Cl- ] = [Cl - ]cel < [K + ]cel [Cl - ]ext = [ K + ]ext

[Cl - ]cel + [K + ]cel > [Cl - ]ext + [ K + ]ext

A pressão osmótica intracelular: POcel = RT [ [A - ]cel + A pressão osmótica externa POext = RT [ [ k +]ext + [Cl - ]ext ] Tendo em conta a desigualdade anterior, resulta no equilíbrio POcel > POext. O equilíbrio de Gibbs está portanto necessariamente associado a uma DIFERENÇA DE PRESSÃO OSMÓTICA entre os compartimentos em que se estabelece e a que se dá o nome de PRESSÃO ONCÓTICA OU COLOIDOSMÓTICA. Como esta levaria à entrada de água para o interior da célula, deve concluir-se que a distribuição de iões em equilíbrio entre a célula e o meio é incompatível com a sobrevivência celular. Resulta daqui a necessidade de outro tipo de 2006/2007 - 23 [ k +]cel + [Cl - ]cel ]

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transporte iónico, além de passivo, que torne possível a sobrevivência celular – aquele será dependente do metabolismo da célula, única parte de energia para transportes não passivos. E. Mecanismos de transporte passivo a) Difusão Simples - Depende do Nº de choques da substância com a membrana, o movimento resultante ocorrendo sempre no sentido da diferença de concentração ou lotação. - Depende da permeabilidade da membrana i. superior para substâncias lipossolúveis e retendo intracelularmente os intermediários - Depende da presença de poros hidrofílicos (proteínas) nas membranas, permitindo que a sua permeabilidade para substâncias hidrofílicas seja maior do que nas membranas anfipáticas de fosfolípidos Estes poros descriminam a passagem com base no tamanho e na carga eléctrica da substância. - São em geral impermeáveis para solutos hidrofílicos com diâmetro molecular maior a 7 Å - São em geral impermeáveis para solutos com cargas idênticas à sua parede, mas a densidade de carga do poro pode regular a passagem de iões com a mesma carga (exemplo, o K+ tem permeabilidade 10 X a do Na+ para carga e tamanhos idênticos) - A conformação das proteínas dos poros alterando a densidade da carga, pode regular a permeabilidade iónica b) Difusão Facilitada Quando a substância a ser transportada passivamente se deve combinar a um componente da membrana denominado TRANSPORTADOR (CARRIER) a. A velocidade de passage, é proporcional, não à concentração de substâncias mas à quantidade dos complexos transportadores. S+X sx Transporte de X

A diferença de concentração e de potencial determina a direcção do transporte Quer dizer, a velocidade não é descrita pela lei de Fick (directamente proporcional ao gradiente de concentração) mas obedece à cinética descrita pela equação de MICHAELIS-MENTEN

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Em resumo: a) o tranporte é PASSIVO b) o transporte é ESPECÍFICO para determinadas substâncias c) o transporte é SATURÁVEL, quer dizer, é limitado pelo Nº de transportadores, fazendo-se a velocidade constante a partir de certo valor

c) Tranporte Activo É um transporte que se efectua contra uma diferença de concentrações ou de potencial eléctric, implicando a introdução da energia necessária e que cessa com a interrupção do metabolismo celular. A diferença de concentração gerada pelo transporte activo tende a dissiparse com o movimento passivo em direcção oposta. A distribuição final de um soluto submetido a transporte activo é uma distribuição em estado estacionário, distinta da distribuição dos transportes passivos 1.Transporte activo de Na+ e K + As concentrações INTRACEL de K+=150mM e de Na+=15Mm são respectivamente superiores e inferiores às esperadas, se estiverem em estado de equilíbrio com o meio EXTRA. Isto deve-se à capacidade da célula transportada activamente o Na+ para fora e o K+ para dentro da célula. Esta expulsão activa do Na+ vai permitir compensar o excesso de osmolaridade (π) intracelular gerada pela tendência dos iões em se distribuirem em equilíbrio de Gibbs- Donnan ( πint.>πext ). É assim indispensável para a manutenção de volume celular e sobrevivência da célula É resultante das propriedades de certas unidades da membrana ( 1 a 1000 μ2 de superior da membrana) É um fenómeno SATURÁVEL É um fenómeno ASSIMÉTRICO O transporte de Na + para fora está acoplado ao transporte activo de K + para dentro, saindo 3 iões de Na + para 2 K + que entram, quer dizer, tem um efeito electrogénico, aumentando a electronegatividade intracelular. A fonte de energia provém da hidrólise de ATP, sendo a molécula de ATP consumida por 3 iões de Na + para 2 K + transportados. O sistema de transporte activo transforma a energia metabólica em energia acumulada na diferença de potencial electroquímico gerada pelo gradiente Na+, K+ entre a célula e o meio.~ Esta energia pode ser utilizada para impulsionar o transporte activo de outras substâncias, chamados transportes activos secundários. Por exemplo, a entrada de aminoácidos em certas células, a passagem de glúcidos através da parede intestinal ou a

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expulsão de Ca2+ no nervo e músculo e a geração e propagação do potencial de acção nas células excitáveis. Classificação dos transportadores (proteinas de transportadores (proteinas de transporte)

1. Uniporte - transporte de só uma substância, não acoplado ao de outra (ex. entrada de glicose no neurónio) 2. Simporte - requer a ligação de mais uma substância ao transportador, sendo transportadas conjuntamente (ex. difusão facilitada de Na+ e glicose na mucosa intestinal - mantida pelo transporte activo de Na+ para fora da célula intestinal) 3. Antiporte - trocam uma substância por outra (ex. Na+/K+ ATPase)

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Os Compartimentos Líquidos do organismo Distribuição de água no organismo adulto
Compartimento Extracelular (total) Plasma Intersticial Osso, cartilagem, outros Intracelular Total % da fase corporal 27 4,5 12 10.5 33 60

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% da água total 45 7,5 20 17,5 55 100

Perda diária de Água Pele Ar Expirado Urina Fezes TOTAL Vol/dia (ml) 500 350 1500 150 2500

As barreiras Hemato-Encefálica e Sangue-LCR e o Liquido EncéfaloRaquidiano I

Superfície capilar 5000x sup à barreira Sangue-LCR • Endotélio continuo ou com complexos de junção (tight junctions) • Pinocitose discreta • Abundância de mitocondrias - 10-11% do citoplasma (2,5- 3% noutros tecidos) • Geração e manutenção pelos astrocítos Funções metabólicas, enzimáticas e reguladoras especificas, incluindo sistemas de transporte +/- específicos

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz • • • • • Órgãos circunventriculares (plexos coroideus, etc) Capilares fenestrados Pinocitose activa Secreção do LCR Sistemas de transporte activo e passivo +/específicos

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LCR • Volume o neo-natal 40-60 ml o <10 anos 60-100 ml o adulto 140 ml • Secreção o Cerca de 70% pelos plexos coroideus o 400 μl/min, 24 ml/h, 600ml/dia o Cerca de 30% - do liquido intersticial (extracelular), vasos sanguíneos (espaço subaracnoidneu), ependimo • Renovação o 3 ou 4 vezes por dia

Os órgãos circunventriculares

A Absorção do LCR

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II. Barreira Hemato-Encefálica 1. Funções de transporte Difusão simples • Compostos lipo-soluveis - etanol, nicotin imipeamina, etc • Água • Gases - CO2, O2, N2O • Anestésicos voláteis • Pobre para o H+, pelo que o pH no fluido intersticial reflecte a pCO2 e não o pH sanguíneo. Difusão Facilitada (mediada por transportadores) • Sistema das Hexoses GLUT1 - D-Glicose, manose, maltose (intermediários para a galactose, pobre para a frutose). Insulino-dependente Também para o ácido dehidroascórbico • Sistema dos ácidos monocarboxilicos L-lactato, piruvato, acetato, corpos cetónicos (importante nos recém-nascidos e em jejum prolongado) • Sistema L Leucina, fenilalanina, tirosina, isoleucina, valina, triptofano, metionina, histidina, valina, L-Dopa • Outros Sistemas de influxo

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Dos aminoácidos básicos (arginina, lisina), ácidos (glutamato, aspartato), β-aminoácidos, colina, vitamina C, sódio, outros. Transporte Activo • Na/K ATPase Localizada predominantemente na face anti-luminalda célula endotelial Efluxo de K+ do espaço intersticial para o sangue e influxo de Na+ para o espaço intersticial • Sistema A Sistema de efluxo de pequenos aminoácidos neutros (alanina, glicina, prolina, GABA) • P-Glicoproteinas 1, mdr1a Proteina transportadora ABC (ATP-binding casette), produto do gene MDR1 Expressa na superfície luminal da barreira Sistema de efluxo de drogas do cérebro para o sangue Transportam também opiáceos endógenos e intra neuropéptidos, podendo representar um novo sistema de comunicação entre o SNC com o resto do organismo - para além do sistema hipotálamo-hipófise e do sistema autosomico. Transcitose mediada por receptores • Transporte de péptidos plasmáticos para o SNC, como a insulina, a transferina e leptina Outros sistemas de transporte para proteinas • Em função das cargas ou afinidade (absorção) ou do raio hidrodinâmico (endocitose adsortiva) Migração Celular 2. Funções Enzimático-Metabólicas A barreira hemato-encefálica é também uma “barreira enzimática” protegendo o SNC de neurotransmissores circulantes e os seus precursores ou toxinas (MAO, L-Dopa descarboxilase, aminopeptidases, peptidil-dipeptidases, adenil ciclase, guanil ciclase, etc.) 3. O complexo de Junção e a Regulação da Permeabilidade da B1 + E – 4A III. Barreira Sangue-LCR 1. Funções de Transporte Quantitativamente em geral menos importantes do que através da barreira hemato-encefálica, mas em casos pontuais mais importante do que esta – para

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o cálcio, leptina (o transporte da leptina nos humanos será sobretudo efectuado pela barreira hemato-encefálica). Sistema de efluxo (para o sangue) importante é a dos ácidos orgânicos fracos, que inclui os catabolitos neurotransmissores ac. homovanílico e ac. 5hidroxiindolacético (inibido pelo probenecide). 2. Secreção do Líquido Cefalo-raquidiano (LCR) Os Plexos Coroideus constituem a principal fonte de produção do LCR. Esta consiste num processo de transporte iónico activo, resultando na secreção de Na+ e Cl-, os principais constituintes iónicos do LCR. É aqui importante a anidrase carbónica. Complexo de Junção de tipo “Tight Junction” na BHE

1. P rot eínas Transmembranárias Claudinas (a), ocludina (b) e moléculas de adesão celular, incluindo as moléculas de adesão de junção (c) e o complexo caderinas-cateninas (d) 2. Proteínas Citoplásmicas Acessórias Proteínas “zonula occludens” (201-3) (e), AF6 (f), Antigénio 7H6 (g), Cingulina(h) 3. Proteínas do Citoesqueleto Actina, a principal (i), α-actinina e vinculina (j). Estas proteínas localizam-se em regiões da membrana ricas em colesterol associadas a caveolina-1 que interage e regula vias de Transdução de Sinal regulando o estado das proteínas do Complexo de Junção e assim a permeabilidade da BHE. As principais vias de regulação são: a concentração de Ca2+, a fosforilação e as actividades da PKC, da PKA (AMPc) e da proteína Rho.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Mecanismos de Transporte na Barreira Hemato-Encefálica (síntese) Via para-celular aquosa Facilitada (agentes hidrossolúveis) purinas,..) Transporte Lipofílico

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Difusão

(transportadores - glicose, aa.,

Transcitose mediada Activos de Efluxo por Receptores anti luminal) (insulina, leptina, transferrina,…)

Endocitose Adsortiva (albumina e outras proteínas cationizadas)

Transportes (Luminais e na face

Os PC produzem e secretam os princiapis constituintes proteicos da LCR depois da albumina: a pré-albumina ou transtirretina e, com as leptomeninges, a beta-trace.

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1. Ubaina, reduz a secreção de LCR 2. Sistema Antiporte 3. Acetozolamida, inibidor da AC, reduz a secreção de LCR 4. Transporte simporte inibido pela furosemida 5. Aquoporina 1, concentrada no pólo apical do epitélio dos PC, para transporte de água 3. A Composição do LCR A) ≤ 5 linfócitos ou células mononucleadas por mm3 99% de água ( soro 93%) Electrólitos (Na+,Cl-, etc) Metabolitos (Glicose, Lactato, Ureia, etc) Aminoácidos (Glutamina, Glutamato, etc.) Proteínas Totais (300-500 mg/L) Ratios LCR: Plasma Exemplos: Lactato: 1,6; Glutamina: 0,9; Glicose:0,7; Proteinas Totais: 0,005

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B) A Composição Proteica do LCR (electroforese em acetato de celulose) Pré-Albumina Albumina α1 Globulinas α2 Globulinas β1 Globulinas β2 Globulinas γ Globulinas Soro 2-10% 45-71% 50-68% 2-7% 2-7% 2-7% 6-11% 4-16% 9-18% 1,5-11% 5-14% 12-20%

C) Cerca de 20% das proteínas do CR têm origem intra-cerebral Para as proteínas de origem sérica o principal princípio de transferência não é o peso molecular, mas o raio hidrodinâmico (Felgenhauer), com as moléculas de menor tamanho a passar melhor. Pelo menos três proteínas não seguem esta regra, tendo desproporcionadas altas concentrações no LCR – a β2microglobulina, a pré-albumina, a lisozima e a transferrina e outras desproporcionadas menores concentrações, como a IgG e IgA. As principais proteínas de origem cerebral são: • a β trace (26mg/l), • a γ trace (16mg/l) • a pré-albumina ou transtirretina (17mg/l). Uma proteína tau será de origem cerebral ou derivada (dessialização) da transferrina (1/3) (transferrina, 14mg/l). D) Lipoproteínas no LCR A apo E e a Apo A-I são as principais apolipoproteínas no LCR, presentes em HDLs, não existindo VLDL e LDL contendo apo B. Entre outras há a apo J(~ 2,5μg/ml).

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A apo E é a predominante e é de síntese intra-cerebral (predominantemente pelos astrócitos) (~5μg/ml), enquanto que a apo A-I será transportada do plasma com as HDL (~4μg/ml). O metabolismo lipoproteico no LCR-SNC está hoje sob intensa investigação, podendo associar-se a diversas patologias neurodegenerativas (exemplo do Alzheimer) ou inflamatória E) O conceito de síntese intratecal patológica Como as proteínas do LCR podem ter uma origem sérica e/ou intestinal, esta relação pode estar alterada em situações patológicas, o qual pode ser avaliado por métodos quantitativos e qualitativos. De especial relevância actual é a síntese intrafecal de imunoglobulinas nalgumas situações neuroinflamatórias – como a síntese intrafecal de IgG (a mais frequente) na esclerose múltipla. Nota: A β-trace (identificada como prostaglandina D sintetase) é a segunda maior fracção proteica de LCR depois da albumina, principalmente produzida pelas leptomeninges e os plexos coróides e o melhor marcador para a identificação de LCR, por exemplo na rinorreia .Papel na regulação do sono. A Migração Celular Fisiológica para o LCR 175.000 a 500.000 células no LCR, predominantemente linfócitos. 1000-3000 leucócitos/ml. Como? Interacção entre: • Selectina-P e ICAM-1 nas vénulas do espaço subaracnoideu e plexos coróides • PSGL-1 (P-selectin glycoprotein-ligand) e integrina α1β2 (lymphocyte factor-associated antigen 1) nas células T. (LFA-1) A Regulação da Permeabilidade Vascular na Barreira Hemato-Encefálica • • MMP – 9, PARs (PAR-2), LRP, tPA Aumento da Permeabilidade da barreira induzida pelo LCR activado pelo tPA o Pode ser mediada pelo aumento da expressão MMP-9 activa o Pode ser independente de MMP-9 o Associada a activação da PAR-L

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz SANGUE

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O sangue é constituído por uma componente celular, ou de elementos figurados, e por uma componente líquida, ou plasma. O soro é a componente líquida do sangue após coagulação (ver à frente). Através da circulação (objecto de estudo noutro local), o sangue constitui um meio crucial na manutenção da homeostase do organismo, isto é: a coordenação dos processos fisiológicos entre os diversos tecidos, órgãos ou sistemas, mantendo a estabilidade, unidade ou integração funcional do organismo. I. A Constituição Celular (Hemograma) LEUCÓCITOS Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Linfócitos Monócitos ERITRÓCITOS PLAQUETAS _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ 4,00 – 11,00 x 103 /μl 41 – 77% 0,5 – 5% 0,0 – 2% 24 – 44% 2 –13% 4,60 – 6,20 x 106 /μl 150 – 450 x 103 /μl

A fisiologia destes componentes celulares será estudada noutros locais: a dos leucócitos na Imunologia, a dos eritrócitos a propósito da Respiração e a das plaquetas no tema da Hemostase. Assinale-se muito sucintamente desde já as funções de fagocitose dos neutrófilos e as funções de imunidade humoral (anticorpos, linfócitos B) e celular (linfócitos T) dos linfócitos. II. Propriedades Gerais do Sangue 1. HEMATÓCRITO É o volume de glóbulos vermelhos em 100 ml de sangue incoagulável centrifugado até à obtenção de um volume constante em duas leituras sucessivas. V.N. 45% de eritrócitos 55% de plasma 2. VELOCIDADE DE SEDIMENTAÇÃO ERITROCITÁRIA Depende quase exclusivamente do Plasma, estando em relação directa com a quantidade de fibrinogénio, depois de globulinas e finalmente de albumina. O agrupamento dos glóbulos vermelhos sedimenta-os mais depressa: • Por diminuição da carga negativa dos glóbulos • Por aumento da tensão superficial e hidrofilia doa glóbulos. V.N. 2-7mm/hora

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz 3. COR Oxihemoglobina, hemoglobina reduzida. 4. OPACIDADE Os glóbulos retêm a luz, é mais transparente na hemólise.

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5. DENSIDADE É maior que a do plasma, variando entre 1090 e 1100, enquanto a densidade do plasma é de 1024. 6. VISCOSIDADE Depende do atrito interno entre as partículas tomando a ++++++ como unidade ♂ 4,3 – 5,3 ♀ 3,9 – 4,9 7. PRESSÃO OSMÓTICA Isotérmicas, hipertónicas, hipotónicas A pressão osmótica do sangue total é semelhante à do plasma ou soro, expressa-se pelo ponto de congelação. O plasma humano congela a –0,56ºC, ~ a solução 0,63 H, equivalente a uma pressão osmótica de 6,3 atmosferas ¾ da pressão osmótica do plasma deve-se ao NaCl cuja concentração de 9 g/l é isotónico com o plasma A pressão osmótica determinada pelas proteínas é muito menor. A albumina é responsável por 80% da p.o. das proteínas do plasma. HEMÓLISE Sob acção de diversos agentes físicos ou químicos a hemoglobina difunde para o meio. → Resistência globular III. COMPOSIÇÃO DO SANGUE elementos figurados SANGUE plasma – soro = a parte líquida após coagulação 90% no plasma Água 65% no eritrócitos Compostos Inorgânicos • plasma + líquido intersticial – Na, Cl, Ca • eritrócitos – Fe, K, Mg • 3/4 das moléculas do plasma são electrólitos e destas 75% são NaCl

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Expressão habitual em mEq/l g/l Eq = ––––––x valencia p.At. Exemplo: Na pA = 23 concentração = 3,35 g/l 3,35 –––– x 1 = 0,1456 = 145,6 mEq/l 23 → PROTEÍNAS • concentração de 63-83 g/l α1 globulinas α2 globulinas β globulinas 2-7% 6-11% 9-18% ←--------------------------

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albumina 50-68% +

γ globulinas 12-20% -

Funções 1- Nutritiva e de Transporte 2- P. Osmótica – albumina, edema 3- Coagulação – fibrinogénio → fibrina 4- Viscosidade – fibrinogénio > γ globulinas 5- Estabilidade de suspensão (vs) – fibrinogénio > γ globulinas 6- Imunidade – imunoglobulinas (γ globulinas), outras 7- Equilíbrio ácido-base como ácidos em meio alcalino como bases em meio ácido → FORMAÇÃO O fígado secreta albumina, o fibrinogénio e mais de 50% das globulinas. As restantes formam-se no tecido linfóide (γ globulinas) e sistema retículo-endotelial. → AZOTO NÃO-PROTEICO Uma vez eliminadas do sangue todas as proteínas, permanecem substâncias azotadas cristalóides – o azoto não proteico (25-35 mg/%). Ureia > aminoácidos > ácido úrico > creatinina >creatina A sua concentração é regulada: – pela eliminação renal – pela excessiva produção – pela fixação nos tecidos → OUTROS CONSTITUINTES • Gases, glucose, lípidos, colesterol, etc.

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IV. VOLUME DE SANGUE Um homem de 70 Kg tem cerca de 5 litros de sangue: 2,750 de plasma e 2,250 de eritrócitos. Pode calcular-se, por método de diluição, tanto o volume de plasma como o de glóbulos. • O Hematócrito é uma medida aproximada do volume de glóbulos (~ 45%). Factores principais na regulação do volume de plasma: • A pressão sanguínea – a principal, que condiciona a sua saída do vaso. • A pressão osmótica das proteínas (pressão oncótica) – a principal, que condiciona a retenção ou seu retorno ao interior do vaso.

CAPILAR ARTERIAL Pressão Arterial 36 mmHg Pressão Oncótica 28 mmHg Pressão Venosa 20 mmHg CAPILAR VENOSO

Líquidos saem P. Osmótica > P. Oncótica

Líquidos entram P. Osmótica > P. Venosa

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz LINFA

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1- Generalidades – Composição • Semelhante à do plasma, mas com os seus constituintes em menores concentrações e variando com o território e a actividade do organismo: • Electrólitos, lípidos, glicose, azoto não proteico, Proteínas (incluindo enzimas e anticorpos): em cada dia, cerca de 50% das proteínas plasmáticas passam pelo canal torácico. • Elementos figurados: a quase totalidade são linfócitos, libertados durante a passagem pelos gânglios linfáticos – 550 por mm3 na linfa periférica; 20.000 por mm3 no canal torácico. 2- Formação – Interacção Sangue – líquido intersticial • Factores regulando a passagem de fluidos: a) Parede capilar Os factores regulando a sua permeabilidade: Esta varia com o órgão; em geral passam facilmente o potássio, o sódio ou a ureia, por exemplo, e mais dificilmente a glicose, o cálcio, o magnésio e sobretudo as proteínas. b) Pressões hidrostáticas A do capilar arterial, do capilar venoso e do espaço intersticial variam com os tecidos. A pressão hidrostática efectiva, que governa a entrada e saída de líquidos é a diferença entre a capilar e a intersticial (ver esquema). c) Pressão oncótica Desenvolvida pelas proteínas, sobretudo a albumina, é constante no homem (entre 28-40 mmHg). Na hipoproteinemia há passagem de água para o interstício (esquema)

1 A pressão hidrostática expulsiva supera a oncótica de retenção 2 A pressão oncótica é mais do que a hidrostática venosa

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz 3- Formação – Interacção líquido intersticial – linfáticos

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Os vasos linfáticos estão sempre abertos por fibras conjuntivas, sendo a entrada do fluido intersticial determinada pelas diferenças de pressão hidrostática. A passagem de água por esta via é importante meio de evitar o edema. Passam proteínas (contacto com o tecido linfóide), líquidos e partículas animadas (células) ou inanimadas. 4 – Circulação da Linfa União Veia Jugular/Subclávia

Esquerda

Direita

2

Canal Torácico

Veia Linfática

1

Capilares linfáticos

1

Drena a metade direita da cabeça e supradiafragmática do tronco: 0,1 ml/Kg/hora.

pescoço

e

a

parte

2

Drena a linfa do resto do organismo: 0,94 ml/Kg/hora.

Há forças propulsoras da circulação, que completam o papel das válvulas linfáticas (determinam o sentido da corrente): - A vis a tergo (diferença nas pressões hidrostáticas) - Contracção das paredes dos vasos. Nos vasos de certo calibre, com paredes musculares, há contracção sob controle neuronal. - Actividade músculo-esquelética. Eleva o fluxo no canal torácico em relação directa com a sua intensidade (até + 270%). - Movimentos passivos. Dos membros e cabeça (massagens, compressões diversas) - Gravidade. - Respiração. Favorece a inspiração.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Plaquetas, coagulação e fibrinólise

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A ruptura de um vaso e consequente hemorragia leva ao desencadear de mecanismos protectores e tendentes a reparar esse processo lesivo e conservar o volume sanguíneo (hemostase). Após uma inicial vasoconstrição são desencadeados dois tipos de mecanismos: • Plaquetário – de adesão ao vaso, de activação e de agregação das plaquetas • Coagulação e fibrinólise – de formação de uma rede de fibrina e sua posterior dissolução. Consoante o local e as circunstâncias geram-se assim 3 tipos de coágulos ou trombos: • Trombo branco – composto por plaquetas e fibrina e pobre em eritrócitos (mais em áreas de fluxo rápido, artérias) • Trombo vermelho – composto primariamente por eritrócitos e fibrina (mais em áreas de fluxo lento, de estase, veias) • Depósito disseminado de fibrina (mais nos vasos de pequeno calibre, capilares) I. Plaquetas 1. Adesão • Adesão ao colagénio no vaso lesado através da glicoproteína Ia – IIb em condições de baixo atrito de fluxo • Adesão ao subendotelial factor de von Willebrand através da glicoproteína Ib –IX sobretudo em condições de alto atrito de fluxo. 2. Activação e Agregação

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Adesão, Activação e Agregação Plaquetária (visão de conjunto)

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PAR-1 = Um dos receptores activados por proteinases (PAR’s) para a trombina (as outras são o PAR-3 e PAR-4) Inibidores da agregação plaquetária

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Coagulação (visão de conjunto)

Activação Activação de receptores activados por proteinases (PAR’s) Conversão enzimática • • • Antitrombina III, Proteína S e Proteína C são inibidores fisiológicos da coagulação. Heparina potencia antitrombina III. Anticoagulantes inibem os factores II, VII, IX e X e proteínas C e S.

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III. Fibrinólise Dissolução da fibrina, normalmente num estado de equilíbrio dinâmico com os mecanismos de coagulação levando à sua formação.

O plasminogénio liga-se à fibrina e gera aí a plasmina, de modo a estar num ponto acessível aos inibidores. A plasmina é uma protease resultante da clivagem do plasminogénio na ligação arginina-valina, constituindo-se uma molécula composta por duas cadeias ligadas por pontes dissulfito. O t-PA (recombinante), como a estreptocinase (produto bacteriano) são utilizados terapeuticamente em patologia trombótica, como fibrinolíticos. A estreptocinase é também um activador do plasminogénio, embora menos selectivo para a sua forma ligada à fibrina.

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Transporte axonal I. Demonstração experimental do conceito • o corpo neuronal fornece material transportado ao longo do axónio Desenvolvimento do conceito a partir dos anos 60 com aplicação de novas tecnologias (métodos radioactivos, novos métodos bioquímicos e histológicos).

A

B

C

D

Legenda: A – Estruturas vesiculares pequenas Neurotransmissores (péptidos) Proteínas membranárias e de secreção Lípidos membranários B – Vesículas lisossomais Enzimas Outras moléculas e estrutura

C – > 200 polipéptidos associados à Matriz Axoplasmática Microfilamentos: Actina, Miosina Clatrina Espectrina – Tb e SCa Enzimas metab. energ. / outras (glicolíticas, CK, calmodulina) D – 70-80% em 5 polipéptidos: Microtúbulos – α e βTubulinas MAP’s Neurofilamentos (Filamentos intermediários) 200, 145, 68 KDa (H) (M) (L)

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II – Transportes rápidos

Ante-rógrado ou retrógrado, de moléculas sempre associadas a membranas m no lume vesicular. Dependentes dos microtúbulos. Mitocôndrias.

Transporte ante-rógrado Síntese no retículo endoplasmático com passagem obrigatória pelo aparelho de Golgi. Aporte de componentes membranários, moléculas de secreção e neurotransmissão, enzimas e mitocôndrias, ou axónio e terminações axonais e dendríticas. Transporte retrógrado Reciclagem molecular e estrutural da periferia neuronal, informação do estado metabólico funcional da periferia (sinais durante o desenvolvimento e regeneração), vesícula de transporte de factores neurotróficos, toxinas, vírus. Mecanismos moleculares de transporte • Grandes consumidores de energia, dependentes de ATPases. • Requerem um complexo de translocação do organelo constituído por uma enzima motora (quinesina para o ante-rógrado e dineína para o retrógrado), um receptor no organelo a transportar, entre muitas outros factores acessórios. • O complexo desloca-se associado aos microtúbulos.
Retrógrado

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Representa-se a proteína TAU (6 isoformas) ligada aos microtúbulos, dependente da sua fosforilação e que sendo estabilizadora dos microtúbulos é essencial para o transporte axonal. Défices na proteína TAU ou de muitos outros componentes do complexo de translocação resultam em alterações do transporte axonal, disfunção e morte neuronal, estando implicados em muitas doenças neurodegenerativas. Doenças associadas a défices no transporte axonal (explos) D. Neurodegenerativa Mutação/Proteína Paraplegia espástica familiar Quinesina Doença do neurónio motor familiar Dinactina Doença de Choncot-Mawie-Tooth 2A Quinesina Doença de Parkinson α-sinvoleina Doença de Huntirgton Huntiugtina Doença de Alzeimer TAU, APP, Presenilinas Tauopatias TAU Baseado em Roy et al. Acta Neuropathol. 2005: 105: 5-13 III – Transportes Lentos

• • • •

São unidireccionais (ante-rógrado) Síntese nos polissomas citoplásmicos As estruturas do citoesqueleto (microtúbulos, neurofilamentos e microfilamentos) são agregadas no corpo neuronal. Os microtúbulos e neurofilamentos (estes, membros dos filamentos intermediários) aparecem como tofas ao longo ao longo do axónio com pontes de ligação dinâmicas. Na terminação axonal são degradadas: os microtúbulos em dimeros de tubulina por aumento de Ca2+ e os neurofilamentos por protease dep. Ca2+ (originária do RE, mitocôndrias ou canais na membrana citoplasmática). Os microfilamentos (actina, miosina, diferentes dos musculares) estão presentes no axoplasma mas muito mais concentradas nas terminações pré-sinápticas e espinhas dendríticas. A elastina terá papel na formação das vesículas para transporte rápido na reciclagem das vesículas présinápticas e endocitose mediada por receptor. A espectrina está - 48 -

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envolvida na interligação dos microfilamentos com estruturas membranárias e com outros componentes do citoesqueleto. Funções o SCb – Motor do cone de crescimento. Génese e plasticidade das terminações sinápticas e espinhas dendríticas. Fornecedor do metabolismo energético. o SCa – Determinante das alterações de calibre (diâmetro) e comptimento axonal durante o desenvolvimento e regeneração.

IV. TAU e Neurodegeneração

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Potencial de membrana ou de repouso e a génese do potencial de acção I – Potencial de membrana Todas as células mantêm gradientes de concentração iónica entre os meios interno e externo da membrana citoplásmica, responsáveis pela sua polaridade ou potencial de membrana, o interior negativo relativamente ao exterior (na maioria entre -50 a -90 mV, dependendo das células). Aquela depende do metabolismo da célula, fonte de energia, em particular via a utilização pela Na+-K+-ATPase. Sódio, cloro e cálcio predominam no exterior, enquanto o potássio no interior. O fluxo destes iões é possível devido à existência de proteínas na membrana, que são canais iónicos. Estes canais transportam iões à velocidade de 1000000 a 100000000 iões por segundo e este fluxo cria uma corrente eléctrica da ordem dos 10-12-10-10 amperes por canal. Alterações nestes fluxos iónicos induzem pois correspondentes alterações rápidas do potencial de membrana, que podem ser de duas naturezas: • Despolarizantes – tornando o interior mais positivo, nomeadamente pela entrada de Na+ ou Ca2+. • Hiperpolarizantes – tornando o interior mais negativo, nomeadamente pela entrada de Cl- ou ainda de K+ (ver figura). As proteínas constituintes dos canais iónicos são complexas, constituídas por subunidades proteicas com distribuição diversa entre os tecidos e no interior do próprio SNC.

II – Impulso ou potencial de acção Os neurónios têm a propriedade de serem excitáveis, isto é, de responderem a estímulos exteriores com uma inversão do potencial de membrana (ou de repouso) designada impulso ou potencial de acção. A despolarização atingiu aqui um limiar, que levou a inverter o potencial de membrana de por exemplo -70 mV para +30 mV, durante um brevíssimo período (0,2 -0,5 milissegundos). Esse ganho passageiro e acentuado de cargas positivas é devido à entrada súbita e maciça de iões Na+. • Porquê? Porque sobretudo em determinados locais, a membrana neuronal concentra canais de sódio dependentes da voltagem (CSDV), que se abrem (estão

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acoplados) a partir de certo limiar de despolarização. O processo é autolimitante, sucedendo-se a repolarização, por inactivação desses canais e permeabilidade e aumento de fluxo para outros iões – o K+ e o Ca2+ (ver figura).

Esta capacidade despolarizante iniciadora de potencial de acção é regulada por outro canal iónico, canal de potássio dependente da voltagem “rectificados”, ou corrente-M. Esta corrente é lentamente activada quando os estímulos despolarizantes atingem o limiar para o impulso, repolarizando a membrana (saída de cargas positivas). Perante a persistência de estímulos despolarizantes capazes de desencadearem potenciais de acção, a corrente-M limita a frequência dos impulsos – é um mecanismo crucial do mecanismo chamado de “adaptação à frequência de impulsos” e assim de oposição à génese da actividade epiléptica.

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Excitabilidade e Potencial de Acção

A – Influxo de Na+ B – Canais de Na+ fecham, efluxo de K+ C – Canais de K+ mantêm-se abertos D – A despolarização da membrana inactiva os canis de Na+ e um novo PA não pode ser gerado E – Enquanto os canais de K+ se mantiverem abertos é necessária uma maior intensidade de estimulação para gerar um PA. • O PA é um fenómeno tudo ou nada. Ele codifica num padrão de frequências a intensidade de uma estimulação.

- Se a intensidade do estímulo não despolariza a membrana a um certo limiar, não há geração de PA; - A frequência de PA aumenta com a intensidade da estimulação.

2 . Fase de Repolarização • Fase descendente do potencial de acção, que tem origem em 2 factores: Brusca interrupção da entrada de Na+ (da sua permeabilidade)

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Aumento da permeabilidade para o K+ que sai da célula sob o efeito do gradiente de concentração mas também do gradiente eléctrico, pois o exterior é nesta altura negativo. Este aumento de permeabilidade é de longa duração e prolonga-se para além do potencial de acção, explicando o pós-potencial positivo. III. Condução do impulso nervoso O impulso nervoso é a propagação do potencial de acção (=impulso) ao longo da fibra nervosa (axónio). Pode ser de 2 tipos: 1. Condução continua • O impulso propaga-se por despolarização das zonas vizinhas como resultado da formação de correntes locais ou electrónicas • É o meio de condução das fibras não-mielinizadas 2. Condução Saltatória • É o meio de condução das fibras mielinizadas, resultando numa maior velocidade de condução em relação às amielinicas de igual diâmetro. • As áreas excitáveis estão confinados aos nódulos de Ranvier. • Os internódulos são condutores passivos • A despolarização como que salta entre nódulos vizinhos

Velocidade de condução e Tipos de fibras nervosas 1. Tipo A - mielinicas (1-20μ, 5-120 m/s) • α - 12-20μ, 70-120 m/s (propagação somática motora) • β - 5-12μ, 30-70 m/s (tacto) • γ - 3-6μ, 15-30 m/s (motoras para fusos neuromusculares) • δ - 1-5μ, 12-13 m/s (dor e temperatura, tacto) 2. Tipo B - mielinicas • <3μ, 3-15 m/s (autonómicas pré-ganglionares) 3. Tipo C - amielinicas • 0,4-1,2μ, 0,5-2 m/s (aferentes somáticas - raízes posteriores) • 0,3-1,3μ, 0,7-2,4 m/s (simpáticas pós-ganglionares)

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Fisiologia da Sinapse 1. Conceito de transmissão sináptica a) O conceito de áreas de junção ou contacto entre neurónios e polarização da condução por Cajal (contra os reticularistas) e a introdução do termo sinapse por Sherrington (1897), com um significado funcional Substâncias químicas (neurotransmissores) na comunicação sináptica, para além das sinapses eléctricas. Principio de Dale - um neurónio contem e liberta só um neurotransmissor nas suas terminações sinápticas. (hoje sabe-se que existem excepções) b) Organização das Sinapses

2. Características da transmissão sináptica • Unidireccional o a presença de sinapses determina a condução num só sentido o celulipeto nos dendritos e celulijugo nos axónios o lei da polaridade dinâmica de Cajal ou da progressão anterrograda de Scherrington (há excepções a esta regra)

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Resposta Local Pós-Sináptica o Potencial pós-sináptico Diminui exponencialmente no espaço/tempo Não segue a lei do tudo ou nada Pode somar-se uma vez atingido o nível crítico Origina o potencial de acção pós-sináptico, que se propaga como impulso nervoso. o Potencial de placa = potencial pós-sináptico na sinapse neuromuscular Potencial pós-sináptico despolarizante (excitatório) o que diminui o potencial de repouso 2 Tipos Potencial pós-sináptico hiperpolarizante (inibitório) o que aumenta o potencial de repouso

Quando ambos os tipos de potencial actuam no mesmo neurónio, o valor do potencial é a soma algébrica do efeito despolarizante e hiperpolarizante.

Inibição Pré-sináptica o É a inibição obtida por redução da libertação de tranmissor na terminação pré.sináptica de sinapse excitatória o É realizada por sinapses axónio-axónio

Inibição de potencial pós-sináptico excitado sem alteração das propriedades da membrana póssináptica

Bases Iónicas dos potencias pós-sinápticos o Para o potencial pós-sináptico excitatório permeabilidade para o K+, Cl- e Na+

-

aumenta

a

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Fisiologia I a

o Para o potencial pós-sináptico inibitório - aumenta permeabilidade para o Cl- (que entra) e o K+ (que sai)

3. Circuitos Neuronais • Convergência e Divergência o Principio de convergência - a conexão sináptica de múltiplos axónios com um neurónio (uma célula para várias fibras) o Principio de divergência - a subdivisão de axónio de um neurónio e conexões sinápticas com múltiplos neurónios (uma fibra para várias fibras)

Facilitação temporal e espacial Quando uma fibra se distribui por outras, o estimulo pode descarregar 3, mas ser sublimiar para outras 3 - os 1os neurónios estão na zona de descarga e os outros na orla sublimiar. o Facilitação Temporal É a acumulação dos efeitos de impulsos pré-sinápticos que chegam sucessivamente a uma célula (sequencia temporal) na mesma área, pela mesma via aferente Ocorreu um aumento de excitabilidade resultante de potencial pós-sináptico excitadores sucessivos

Deu-se o fenómeno de recrutamento Esta acumulação repetida determinou a intervenção de células que antes não descarregavam e houve facilitação, pois a repetição de estímulos facilitou a acção dos estímulos posteriores na orla sublimiar Os efeitos do principio de convergência são: Facilitação espacial Oclusão

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o Facilitação Espacial Duas ou mais áreas vizinhas de despolarização somam os seus efeitos para alcançar o limiar de descarga da célula Quer dizer, estímulos que activando de forma isolada não descarregam a célula, agindo em conjunto somam as suas áreas de despolarização e atingem o nível critico do neurónio houve facilitação, que aqui é espacial – será necessário que uma determinada superficie de um neurónio seja despolarizada para que se inicie o impulso pós-sináptico.

A estimulação simultânea de ambas as fibras não resultarão na excitação de 9 mas de 7 neurónios, como se as células c e d se tornassem ocluídas – é o fenómeno de oclusão (Sehemington) – há um défice aparente de descarga resultante da sobreposição de zonas de descarga. Em Resumo: Quando a eficácia de estimulos diversos simultâneos ou ocorrendo em rápida sucessão é maior do que a de estímulos individuais, deu-se facilitação; quando a eficácia de diversos estimulos simultâneos é inferior à soma dos estímulos individuais, deu-se oclusão.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz UMA INTRODUÇÃO À NEUROTRANSMISSÃO 1. Potencial de Membrana (em todas as células)

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Diferença de potencial varia de -50 mV ou ainda mais negativa

2. Os Neurónios e a Neurotrasmissão

As alterações induzidas pelo neurotrasmissor nos seus receptores (libertado por A) vai permitir que o B interprete a mensagem de A. • • Como é que o neurotransmissor é libertado por A? Qual a mensagem interpretada por B?

A base da resposta para ambas as perguntas está numa alteração do potencial de membrana dos neurónios. Representa-se também o papel dos astrocítos, nomeadamente na inactivação (captação) e libertação de alguns neurotrasmissores. 3. O Potencial de Acção ou Impulso Nervoso Contrariamente à maioria das células do organismo, os neurónios têm a propriedade de serem excitáveis. Isto quer dizer, a capacidade de responderem a estímulos exteriores com uma inversão do potencial de repouso designada, impulso ou potencial de acção. Quer dizer que houve despolarização a um nível, que o inverteu de, por exemplo, -70mV a +30mV, durando só um

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brevíssimo período (0.2 – 0.5 milisegundos). Esse ganho passageiro de cargas positivas dentro da célula foi conseguido pela entrada maciça de iões de sódio.

Ora este potencial de acção tem a capacidade de ser arrastado pela membrana do neurónio para além do ponto onde foi gerado. Para esta condução do potencial de acção os neurónios estão especialmente habilitados; Não só o podem fazer para grandes distâncias (axonais) como a grande velocidade (120 m/s) – é a condução do impulso nervoso, que torna o sistema nervoso o previligiado da comunicação – condução continua versus condução saltatória (mielina). 4. A Libertação Neurotrasmissora A resposta à 1ª pergunta: • O neurotransmissor é libertado por A porque um PA gerado no segmento inicial (cone de implantação) do seu axónio foi conduzido até à terminação sinaptica e forneceu-lhe o nivel para a libertação (canais de Ca2+ dependentes de voltagem)

5. Acção do Neurotransmissor O neurotransmissor é libertado no neurónio A pelos seus receptores existentes no neurónio B. A resposta à 2ª pergunta: • O encontro do neurotransmissor com o seu receptor, pode despolarizar a membrana do neurónio B no ponto de gerar novo PA, propagando uma mensagem excitatória. O principal no SNC é o glutamato (com a entrada de sódio por receptor AMPA). • Outra possibilidade é esse encontro hiperpolarizar a membrana, inibindo a propagação da condução, é uma mensagem inibitória. O principal no

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SNC é o GABA, através de receptores GABA-A, que fazem entrar um ião negativo, o cloro.

Nota: Há outras formas de acção neurotransmissora, não rápidas ou ionotrópicas (receptores com canais iónicos) chamadas MODULADORAS, não só do potencial de membrana como do metabolismo e expressão genética do neurónio (exemplo: inibem a corrente–M)

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz NEUROTRANSMISSÃO (CONCEITOS GERAIS)

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I. SINAPSE • Substâncias químicas na comunicação neuronal • Acções “nicotínicas” e “muscarínicas” da acetilcolina • Libertação do “vagusstoft” • Libertação de “simpatinas” • Nervos colinérgicos e adrenergicos • Princípio de Dale 1. um neurónio contém e liberta só um neurotransmissor 2. um neurónio é excitatório ou inibitório, mas não pode ter efeitos diferentes em terminações diferentes. ´ NOVOS CONCEITOS: 1. Um mesmo transmissor pode produzir receptores diferentes em diferentes locais. 2. Uma mesma resposta pode ser desencadeada por diferentes transmissores em diferentes locais. 3. Num mesmo neurónio podem coexistir mais do que um transmissor. 4. A comunicação neurotransmissora pode exigir uma conexão anatómica precisa – transmissão sináptica linear – mas pode existir uma libertação difusa do transmissor através do espaço extra-celular – transmissão para-sináptica de volume – e existem receptores em regiões não sinápticas. 5. Os Astrocitos têm um papel fundamental na neurotransmissão – recepção, transporte, catabolismo, sintese, libertação de NT. 6. Há uma diversidade de sinais químicos (moléculas, iões) na comunicação inter-celular no SNC (neuro-reguladores) com acção do tipo neurotransmissor, neuromodulador e de factor neutrófico. NEURO-REGULADORES MOLÉCULARES • Transmissores clássicos o Acetilcolina, Dopamina, Noradrenalina, Adrenalina, Serotonina, Histamina. o Glicina, Ac. Gama-Aminobutírico(GAMA), Glutamato, Aspartato. Neuropéptidos Neurohormonas o Hormonas de síntese nos neurónios ou fora deles mas influênciando a função neuronal. “Factores “ neurotróficos, instrutivos e outros

• • •

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Co-existência de transmissores clássicos com péptidos GABA + Somatostatina GABA + Colecistoquinina Acetilcolina + VIP Acetilcolina + Substantina P Noradrenalina + Somatostatina Noradrenalina + Encefalina Noradrenalina + Neuropéptido Y Noradrenalina + Neurotensina Dopamina + Colecistoquinina Dopamina + Neurotensina Adrenalina + Neuropéptido Y Adrenalina + Neurotensina Serotonina + Substantina P Serotonina + TRH Serotonina + Encefalina • Cortex Cerebral, Hipocampo Cortex Cerebral

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Cortex Cerebral, Parassimpático ou Simpático Protuberância Simpático Simpático Bulbo, Protuberância Locus ? Mesencéfalo Mesencéfalo Subst. Reticular Subst. Reticular Rafe Bulbar Rafe Bulbar Rafe Bulbar

Outros exemplos de co-existência de neuro-reguladores (neuronios hipotalamicos): o Vasopressima + CCK, Dimorfina o Oxitocina + Encefalina

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz TRANSDUÇÃO DE SINAL (SÍNTESE)

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3 MECANISMOS: A – Acoplamento do receptor A – A1 – enzimas efectoras ou A2, canais iónicos através de proteína G B – Directa activação de canais iónicos pelo ligando C – Receptores com actividade enzimática (tirosina ou serina/tirosina cinase, guanil ciclase)

A1 * ou outra enzima efectora (fosfolipases C e A2, Fosfodiesterase) (segundos a minutos)

A2 (cntenas de milisegundos)

B

C para factores de crescimento e factores neurotróficos excepto o CNTF, que tem um complexo receptor distinto. • Cerca de 80% dos 1os mensageiros (hormonas, neurotransmissores, neuromoduladores ou outros factores) exercerão os seus efeitos celulares através de receptores acoplados a proteínas G

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II – Neurotransmissores, neuromoduladores e factores neurotróficos: inter-relação dos conceitos

Neurotransmissor • Substância libertada numa sinapse e com acções pós-sinapticas • Efeitos rápidos na polaridade da membrana (despolarizaçãoexcitatório, hiperpolarização-inibitório) Neuromodulador • Substância que “modula” a neurotransmissão (incluindo a libertação ou/e acção de neurotransmissores), na presença de actividade sináptica, a nível pós ou pré-sináptico. • Não se libertam necessariamente em sinapses e podem agir em receptores difusos não-sinápticos. • Efeitos longos. • Afectam frequentemente a condutância para o K+ ou o Ca2+. • A mesma substância pode agir como neurotransmissor ou como neuromodulador (ex.: a serotonina, a acetilcolina). • A importância da libertação não-sináptica de monoaminas é controversa -mais de 80% a menos de 10%. Factores neurotróficos ou de crescimento • Há factores “especializados” nestas acções, agindo por transdução mediada por tirosina cinase (actividade intrínseca ao receptor, ou citoplásmica). • Contudo, substâncias com acção neurotransmissora ou neuromoduladora podem tb ter esses efeitos (mediadas por proteínas cinases e/ou cálcio) – na prodiferação celular, neurifogénese, expressão fenotípica. • Acetilcolina, noradrenalina, serotinina e mtos outros compostos com acção neurotransmissora ou neuromoduladora existem numa fase embrionária sem sistema nervoso, onde desempenharão esse tipo de efeitos. A distinção entre neurotransmissor, neuromodulador e factor próprio não caracteriza um tipo de substância mas a natureza dos seus efeitos numa célula receptora.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Classificação dos neurotransmissores

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Tipo I • Aminoácidos, como o glutamato, o GABA e a glicina. • Responsáveis por 80-90% da transmissão sináptica no SNC. • Transmissão predominantemente rápida, ionotrópica. • Concentrações de micromoles por grama de peso fresco. Tipo II • Incluem os transmissores “clássicos”, como a acetilcolina, catecolaminas e serotonina. • Transmissão predominantemente lenta e de acção moduladora. • Concentracções de monomoles por grama de peso fresco. Tipo III • Incluem os neuropeptidos. • Transmissão predominante de acção moduladora e em receptores difusos, maior do que só em regiões sinápticas. • Concentrações de nanomoles a picomoles por grama de peso fresco. Libertação por pequenas vesículas sinápticas (PVS) versus vesículas secretorias (VS) – significado funcional

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Secreção neurotransmissora (exocitose por pequenas vesículas sinápticas) A. Reciclagem vesícular em terminação nervosa

1. Transporte vesicular de neurotransmissores. • 4 tipos de transportadores (12 TM): o para acetilcolina; o para aminas (catecolaminas, serotonina, histamina); o para aminoacidos inibitórios (GABA, glicina); o para o glutamato. • Transporte por acidificação do lume à custa duma bomba protonica gerando pontencial de membrana mais no interior. Uma proteína vesicular comum é a SV2 (12TM) – Tr.Cl-

2. Migração e fusão • com a membrana pré-sináptica (libertação do neurotransmissores) 3. Reciclagem por “corated pits” e passagem pelos endossomas 4. Ligação ao citoesqueleto, neurotransmissores antes de novo transportador de

5. Hipótese “kiss-end-run” – a vesícula é recuperada após breve contacto com a membrana pré-siáptica e libertação de neurotransmissores

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz B. Migração para a zona activa da terminação nervosa

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As vesículas são transportadas para a zona activa através da interacção sinaptica-fodrina/actina. Estas são proteínas do citoesqueleto muito concentradas nas terminações présinápticas. A acumulação de Ca2+ fosforiliza a sinapsina através da CaMK-2 a ela associada. Outra enzima presente dependentente do Ca2+ é a PKA. A afinidade da sinapsina para a vesícula e a actina é diminuida, deixando-a migrar para a zona activa da emb pré-sináptica. C. A migração para o “alvo” e a fusão da vesícula com a memb présináptica A visão actual foi desenvolvida a partir da Hipotese SNARE. • Esta pressupõe a existência de proteínas receptoras nas membranas vesicular e pré-sinaptica (chamadas SNAREs) que reconhecem um complexo proteico citoplasmatico de fusão designado NSF-SNAP.

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Propõe-se a existência de 3 classes de proteínas: 1. Proteínas citoplasmicas • Rab 3 – membo da superfamilia ras de GTPases (prot.G) necessária para a estabilização do complexo • N-sec 1 – possivelmente necessária para a ligação VAMP-sintaxina • NSF(N.etilmaleimide-sensitive fusion protein) e SNAPs– proteínas ubíguas no citoplasma que reconhecem receptors específicos nos pares de membrana a ligar e a fundir (esses receptores são V. e t.SNAREs) 2. Proteínas na membrana vesícular (incl. V-SNAREs) • Sinaptobrevina (VAMP) - liga-se a sintaxina • Sinaptogamina – será um Ca2+ sensor levendo a vesícula à fusão • Sinaptofisina – será componente vesicular do poro de fusão 3. Proteínas na memb pré-sinaptica (incl. T-SNAREs) • SNAP.25, neurexinas, canais de Ca2+ - tipo N • Sintaxina (A,B – VAMP-2) – interage com a subunidade α 1β do canal de Ca2+ do tipo N acoplando a entrada de Ca2+ com a rápida fusão vesicular • Fisofilina – componente membrana pré-sináptica do poro de fusão

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Visão geral sobre o metabolismo e acções dos neurotransmissores

1. A libertação do N pode estimular receptores (R) pós-sinapticos e astrocitários 2. O catabolismo do N (CATAB) pode ser sináptico ou implica transpostadores (T) para o neurónio e/ou astrocíto. Este também pode ser fonte de N ou de seus percursores 3. Existem moduladores pré e pós-sinapticos da libertação e efeitos destes neurotransmissores (neuropeptidos, neurotransmissores atípicos, factores neurotróficos) III. Neuropéptidos Generalidades Mais de 50 actualmente. O nº possível de péptidos com 2 a 10 aminoácidos é maior que 10¹³. Quantos mais haverão a descobrir? • Presentes em concentrações muito baixas (picomoles por grama de membro); coexistentes frequentemente com neurotransmissores dos tipos I e II mas em grandes vesículas secretórias, permitindo uma libertação diferencial dependente da frequência. • Síntese no corpo neuronal como precursores, incorporação nas vesículas (com processamento por proteases), libertação frequente não-sinápticca, com acções difusas, mas tb pos-sinápticas, dependente da cc de Ca2+ citoplasmático. Acção sobretudo

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neuromoduladora por efeito directo na condutância iónica ou por transdução metabotrópica Inactivação: a terminação de seus efeitos não se faz por recaptura, mas por acção de peptidases (exo e endopeptidases) que não parecem ser específicas para determinado péptido

Péptidos não opioides Algumas características de alguns dos mais estudados. • Oxitocina e vasopressina – nonapeptidos: o neurónios nos neurónios supraóptico e paraventricular e outros, extra-hipotalamicos. o Regulação neuro endócrina, comportamento reprodutor sexual, aprendizagem/memória, outras.... • Taquiniaras ou Neuroguininas – família com uma comum sequencia C-terminal: Fen-XX-Gli-Leu-Met-NH2 Inclui os seguintes membros: o Substancia P o Medidor nas terminações sensitivas primárias e em muitos interneurónios no SNC, neuriguinina A (ou substancias K), neuroguinina B (ou neuromedina K), neuropeptido K, neuropeptido γ • Endotelinas: o END-1 e -3, prevalecendo a End-3 e os receptores e astrocitos. o Efeitos essenciais durante o desenvolvimento do SNC, regulação neuroendocrina, etc. o Aumentos no vasoesprasmo da isquemia cerebral e hemorragia sub-aracnoideia VIP (vasoactive intestinal peptide) o 29 aminoácidos o Membro da família que inclui o glucagon e a secretina, entre outros, da qual é a principal no SNC e tb no SNP o Co-existe em acetilcolina. o As maiores concentrações no SNC estão no córtex cerebral Somatostatina (SOM-14, -18) o para além de hipotalamica, existe em interneuronios e noutras regiões do SNC, incluindo neocortex o Frequentemente com o GABA o Implicado na cognição, afeitos, movimento... Neuropeptido y o Membro da família dos péptidos relacionados com o polipeptido mais abundante em qualquer tecido, incluindo o SNAutónomo e em muitas regiões do SNC. - 71 -

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o Receptores y1, 2, 3. o Implicados na modulação da dor (+ analgésico), ansiedade (ansiolítico), comportamento alimentar (↑), memória (↑) e regulação cardiovascular (hipertensão). • Calcitonin lene-relared peptide (CGRP) o Presente em neurónios motores, sensitivos e no nervo central da amígdala. Colecistoquinina (CCK) o A maior concentração de todos os neuropeptidos no SNC, especialmente no córtex cerebral com existência muito variada com outros transmissores. o Modula libertações de GABA e dopamina. o Dois tipos de receptores, sendo o CCK-B predominante no SNC. o Implicações funcionais diversas, incluindo na modulação da dor, compotamento alimentar e ansiedade. Galanina o Abundante no tronco cerebral. o Frequentemente associada a neurónios serotonina e noraturgicas. o Acção predominantemente inibitória.

colimergicas,

CRH o Do nervo proventricular, com proporções difusas para o SNC. o Participa nos circuitos de SNC associados ao stress Neurotensina o Tridecapeptido com distribuição difusa no SNC. o Efeitos sedativos morfotensores, moduladores da dor e possivelmente anti-psicoticas.

Uma das acções principais dos neuropeptidos é a regulação pré-sinaptica da libertação de neurotransmissores dos tipos I, II, com as quais eles co-existem no neurónio. Exemplos:

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Péptidos Opioides • Endorfinas o Péptidos derivados de 3 famílias principais o Sintetizados no SNC o Diferenciam-se de péptidos com acção opioide de origem exógena ou exorfinas (leite, plantas) Péptidos derivados da • Pró Opiomelanocortina Não opioides (ACTH, γ, α, β-MSH e β-Endorfina. Principalmente do nervo arqueado (hipotálamo) e nervos tractos solitários (bulbo) com projecções e defesas para muitas áreas do SNC. Péptidos derivados da • Pro-encefalina Met-Encefalina e Leu-Encefalina (esta em menores concentraçoes). Os mais obliquamente distribuídos de todas as opioides, do telencéfalo à medula, com as mais altas concentrações no globus pallidus. Péptidos derivados da • Pro-dinorfina Dinorfia A, Dinorfina B, Neoendorfina α e β. Em geral em distribuição ou ás encefalinas. As mais altas concentrações na hipófise posterior e hipótalamo e altas concentrações na amígdala, septo, medula, mesencéfalo. Receptores opioides , metrototivicas em geral com acção hiperpolarizante ou inibitória e modulando a libertação de outros transmissores. 3 Subtipos com afinidades diversas para os três tipos de opioides.

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Endomorfinas o Recentemente descobertas Tetropeptidas, Endomorfina 1 e Endomorfina 2 com alta especificidade e afinidade para o receptor da morfina, Receptor μ (a heroína é um derivado da morfina, com dois grupos acetis, que aumentam a sua lipo-solubilidade)

Implicações Funcionais e fitopatológicas Muito diversas, consoante o nível anatómico: Medula – percepção dolorosa do corpo Tronco – percepção dolorosa da cabeça, reflexos vogais, respiração (depressão respiratória), supressão da tosse, cardiovascular (hipotensão) , inibição das secreções gástricas, náuseas e vómitos, miose, euforia e outros efeitos emocionais Diencéfalo – percepção dolorosa, secreção da ADH Telencéfalo – efeitos emocionais e hormonais com rigidez motora (catatonia). A importância para a compreensão dos mecanismos dependência e comportamentos compulsivos da adição. de tolerância,

Novo opiáceo endógeno, a nociceptina com receptor ORLA – modulando a dor, mas não a depressão respiratória Receptores Opioides Todos modulando a dor, mas com distribuições e funções diversas no SNC. μ – córtex, amígdala, hipocampo, tálamo, mesencéfalo, protuberância, bulbo e medula. K – também no hipótalamo δ – distribuição mais restrita no mesencéfalo e medula.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Factores Neurológicos • • • • • •

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São factores proteicos necessários para a sobrevivência e diferenciação neuronal e desenvolvimento, especificidade e plasticidade das suas conexões. Podem regular a transmissão sináptica e mielinização e estão implicados em diversas actividades fisiológicas como a aprendizagem, memoria e dor. A sua origem pode ser um neurónio alvo (mecanismo retrógrado), a aferente (mecanismos anterogado), o próprio neurónio (mecanismo autónomo), as células glicais ou outras (fibroblastos, etc) Um factor pode afectar múltiplos tipos de memória e cada tipo neuronal ser influenciado por diversos factores. Podem integrar o conceito (classificação) dos factores de crescimento ou de citocinas . Contudo, a evidência de que podem abrir canais de sódio específicos e gerais potenciais de acção. (BDNF) aproxima-os também do conceito de neuro transmissor

Neurotrofinas • Factor de crescimento do neuro (NGF) o O primeiro a ser descoberto nos anos 50, não age só no simpático e populações de neurónios sensoriais do SNP, mas também no SNC (estriado, septo) • Neurotrofina – 3 Neurotrofina 4/5 BDNF (brain derived neurotrophic factor) o Com o NGF constituam a família das neurotrofinas o O BDNF tem sido mais estudados: medula a função do hipocampo e a aprendizagem/memória o Promove a mielinização e pode gerar potenciais de acção; o Os seus sinais alteram-se nalgumas áreas do SNC com o stress, e o seu aumento está associado com o tratamento crónico com anti-depressivos. o A NT3, contrariamente ao BDNF, é inibidora da mielinizaçao Factor neurotrófico Ciliar (CNTF) e LIF: • Estruturalmente e funcionalmente distintas das neurotrofinas, fazem parte da família citosinas neuropoieticas. • O neuro periférico e o factor mais atenuante do CNTF, mas estes afectam também neurónios do SNC, em particular neurónios motores (colinergicos). • É factor de sobrevivência do neurónio do gânglio ciliar e do parassimpático em geral Outros • DNF (glia cll. Derived neurotrophic factor) o com acções no SN e for a dele • neurosepulinas o multiplica acções, em particular nas sinapses neuro-musculares,

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Efinas o criticas para o desenvolvimento e migração neuronal … entre outros…

Receptores e transdução de Sinal 1. Receptores para as neurotrofinas • TRK família dos receptores tirosina sinase. Fites incluem classes para factores de crescimento - I (EFG), II (FDGF), III (Insulinas, IGF, 1), IV (FGF), V (família Eph) tem três formas: TRF A,B;C

As neurotrofinas têm um receptor de alta afinidade preferencial TrK, enquanto o de baixa afinidade se liga a todas elas. • O inicio propagação e manutenção da transdução de Sinal para as neurotrofinas e outros factores neurotroficos depende de rafts lipidicos

Transdução de Sinal Dimerizaçao receptora – Auto fosforilizaçao receptora - Associação do receptor com proteínas citoplasmaticas de sinal, que ao serem fosforiladas no resíduo de tirosina activam a cascata de transdução. Estas proteínas contêm o domínio SH2 (Src homologia 2). Estes são regiões não catalíticas e aproximadamente sem aminoácidos conservadas nestas proteínas incluindo a proteína Shc, a fosforilase C- ‫ ,ﻻ‬a fosfatidilinositol – 3 – cinase (subunidade P85) (PI- 3 sinase) entres outras. Os domínios SH2 estão usualmente acompanhados de domínio SH3 (ex, a GRB2) ligando-se a sequencias ricas em prolina (ex, das SOS, son of seventess ). A cascata de transdução mais conhecida leva á activação da pequena proteína G (Ras GDP → Ras GTP), activando a cadeia de fosforilações : (B- Raf (serina- trionina- sinase)→ acivador das sinase mitogenica – activada 2006/2007 - 76 -

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(MAPKK) → activador), fosforilando resíduos da tirosina e trionina, a proteína sinase mitogenica activada (MAPK), chamadas cinases reguladas por sinal extracelular (ERKA). Estas tem diversas acções, amplificando a resposta e regulando factores de transcrição e assim a expressão genética.

p75 outro receptor, de baixa afinidade para neurotrofinas. Tem mais vastas distribuições e expressão em maior número de células para as TRK, pode estar co-expresso com estes, ou não. Tem semelhança estrutural com os receptores para a família de factores de necrose tumoral (Citocinas), como nestes estimulando a hidrólise de esfigomielina (sistema de transdução de sinal), nomeadamente por proteínas sinases estimuladas pela Ceramida . Entre funções propostas contam-se: • Aumentar a afinidade dos receptores para as neurotrofinas, • medular a actividade da TRK tirosina-cinase, • transporte retrogado de neurotrofinas, • apoptoses..

2. Receptor CNFT • Heterodímero comprendendo três sub-unidades. • A componente α para o CNTF é extra-celular ligando-se a membrana pelo glicosil-fosfatidilinositol. • Ao LIFR(β) liga-se o factor inibitório leucemico (LIF), com reacções neurais e extra neurais. 2006/2007 - 77 -

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A GP130(β) é membro da família dos receptores citocina– hematopoiéticos, associando-se a receptores para a interleucinas 6 e 11 e a oncostativas M. A transdução pela ligação do CNFT envolve a fosforilação da JAK1 e JAK2 que são tirosinas cinase citoplasmaticas. A actividade da JAK inclui subsequentemente fosforilação de factores de transcrição.

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Sistema Nervoso Autónomo
Com excepção do musculo esquelético, todas as regiões periféricas ou vísceras recebem inervação deste sistema e mesmo aquele tem fibras autónomas vasomotoras Tal como o sistema nervoso somático (musculo esquelético, articulações, pele), é constituído por fibras eferentes (motoras) e fibras aferentes (sensoriais). Estas ultimas conduzem as sensações para as percepções viscerais (dor, temperatura) Classificação e funções gerais • SN Entérico o Inervação intrínseca do aparelho gastro-intestinal, pâncreas e vesícula biliar o Tem uma funcionamento autónomo, mãe é regulado por inervação extrínseca do parassimpático e do simpático • SN Parassimpático o Associado à conservação de energia, estimulação da secreção glandular e da motilidade e absorção gastro-intestinal, relaxação de esfíncteres, etc. o Divide-se num craniano (fibras de nervos cranianos) e num pélvico (fibras de nervos sagrados) (1) • SN Simpático o Actividade associada ao gasto de energia, resistência à fadiga em situação de stress ao elevar a glicemia e a tensão arterial, inibição intestinal e fecho de esfíncteres. (2)

Fibras aferentes ou sensoriais Os centros que recebem no SNC são o núcleo do tractus solitarius (bulbo) e o complexo parabraquial (…). Daqui seguem para o talámo e deste para o cortéx da insula.

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Parassimpático N. Edinger-West lII (mêsencéfalo) N.lacrimal, Glan.Salivar VII (protuberância) N.salivar inf. IX (bulbo) N. dorsal vago e Ambíguo X (bulbo) E S2- S4

Gânglio ciliar Gânglio pterigopalatino Glândula submandibular Gânglio óptico Gânglio terminais Olho Gland.lacrimal Gland.salivares Pulmão Coração Fígado(simpático) Estômago Pâncreas Intestino Bexiga Órgãos reprodutores

Acetilcolina

Plexo pélvico

Acetilcolina

Simpático T1 - L3 (coluna intermédiolateral-medula) ´

Gânglio cervical sup. Gânglio estrelado Cadeia paravertebral

1 - Sobretudo com receptores nicotínicos, mas também por receptores muscarinicos. Também se libertam peptidosm agindo em receptores peptidergicos 2 - Com acção moduladora, tal como a dos receptores muscarinicos (potenciais pós-sinápticos excitatorios mas mais lentos) Mediadores e Acção Pós-Ganglionar Parassimpático • O mediador principl é a acetilcolina, actuando em receptores muscarinicos • Também libertam péptidos com acção moduladora (ex. Vip) Simpático • O principal é a noradrenalina, com +/- péptidos • Para alem dos receptores peptidergicos, há diversos receptores adrenergéticos

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o α1 - vasoconstrictor, dilatação da pupila, encerramento de esfíncteres, gastro-intestinal, bexiga, secreção de suor o α2 - pré-sinápticos. A noradrenalina inibe a sua libertação o α2 - pós-sinápticos. Inibe a secreção de insulina e serina o β1 - aumenta a frequência cardíaca, a lipolise; inibe a motilidade o β2 - aumenta a secreção de renina; broncodilatador, vasodilatador coronário Regulação Central do Sistema Nervoso Autónomo: Hipotálamo

O hipotálamo não é indispensável para a regulação autónoma de algumas funções, como a respiratória e a cardiovascular, cujo o centro é bulbar, em particular o NÚCLEO DO TRACTUS SOLITARIUS (NTS).

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Músculo

1. Sarcolema • A membrana citoplasmatica com os elementos especializados da placa motora e outras de tecido conectivo e colagénio. • O potencial de membrana é de cerca de -80mV • Contém um complexo glicoprpteico associado à distrofina de grande importância funcional e patológica INM = [K+] [Na+] [Ca2+ ] [Mg2+] [H+] • • • INM aumentada, por exemplo em situações de hipocalcemia ou hipomagnesiemia. Ao contrário das membranas dos nervos, a muscular tem uma alta condutância para os iões cloro. Mutações nestes canais causam miotenia. Mutações noutros canais (Na+, Ca2+) também alteram a excitabilidade, causnado doença.
INM = irritabilidade neuromuscular

2. Sistema Contráctil • Sistema de proteinas constituindo os filamentos espessos e os filamentos delgados 3. Retículo Sarcoplásmico • Os potenciais de acção originados no sarcolema penetram no interior da fibra muscular por um sistema tubular em T associando-se ao retículo sarcoplasmático • Este reserva o cálcio no músculo relaxado, libertando-o quando a despolarização chega pelo sistema T

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Contem: o uma ATPase, Ca2+ dependente, responsável pela sua captura. o uma proteína de canal de Ca2+ necessária para o acoplamento da despolarização à libertação o um receptor rianodina, necessárip para a libertação de cálcio. Mutações neste receptor associam-se a doença (hipertremia maligna)

4. Substratos Energéticos • Ácidos Gordos livres o O principal substrato em repouso, sobretudo em períodos prolongados de endurance o Originam-se dos triglicéridos musculares, do tecido adiposo e das lipoproteinas o A importância da carnitina • Glicogénio o No principio do exercício ou na sua grande intensidade o A glicose e os ácidos gordos substituem-no à medida que o trabalho se prolonga o Muitas doenças estão associadas a défices de utilização destes susbtratos

5. A heterogeneidade das fibras musculares • Fibras do tipo 1 (fibras vermelhas) o De contracção e relaxação lentas o Resistentes à fadiga o De metabolismo sobretudo aeróbio o Muito ricas em mitocondrias e em mioglobina • Fibras do tipo 2 (fibras brancas) o De contracção e relaxação rápidas o Mais fatigáveis o Metabolismo sobretudo anaeróbio o Retículo sarcoplasmico mt desenvolvido o Existem intermédias (2a e 2b) 6. A junção e transmissão neuro-muscular • Nervo e musculo constituem uma unidade funcional inseparavél • Unidade Motora o É definida pelo neurónio motor (α) e o conjunto de fibras musculares que ele inerva • Fibras pertencentes à mesma unidade motora são do mesmo tipo bioquímica e funcionalmente. o A inervação e a actividade da fibra nervosa pode alterae o tipo de fibra muscular • A transmissão neuro-muscular pode ser afectada: o a nível pré-sináptico (ex. toxina botulinica),

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o a nível da junção (ex. inibidores da acetilcolinesterases e organofosfatos) o a nível pos-sinaptico (ex. certas toxinas que bloqueiam o receptor da acetilcolina ou a miastenia gravis) Esta última está associada a anticorpos dirigidos contra a acetilcolina. A toxina botulinica inibe a libertação de acetilcolina • Os receptores nicotínicos iniciam a despolarização põe abertura dos canais de sódio

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Neurotoxina Botulinica e Sinapse Neuromuscular

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As neurotoxinas botulinicas (TB) A e B são constituídas por cadeias A e B. • Cadeias B o De ligação e internalização das toxinas o Para além da cooperação de gangliósidos, TB - A liga-se à proteína SV2 TB - B liga-se à proteína sinaptogarmina?? o Estas proteinas são V-SNAREs, proteinas da membrana vesículas para a fusão e libertação de acetilcolina nas sinapses neuromusculares Cadeias A o São endoproteinas o Ao clivarem SNAREs perturbam a fusão vesicular e libertação de acetilcolina. A da TB - A degrada a SNAP-25, uma proteína da membrana pré-sináptica (t-SNARE) A da TB - B degrada a sinaptobrevina (V-SNARE)

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Contracção Muscular

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As células eucaríoticas têm filamentos contrácteis e microtúbulos, participando: • Organização dos compartimentos celulares • Divisão celular • Actividade de cílios e flagelos • Transporte de materiais • Etc. Energia Química Energia Mecânica

Os elementos contrácteis das células musculares são as miofibrilhas, constituindo-se por unidades contrácteis, os sarcómeros.

Banda I • Isotrópicas • Têm propriedades físicas uniformes qualquer que sejam as direcções nas quais sejam medidas Banda A • Anisotrópicas • As propriedades físicas dependem da direcção de medida • O seu índice de refracção não é uniforme em todas as direcções • Birrefrangência - componentes musculares assimetricos orientados numa direcção Os sarcómeros podem-se encurtar de 20 a 50% e podem estender-se até 120% do seu comprimento de repouso quando o musculo é estriado. As alterações no comprimento de um musculo devem-se ao grau de penetração dos filamentos finos nas zonas com filamentos grossos.

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Os componentes proteicos das miofibrilhas (miofilamentos) 1. MIOSINA • 55-60% da proteinas miofibrilhares

• •

Composta oor 6 cadeias de polipepticos 2 H (pesadas) 4 C (leves) Cadeias pesadas Meromiosina L Meromiosina H (transversal, portadora de actividade ATPásica e dos sitios de união com as cadeias C e a actina) Cadeias Leves(*) C1 C2 (duas para cada molécula de miosina) C3

(*) o musculo cardíaco e os de contracção lenta contêm só 2 filamentos de cadeias leves (LC1 e LC2) 2. ACTINA • 20-25% das proteinas miofibrilhares • Existe sob 2 formas: o Actina G - Globular o Actina F - Fibrilhar (constituída pela união de um grande número de moléculas de actina G dispostas em dupla espiral) • Constituem os filamentos delgados, juntamente com 2 outras proteinas reguladoras

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz 3. TROPOMIOSINA • 4-11% das proteinas miofibrilhares • Entrelaçadas com as moléculas de actina • Fixam-se ao nível da linha 2, juntamente com a α-actinina

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4. TROPONINA • Formada por 3 cadeias polipeptidicas o Troponina T - fixa o complexo à tropomiosina o Troponina C - fixa os iões cálcio o Troponina I - inibe a interacção entre a actina e a miosina

ACTINOMIOSINA • Forma-se pela associação de uma parte de Actina-F com 3 partes de miosina • O complexo é muito viscoso, dissociando-se a concentrações salinas muito altas (KCL a 24) • Enquanto a actividade ATPásica da miosina pura requer Ca2+ e é inibida pelo Mg2+, a actividade ATPásica da actinamiosina é estimulada pelo Mg2+

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Mecanismo de Contracção e sua Regulação Modelo de deslizamento

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A tropomiosina inibe a ligação de 7 unidades de actina-G através da troponina-I. Quando a troponina-C se liga a 2 Ca2+ expõe o local de ligação da actina-G à miosina.

Forma-se o Complexo Gerador de Força, na qual a cabeça da miosina se liga aos monómeros da actina-G

Ocorre uma alteração de conformação da cabeça da miosina, que assume um ângulo de 45º em relação à cauda. Isto provoca um movimento do filamento delgado em relação ao espesso.

Termina num complexo rígido, forma de actinamiosina de baixa energia

Preparado para interagir com um novo monómero de actina-G

A cabeça da miosina passa do seu estado energético a uma conformação não energética, deixando o ADP e o Pi nos seus locais de ligação na miosina. A hidrólise do ATP em ADP e Pi permite recuperar o ângulo de 90º.

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A relaxação muscular efectua-se com o transporte de Ca2+ do sarcoplasma para o retículo sarcoplasmico, por transporte activo. A preceder a contracção: • A despolarização do sistema T, cujas as membranas têm receptores dihidropiridina, relacionados com canais de Na+ voltagem-dependentes, é transmitida às membranas do retículo sarcoplásmico, que aumenta a sua permeabilidade para o Ca2+ (receptor rianodina), contido nas suas cisternas no estado de repouso. (o Ca2+ pode estar solúvel nas cisternas ou ligado a calsequertrina) • Neste estado, a hidrolise de ATP pela miosina é inibida pelas concentrações de Mg2+. Esta é contrariada pela reacção da actina com a miosina na presença de concentrações activadoras de Ca2+. Uma molécula de ATP é necessária para reagrupar duas moléculas de Ca2+ nas cisternas, de modo a relaxar o musculo. De 2 a 4 moleculas de ATP são ligadas e hidrolizadas por cada ponte activadora, durante a contracção. Nota: O ATP é necessário tanto para a contracção como para a relaxação. Pelo menos 2/3 do ATP é usado para a contracção e 1/3 na relaxação. Mecânica da Contracção Muscular 1. Tipos de contracção • Isométrica - contracção sem encurtamento do musculo

•I s o t ó n ica - contracção onde há encurtamento do musculo e manutenção da sua tensão

A força total desenvolvida pelo musculo esquelético depende de 2 factores:

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I. Somação das contracções induzidas pelos potencias de acção numa fibra muscular II. Recrutamento de um número crescente de fibras activas num dado musculo. III. Para altas frequências de estimulação, a fibra muscular esquelética pode desenvolver contracção tetânica, com redução do desenvolvimento da força , a qual requer: a. A manutenção de altas concentrações de Ca2+ citoplasmático b. uma duração do potencial de acção inferior à duração da contracção da fibra (o que vai acontecer na contracção cardíaca)

Fibras de contracção rápida • em 10-20 ms, todo o Ca2+ é capturado pelo retículo sarcoplasmico Fibras de contracção lenta • a contracção da fibra pode durar 40-50ms

2. Relação entre Força Máxima e Comprimento Muscular • Curva tensão passiva o Medida de elasticidade do musculo ou a sua tendência em voltar ao comprimento de repouso após estiramento o O musculo contem elemtos elásticos entre os sarcómeros e os tendões. A tensa activa é máxima perto do comprimento de repouso do musculo esquletico. O seu estiramento leva a que as cabeças de miosina não possam establecer pontes, resultando numa quebra de tensão activa. Para além de um encurtamento exagerado, a tensão activa também diminui. o Há um intervalo óptimo de performance ou “operacional”, para o desenvolvimento da força máxima, na qual se encontram os músculos esqueléticos.

• • •

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3. Fadiga Muscular • Redução da sua capacidade de gerar força e seu consequente uso • Fadiga Rápida - exercício intenso/rápido leva ao aumento de acido láctico, o que faz diminuir a quantidade de ATP disponível. • Fadiga Lenta - exercicio prolongado leva a uma diminuição do glicogénio no musculo, que está dependente de substâncias lipidicas (AG)~

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Músculo Cardíaco Fibras semelhantes às do tipo I do musculo esquelético Fibras mais curtas ligadas por discos intercalares, com complexos de junção (permite a comunicação eléctrica entre as fibras). Não há somação o O potencial de acção dura vários milisegundos, quase até ao final da contracção Não há contracção tetânica A superfície da membrana tem canais de Ca2+ voltagem-dependentes, o A entrada de Ca2+ pelo potencial de acção é necessária para o acoplamento excitação-contracção.

Como no musculo esquelético, a força é determinada pela estiramento, contudo, o intervalo operacional está numa região da curva comprimentotensão na qual a força gerada é inferior ao comprimento na qual a força máxima será obtida. Por isso, na condição normal de estiramento gera mais força.

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Instituto Superior de Ciências da Saúde - Egas Moniz Músculo Liso • • • •

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Fibras unitárias - estão electricamente e mecanicamente acopladas (aparelho gastro-intestinal, vasos sanguíneos) Fibras multi-unitárias - têm poucos ou nenhuns complexos de junção (íris, parede de vasos de maior diâmetro, vias respiratórias) As proteinas contrácteis não estão organizadas em sarcomeros. As unidades contrácteis são arranjos paralelos de filamentos espessos e delgados, em que a miosina se liga em corpos densos ou ao sarcolema e os filamentos de actina não têm relação constante com os filamentos de miosina. A razão actina/miosina é muito maior do que no musculo esquelético (10/15 contra 3/1) Nas fibras unitárias, há despolarizações espontâneas regulares (ritmo eléctrico básico). Nas fibras multi-unitárias, as alterações na contractibilidade resultam, em geral, da influencia do sistema nervoso autónomo. (assemelham-se mais às do musculo esquelético) As fibras lisas não têm retículo sarcoplasmico desenvolvido Como no cardíaco, há canais de Ca2+ voltagem-dependentes na membrana citoplasmatica e a entrada de Ca2+ resulta na despolarização. o O Ca2+ combina-se com pelo menos 2 proteinas: a cadeia leve de miosina e a calmodulina. o A activação da calmodulina é essencial para a ligação da miosina à actina

• • •

• •

Receptor de Ca2+ no acop. exc-cont. Fonte de Ca2+ Regulação da força Organização

Diferenças entre os tipos de músculo Esquelético Cardíaco Troponina Ret. Sarcopla. Somação Recrutamento Unidade Motora Troponina Ret. Sarcopla. Espaço extra-cel. Estiramento Moduladores de contracção Unitária

Liso Calmodulina Miosina Primariamente espaço extra-cel Moduladores de Contracção Unitária Multiunitária

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