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ESPECTROMETRIA DE LIMINESCNCIA MOLECULAR


Terminologias e conceitos Luminescncia - termo empregado como uma generalizao do fenmeno de emisso de radiao eletromagntica por um material. Luminforo-espcie responsvel pela luminescncia. Para a fluorescncia, o termo fluorforo pode ser usado. H vrios tipos de luminescncia definidos em funo da forma de energia utilizada na excitao. Contudo, se a excitao for realizada por aquecimento ao rubro o fenmeno de emisso denominado incandescncia. Na tabela mostrada a seguir encontram-se citados diversos tipos de luminescncia. Fotoluminescncia (Fluorescncia e Fosforescncia); Quimiluminescncia; Bioluminescncia; Radioluminescncia; Triboluminescncia; Termoluminescncia; Eletroluminescncia; Magnetoluminescncia; Sonoluminescncia.

Fluorescncia
A luminescncia instantnea (cerca de 1 ns) da matria aps excitao com radiao UV ou visvel. Fosforescncia A luminescncia retardada da matria aps excitao com energia de uma radiao UV ou visvel. Quimiluminescncia A luminescncia promovida por uma reao qumica. Bioluminescncia A luminescncia resultante da excitao com energia associada a uma reao bioqumica. Ex.: luminescncia do vaga-lume. Radioluminescncia A luminescncia produzida pela irradiao do sistema com partculas gama. Triboluminescncia Luminescncia produzida excitando o sistema com energia mecnica. Ocorre quando, por exemplo, um mineral esmagado, riscado ou esfregado. A maioria dos minerais que tm esta propriedade do tipo no metlico, anidro e com clivagens.

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Ex.: Enquanto a fluorita (CaF2), a esfalerita (ZnS) e a lepidolita (mica de ltio, K2Li3Al5Si6O2) mostram notvel triboluminescncia, Pectolita (CaNaH(SiO3)3), ambligonita (LiAl(F,OH)PO4), feldspatos (KAlSi3O8 - NaAlSi3O8 - CaAl2Si2O8) e calcita (CaCO3) tm triboluminescncia menos expressiva. Termoluminescncia a emisso de luz por meio do aquecimento dos minerais em baixa temperatura, entre 50 e 475 sendo inferior te mperatura de incandescncia. C, Ex.: Certos minerais no metlicos e anidros, sobretudo os que contm elementos alcalinos terrosos, a exemplo do clcio, mostram esta propriedade. A fluorita (CaF2) um mineral termofluorescente tpico. Alm disso, a calcita (CaCO3), feldspatos (KAlSi3O8 - NaAlSi3O8 - CaAl2Si2O8), quartzo (SiO2), etc. mostram leve termofluorescncia. Por meio da comparao da intensidade de radiao nuclear com a da termoluminescncia recuperada, pode-se determinar a idade do ltimo evento trmico (aquecimento) do mineral. Este mtodo aplicado para datao (medir a idade da rocha ou mineral) de amostras com idade inferior a algumas dezenas de milhares de anos, sendo til para vulcanologia e arqueologia. Magnetoluminescncia A luminescncia provocada pela excitao com energia de um campo magntico. Sonoluminescncia A luminescncia produzida aps excitao com energia de radiao ultrasnica (freqncia superior a 20 kHz). Apesar da diversidade dos fenmenos luminescentes, abordaremos a fotoluminescncia e a quimiluminescncia associadas principalmente a compostos orgnicos. Ademais, ser explorado o seu aproveitamento analtico bem como a instrumentao necessria para a obteno dos espectros.

Luminescncia por Molculas Quando o sistema luminescente uma molcula, as bandas de fluorescncia (ou fosforescncia) ocorrem tipicamente em um maior que a linha de ressonncia (deslocamento Stokes). Para compreendermos as razes desse comportamento, bem como das caractersticas dos espectros de fluorescncia molecular e fosforescncia, considere os diagramas de energias das figuras mostradas a seguir. Tais diagramas podem ser inferidos a partir de consideraes baseadas na teoria dos orbitais moleculares e na espectroscopia vibracional.

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Figura - Ilustrao da origem da fluorescncia

Figura-Ilustrao de um espectro de absoro (a) e de fluorescncia (b) de uma substncia.

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Figura - Ilustrao da origem da fosforescncia

Figura Diagrama de Jablonski para o naftaleno: CI = converso interna; CIS = cruzamento intersistema

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Figura Diagrama de energias de uma molcula fotoluminescente tpica.

Caracterizao dos Nveis de Energia do ltimo Diagrama Linhas horizontais grossas estados eletrnicos - estado fundamental: S0 (normalmente singlete) - excitados: S1 e S2 (singletes) e T1 (triplete) Linhas horizontais finas estados vibracionais - associados ao estado fundamental: S0 - associados aos estados excitados: S1 e S2 e T1 OBS: O diagrama no explicita as linhas horizontais associadas aos estados rotacionais da molcula, embora esses nveis de energia existam. Flechas verticais retas indicam processos associados a absoro ou emisso de radiao (fluorescncia ou fosforescncia). Flechas verticais sinuosas processos no-radiativos (relaxao vibracional, converso interna, etc).

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Excitao Molecular Conforme o diagrama, excitao da molcula pode ser feita pela absoro de radiao UV-Vis cujas bandas so centradas em: 1 promove a transio eletrnica: S0 S1

2 provoca a transio eletrnica: S0 S2

Contudo, a molcula pode ser levada para qualquer um dos estados excitados vibracionais ilustrados na figura. digno de nota salientar que a excitao da molcula para o estado triplete no foi mostrada no diagrama, pois essa transio no ocorre de modo significativo. De fato, esse processo envolve uma mudana de spin, cuja probabilidade de ocorrer to baixa que a transio considerada proibida de acordo com a Mecnica Quntica. Velocidades de Absoro e Emisso Absoro de ftons processo extremamente rpido (10-14 a 10-15 s) Fluorescncia ocorre em 10-9 a 10-7 s (pico de absoro: 103 a 105) ocorre em 10-6 a 10-5 s (pico de absoro < 103) Fosforescncia requer tempos na faixa de: 10-4 a 10s ou mais Processos de Desativao A molcula pode voltar ao estado fundamental devolvendo a energia ganha na absoro por meio de: um processo radiativo: fotoluminescncia que compreende a fluorescncia e a fosforescncia; um processo no-radiativo: - relaxao vibracional; - converso interna; - converso externa; - cruzamento intersistema OBS.: O mecanismo pelo qual a molcula libera a energia aquele que minimiza tempo de vida do estado excitado. Assim, se a fluorescncia for mais rpida que os processos no-radiativos ento ela ir ocorrer. Caso contrrio, a fluorescncia no ocorre ou pouco intensa. Relaxao Vibracional significativa em soluo, pois essas condies favorecem maiores interaes entre a molcula excitada e a do solvente. Nesse caso, a energia vibracional em excesso perdida imediatamente tendo em vista a alta eficincia desse processo. De fato, o tempo de vida mdio estimado de uma molcula excitada vibracionalmente da ordem de 10-12 s.

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Conseqncias da relaxao vibracional prevalece sobre a desativao por fluorescncia, pois seu tempo de vida menor que o de um estado excitado eletronicamente; a fluorescncia, quando ocorre, envolve uma transio a partir do nvel vibracional mais baixo de um estado eletrnico excitado; as bandas de fluorescncia so deslocada para s maiores que os associados s bandas de absoro (deslocamento Stokes). Converso Interna Embora essa desativao no seja bem-compreendida, ela parece ser particularmente eficaz quando dois nveis eletrnicos possuem energias prximas o suficiente para promover uma superposio de nveis de energia vibracionais (veja no diagrama) importante ressaltar que a converso interna um evento geralmente mais provvel que a desativao por fluorescncia a partir de um estado eletrnico excitado mais alto (S2, S3, etc). Conseqncias do fato anterior: a excitao em 2 promove uma fluorescncia cuja banda centrada em 3, excluindo a banda que resultaria de S0 S2.

de fato, a molcula excitada passa de S2 para o nvel vibracional mais baixo de


S1 por relaxaes vibracionais, uma converso interna e depois relaxaes subseqentes. Um exemplo tpico desse comportamento pode ser dado pelo quinino, cujos espectros de excitao e fluorescncia so mostrados a seguir.

Figura - Espectros de excitao e de fluorescncia de uma soluo de sulfato de quinino.

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Continuao das conseqncias da converso interna: S0, quando houver possvel ocorrer tambm a converso interna de S1 superposio entre os nveis vibracionais associados aos estados eletrnicos S1 e S0 se estas energias forem prximas. a converso interna pode causar a pr-dissociao da molcula. De fato, isto pode ocorrer quando a molcula retorna para um estado eletrnico de menor energia, cuja energia vibracional associada alta o suficiente para quebrar uma ligao. OBS.: A diferena entre a pr-dissociao e a dissociao que nesta ltima a ligao que se quebra pertence ao cromforo quando excitado a um nvel vibracional suficientemente alto. Neste caso, no ocorre converso interna. Converso Externa Consiste na interao e transferncia de energia entre a molcula excitada e a do solvente ou a de outros solutos. digno de nota salientar a relevncia desse tipo de desativao, haja vista o efeito expressivo do solvente sobre a intensidade de fluorescncia. Uma discusso detalhada sobre essa influncia ser realizada adiante. Cruzamento Intersistema Este tipo de desativao ocorre por meio de uma inverso do spin de um eltron excitado levando a molcula para o estado triplete. Como ilustrado no diagrama, essa processo favorecido quando ocorre superposio entre estados vibracionais dos dois estados eletrnicos, a exemplo do que ocorre em S1 T1. OBS.: A desativao por cruzamento intersistema ocorre com maior facilidade quando a molcula contm tomo pesado (Br, I, etc). Neste caso, as interaes spin-rbita propiciam condies mais favorveis para uma mudana de spin. Outra situao que tambm favorece mudana de spin por motivo anlogo ocorre quando na presena de O2 (molcula que contm es desemparelhados, sendo portanto paramagntica). Fosforescncia Esse fenmeno ocorre com maior intensidade quando a desativao por cruzamento intersistema favorecida. Contudo, existe a possibilidade desse tipo de emisso ser inibido devido competio de converses externa e interna envolvendo T1 e S0, como se pode observar no diagrama. Com efeito, essa competio to significativa que a fosforescncia observada com maior facilidade a baixas temperaturas e em meios muito viscosos.

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Tipos de transies na fluorescncia * no ocorre, pois a absoro de radiao com max < 250 nm prdissociao ou dissociao. OBS.: 200 nm 600 kJ mol-1 (energia de ligao em muitas molculas orgnicas) n * decorrente da absoro n transio 10-7 a 10-5 s * proveniente da absoro * com max > 250 nm tempo de

* com max > 250nm tempo de

transio 10-9 a 10-7

OBS.: Entre as transies promotoras da fluorescncia prevalecer a que implicar um menor tempo de vida do estado excitado e/ou for menos energtica. Eficincia ou Rendimento Quntico() a razo entre o nmero de molculas que sofrem fotoluminescncia e o nmero de total de molculas excitadas.

kf kf + ki + kce + kci + kd + k pd

onde kx representa a constante de velocidade referente ao processo X, ou seja: kf fluorescncia ou fosforescncia; ki cruzamento intersistema; kce converso externa; kci converso interna; kd dissociao; kpd pr-dissociao;

Fatores que Afetam a Fotoluminescncia Influncia da Estrutura Qumica Via de regra, a fluorescncia de compostos aromticos > a fluorescncia de alifticos, alicclicos carbonlicos ou aqueles com ligaes duplas altamente conjugadas. Com efeito, a maioria dos hidrocarbonetos aromticos no-substitudos

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fluoresce em soluo, a exemplo do que ocorre com o fenantreno cujo espectro de fluorescncia mostrado na figura a seguir. Nesses compostos, aumenta com o nmero de anis e seu grau de condensao.

Figura - Espectros do fenanteno: E: excitao, E: fluorescncia e F: fosforescncia

Por outro lado, compostos heterocclicos simples como a priridina, furano, tiofeno e o pirrol (veja as estruturas abaixo) no fluorescem.

Presume-se que nesses compostos (sobretudo os nitrogenados) a transio eletrnica n * seja a de menor energia e que rapidamente se converte para um estado triplete suprimindo a fluorescncia. Entretanto, compostos heterocclicos condensados com anis benznicos exibem fluorescncia devido ao aumento da absortividade associada ao pico de absoro, o que diminui o tempo de vida do estado eletrnico excitado singlete. A ttulo de exemplo podemos citar:

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importante discutir a influncia que certos substituintes podem causar sobre as posies dos picos, bem como a eficincia quntica da fluorescncia de um composto aromtico. Para isso, considere os dados da Tabela a seguir que mostra o resultado dos efeitos de substituintes sobre a fluorescncia do benzeno. O efeito da substituio por halognios notvel sobretudo ao se aumentar o nmero atmico. Neste caso, o efeito do tomo pesado aumenta a probabilidade de cruzamento intersistema para o estado triplete, diminuindo a eficincia quntica da fluorescncia. Quanto ao iodobenzeno, atribui-se ao seu comportamento de no exibir fluorescncia uma provvel pr-dissociao que deve ocorrer devido presena da ligao C I de fcil ruptura.
Tabela - Efeito da substituio na fluorescncia do benzeno.

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Influncia da Rigidez Estrutural

Ex. 1:

CH2

Fluoreno: 1

Difenil: 0,2

Maior rigidez promovida pelo CH2 menor kci Aumenta a fluorescncia

Baixa rigidez maior kci Propicia um aumento da Desativao no - radiativa Diminui a fluorescncia

Influncia do Solvente

Solventes pouco viscosos

Solventes c/ tomos pesados

Mais colises intermoleculares

Interaes spin-rbita

Aumenta a converso externa

Cruzamento intersistemas

Desativao no-radiativa

Desativao no-radiativa

Menor Fotoluminescncia

Menor Fluorescncia, porm favorece a Fosforescncia

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Influncia do pH notvel a influncia do pH na intensidade de fluorescncia de um composto orgnico cuja estrutura contm grupos cidos ou bsicos. Com efeito, tanto o como a intensidade de fluorescncia sero diferentes para as formas protonada e desprotonada.
Composto Fenol on fenolato Anilina on anilnio Frmula C6H5OH C6H5O C6H5NH2 + C6H5NH3 Comprimento de Onda da Fluorescncia, nm 285 365 310 400 310 405 Intensidade Relativa da Fluorescncia 18 10 20 0

Influncia da Temperatura

Maior temperatura

Mais colises intermoleculares

Converso externa

Diminuio da fotoluminescncia
Influncia do Oxignio Dissolvido A propriedade paramagntica da molcula de oxignio propicia o cruzamento intersistema, acarretando uma atenuao da fluorescncia. Influncia da Concentrao do Fluorforo A relao entre a potncia da emisso de Fluorescncia (F) e a Concentrao (c) do fluorrofo pode ser escrita como:

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F = k (P0 P ) = k P0 1 10 .b.c

P0 = 10 .b.c P

onde: - K depende do rendimento quntico da fluorescncia; - P0 a potncia do feixe incidente (radiao excitadora); - P a potncia aps atravessar uma distncia b do meio. A expresso 1 10-bc pode ser expandida em uma srie de Maclaurin como:

(2,303 .b.c )2 + (2,303 .b.c )2 F = k P0 2,303 .b.c 2! 3!


Quando bc =A < 0,05, os termos de ordem 2 ser desprezados Ento

F = 2,3k .bcP0
Se P0 for mantido constante

F = K c
onde K um coeficiente de proporcionalidade que depende: - da absortividade () associada ao pico de absoro; - do rendimento quntico () da fluorescncia; - da potncia do feixe incidente (P0) da radiao excitadora; - do percurso ptico (b). Desvios da linearidade medida que a concentrao do fluorforo aumenta, dois fatores podem provocar um desvio da linearidade na relao entre F e c, a saber: auto-supresso resulta da transferncia de energia no-radiativa entre molculas excitadas decorrente de colises, cuja probabilidade tende a aumentar com o aumento da concentrao do fluorforo; auto-absoro esse tipo de interferncia ocorre quando h uma superposio entre o da radiao emitida com o do pico de absoro. Neste caso, a intensidade da fluorescncia diminui medida que a radiao emitida por certos fluorforos atravessa a soluo e reabsorvida por molculas fluorescentes.

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Anlise Qualitativa Os mtodos fotoluminescentes no so potencialmente aplicveis anlise qualitativa por duas razes principais: i) nmero pequeno de molculas que incorporam propriedades estruturas e ambientais capazes de promover uma diminuio dos processos de desativao no-radiativos que competem com a fotoluminescncia; correlao pobre entre s bandas de emisso e a estrutura molecular, embora a presena de anel aromtico seja, a princpio, esperada no sistema fotoluminescente investigado.

ii)

Anlise Quantitativa Os mtodos fotoluminescentes quantitativos tm oferecido resultados satisfatrios, sobretudo por apresentar sensibilidade e faixas dinmicas melhores que os mtodos baseados em medidas de absoro UV-Vis. As curvas analticas fluorimtricas so construdas com base na relao

F =Kc
e num planejamento experimental que minimize problemas de desvios da linearidade decorrentes da auto-supresso e auto-absoro. Para aumentar a sensibilidade das medidas fluorimtricas, basta aumentar a potncia da radiao excitadora (P0). Contudo, o mesmo no se pode conseguir para as medidas de absoro, pois um aumento de P0 implica tambm um aumento de P. Assim, a medida da transmitncia (e portanto de absorbncia) no afetada. Instrumentao para Medidas de Fotoluminescncia Os fluormetros so semelhantes ao fotmetros de absoro, tendo em vista que usam filtros para selecionar tanto a radiao para excitao como a da emisso fluorescente. Por outro lado, os espectrofluormetros, embora similares aos especrofotmetros, podem ser de dois tipos, a saber: o primeiro utiliza um filtro para selecionar a radiao excitadora e um monocromador para produzir os espectros de emisso de fluorescncia. A figura da pgina seguinte ilustra um modelo desse tipo de instrumento.

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Figura Esquema de um fluormetro tpico.

os espectrofluormetros do segundo tipo so sempre equipados com dois monocromadores, sendo um deles usado para variar o comprimento de onda durante a obteno dos espectros de excitao. O outro permite registrar os espectros de fluorescncia ao variar o comprimento de onda. Os espectrofluormetros do segundo tipo so considerados autnticos e podem ser representados pelo modelo exemplificado na figura a seguir.

Figura Esquema de um espectrofluormetro autntico.

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Fosformetros Os fosformetros so idnticos aos instrumentos utilizados para medidas de fotoluminescncia, exceto pelo fato de usar dois componentes adicionais: um dispositivo mecnico (ou eletrnico) usado para alternadamente irradiar a amostra e medir a intensidade de fosforescncia aps um certo tempo. O atraso necessrio para distinguir entre a emisso de fosforescncia e a de fluorescncia que tem um tempo de vida curto. um frasco de Dewer com janelas de quartzo usado com nitrognio lquido para realizar medidas em baixas temperaturas a fim de reduzir a supresso de fosforescncia por colises. Quando na temperatura de N2 lquido, o analito um soluto em um vidro ou solvente slido. Neste caso, usa se habitualmente a seguinte mistura de solventes: ter etlico, pentano e etanol. Ambos os componentes mencionados so ilustrados na figura mostrada a seguir.

Figura - Esquema de um dispositivo que permite excitar a amostra e observar a fosforescncia alternadamente.