Secuenciacin de ADN

Mariel Salgado Rodrguez

Introduccin
Son procedimientos destinados a determinar la secuencia nucleotdica, en una cadena de ADN. Los ltimos aos han visto avanzar notablemente nuestra capacidad para determinar las secuencias de ADN o ARN. A partir de 1997 dos tcnicas han sido utilizadas habitualmente para la secuenciacin de molculas largas de ADN, por una parte, el mtodo de Alan Maxan y Walter Gilbert de hidrolisis qumica especifica y, por otra la de interrupcin controlada con didesoxinucletidos, de Frederic Sanger.

Metodo de Maxan-Gilbert
En este mtodo, se introduce, en primer lugar, un marcaje radioactivo en el extremo 5 del filamento a secuenciar con P. Utilizando mtodos especficos la molcula es cortada en lugares diferentes que coinciden con cada uno de los cuatro nucletidos, dando lugar a fragmentos de distinta longitud que pueden ser separados por electroforesis en gel de poliacrilamida, capaz de detectar diferencias de longitud de tan solo un nucletido. Los diferentes fragmentos son identificados autoradiograficamente.

Secuenciacin de Sanger
La secuenciacin de Sanger es similar en principio a la de Maxan-Gilbert en cuanto a que genera una serie de fragmentos con un origen 5 comn y terminaciones 3 con bases especificas. Sin embargo, las terminaciones 3 se crean no por una ruptura en bases especificas a partir de una molcula de longitud completa, sino mediante una interrupcin en bases especificas de la sntesis enzimtica de la molcula in vitro, al incorporar anlogos de nucletidos que sirven como terminadores de cadena.

Se disea un oligonucletido sinttico de unos 17-20 bases complementario de la cadena de ADN que se quiere secuenciar y situado a unos 20-30 bases de distancia del comienzo de la secuencia que se quiere leer. Si este oligo se disea fuera de la regin de clonaje de los plsmidos podr emplearse el mismo oligo para secuenciar distintos insertos.

El dplex formado entre el oligo y el ADN complementario de cadena sencilla se convierte en sustrato de la ADN polimerasa I que va a extender la cadena desde grupo OH libre del extremo 3 del oligo, incorporando dNTPs y copiando el molde de ADN al sintetizar la cadena complementaria. Como enzima se emplea el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I que carece de actividad exonucleasa 5- 3. Tambin pueden emplearse otras polimerasas como la Taq polimerasa o la polimerasa del fago T7. Durante la secuenciacin se llevan a cabo cuatro reacciones de sntesis separadas incluyendo en cada una de ellas pequeas cantidades de los dideoxinucletidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP, ddTTP) que carecen de extremo 3 OH libre y que al incorporarse en la cadena de ADN que se esta sintetizando acaban con la elongacin de la misma.

La incorporacin al azar de un ddNTP en competicin con el dNTP correspondiente, implica la formacin de una mezcla de cadenas de distintas longitudes, todas ellas empezando en el extremo 5 y acabando en todas las diferentes posiciones posibles donde un ddNTP puede incorporarse en lugar de un dNTP. El promedio de longitud de las cadenas puede alterarse modificando la relacin dNTP/ddNTP en la mezcla de reaccin. Por ejemplo, aumentando la concentracin de ddNTP aumenta el nmero de cadenas de pequea longitud al aumentar la frecuencia de incorporacin de este tipo de nucletidos.

La sustitucin de uno de los dNTPs por el mismo nucletido marcado radiactivamente permite la visualizacin de las bandas de distinta longitud en un gel de poliacrilamida donde cada una de las reacciones se carga en un carril. En el gel la separacin de las distintas bandas se produce en funcin de su tamao y la secuencia puede determinarse leyendo las bandas de los cuatro carriles. En este tipo de geles pueden leerse hasta 300 bases. En carreras ms largas la lectura puede llegar a ser de hasta 500 bases.

Amplificacin del ADN: PCR

La PCR requiere el conocimiento de las secuencias que flaquean la regin a amplificar. Se producen oligonucletidos complementarios de estas secuencias mediante sntesis qumica automatizada y se utilizan como cebadores en una serie especial de reaccines catalizadas por la ADN polimerasa. En primer lugar, el ADN que contiene las secuencias a amplificar se desnaturaliza mediante calor y luego se alinea con los cebadores, que se encuentran presentes en exceso. A continuacin, se realiza la extensin de la cadena por la polimerasa a partir de los extremos del cebador. Luego, se aplica un segundo ciclo de desnaturalizacin por calor, alineado, y extensin

Con el empleo de una forma termoestable de ADN polimerasa, la Taq polimerasa procedente de una bacteria que vive a temperaturas altas (en aguas termales), se evita la necesidad de aadir ms polimerasa en cada ciclo, puesto que la enzima no se inactiva a la temperatura de desnaturalizacin de ADN. Este ciclo se repite 30 veces o ms en un dispositivo de regulacin automtica de la temperatura, de manera que cada ciclo aumenta la abundancia de las dobles cadenas de ADN unidas por los cebadores oligonucletidos. Al final del ciclo III se han formado dos molculas de este tipo, y su nmero se duplica con cada ciclo sucesivo. Despus de 32 ciclos hay alrededor de 1000 millones de copias (para ser exactos , en donde n es el nmero de ciclos).