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Apostila Biotecnologia de Alimentos

Apostila Biotecnologia de Alimentos

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O termo Fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas

devido a produção de dióxido de carbono pela ação das leveduras sobre o extrato de frutas ou grãos

de malte;

⇒ Significado bioquímico: relata a geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos;

⇒ Produção de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma época e as

bebidas alcoólicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China;

⇒ Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egípcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, após

estrusavam e amassavam os grãos lavando-os após para obter a bebida, ainda, utilizavam as

leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pães;

⇒ Leite e derivados lácteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando

retido no estômago de terneiros jovens coagulava-se (ação enzimática);

⇒ Produtos cárneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem já sabia que a carne

finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca

e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradável

Este produto foi o precursor da lingüiça fermentada produzida atualmente.

O nome salame provém da cidade de Salamis, destruída a mais de 2000

anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros.

Exame microscópico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440

a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma

pureza maior nos sedimentos mais recentes.

A necessidade de preservar a carne da caça e de animais domésticos abatidos durante o

inverno e consumidos no verão (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse soluções

para a preservação do produto.

Assim, os produtos cárneos fermentados tornaram-se de grande importância no mercado

alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma característicos da tecnologia

usada.
Ø Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscópio, foi o primeiro a examinar em
1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida......
Ø 1856-1857: Louis Pasteur, após investigações detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do
vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o açúcar em etanol e CO2 quando em

anaerobiose.
Ø Pateur também observou muitas outras fermentações: Ex.: observou provavelmente um
Penicillium que fermentava D-tartarato de amônio em uma mistura racêmica de D e L-tartarato

(tartarato de Na, K);
Ø Observou também como uns microrganismos cilíndricos produziam ácido butírico somente em
condições anaeróbias e investigou a produção de ácido acético por fermentação;
Ø 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo
frente a outros e previram suas aplicações terapêuticas;

Introdução à biotecnologia de alimentos

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Ø 1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos
bacteriológicos clássicos utilizados até hoje;
Ø Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentações industriais:
• Emprego de fungos e leveduras na modificação de alimentos e bebidas e os estudos

microbiológicos pioneiros de Pasteur e Kock.
Ø Desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o desenvolvimento
de alimentos orientais e durante as grandes navegações;

• Capacidade hidrolítica de determinados fungos em hidrolisar o amido e proteínas na produção

de molho de soja, este foi o inicio das fermentações industriais.
Ø Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obtenção de proteínas alimentícias
microbianas (SCP - proteínas de organismos unicelulares) e de inóculos de microrganismos
Ø Produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produção de ácidos prepararam o caminho
para o desenvolvimento de fermentações que produzissem ácidos orgânicos;
Ø O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de
técnicas que permitiram estudar as aplicações industriais de espécies microbianas individuais,

iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas

fermentações industriais.

FERMENTAÇÃO DE ALIMENTOS

Fermentação de pão, queijo e cerveja bem como bebidas alcoólicas desenvolveram-se para

satisfazer as exigências comerciais modernas de produção em grande escala, com qualidade elevada

e constante, custos competitivos e variedade de produtos.
Ø Produção de cultivos “Starters” para produtos lácteos e o emprego de enzimas industriais
melhoraram a eficiência dos processos, assim como a automação e controle da qualidade na

produção de pão e produtos lácteos.

Fermentação de pão em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo;

Uso de amilases microbianas na produção de açúcares fermentescíveis a partir de grãos de

amido, proporcionando açúcares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a

massa de pão e produzir textura característica).

Técnicas de Pasteurização: permitiram a produção de cerveja em escala industrial fazendo com que
industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos

produzindo em grande escala.

Técnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos)
Ø Controle da velocidade de inoculação;
Ø Viabilidade e condições de armazenamento das leveduras;
Ø Controle das condições de oxigênio dissolvido;
Ø Controle da concentração de Nitrogênio solúvel e de açúcares fermentescíveis no álcool;
Ø Controle da temperatura do processo;
Ø Fermentação em processos contínuos;

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Introdução de inovações tecnológicas como:

Ø Obtenção de cerveja com elevadas concentrações de mosto;
Ø Emprego de cereais não malteados e enzimas microbianas
Ø Produção de cervejas com baixos níveis de carboidratos
Ø Aplicação de técnicas genéticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e
eliminar características indesejáveis.

LEVEDURAS DE PANIFICAÇÃO

Ø Século XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais;
• Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentação variáveis, foram gradualmente sendo

substituídas por leveduras procedentes de fábricas de bebidas alcoólicas.
Ø 1781 obtém-se as primeiras leveduras de panificação prensadas, obtidas através do processo
“Holandês” e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado “Viena”

• Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matéria-prima e

30% de álcool.

• 1879-1919 - avanços substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa

permitindo a obtenção industrial de leveduras para panificação de forma independente de

bebidas alcoólicas;

• 1879 - Marquardt introduziu a aeração no processo fermentativo de cereais permitindo

aumentar o rendimento e diminuindo a produção de álcool a 20%.

INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS:

Adição gradual de açúcar

Surge o primeiro processo de retro-alimentação

Permite elevar a eficiência do processo ate

próximo do máximo teórico sem a formação

conjunta de álcool.

Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produção de leveduras de

panificação usando melaço (todo resíduo dos processos industriais da época) como substrato, com a

finalidade de produzir proteína para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produção

de SCP.

Durante a Segunda Guerra Mundial, também na Alemanha, inicia-se a produção de SCP para

consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melaço procedente da produção de

papel e polpa de celulose, obtendo-se os açúcares (substrato) a partir da hidrólise ácida da madeira.

USA, Suíça, Taiwan e Rússia passam também a utilizar este processo.

ÁCIDOS ORGÂNICOS

Ø 1881 inicia-se a produção comercial de ácidos orgânicos sendo que até hoje 50% do ácido
láctico utilizado a nível industrial é produzido via fermentação usando Lactobacil1us delbrueckii.

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• Ácido Cítrico extraído inicialmente a partir do suco de limão e posteriormente sintetizado a

partir do glicerol.
Ø 1923 - inicia-se a produção de Citrato via fermentação industrial, atualmente estima-se uma
demanda aproximada de 450.000 toneladas/mês produzidas exclusivamente por fermentação,

inicialmente:

• Empregava-se cultivo em superfície de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato).

• Após a 2ª Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977

desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente.

Outros ácidos orgânicos são produzidos de forma econômica e rentável por fermentação:

Ex.: produção de Acido Glucônico e Acido Acético, este obtido pela oxidação do etanol

utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o Ácido Acético em escala industrial é produzido somente

por via química.

ÁLCOOL E CETONAS

Ø Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados
na produção de glicerol, componente para produção de explosivos, desenvolve a primeiro processo

fermentativo de produção de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presença de

bissulfito de sódio;
Ø Durante a Primeira Guerra na Inglaterra é desenvolvido o processo de fermentação acetona-
butanol por via anaeróbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em

grande escala que necessitava métodos de cultivos puros para prevenir a contaminação.

• Após a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou aprocura por n-butanol,

produzido por fermentação até os anos 50, sendo substituído pelo n-butanol produzido a partir do

petróleo, cujo preço era mais baixo que o preço do amido e dos substratos a base de açúcar utilizados

no processo fermentativo.

• 1941 - Inicia-se a implementação da indústria da fermentação alcoólica nos USA, após revogar-

se a proibição da produção de álcool por bioprocessos, sendo responsável então por 77% do álcool

industrial produzido

Ø 1973 - A crise do petróleo faz surgir projetos para produção de combustíveis alternativos.
• Surge o PROÁLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhões de galões de

etanol/ano, a partir da cana-de-açúcar.

• Nos USA inicia-se o “Gasohol Program” que destinava-se a produzir álcool a partir do milho,

adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um número muito grande de plantas

industriais de pequena e grande escala utilizando processos contínuos e descontínuos.

AMINOÁCIDOS

Glutamato Monosódico e a Lisina são os que se produzem em maiores quantidades, cerca de

500.000 e 80.000 toneladas/mês, respectivamente.

A produção de aminoácidos é resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos

bioquímicos que regulam a biosíntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se

superproduções a partir de mutações e do controle do processo de fermentação.

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As novas técnicas passam a:

Ø Estimular as células para que usem substratos alternativos;
Ø Prevenção ou impedimento de reações laterais;
Ø Indução e ativação de enzimas biosintéticas;
Ø Redução ou inibição de atividades enzimáticas que poderiam degradar o produto e, finalmente
facilitar a excreção do aminoácido pelo microrganismo.
Ø As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentação para
produção de ácido glutâmico foram as responsáveis pelo grande avanço na produção de aminoácidos

por fermentação.

• Hoje a maioria dos aminoácidos comerciais são produzidos por fermentação. Assim como a

de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor.

BIOPOLIMEROS
Ø Goma Xantana
- biopolímero mais importante atualmente em função do volume de produção,
utilizada como gelificante ou estabilizante de suspensões. Produzido por fermentação utilizando a

bactéria Xanthomonas campestris.

Outras gomas:

Ø Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii;
Ø Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans;
Ø Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum;
Ø Gelano produzido pela Pseudomonas elodea

Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando

problemas nos processos de mistura, transferência de massa e calor em fermentadores. Estes

aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentação.

POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : poliéster termoplástico acumulado intracelularmente em
alguns tipos de bactérias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre

outras) até um nível de 80% da massa seca celular, sua produção permite a fabricação de plásticos

biodegradáveis.

VITAMINAS

A maioria das vitaminas é produzida por métodos químicos. Entretanto algumas vitaminas

podem ser produzidas por fermentação. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, ácido

fólico, ácido pantotênico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina.

• A síntese química da vitamina B12 é muito complexa sendo que sua produção comercial só é

viável por via fermentativa utilizando Pseudomonas.
Ø Riboflavina: sua produção por fermentação compete eficazmente com os métodos de síntese e
semi-síntese, sendo que 30% da demanda mundial é produzida por fermentação.

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• Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de

produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentação, período muito inferior aos 5 dias

necessários quando se utiliza Ascomycetes.

ANTIBIÓTICOS

Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou

que poderiam ter efeito terapêutico.
Ø 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de
Staphylococcus aureos, matava as bactérias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia

inibir outras bactérias.
Ø Após a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain
demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se então um processo

fermentativo comercial para sua produção. Este fato marcou o início da indústria de antibióticos.
Ø Seguiu-se então a descoberta de
Ø Estreptomicina a partir de espécies de Streptomyces
Ø Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium

Com o desenvolvimento a partir de 1940 de técnicas de genética microbiana que implicaram

em técnicas de mutação e seleção de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da

produção de penicilina de poucas mg/L para até 20g/L de cultivo.

Iniciam-se também, nesta época, os estudos sobre a produção de metabólitos secundários,

pequenas moléculas como os antibióticos que não têm papel importante no crescimento e

manutenção das células.

TRANSFORMAÇÕES DE ESTERÓIDES

O uso de microrganismo, o domínio das técnicas microbiológicas e fermentativas permitiu

fazer transformações enzimáticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avanço

na produção de fármacos, como os hormônios esteróides.
Ø 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteróide secretado pela glândula adrenal, aliviava a dor de
pacientes com artrite reumática, o que fez desenvolver-se um processo de síntese química para

sua produção que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g;
Ø 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona,
produzindo 11á-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da síntese de cortisona caísse para

11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g.
Ø 1980 - Introduziram-se modificações no processo e os custos foram diminuindo gradativamente
de forma que hoje estes custos estão próximos de U$ 0,46/g.

Técnicas semelhantes de biotransformação microbiana permitiram a síntese de outros

esteróides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros fármacos

importantes na medicina.

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ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO

1) Formulação do meio de cultura a ser usado no processo;

2) Esterilização do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares;

3) Produção de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador;

4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condições ótimas para a formação do

produto

5) Extração do produto e sua purificação;

6) Disposição dos efluentes produzidos no processo.

ÁREAS DE APLICAÇÃO DA FERMENTACÃO INDUSTRIAL
A) ALIMENTOS

v Massas fermentadas (pão, panetone);
v Carnes fermentadas (salame, lingüiça);
v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...);
v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...);
v Leite fermentado (iogurte, queijo ...);
v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...);
v Condimentos (vinagre, glutamato...)
v Aminoácidos (lisina, ácido glutâmico);
v Polissacarídeos (dextrano)

B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS

v Álcool (industrial e carburante);
v Antibióticos de uso veterinário;
v Biogás;
v Hormônios de crescimento vegetal.

C) MEDICAMENTOS

v Antibióticos;
v Vacinas;
v Vitaminas;
v Hormônios de consumo humano (insulina);
v Aminoácidos.

D) ÁCIDOS ORGÂNICOS E SOLVENTES

v Ácido cítrico;
v Ácido acético;
v Etanol;
v Propanol;
v Butanol;
v Ácido láctico.

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INTER-RELAÇÕES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS

As relações existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos são muito

importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reações químicas

especificas.

As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimática pode convenientemente

ser manipulada em bio-reatores apropriados.

Por outro lado as células microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte

sólido, atuam como catalizadores que levam a reações químicas concretas, da mesma maneira que as

enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo.

Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentações se refere ao cultivo de

microrganismos em grande escala.

A seleção e aplicação dos princípios da engenharia genética aplicada a microrganismos

apropriados permitem manipular o conteúdo enzimático destes em determinadas condições. Também

o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocará a indução da enzima

necessária para a degradação desse substrato de crescimento dentro da célula.

Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzirá a biossíntese da enzima maltase, (uma á-

glucosidase) que degrada maltose a glicose, que é necessária para a produção de energia química em

forma de ATP dentro da levedura.

MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL
Introdução
– Os produtos comercialmente importantes das fermentações industriais são de 4
categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e polissacarídeos, produtos básicos

e metabólitos secundários que não são necessários para o crescimento celular. A produção comercial

dos produtos de fermentação tem utilizado principalmente diversas espécies de bactérias, leveduras e

fungos, ainda que os avanços recentes no desenvolvimento de técnicas de cultivos têm permitido

utilizar células mais complexas nos processos de fermentação.

Microrganismos Industriais – Na natureza existem duas classes principais de células, ambas
utilizadas nos processo de fermentação industrial:

procariontes - células bacterianas;

eucariontes -leveduras, fungos, células animais e vegetais.

Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio,

podendo dividir-se em estritamente aeróbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos

filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presença de O2 e os estritamente

anaeróbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausência de O2 e os

microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de

aerobiose e anaerobiose.

As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente quimiorganotróficos,

isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação dos compostos orgânicos. As bactérias

podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em função de suas resposta a coloração de

Gram. A reprodução se dá por divisão assexuada. Os esporos são produzidos usualmente em resposta

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as condições adversas do meio, porque são mais resistentes ao calor e aos compostos tóxicos que as

células vegetativas e posteriormente germinam em condições apropriadas. As bactérias são

desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintéticos

Os fungos (bolores) também são quimiorganotróficos e os mais importantes utilizados nas

fermentações se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos

gêneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gêneros Thicotherma, Aspergillus,

Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos são desprovidos de clorofila ou outros pigmentos

fotossintéticos. Sua reprodução pode ser assexuada (esporulação) ou sexuada.

As leveduras são fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada

(por gemação ou divisão binária) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos

industriais é a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produção de álcool e nas panificações.

Esta levedura não degrada a lactose, por isso para produzir álcool e biomassa a partir de soro de leite

é utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessárias para degradar lactose. Outras

leveduras importantes são: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger

Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou RNA) contido

por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto, não sintetizam

protoplasma nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não pode ser feita por um

processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos vírus são “produzidos” pelas células

nas quais penetram, de acordo com as informações contidas no seu ácido nucléico. São agentes

submicroscópicos que infecta as plantas, animais e bactérias. Os vírus bacterianos (bacteriófagos)

infectam os processos de fermentação de cepas microbianas e causa sérios problemas,

particularmente nos cultivos “starter” utilizados no processamento de alimentos.

Células animais e células vegetais também podem ser utilizadas nos processos fermentativos

industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais. Necessitam de um

meio muito nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2

dissolvidos.

FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS

Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos são as mesmas de todos os

seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de

energia e fonte de material plástico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos:

a) os vegetais são fotossintéticos (obtém energia da luz solar) e autotróficos, se nutrem

exclusivamente de substâncias inorgânicas;

b) os animais são quimiotróficos, pois obtém energia as custas de reações químicas e heterotróficos,

por exigirem fontes orgânicas de carbono.

Entre os microrganismos há uma grande variedade de tipos intermediários.

FONTES DE ENERGIA

a) Algumas bactérias realizam fotossíntese, porém não produzem oxigênio. Podem utilizar fontes

inorgânicas (liotróficas) ou compostos orgânicos (organotróficas) como doadores de elétrons.

b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactérias são quimiossintéticas, obtendo energia as

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custas de reações químicas, nas quais substratos adequados são oxidados com desprendimento de

energia. Estes substratos podem ser inorgânicos (litotróficos) ou orgânicos (organotróficos). No

primeiro grupo encontramos apenas bactérias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de

oxidar enxofre, produzindo ácido sulfúrico, podem ser utilizados na lixiviação de metais, como

cobre e urânio. A grande maioria das bactérias e a totalidade de fungos, leveduras e, também, os

protozoários são quimiorganotróficos.

FONTES DE MATERIAL PLÁSTICO

MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE CARBONO

Para os autotróficos a única fonte de carbono necessária é o CO2. Para os heterotróficos, há

necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintéticas:

• Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), Óleos, Metanol, Etanol;

• Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais,

vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S);

• Extrato de Malte –cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminoácidos.

MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE NITROGÊNIO

Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos:

Alguns microrganismos, especialmente bactérias, retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o

converte em nitrogênio orgânico. Muitos fungos e quase totalidade das bactérias utilizam compostos

inorgânicos de nitrogênio, como amônio e nitratos. Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de

nitrogênio. De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o

crescimento da maioria dos heterotróficos.

o Sais de Amônio, Sais (nitratos); Uréia

o Líquido da maceração do milho (± 4% N);

o Extrato de levedura e Peptonas (laboratório)

o Ar atmosférico

ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS

Além de nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de

compostos inorgânicos, alguns em quantidade bem maiores que outros.

o Macronutrientes – P, S, K, Mg, Ca, Fe

o Micronutrientes – Cu, Zn, Co, B, ...

FATORES DE CRESCIMENTO

São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não

consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa

crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios,

ácidos graxos, entre outros.

Aspecto importante dessa exigência resulta do fato que, quando um microrganismo exige um

determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio.

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Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isso

permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos, baseados na medida do

crescimento microbiano. Essa é a base da dosagem microbiana de uma série de substâncias,

principalmente aminoácidos e vitaminas.

AGUA

A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos

microrganismos. Seu papel é múltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias

em solução através da membrana citoplasmática. Exerce função na regulação da pressão osmótica e

regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser

quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização)

OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO

Como a água o oxigênio não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio

nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença

de O2 livre:

Aeróbios – exigem oxigênio livre; alguns, porém, em pequenas quantidades não tolerando as

pressões normais de O2 atmosférico;

Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre;

Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2.

Entre as bactérias encontra-se os três tipos de comportamento. Os fungos (bolores) são estritamente

aeróbios, enquanto as leveduras são aeróbias ou facultativas.

CLASSIFICAÇÃO DOS MOSTOS
SINTÉTICO:
composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas
quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de

fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos

Microorganismos. Tem um alto custo.

COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como:
caldo de cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais.

CARACTERISTICAS DO MOSTO

Requerimentos básicos:

1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado;

2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto;

3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto;

4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis;

5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo

6) Não sofrer degradação durante a esterilização

7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente:

aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes.

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SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
a) Açucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescíveis (contém monossacarídeos: Ex.:

glicose, frutose, suco de uva, maçã, pêra, etc.).

Principal substrato é um monossacarídeo (glicose) e este é metabolizado diretamente até

piruvato.

As matérias-primas indiretamente fermentescíveis são aquelas que contém dissacarídeos,

predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-açúcar e melaço.

A composição do melaço de cana-de-açúcar varia em função de fatores como:

• qualidade da matéria-prima (variedade, idade, sanidade, maturação, queimada ou não, etc);

• métodos de extração do açúcar (moagem, clarificação, cozimento, etc);

• condições técnicas das regiões açucareiras;

• condições e tempo de armazenamento.

b) Amiláceas: contêm em sua composição polissacarídeos (amido) utilizada para produção de
vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificação).

PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA

a) Melaço: deve sofrer uma preparação prévia (de 82 ºBrix 18 -20 ºBrix)

CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluição do

melaço.

B

M - b = Quantidade de melaço em peso d = volume litros)

M

b

B - M = Quantidade de água em peso d = volume (litros)

B = Brix do melaço
b = Brix da água (zero)

M = Brix desejado (18 –20º)

d = densidade

Ex.: melaço: 80 ºBrix

Água; 0 ºBrix

M = 20 ºBrix

dmelaço = 1,6284

dágua = 1,0000

80

20 – 0 = 20 Kg melaço = 12,31 Litros

1,6284

20

0

80 – 20 = 60 kg de água = 60 litros

1,0000

Microbiologia industrial

Prof. Raul Vicenzi

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No tanque de diluição controla-se:

pH: entre 4,5 – 5,5

Nutrientes: Sulfato de amônio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimático}

b) Caldo de cana-de-açúcar: não necessita diluição pois a cana sofre adição de água por aspersão na

moenda para extração do açúcar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20

D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada

Brix desejado

Ex.: Brix do caldo = 20

Volume = 50.000 L

Brix desejado = 16º

D = 20 x 50.000 – 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16º Brix

16

Após fazer a diluição corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando ácido sulfúrico, cítrico ou ainda suco de

limão (caseiro) e colocam-se os nutrientes.

DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA

1) Preparo do mosto:
a) Determinação de sólidos solúveis por refratometria

- Para cada grau acima de 20 ºC subtrai-se 0,06 por grau;

- Para cada grau abaixo de 20 ºC soma-se 0,06 por grau:

Ex.: 20 ºBrix a 25ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix – 0,3 = 19,7 ºBrix

20 ºBrix a 15ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix + 0,3 = 20,3 ºBrix

Um mosto inicialmente com 76 ºBrix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST.

100 g melaço -------- 76 g SST

X g --------------------- 16 g SST

X = 21,05 g/100mL

Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de água

RELACÃO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA.

1 ºBrix corresponde a 0,54 ºBaumé

1 ºBaumé corresponde a 1,8 ºBrix

1 ºBrix corresponde a 0,85 ºBabo

BRIX = % de sólidos solúveis existentes em uma solução de sacarose quimicamente pura.

Fermentadores

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ELEMENTOS DE UM FERMENTÁDOR (BIOREATOR)

O coração de qualquer processo fermentativo é sem dúvida o fermentador. Uma definição

funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantém um

ambiente favorável para que se desenvolva um determinado processo biológico.

A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de aço inoxidável

brilhante e com uma instrumentação muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais

são assim, outros importantes processos biológicos industriais, desenvolvidos em grande escala, são

conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados.

Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto,

embora para processos cujas condições são muito sensíveis será necessário um sistema fechado e

muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorável.

MEIO AMBIENTE

As condições ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob três

aspectos diferentes: condições biológicas, químicas e físicas.

MEIO BIOLÓGICO

Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questão encontram-se

presentes, enquanto que os não produtivos, destrutivos ou não desejáveis estejam excluídos do

processo. Do ponto de vista de produção é importante também que os microrganismos desejados

estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentável.

Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema asséptico.

A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos

vivos, diz-se então esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir

o microrganismo desejado denomina-se inoculação.

MEIO QUÍMICO

Implica na composição do meio de crescimento microbiano, que deverá conter as

concentrações adequadas de substratos ou nutrientes microbiológicos, assim como dos precursores

sintéticos, livres de substâncias inibidoras e mantidas a um pH adequado.

MEIO FÍSICO

Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle é muito importante

quando se projeta um fermentador.

Este parâmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condições ao longo da

fermentação, exigem um bom sistema de agitação, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos

organismos e de seus agregados.

Quando se mantém um ambiente favorável os parâmetros ambientais não têm que

necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.

Fermentadores

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Fermentação por batelada - características:

v Diferentes fases de crescimento;
v Diferentes condições ótimas;
v Fermentação parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes;
v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apareçam de acordo com estas trocas as
sucessivas fases de crescimento

PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES

Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos:

v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos estão imersos no meio
de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes líquidos. O fermentador mais simples consiste em

um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio líquido.

Estes fermentadores forma utilizados de geração em geração com muito êxito na indústria

cervejeira já que ao formar-se na fase anaeróbica da fermentação, uma capa de espuma que contém

CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura

durante a fermentação se pode colocar tubos refrigerantes. São muito utilizados no tratamento

biológico de águas residuais em fluxo lento, onde a superfície do líquido permite que se dissolva o

O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitação do líquido que aumenta a

transferência de gases e mantém a homogeneidade. Nos sistemas anaeróbios os próprios gases da

fermentação podem proporcionar a agitação, através do desenho do fermentador (cônico/cerveja) ou

por meio mecânico (bombas de recirculação).

v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se
desenvolve sob forma de uma lâmina ou capa disposta sobre uma superfície que está em contato com

o meio nutritivo. Em laboratórios se utiliza o “cultivo em superfície” (placas). Inicialmente a

produção de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente

se utilizada o cultivo em superfície na fermentação do ácido cítrico (Aspergillus niger), que se

cultiva em uma superfície com um meio adequado contendo melaço em bandejas de pouca

profundidade, colocadas em estantes à temperatura constante e com circulação de ar freqüente.

Também e pode desenvolver películas microbianas sobre uma superfície de meio sólida adequada.

Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plástico particulado, lâminas de plástico onduladas,

através dos quais se faz passar o meio líquido sobre a capa de microbiana da superfície.

v Na prática, porém, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso também aparece uma capa sobre
a superfície do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos

dispersos no meio de cultivo.

Fermentadores

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Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de
recuperação do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo:

Esterilizador

Refrigeração

Com ou sem ruptura celular

Formulação

Armazena,mento de
Matérias-primas

Inóculo
Volume: 1 a 2 litros

Preparação de
Meios

Fermentador
de produção

Tanque de
Semeadura
(pé-de-cuba)

Separação de
células

Etapas de
Recuperação do
Produto

Envasamento e
Armazenamento

PRODUTO

Tratamento de
Efluentes

Utilização de
Subprodutos

- água
- ar
- vapor

Água do
Processo

Ar Estéril

Vapor

Energia

Inóculo
Preparado
1:10

Esterilização na indústria fermentativa

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