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Microscopia básica2

Microscopia básica2

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Apostila de revisão de microscopia da Universidade Federal de Lavras, autoria dos Drs. Edilene Marchi e Daniel de Melo e Castro
Apostila de revisão de microscopia da Universidade Federal de Lavras, autoria dos Drs. Edilene Marchi e Daniel de Melo e Castro

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
DEPARTAMENTO DE AGRICULTURA






REVISÃO DE MICROSCOPIA


















Com a ajuda do microscópio não há nada tão pequeno que possa escapar às
nossas investigações; portanto há um novo e visível mundo descoberto a ser
entendido. Robert Hookie (Micrographia, 1664).






Edilene C.S. Marchi
Prof. Daniel Melo de Castro
Disciplina DBI Anatomia vegetal




2005
Tipos de microscopia

Histórico
Desde a antiguidade povos como os egípcios, gregos e romanos
conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas
primitivas como objetos decorativos. No entanto, somente em meados do século
XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construção da
fabricação de lentes corretivas. Os primeiros estudos científicos datam do século
XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenômenos óticos e a
formação de imagens no olho.
Atanásio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra
microscopium nome dado ao microscópio daquela época (Gato, 2005).
Muitos atribuem a invenção do microscópio a Galileu, porém foi Antonie
van Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeiçoou o instrumento e o
utilizou na observação de seres vivos. Seu microscópio era dotado de apenas
uma lente de vidro, permitindo um aumento de até 300 vezes. Com este
instrumento Leeuwenhoek estudou os glóbulos vermelhos do sangue e constatou
a existência dos espermatozóides (Embrapa, 2005).
Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado “Micrographia”
onde descreveu o microscópio e como ele havia descoberto a circulação do
sangue nos peixes. Em seu microscópio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino
e acrescentou mais uma lente (Embrapa, 2005).
Após o aprimoramento, os microscópios ficarão constituídos por 2
sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliações de
imagem que vão em geral de 100 a 1000 vezes (Embrapa, 2005).
Em 1932, surgiu o microscópio eletrônico permitindo aumentos de 5 mil
a 500 mil vezes. A diferença básica entre os microscópios ótico e eletrônico é
que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons. No
microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes
eletromagnéticas. Estas lentes ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe
de elétrons no material e a projetam em uma tela onde é formada uma imagem
de pontos mais ou menos brilhantes. No entanto, é impossível observar material
vivo neste tipo de microscópio. O material a ser estudado passa por um
complexo processo de desidratação, fixação e inclusão em resinas especiais,
muito duras, que permitem cortes ultrafinos por meio das navalhas de vidro de
ultramicrótomo (Embrapa, 2005).
Na história da microscopia, 200 anos foram necessários para que o
microscópio deixasse de se ser um instrumento exótico e pouco acessível para
ser usado em uma escala mais ampla. Então, a partir do séc. XIX, graças aos
estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de célula
como verdade científica, surgindo a ciência da biologia celular (Melo, 2002).

Unidades de medida utilizada em microscopia
Em geral, podem-se dividir as unidades de estruturas biológicas em
macroscópicas e microscópicas, sendo essa última invisível a olho humano nu.
As unidades de medida em microscopia compreende o micrômetro (m), em
microscopia ótica e (m) e o angstrom (), na microscopia eletrônica.

As unidades de medida geralmente usadas em microscopia são as seguintes:
Unidade de medida Símbolo Valor
Micrômetro m 0,001 mm (milésima parte do milímetro)
Nanômetro nm 0,001m (milésima parte do micrômetro)
Angstrom 0,0000001 mm (10
-7
mm)

O aumento total do objeto observado é calculado multiplicando-se os valores do
aumento da objetiva e da ocular.
Ocular Objetiva Aumento Diâmetro do Campo
10 x 10x (pequeno aumento 100x 1.500m
10 x 40x (grande aumento a seco) 400x 375m
10 x 100x (imersão em óleo) 1.000x 150m


Microscopia de luz
Microscópios são aparelhos nos quais lentes de vidro são associadas de
tal forma que se consiga reproduzir para o olho humano, uma imagem
aumentada e detalhada de objetos, células, tecidos e órgãos, que à vista
desarmada não seria possível de se observar mais detalhes (Taboga, 2001).
O microscópio de luz é assim chamado devido sua fonte luminosa que é
uma luz branca oriunda de um filamento de tungstênio (Melo, 2002). O conjunto
de lentes é formado pelas objetivas e oculares. A objetiva, a primeira lente e a
que está mais próxima do objeto, capta a luz filtrada pelo condensador e projeta
uma imagem real, invertida e aumentada da estrutura. A lente ocular, presta-se a
aumentar a imagem projetada pela objetiva, para ser captada pelo olho do
observador (Parreira, 2005) (Figura 1).


Figura 1. Esquema da formação da imagem num microscópio óptico. AB –
objeto iluminado e colocado sobre a platina; A’B’ – imagem real e invertida,
formada ao nível do foco da ocular; A’’B’’ – imagem captada na retina do
observador (na realidade forma-se uma imagem virtual no infinito); F – foco da
objetiva; fobj – distância focal da objetiva; foc –distância focal da ocular.
(Adaptado de Mello e Vidal, 1980 citado por Parreira, 2005).

Adicionalmente, o microscópio apresenta uma base mecânica (base,
braço, revólver, platina, charriot, parafusos macro e micrométrico e parafuso de
regulagem do condensador) e um sistema de iluminação (fonte luminosa,
diafragmas, condensador e filtros) (Figura 2). O pé ou Base – suporta o
microscópio, assegurando a sua estabilidade; braço ou Coluna – peça fixa à base,
na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio; Tubo
ou Canhão – cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na
extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas; Platina –
peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a
preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que
possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador;
Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o tubo e permite a sua
deslocação a da platina, indispensável para fazer a focagem; Parafuso
Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito
reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do
microscópio; Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta
duas a quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar
rápida e comodamente de objetiva (Reis, 2003).


Figura 2. Partes constituintes do microscópio de luz, em que (A) compõem o
sistema ótico e (B) o sistema mecânico (Reis, 2003).

No microscópio ótico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a
imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser
observado não pode ser opaco. Muitas vezes, para se obter material biológico
translúcido o suficiente para ser bem observado ao microscópio, é preciso
preparar convenientemente o material que quer estudar. Para isto são feitos
cortes muitos finos, de preferência com uma máquina, chamada micrótomo. O
material a ser cortado recebe um tratamento de desidratação e inclusão em
parafina que facilita o manuseio e permite que sejam cortadas fatias muito finas
(Embrapa, 2005).
Na microscopia de luz existem vários tipos de aparelhos, os quais
apresentam sistemas de lentes e filtros que selecionam um ou outro tipo de luz,
diversificando as imagens formadas. Estes aparelhos são chamados microscópios
especiais e são chamados: microscópio de campo claro, campo escuro,
fluorescência, invertido, confocal (microscopia de varredura confocal) e de
polarização.

a. Microscopia de campo claro
O microscópio de campo claro é o mais comum microscópio de luz
(Melo, 2002). Nesse microscópio, o campo de visão aparece iluminado e os
objetos que estão sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).
Segundo Weiss et al. (1991), a microscopia de campo claro apresenta
algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores
concentrações de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas
concentrações de cromóforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser
grandemente aumentados; observações feitas no comprimento de onda de
máxima absorção aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas
limitações como objetos de fase exibem mínimo contraste em foco e mostra
contraste oposto por cima e abaixo do foco.

b. Microscopia de campo escuro
Microscópio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como
plâncton, bactérias e cristais (Melo, 2002). As imagens obtidas no campo escuro
apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vídeo
(Weiss et al., 1991).
Baseia-se no princípio de que a luz é dispersa pela superfície dos
materiais que possuem diferentes índices de refração. A luz dispersada entra na
objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal
consegue-se pela utilização de um tipo especial de condensador que ilumina o
objeto obliquamente (Reis, 2003). A luz atinge o espécime a ser analisado e
somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto é,
objetivas e oculares, formando a imagem (Taboga, 2001) (Figura 3).



Figure 3. Esquema da configuração do
microscópio de campo escuro
(Davidson e Abramowitz, 2005).
É um tipo de microscopia utilizada na observação de microorganismos
não corados, suspensos em líquidos, preparações a fresco e em gota pendente
(Reis, 2003), plânctons, bactérias, grãos de pólen (Taboga, 2001).

c. Microscopia de contraste de fase
Esse tipo de microscopia foi desenvolvida pelo holandês Zerniké, na
década de 50, baseada nos princípios de difração da luz, isto é, o caminho do
feixe luminoso, na formação da imagem por esse tipo de microscópio, sofre um
retardo óptico, permitindo assim que se possa observar materiais biológicos sem
a coloração (Taboga, 2001). Portanto, o microscópio de contraste de fase dispõe
de certos recursos específicos para estudar células vivas e não coradas (Melo,
2002), particularmente útil para o estudo da mitose em células cultivadas in vitro
(Reis, 2003), e exames rápidos de culturas de células, sangue, bactérias, algas,
protozoários de ambientes aquáticos, conteúdo estomacal de animais, análise de
materiais cerâmicos, têxteis e minerais (Taboga, 2001). Então, grande parte dos
detalhes de células vivas não são detectados no microscópio de campo luminoso
devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, não
apresentando contraste suficiente. Contudo, o microscópio de contraste de fase
tem um sistema óptico especial que torna possível a distinção de materiais
biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus índices de
refração. A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente
diferentes é refratada ou desviada do seu trajeto original. Variações mínimas de
fase, devidas às diferenças de índice de refração dentro do objeto, são ampliadas
e transformadas em mudanças de amplitude (intensidade) as quais são
visualizadas como diferenças de contraste na imagem (Reis, 2003) (Figura 4).

Figura 4. Aspecto de células vivas observadas com microscópio óptico de
campo luminoso (a) e microscópio óptico de contraste de fase (b) (Reis, 2003).

O microscópio de contraste de fase apresenta sistemas de anéis metálicos
postos no caminho da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. Uma
singular particularidade é que as objetivas de fase apresentam a designação “Ph”,
oriunda da palavras phase, diferenciando-a das demais. Esses anéis, após
centralizados, promovem o retardo óptico, permitindo assim a visualização do
espécime sem coloração (Taboga, 2001) (Figura 5).



Figure 5. Esquema da configuração do
microscópio de contraste de fase (Davidson
e Abramowitz, 2005).



d. Microscopia de contraste interferencial
A microscopia interferencial mais conhecida é a chamada de
microscopia de Normarski. A geração do contraste a uma alta abertura de
trabalho é limitada em uma profundidade de campo raso, resultando na
habilidade de tornar a seção com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura
(Weiss et al. et al., 1991). Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a
defasagem dos comprimentos de ondas. Assim, a defasagem gera uma
deformação na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a
superfície do material analisado. A aplicação dessa microscopia permite a
observação de materiais biológicos sem coloração, sendo útil no monitoramento
de culturas celulares, estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e
ácaros e outros ectoparasitos (Taboga, 2001).
Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas ópticos posicionados na
passagem da luz. Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastarão
com o meio em que se encontra o material a ser observado. Esse microscópio
requer uma construção específica, apesar de não utilizar lentes objetivas
especiais, ele necessita de um revólver com ranhuras para alojar os prismas de
interferência, então as cores de interferência promoverão a visualização da
imagem (Taboga, 2001) (Figura 6).




Figure 6. Esquema da configuração do
microscópio de contraste de fase
interferencial (Davidson e
Abramowitz, 2005).



e. Microscopia de fluorescência
A microscopia de fluorescência é, provavelmente, a mais versátil e
poderosa técnica para localizar proteínas dentro da célula pela microscopia de
luz (Lodish et al., 2003).
Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias para, após serem
excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, emitirem radiação de
maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da
radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível.
Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos
luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com os recursos desta
técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a
anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de
fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e patológica (Taboga,
2001).
O mais fluorescente corante é chamado de fluorocromo, capaz de emitir
luz visível (Lodish et al., 2003). Dois exemplos de fluorocromo é o corante
alaranjado de acridina que se liga aos ácidos nucléicos conferindo uma
fluorescência amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina,
que apesar de não ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a
fluorescência natural da elastina (Taboga, 2001). Os fluorocromos, quando
conjugados com anticorpos, torna possível a identificação de células individuais
que reagem com o anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência) (Reis,
2003). Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-
as fluorescentes, tornando-as passíveis de identificação e localização, como
proteínas ou estruturas celulares (Melo, 2002).
O microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico que interage
pouco com a luz. Utiliza-se uma luz de mercúrio de alta pressão, cujos picos
variam entre 312 e 579 nm. Nessa microscopia também há filtros especiais
chamados de filtros de excitação e filtros de barragem (Taboga, 2001). Os filtros
de excitação localizam-se logo após a saída de luz antes do condensador,
selecionando o comprimento de onda desejado. Já, os filtros de barragem
localizam-se entre a objetiva e a ocular, após o objeto, deixando passar somente
a luz fluorescente, então o material fluoresce contra um fundo escuro (Taboga,
2001) (Figura 7).




Figure 7. Esquema da configuração
do microscópio de fluorescência
(Davidson e Abramowitz, 2005).



Na microscopia de fluorescência pode-se detectar compostos
naturalmente fluorescentes, como a clorofila, lignina de paredes celulares,
elastina e colágeno (Taboga, 2001).

f. Microscopia de varredura confocal
A microscopia de varredura confocal representa um dos mais importantes
avanços da microscopia de luz já desenvolvida, principalmente, porque é uma
técnica capaz de visualizar em profundidade células e tecidos vivos e fixados
(Fellers e Davidson, 2005). O espécime é escaneado com uma série de muitos
estreitos campos de visão, as imagens destes campos são recuperadas
individualmente, e depois de estocadas, a imagem completa é construída como
um mosaico de partes combinadas (Lacey, 1991).
O microscópio de varredura confocal é indicado para estudos de
materiais espessos, sem coloração prévia, vivos ou pré-fixados. Essa
microscopia permite o detalhamento de estruturas subcelulares que não
apresentam limite de resolução compatível ao da microscopia de luz fluorescente
convencional, como microtúbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e
elementos finos da matrix celular (Taboga, 2001). Nesse microscópio, a imagem
pode ser obtida de planos focais específicos ou cortes ópticos. Os cortes ópticos
são transferidos para um computador e são reconstruídos tridimensionalmente de
forma a obter uma imagem no total. Logo, os microscópios tradicionais
trabalham com imagem analógica, e os confocal a laser trabalham com imagens
digitais (Taboga, 2001).
O microscópio de varredura confocal utiliza como fonte de luz o laser,
sendo seu funcionamento complexo. Seu sistema óptico é o mesmo da de
fluorescência tradicional, com exceção de que a iluminação se dá somente em
pequenos pontos iluminados pelo laser. Acima da objetiva existe um orifício
chamado pinhole ou íris que elimina a luz proveniente de objetos que estejam
fora do plano focal (Figura 8) (Albert et al., 1994).

Figura 8. Esquema geral de um microscópio de varredura confocal, mostrando
as principais partes constituintes (Fellers e Davidson, 2005).

Graças à sensibilidade dos detectores fotoelétricos e o controle eletrônico
da intensidade dos sinais, imagens pouco evidentes na microscopia de
fluorescência são observadas com mais nitidez na microscopia confocal
(Taboga, 2001) (Figura 9).

Figura 9. Comparação de imagens obtidas do microscópio de fluorescência (a, b
e c) e do confocal de varredura (d, e, f) (Fellers e Davidson, 2005).

Na letra a e d, tem-se uma espessa seção de tecido de medula humana.
Nota-se um significante grau de detalhe estrutural nas imagens obtidas com a
microscopia confocal de varredura. Na letra b e c, tem-se fibras musculares de
ratos. Na imagem obtida pela microscopia confocal percebe-se uma topografia
estriada não visível na imagem b (microscopia de fluorescência). Nas letras c e
d, tem-se grão de pólen de girassol. Existe uma dramática diferença entre as
imagens obtidas pelas duas técnicas, a microscopia confocal revela diferença de
cor e um envelope envoltório (Fellers e Davidson, 2005).

g. Microscopia de polarização
Esse microscópio apresenta dois prismas, ou filtros, chamados de
polarizador e analisador. Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o
condensador (filtro polarizador) e entre a objetiva e a ocular (filtro analisador)
(Figura 10). Os filtros polarizadores promovem a seleção de apenas um plano de
direção de vibração de ondas luminosas, conhecido por plano da luz polarizada
(PPL). Sob o efeito do PPL, os componentes macromoleculares birrefringentes
(anisotrópicos) apresentam brilho colorido ou não, promovendo um realce destes
materiais em detrimento a outros não birrefringentes (isotrópicos), que se
distinguem em fundo escuro (Taboga, 2001).



Figure 10. Esquema da configuração
do microscópio de luz polarizada
(Davidson e Abramowitz, 2005).

Os materiais biológicos mais estudados na microscopia de polarização
citam-se células musculares estriadas, espermatozóides, paredes celulares,
amido, colágenos e DNA (Taboga, 2001). Em estudos com o colágeno, pode-se
aumentar sua birrefringência utilizando-se de corantes como, Xylidine Ponceaus
ou Picrossírus. Um outro corante, que se presta a estudos anisotrópicos, é o azul
de toluidina, permitindo estudos de ordem e agregação molecular da cromatina,
da matrix extracelular e outros componentes (Taboga, 2001).

Microscopia eletrônica
A construção do microscópio eletrônico foi de suma importância para a
observação de organelas e estruturas celulares que até então eram desconhecidas,
pois se encontravam abaixo do limite de resolução do microscópio ótico (Melo,
2002).
Como foi mencionado anteriormente, o poder de resolução do
microscópio óptico está limitado pela abertura numérica e pelo comprimento de
onda da radiação. Não sendo possível aumentar a abertura numérica, a solução
passou pela utilização de radiação de menor comprimento de onda () (Reis,
2003).
Em 40 anos a microscopia eletrônica foi inventada, sendo que 2
princípios básicos, propostos no início do século XX, foram primordiais para a
construção do microscópio eletrônico (Melo, 2002). O primeiro, estabelecido,
em 1924, por Louis de Broglie, um físico francês, demonstrou que os elétrons
têm propriedades ondulatórias, à semelhança da luz visível, ultravioleta e raios x.
O comprimento de onda de um elétron em movimento depende da sua
velocidade e esta da energia de aceleração que lhe é imposta (Reis, 2003). O
segundo foi do inglês Bush, que em 1926, demonstrou que um campo
magnético, adequadamente estruturado, poderia ser usado como lentes de
aumento para um feixe de elétrons (Melo, 2002). Então, o comprimento de onda
de um elétron é dado por:


Nesta fórmula representa o comprimento de onda, h é a constante de Planck
(6,62559 x 10
-34
J.s
-1
), m é a massa da partícula e v a velocidade da partícula.
Os elétrons podem ser acelerados por uma diferença de potencial, sendo
a velocidade diretamente proporcional a essa diferença de potencial (tabela 1).

Tabela 1. Comprimento de onda de um elétron em função da diferença de
potencial aplicada.
Diferença de potencial (V) - Comprimento de onda (m)
150 0,1
50000 0,0053
100000 0,0038
1000000 0,00087

Para efeitos de cálculo, valores aproximados para o comprimento de onda dos
elétrons podem ser obtidos pela seguinte fórmula:

onde V é a diferença de potencial em volts.
Os elétrons acelerados por diferença de potencial de 50 000 a 100 000
volts têm um comprimento de onda cerca de 100 000 vezes menor que o da luz
visível. Graças ao reduzido valor de é possível aumentar o poder de resolução.
O limite de resolução do microscópio eletrônico de transmissão atinge 0,4 a 0,5
m (excepcionalmente 0,2 m) o que representa, relativamente ao microscópio
óptico, um poder resolvente cerca de 500 vezes maior. Em objetos biológicos o
limite de resolução situa-se perto de 1 m (10 Å) (Reis, 2003).
O primeiro microscópio foi construído em 1932, na Alemanha, na
Universidade Técnica de Berlim, por Max Knoll e Ernst Ruska (Melo, 2002).
Outros nomes como Porter, Claude e Fullam introduziram, em 1945, técnicas de
microscopia utilizando tetróxido de ósmio para observar células; Pearse e Baker,
em 1950, forma os pioneiros na observação de cortes de material biológico com
espessura muito pequena, chamados de cortes ultrafinos, com cerca de 0,1 a 0,2
nm de espessura e Palade Porter, Sjostrand e Blum que promoveram avanços nos
processo de fixação e microtomia (Melo, 2002).
As lentes do microscópio eletrônico são de natureza eletromagnética,
sendo constituídas por uma bobina, formada por milhares de voltas de fio,
através da qual passa uma corrente elétrica. Enquanto que no microscópio óptico
a focagem da objetiva faz-se pelo deslocamento mecânico da lente ou do objeto,
no microscópio eletrônico a focagem é feita por variação da corrente que passa
na bobina, a qual afeta a distância focal da objetiva. A variação da ampliação é
feita por variação da distância focal das lentes intermédias (Reis, 2003).
Existem vários tipos de microscópios eletrônicos, que variam de acordo
com suas especificidades: o de transmissão (MET), o de varredura (MEV), o de
alta voltagem e de tunelamento quântico e de força atômica.

a. Microscopia eletrônica de transmissão

No microscópio eletrônico de transmissão, forma-se uma imagem
bidimensional do interior desta sobre uma tela, pela passagem de um o feixe de
elétrons através de cortes extremamente finos da amostra. A imagem é formada
diretamente a partir da impressão do feixe de elétrons na tela de observação,
após a passagem pela amostra (Melo, 2002). Os elétrons quando são emitidos
são absorvidos pelos átomos de ar, então, um tubo inteiro, entre a fonte de
elétrons e o detector, é mantido sob um grande vácuo (Lodish et al., 2003). O
pequeno comprimento de onda de elétrons significa que o limite de resolução do
microscópio de transmissão é de 0,0002 m, sendo maior do que o de varredura
(Melo, 2002).
A parte essencial do microscópio eletrônico de transmissão é uma coluna
vertical a qual é percorrida por um feixe de elétrons (Figura 11). Na parte
superior da coluna existe uma fonte de elétrons, o canhão eletrônico. No canhão
eletrônico existe um gerador de elétrons que é freqüentemente um filamento de
tungstênio. A voltagem aplicada entre o filamento e o ânodo situa-se entre 40
000 e 100 000 V e provoca a aceleração dos elétrons (Figura 12) (Reis, 2003).

Figura 11. Aspecto exterior de um microscópio eletrônico de transmissão (JEOL
mod. JEM1230).



Figura 12. Esquema do canhão eletrônico.

Para além do canhão eletrônico, a coluna é constituída por uma ou mais
lentes condensadoras, uma lente objetiva, uma ou mais lentes intermediárias
(sem correspondente no microscópio óptico e que servem para variação da
ampliação), uma lente projetora, um porta-objetos em platina móvel que é
controlado do exterior, um écran (por vezes dois) e uma câmara fotográfica
(Figura 13) (Reis, 2003). As imagens ampliadas pelas lentes projetoras são
lançadas para um anteparo fluorescente, uma chapa fotográfica ou um monitor
de TV (Taboga, 2001).


Figura 13. Aspecto da coluna do microscópio eletrônico de transmissão (TEM);
A -Secção da coluna (Philips, EM 200); B – Aspecto exterior (Leo, Libra 120)
(citado por Reis, 2003).

A imagem final obtida pode ser interpretada como eletrodensa, ou escura,
quando os elétrons encontram elementos como o ferro, ósmio, chumbo ou ouro e
eletrolúcida ou clara, quando os elétrons encontram-se com hidrogênio, carbono,
nitrogênio ou oxigênio. Os materiais vegetais na maioria das vezes se
comportam como materiais eletrolúcidos implicando na necessidade de contraste
com metais pesados para se conseguir uma boa imagem (Taboga, 2001).



b. Microscopia eletrônica de varredura
O microscópio eletrônico de varredura revela imagens topográficas da
superfície com grande riqueza de detalhes (Taboga, 2001). Este aparelho forma
uma imagem tridimensional da superfície de amostras não seccionadas e a
imagem é visualizada em um monitor acoplado ao microscópio, nesse caso, os
elétrons “varrem” apenas a superfície externa do material biológico (Melo, 2002)
(Figura 14 e 15). Então, esse microscópio permite somente uma observação da
superfície da amostra. A imagem é formada a partir de elétrons secundários que
partem da amostra quando a mesma é atingida pelo feixe de elétrons. Os elétrons
secundários são captados e, após passagem por um amplificador, são
transformados em imagem visível em um monitor. As fotografias são obtidas
indiretamente, a partir da imagem gerada no monitor. O limite de resolução
nesse microscópio é de 0,02 m sendo menor do que o de transmissão (Melo,
2002).




Figura 14. Aspecto tridimensional de
uma diatomácea observada com
microscópio eletrônico de varredura
(ampliação 5000x) (Reis, 2003).


Figura 15. Aspecto do microscópio
eletrônico de varredura.

A microscopia eletrônica de varredura pode fornecer imagens
tridimensionais de objetos relativamente grandes, como vermes e insetos, quanto
de células livres, como tecidos animais e vegetais, embriões, fragmentos
geológicos em análises de granulometria e textura de solos (Taboga, 2001). No
entanto, o pré-tratamento das amostras é essencial para se conseguir uma boa
observação da superfície podendo causar algumas alterações físicas. Por
exemplo, na observação de bactérias e outros organismos vivos, o vácuo obtido
da coluna de elétrons pode provocar alterações morfológicas (Englert et al.,
2001).

c. Microscopia eletrônica de alta voltagem
É a microscopia eletrônica que acelera seus elétrons entre 500 e 1000
KV, então, seus microscópios são conhecidos como de alta voltagem ou de alta
aceleração. Seu funcionamento e estrutura são semelhantes ao do microscópio
eletrônico convencional, porém, são aparelhos extremamente grandes, chegando
a ocupar edifícios de 3 andares (Taboga, 2001).
A utilização desse microscópio revolucionou a biologia estrutural
permitindo que pudesse, por exemplo, observar a organização tridimensional dos
componentes do citoesqueleto (Taboga, 2001).

d. Microscopia eletrônica de tunelamento quântico
A microscopia eletrônica de tunelamento quântico tem a capacidade de
ampliar a potência visual do olho humano cerca de 1 milhão de vezes.
Desenvolvida nos anos 80, essa técnica aumenta em 100 vezes a capacidade dos
microscópios eletrônicos (Taboga, 2001).
O microscópio eletrônico de tunelamento quântico resultou dos esforços
de dois cientistas suíços, Benning e Rohrer, prêmio Nobel de física, em 1986.
Seu princípio pressupõe que todos os corpos apresentam características
ondulatórias emitem energia. O aparelho possui uma agulha que dista da amostra
em 1 (10
-6
mm). Pelo caminhamento da agulha na superfície da amostra se
forma uma corrente energética chamada de tunelamento. Os elétrons do material
são atraídos para a agulha formando um túnel. Então, quando a agulha passa
sobre um átomo, a corrente aumenta e quando ela percorre sobre os espaços
entre os átomos ela diminui. Os sinais de aumento e diminuição são transmitidos
para a tela de um computador formando imagens semelhantes a vales e
montanhas (Taboga, 2001).



e. Microscopia eletrônica de força atômica
A invenção do microscópio de força atômica contribuiu
significativamente para a nanotecnologia e recebeu o prêmio Nobel em 1986. O
microscópio de força atômica assemelha-se ao de tunelamento quântico, porém
apresenta um microespelho e um feixe de laser sobre a agulha (Taboga, 2001).
O princípio de funcionamento de um microscópio de força atômica é
baseado na reflexão da luz de um feixe de laser por um espelho. Após a reflexão,
a luz do laser passa por uma lente e incide sobre um fotodetector (Figura 16).


Figura 16. Esquema do princípio de funcionamento do microscópio de forca
atômica (http://www.fis.puc-rio.br).

A incidência do feixe de laser no fotodetector provoca o aparecimento de
uma diferença de potencial (ddp) em suas extremidades. Esta ddp depende da
área iluminada pelo feixe de laser que por sua vez depende da altura da ponta de
prova. A posição da ponta de prova varia conforme o relevo da superfície em
estudo e com isso a ddp gerada pelo fotodetector traduz os deslocamentos da
ponta durante a varredura. Estes deslocamentos são medidos com a amplificação
da ddp gerada no fotodetector. O fotodetector funciona como uma bateria
variável (dependendo da incidência de luz) e seu sinal serve de entrada para o
amplificador operacional cujo ganho, A, é definido pelas resistências R
1
e R
2
. A
saída do amplificador operacional é conectada a um computador ou a um
registrador gráfico (plotter) para a coleta de dados (http://www.fis.puc-rio.br).
Isto permite uma menor agressividade sobre a amostra e a detecção de
superfícies, por exemplo, de uma bactéria viva, em que as informações são
transmitidas para a tela do computador, incluindo movimentos e forma. Nesse
aparelho também é possível avaliar a estrutura atômica de biomoléculas
(Taboga, 2001).
Nessa microscopia, as amostras podem ser observadas sem qualquer
tratamento superficial, sendo capaz de obter informações complementares em
situações reais sem interferência ou artefatos (Englert et al., 2001).
As técnicas de microscopia eletrônica de varredura e a de força atômica,
em trabalhos conduzidos por Englert et al., (2001), foram ferramentas
complementares na observação de diferenças morfológicas em bactérias com e
sem bio-filme.

Fotomicrografia
O uso da fotografia para capturar imagens advindas de um microscópio
data da invenção do processo de fotografia. As primeiras fotografias foram
memoráveis devido à qualidade que apresentavam, mas a técnica era muito
trabalhosa e sobrecarregava com longas exposições e era considerado um
processo difícil. O primeiro meio para fotomicrografia foi o filme que até a
década passada era o principal, porém com os avanços da câmera eletrônica e a
tecnologia computacional a imagem digital tornou-se mais barata e mais fácil
para o uso do que a fotografia convencional (Abramowitz, 2005).
A qualidade da fotomicrografia seja digital ou gravada em filme, depende
da qualidade do microscópio. O filme é um severo juiz de quão bom o
microscópio tem sido priorizado para capturar a imagem. É essencial que se
tenha um microscópio bem configurado usando Köhler iluminação e que o
campo e o diafragma condensador estejam ajustados corretamente e que a altura
do condensador esteja otimizada. Então, propriamente ajustado, o microscópio
mostrará imagens do campo todo de visão com boa iluminação e fornecerá o
melhor contraste e resolução (Abramowitz, 2005) (Figura 17).



Figura 17. Exemplo de um microscópio capaz de
observar e fotografar simultaneamente as imagens
através do microscópio com sistema de fotomicrografia
incorporado (microscópio biológico trinocular QUIMIS
Q-106F).
(http://www.oticacientifica.com.br/q_106f.htm)




Fotomicrografia por meio do uso de filmes
Filmes fotográficos utilizados em fotomicrografia são revestidos com
uma emulsão sensível a luz de sais de prata e ou corantes (tintas). Quando a luz é
incidida para expor a emulsão, centros ativos combinam para formar uma
imagem latente que deve ser desenvolvida pelo uso de químicos fotográficos, em
ambiente escuro.
O filme é dividido em categorias dependendo se é branco e preto ou
colorido. Os filmes fotográficos são divididos em transparências de campo
positivo (as cores são aquelas da imagem que esta sendo observada) e cores
negativas (cores complementares à da imagem que esta sendo observada).
Filmes positivos apresentam sufixo chrome e negativos color. Os filmes,
geralmente, vem acompanhados de informações como ISO, e se o filme é para
dia com luz (Daylight) ou um para interiores com menor iluminação. A
temperatura de lâmpadas de tungstênio encontradas nos microscópios estão entre
2900 e 3200 K dependendo da voltagem aplicada no filamento da lâmpada. Os
fabricantes de filmes oferecem filmes balanceados para esta iluminação e
usualmente indicam se o filme é indicado para interiores ou uso científico.
Filmes balanceados para dias com luz (Daylight) é o mais comum filme
disponível e pode também ser usado no microscópio desde que seja adicionado
um filtro conversor de luz apropriado para a rota da luz. Filmes polaroides são
usados na fotomicrografia, e são encontrados em três tamanhos 35 mm
Polachrome (colorido ou transparente), pacotes Polapan (preto e branco) em 3
1/4 x 4 ¼ e filmes 4 x 5 individuais.

Fotomicrografia digital
O principal mecanismo de gravar as imagens vistas através do
microscópio, por muito anos, foi a produção de fotomicrografia por meio do uso
de filmes, porém na última década, os cientistas têm começado a capturar as
imagens por meio de câmeras eletrônicas (Abramowitz, 2005).
As câmeras digitais operam capturando a imagem projetada diretamente
em um chip de computador sem o uso de filmes. Nestes últimos anos, o número
de pixels de informações capazes de serem capturados e estocados pela melhor
câmera digital é próximo, mas ainda pequeno, comparando com a resolução do
filme tradicional (Davidson e Abramowitz, 2005).
A seleção da câmera digital deve ser realizada com muito cuidado,
incluindo exame de espécimes fixados ou vivos, necessidade de imagens em
escala de cinza ou cor verdadeira, sensibilidade a baixo nível de luz como
fluorescência, resolução, velocidade de aquisição de imagem, uso em
investigações qualitativas e quantitativas, taxa de alimentação de vídeo para o
computador ou VCR. Em geral, dois tipos de câmeras estão disponíveis para uso
na microscopia são as câmeras tubo (famíliaVidicon ) ou CCD (dispositivo
duplo de mudança) (Davidson e Abramowitz, 2005).
Um critério para seleção de uma câmera eletrônica para microscopia
inclui sensibilidade da câmera, eficiência quântica, resposta espectral,
capacidade de alcance dinâmico, velocidade de aquisição de imagem e leitura
externa, resposta, velocidade de resposta em relação a mudanças na intensidade
da luz, acerácea geométrica e adaptabilidade de leitura ao microscópio. Um
importante critério para a mais nova câmera digital CCD é a resolução, sendo a
preferida para pesquisa (Davidson e Abramowitz, 2005).
O alcance dos chips disponíveis está entre 64 x 64 pixels até 2048 x 2048
e acima quando se trata de condições bem especificas. Sua grande capacidade de
resolução de imagem a torna a câmera digital uma poderosa rival para as
câmeras de filme (Davidson e Abramowitz, 2005).

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