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[Livro] Biologia do Desenvolvimento - Scott Gilbert - 5ª ed

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Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Biologia do Desenvolvimento

QUINTA EDIÇÃO

Scott F. Gilbert
Swarthmore College

Tradução e Revisão
Adolfo Max Rothschild Zuleika Rothschild Francisco A. de Moura Duarte Maria Helena Corrêa Marques

A capa
FOTOGRAFIA DA CAPA: O mRNA para o Fator 8 de Crescimento

Fibroblástico pode ser detectado pela hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado quimicamente que é complementar a essa mensagem. No embrião de pinto de 3 dias, a mensagem do Fgf8 é encontrada no ectoderma mais distal dos brotos dos membros, no limite entre o cérebro posterior e o cérebro intermediário, nos somitos, nos arcos branquiais do pescoço e na cauda em desenvolvimento. O FGF8 é importante para diversos processos desenvolvimentais e desempenha papéis críticos no crescimento dos membros e na padronização do desenvolvimento do cérebro. Capítulos 3, 7 e 18. (Fotografia cortesia de E. Laufer, C.-Y. Yeo e C. Tabin.)
FOTOGRAFIA DA CONTRACAPA: Fotografia de um embrião de pinto
Do original: Developmental biology, Fifth Edition Copyrigth ® 1997 by Sinauer Associates, Inc. Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do livro, SP, Brasil) _____________________________________ Gilbert, Scott F., 1949Biologia do desenvolvimento / Scott F. Gilbert. -5. ed. -- Ribeirão Preto, SP : FUNPEC Editora, 2003. Título original : Developmental biology Vários tradutores e revisores. Bibliografia. ISBN 85-87528-61-0 1. Biologia do desenvolvimento I. Título. 03-4459 CDD-571.8 _____________________________________ Índices para catálogo sitemático: 1. Bilogia do Desenvolvimento: Ciências da vida 571.8 Direitos para a língua portuguesa cedidos pela Sinauer Associates, Inc. para a Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto que se reserva a propriedade desta tradução. Proibida a reprodução dos textos originais, mesmo parcial e por qualquer processo, sem autorização da editora.

de 20-21 dias nos estágios de “pipping” (bicando a casca internamente) e pré-eclosão. Note o revestimento peridérmico proeminente na extremidade do bico (dente do ovo), usado pelo pinto para fazer buracos na casca do ovo, a qual se tornou mais fina e mais quebradiça, como uma conseqüência da utilização de minerais pelo embrião para seu crescimento esquelético. Esse estágio desenvolvimental marca a transição do embrião em um pinto que respira ar. Capítulos 1 e 5. (Fotografia do International Poultry Journal, cortesia de R. Tuan.)

As páginas de título
PÁGINA ESQUERDA: A expressão gênica gera limites nos discos imagi-

nais da Drosophila. Os discos grandes e pequenos dentro da larva da mosca formam as asas e os halteres, respectivamente, no adulto. Nesse estágio, a proteína Apterous (vermelho) é expressa somente nos compartimentos dorsais; a proteína Cubitus interruptus (azul) marca os compartimentos anteriores (mas não os posteriores) (uma linha formando esse limite pode ser observada). A coloração verde (originária da proteína Vestigial) no interior demarca o limite entre o membro livre e a articulação ligando-o à parede torácica. Capítulo 19. (Fotografia cortesia de J. Williams, S. Paddock e S. Carroll.)
PÁGINA DIREITA: Expressão do gene paraxis no embrião de pinto no

estágio de 6 somitos. Hibridização in situ da montagem total usando RNA marcado com “digoxygenin” complementar a uma porção da mensagem paraxis do pinto mostra a expressão desse gene durante a formação do somito. A proteína Paraxis é importante no estabelecimento da estrutura desses grupos mesodérmicos. Capítulos 2 e 9. (Montagem fotográfica cortesia de R. Tuan.)

Para Daniel, Sarah, e David

Tabela de Conteúdos

PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento
Introdução ao desenvolvimento animal 1
O objetivo da biologia do desenvolvimento 1 Os problemas da biologia do desenvolvimento 2 Os estágios do desenvolvimento animal 3 Nossa herança eucariótica 5 Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares 6
Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária 6 Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria 10 As Origens da Reprodução Sexual 12

1

Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 35
As origens embriológicas da teoria dos genes 35

2

Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? 35 O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento 37

A cisão entre a embriologia e a genética 38 Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Evidência para a equivalência genômica 40

39

Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação
As Volvocaceanas 16

16

Informações adicionais & Especulações
Sexo e Individualidade em Volvox 18 Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium 21

Metaplasia 40 Clonagem de Anfibios: A Restrição da Potência Nuclear 42 Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas 43

Informações adicionais & Especulações
Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro 45

Informações adicionais & Especulações
Evidência e Anticorpos 25 27

Informações adicionais & Especulações
Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima

Sobre E.coli e elefantes: O modelo operon Síntese diferencial de RNA 49

47

Hibridização de ácido nucléico Seqüenciamento de DNA 59

54
58

Padrões desenvolvimentais entre metazoários
Os Poríferos 29 Protostomatas e Deuterostomatas 30

28

Clonagem de DNA genômico 55 Hibridização de DNA: entre e intra espécies

Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA 61 Técnicas de localização de RNA 63
Hibridização In Situ 63 Transferências Northern 64

Tabela dos Conteúdos

vii

Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia 66 Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos 69
Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula 69 Camundongos quiméricos 70 Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) 70

Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento 92 Caderinas 92 CAMs da superfamília de imunoglobulinas 95

Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda 97 A base molecular da afinidade célula-substrato 99
Afinidade diferencial a substrato 99 A matriz extracelular 99 Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular 104 Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla 106

Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense 73 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos 73 Uma conclusão e um alerta 75

Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 79
Afinidade celular diferencial 80
O modelo termodinâmico de interações celulares

3
84

Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais 107
A via JAK-STAT 107 A via RTK-Ras 108

Informações adicionais & Especulações
Evidência para o modelo termodinâmico 87
88

Informações adicionais & Especulações
Mutações negativas dominantes em receptores 110 A via do inositol fosfato 111 Cruzamentos entre vias 112 A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento 112 Interações recíprocas na superfície celular 113

A base molecular das adesões célula-célula Informações adicionais & Especulações

88

As classes de moléculas de adesão celular

Anticorpos monoclonais e genética reversa

89

Moléculas de adesão celular

92

PARTE II Padrões de Desenvolvimento
Fertilização: Iniciando um novo organismo 121
Estrutura dos gametas
Espermatozóide O óvulo 125

4

Prevenção da Polispermia

140

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Metabolismo dos Gametas 147

121
121

Ativação do metabolismo do óvulo
Respostas precoces 149 Respostas tardias 151 Fusão do material genético

149

Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância 128
Atração do Espermatozóide 128 Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar 129

152

Informações adicionais & Especulações
A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos 154

Rearranjo do citoplasma do óvulo
Preparação para a Clivagem

156
158

Informações adicionais & Especulações
Ação à Distância: Gametas de Mamíferos 131
Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas 132 Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriçosdo-Mar 132 Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos 135

Clivagem: Criando multicelularidade 167
PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA 168 Clivagem holoblástica radial 169
A holotúria, Synapta Ouriço-do-Mar 170 Anfíbios 173 169

5

Fusão de gametas e a prevenção da polispermia
Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide 139

139

Clivagem holoblástica espiral

175

viii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Adaptação pela modificação da clivagem embrionária 178 Clivagem Holoblástica Bilateral 179

Mecanismos de gastrulação em aves

238

Gastrulação em mamíferos

242

Clivagem holoblástica rotacional
Compactação 181

180

Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo 242 Formação de membranas extra-embrionárias 245

Informações adicionais & Especulações
A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação 184 Formação da massa celular interna 185 Fuga da Zona Pelúcida 185

Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 253
FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais 254
186

7

254

Informações adicionais & Especulações
Gêmeos e células embrionárias precursoras

Clivagem Meroblástica

188

Clivagem discoidal 189 Clivagem Superficial 192

Informações adicionais & Especulações
Exceções, Generalizações, e Clivagem Parasítica da Vespa 195

Neurulação primária 255 A mecânica da neurulação primária 257 A formação da placa neural 257 Formação do assoalho da placa neural 258 A modelagem e dobramento da placa neural 259 Fechamento do tubo neural 260

Informações adicionais & Especulações
A modelagem dorsoventral do sistema nervoso 264

MECANISMO DE CLIVAGEM 196 Regulando o ciclo da clivagem

196
197

Neurulação secundária 264 Diferenciação do tubo neural

265
265

Fator promotor de maturação

Formação das regiões do cérebro

Informações adicionais & Especulações
MPF e Seus Reguladores 198

Informações adicionais & Especulações
Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio 268 Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central 270 Organização do cerebelo 272 Organização cerebral 274

O mecanismo citoesquelético da mitose 201 A formação de novas membranas 203

Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 209
Gastrulação em ouriço-do-mar 210

6

Tipos de neurônios 276 Desenvolvimento do olho em vertebrados

279

Ingresso do Mesênquima Primário 210 Primeiro estágio da invaginação do arquêntero 215 Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero 217

Dinâmica do desenvolvimento ótico 279 Diferenciação da retina neural 280

Informações adicionais & Especulações
Porque os bebês não enxergam bem Diferenciação do cristalino e da córnea 282 283

Gastrulação em peixes

218

A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular 218 Formação das camadas germinais 220

A CRISTA NEURAL 284 A crista neural e seus derivados A crista neural do tronco 285

284

Gastrulação de anfíbios

221

Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios 221 Posicionando o blastóporo 224 Movimentos celulares e a construção do arquêntero 226 Migração do mesoderma involutivo 229

Vias de migração das células da crista neural do tronco 285 A matriz extracelular e a migração da crista neural do tronco 287

Informações adicionais & Especulações
Análise das mutações que afetam o desenvolvimento das células da crista neural 290

Informações adicionais & Especulações
Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica 230 Epibolia do ectoderma 232

A potência do desenvolvimento das células da crista neural do tronco 291
Diferenciação final das células da crista neural 292

A crista neural cefálica

293

Gastrulação em aves

233
233

Generalidades sobre gastrulação em aves

Vias migratórias das células da crista neural cefálica 293 Potência de desenvolvimento das células da crista neural cefálica 295

Tabela dos Conteúdos

ix

A crista neural cardíaca 296 A EPIDERME E A ORIGEM DAS ESTRUTURAS CUTÂNEAS
A origem das células epidérmicas Apêndices cutâneos 299 297

297

Conclusões

300

Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 341

9

Especificidade axônica 307
A geração da diversidade neuronial 307
Especificação do Neurônio Motor de Vertebrado Especificação dos Neurônios Motores em Drosophila 310

8
308

MESODERMA 341 Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos 341
Mesoderma Paraxial 341 Somitômeros e a Iniciação da Formação do Somito 343 Geração de Tipos de Células Somíticas 344 Miogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético 347

Formação de padrões no sistema nervoso 312 Seleção de trajetórias: Orientação pela matriz extracelular 313
Orientação pelo Terreno Físico: Orientação por Contato 313 Orientação para Gradientes de Adesão: Haptotaxia 314 Condução por Sinais Migratórios específicos do Axônio: A Hipótese das Trajetórias Marcadas 315 Orientação pela Repulsão Específica de Cones de Crescimento 317

Informações adicionais & Especulações
Construção Muscular e a Família MyoD de Reguladores Transcricionais 349 Osteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos 351

Informações adicionais & Especulações
Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento 357

Mesoderma da Placa Lateral

358

Informações adicionais & Especulações
Sexo,Odor e Adesão Específica 319

Seleção de trajetória: Orientação por moléculas difusíveis 320 Sinais para condução múltipla 323
Neurônios Motores Vertebrados Axônios da Retina 325 323

Formação das Membranas Extra-Embrionárias 359 O Coração 361 Formação dos vasos sangüíneos

366

Informações adicionais & Especulações
Redirecionando o Fluxo Sangüíneo no Mamífero Recém-nascido 372

O Desenvolvimento de células sangüíneas

373

Seleções de alvos

326

Especificidades Adesivas em Diferentes Regiões do Tectum 328

Seleção de endereço: Desenvolvimento dependente de atividade 331 Sobrevivência diferencial após a inervação: Fatores neurotróficos 331 Informações adicionais & Especulações
Neurônios Fetais em Hospedeiros Adultos 334

O Conceito de Célula-tronco 373 Células-tronco Pluripotenciais e Microambientes Hematopoéticos 374 Desenvolvimento Osteoclástico 377 Locais de Hematopoiese 378

ENDODERMA 380 Faringe 380 O tubo digestivo e seus derivados

382
382

O desenvolvimento de comportamentos: constância e plasticidade 334

Fígado, Pâncreas e Vesícula Biliar O Tubo Respiratório 383

x

Tabela dos Conteúdos

PARTE III Mecanismo da Diferenciação Celular
Regulação transcricional da expressão gênica: Fatores de transcrição e a ativação de promotores específicos 391
Éxons e Íntrons 392 Estrutura e função do promotor
Estrutura do promotor 396 Função do promotor 397

10

Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel dos complexos de ruptura 436 Ruptura e reorganização de nucleossomos: o papel da competição de histonas 437

Regiões de controle de loco: transcrição do gene da globina 437 Informações adicionais & Especulações
Trocas no gene de globina 440

394

Metilação de DNA e atividade gênica

442

Informações adicionais & Especulações
RNA polimerase e os fatores trans-reguladores no promotor 399

Correlações entre metilação do promotor e inatividade gênica 442 Metilação e a manutenção dos padrões de transcrição 443

Estrutura e função dos intensificadores

402

Informações adicionais & Especulações
Metilação e impressão gênica 444

Necessidade de intensificadores 402 Função do intensificador: Modelos temporais e espaciais de transcrição 403

Fatores de transcrição: Os trans-reguladores dos promotores e dos intensificadores 404
Proteínas de homeodomínio 405 Os fatores de transcrição POU 406

Compensação de dosagem do cromossomo X de mamíferos 446 Informações adicionais & Especulações
O mecanismo de inativação do cromossomo X 449

Associação do DNA ativo com a matriz nuclear

451

Informações adicionais & Especulações
Regulação da transcrição dos genes de cadeia leve das imunoglobulinas 409 Fatores de transcrição básicos do tipo hélice-alçahélice 415

Ligação da cromatina ativa a uma matriz nuclear 451 Topoisomerases e a transcrição gênica 453 Isoladores e domínios 454 Resumo 455

Informações adicionais & Especulações
Regulando as proteínas bHLH miogênicas: Governando a troca entre proliferação e diferenciação de células musculares 416 Fatores de transcrição do zíper básico da leucina 416

Controle do desenvolvimento pelo processamento e tradução diferencial do RNA 461

12

Informações adicionais & Especulações
Armadilhas do intensificador: natural e experimental 418 Fatores de Transcrição Dedo de Zinco 420 Receptores Nucleares de Hormônios e Seus Elementos Responsivos a Hormônios 420

CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO PELO PROCESSAMENTO DIFERENCIAL DE RNA 461 Controle do desenvolvimento precoce pela seleção de RNA nuclear 462 Os mecanismos de emenda de RNA: Spliceosomes 465 Emenda alternativa do RNA: Criando proteínas alternativas a partir do mesmo gene 466
Um gene, Muitas Proteínas Relacionadas 466 Processamento Alternativo de RNA e Determinação Sexual em Drosophila 468 Uso Disseminado do Processamento de RNA para o Controle da Expressão Gênica 471

Proteínas que dobram o DNA 423 Ativação dependente de contexto ou silenciamento 423 Regulação da atividade do fator de transcrição 425

Regulação transcricional da expressão gênica: A ativação da cromatina 431
Acessibilidade a fatores trans-reguladores Sítios hipersensíveis à DNAase I 434

11
431
432

Nucleossomos e a ativação da cromatina reprimida

REGULAÇÃO DA TRADUÇÃO DOS PROCESSOS DESENVOLVIMENTAIS 471 Mecanismos da tradução eucariótica 472 Controle da síntese protéica pela longevidade diferencial do mRNA 474
Degradação Seletiva de mRNAs 475

Controle da tradução de mensagens do oócito

476

Tabela dos Conteúdos

xi

Caracterização de RNAs Mensageiros Armazenados em Oócitos 477

Informações adicionais & Especulações
A Ativação do Genoma Embrionário 488

Informações adicionais & Especulações
Determinando o Destino Celular por Meio do mRNA Localizado do Oócito 480

Regulação dos genes da tradução em larvas e adultos 490
Determinação de Gametas em C. elegans 490 RNA Antisenso Natural 491 “Disjuntores” do Controle da Tradução 492 Editoração do RNA 493

Mecanismos para a regulação da tradução das mensagens dos oócitos 481
A Hipótese da Mensagem Materna Mascarada 482 A Hipótese da Cauda Poli(A) 483 A Hipótese da Eficiência da Tradução 486 Outros sistemas de ativação do mRNA: Mensagens sem “Cap” e Mensagens Seqüestradas 486

Controle da tradução e síntese protéica coordenada: Produção de Hemoglobina 494 Epílogo: Regulação Pós-tradução 497

PARTE IV Especificação do Destino Celular e os
Eixos Embrionários
Especificação celular autônoma por determinantes citoplasmáticos 505
Comprometimento celular e diferenciação Pré-formação e epigênese 507
Os Teratologistas Franceses 509

13
510

A genética da especificação axial em Drosophila 543

14

505

Especificações autônomas em embriões de tunicados

Resumo do desenvolvimento de Drosophila 543 AS ORIGENS DA POLARIDADE ÂNTERO-POSTERIOR 545 Visão Panorâmica 545 Os genes de efeito materno 546
Evidência Embriológica da Regulação da Polaridade pelo Citoplasma do Oócito 546 O Modelo Molecular: Gradientes Protéicos no Embrião Precoce 547

O determinante formador de músculos do crescente amarelo 511 Especificação citoplasmática das linhagens endodérmicas e epidérmicas e o eixo ânteroposterior 514

Informações adicionais & Especulações
Modelos de Gradientes da Informação Posicional 551 Evidência que o Gradiente da Proteína Bicoid Constitui o Centro de Organização Anterior 552 O Centro de Organização Posterior: Localizando e Ativando o Produto de nanos 556 O Grupo Gene Terminal 557

Localização citoplasmática em embriões de moluscos 515
O lóbulo polar 517

Especificação celular no nematódeo Caenorhabditis elegans 521
Controle maternal da identidade do blastômero: O controle genético das células progenitoras faríngeas de C. elegans 524 Regulação em C. elegans 527

Os genes da segmentação

559

Informações adicionais & Especulações
“Ser ou Não Ser: Esse é o Fenótipo” 529

Divisões celulares assimétricas no desenvolvimento tardio 530 Localização citoplasmática de determinantes de células germinativas 531
Determinação de células germinativas em nematódeos 531 Determinação da célula germinativa em insetos Componentes do plasma polar da Drosophila Determinação de células germinativas em anfíbios 536

Uma Visão Panorâmica 559 Os Genes de gap 561 Os Genes pair-rule 563 Os Genes de Polaridade Segmentar

565

Os genes de Seleção homeótica

569

532 534

Padrões de Expressão dos Genes Homeóticos 569 Iniciando os Padrões da Expressão dos genes Homeóticos 572 Mantendo os Padrões de Expressão dos genes Homeóticos 572 Os Elementos Cis-Reguladores e o Complexo Bithorax 574

Resumo

538

xii

Tabela dos Conteúdos

Informações adicionais & Especulações
Regulação Molecular do Desenvolvimento: As Proteínas do Homeodomínio 576

Indução de especificidade mesodérmica ventral e lateral 612

A criação da atividade do organizador

613
613

A GERAÇÃO DA POLARIDADE DORSOVENTRAL EM DROSOPHILA 577 A proteína Dorsal: Morfógeno para a polaridade dorsoventral 577
Translocação da Proteína Dorsal 577

Proteínas secretadas do organizador

Informações adicionais & Especulações
BMP4 e a lagosta de Geoffroy 616 Fatores de transcrição induzidos no organizador 619

Provendo o sinal assimétrico para a translocação da proteína Dorsal 578
Sinal do Núcleo do Oócito para as Células Foliculares 578 Sinalização das Células Foliculares para o Citoplasma do Oócito 580 O Estabelecimento do Gradiente da Proteína Dorsal 581

Informações adicionais & Especulações
Como o Organizador Neuraliza o Ectoderma? 621

A especificidade regional de indução

621
621

A determinação das diferenças regionais O modelo do duplo gradiente 623 Correlatos moleculares da caudalização neural 624

PRIMÓRDIOS DE ÓRGÃOS E EIXOS 585 O modelo de coordenadas cartesianas e a especificação dos primórdios dos órgãos 585 Resumo: Alguns princípios do desenvolvimento da Drosophila 586

Informações adicionais & Especulações
Sinais verticais e horizontais do organizador 626 Genes homeobox na especificação neural 628

Competência e cascatas indutivas 628

Especificação do destino celular por interações célula-célula progressivas 591
Desenvolvimento regulativo 591 Testando a teoria do plasma germinativo 592

15

Estabelecimento dos eixos corporais em mamíferos e aves 635
Iniciando o eixo ântero-posterior 635

16

August Weismann: A teoria do plasma germinativo 592 Wilhelm Roux: Desenvolvimento em mosaico 593 Hans Driesch: Desenvolvimento Regulativo 594 Sven Hörstadius: Potência e gradientes em oócitos 597 Formação de um organismo integrado: Restringindo a potência das células vizinhas 598

Estabelecendo um Centro de Nieuwkoop 635 Expressão Gênica em Tecidos Organizadores 636

Especificando o eixo ântero-posterior de mamífero: A hipótese do código Hox 637
Homologia dos Complexos de Genes Homeóticos entre Drosophila e Mamíferos 637 Expressão de Genes Hox no Sistema Nervoso Central e seus Derivados 638 Análise Experimental de um Código Hox: Gene Alvo 640 Transformação Parcial de Segmentos por Eliminação de Genes Hox Expressos no Tronco 642 Análise Experimental do Código Hox: Teratogênese do Ácido Retinóico 643 Evidência para um Código Hox da Anatomia Comparada 645

Regulação durante o desenvolvimento de anfíbios

600

Hans Spemann: Determinação progressiva das células embrionárias 600 Hans Spemann e Hilde Mangold: Indução embrionária primária 603

O centro de Nieuwkoop

606

A formação do centro de Nieuwkoop e a polaridade mesodérmica 606 A especificação da polaridade dorsoventral na fertilização 607

Informações adicionais & Especulações
Animais como Variações sobre o Mesmo Tema Desenvolvimental 646

A base molecular da indução mesodérmica

609

Estabelecendo a regionalização dorsal: o possível papel da β-catenina 609 O funcionamento do centro de Nieuwkoop: funções para Vg1 e Noggin 610

Eixos dorsoventral e esquerdo-direito em mamíferos e aves 647

Tabela dos Conteúdos

xiii

PARTE V Interações Celulares Durante a
Formação do Órgão
Interações proximais de tecidos: Indução secundária 655
Interações instrutivas e permissivas Competência e receptores 656 Fatores parácrinos 657 655

17
658

de crescimento dos fibroblastos como indutores do broto do membro 704 Indução da crista ectodérmica apical 704

Produção do eixo próximo-distal dos membros

706

Os Fatores de Crescimento Fibroblástico A família hedgehog 659 A família Wnt 660 A superfamília TGF-ß 661 Sinalização Justácrina 662

A crista ectodérmica apical: O componente ectodérmico 706 A zona progressiva: O componente mesodérmico 708 Genes Hox e a especificação do eixo próximodistal do membro 709 Interações entre a AER e a zona progressiva 711 Mutações nas interações entre a zona progressiva e a AER 711

Interações epitélio-mesênquima

663
663 666 667 668

Informações adicionais & Especulações
A regeneração dos membros da salamandra e a retenção do eixo próximo-distal 714

Especificidade Regional da Indução Especificidade Genética da Indução

Cascatas de indução embrionária: Indução do cristalino 667
Os Fenômenos da Indução do Cristalino A Base Celular da Indução do Cristalino Formação da Córnea 672

Especificação do eixo ântero-posterior dos membros 716
A zona de atividade polarizante 716 Sonic hedgehog como definidor da ZPA 717 Interações entre a AER e a ZPA para integrar crescimento e padrão 718 Especificando a ZPA 721

Formação de órgãos parenquimatosos 672
Morfogênese do Rim de Mamífero 673 Os Mecanismos da Organogênese Renal 676

Informações adicionais & Especulações
Diferenciação Coordenada e Morfogênese no Dente 682

A produção do eixo dorsoventral 721 Distinguindo o membro anterior do membro posterior 722 Informações adicionais & Especulações
Lições de limbless 724

Mecanismos de ramificação na formação de órgãos parenquimatosos 683
A Matriz Extracelular como um Elemento Crítico na Ramificação 684 Fatores Parácrinos Efetuando Padrões de Ramificação 686

Morte celular e a formação de dígitos 724 Informações adicionais & Especulações
Evolução do membro tetrápode 726

Indução ao nível de uma única célula

687

Indução Vulvar no Nematóide Caenorhabditis elegans 690

Interações celulares à distância: Hormônios como mediadores do desenvolvimento 733
Metamorfose: o direcionamento hormonal do desenvolvimento 733 Metamorfose anfíbia 734

19

Informações adicionais & Especulações
Interações Célula-Célula e Possibilidade na Determinação de Tipos Celulares 692

Desenvolvimento do membro de tetrápode 701
Padronização no membro 701 Formação do broto do membro 702

18

Controle hormonal da metamorfose de anfíbios 735 Respostas Moleculares aos Hormônios da Tireóide Durante a Metamorfose 740

Informações adicionais & Especulações
Heterocronia 743

Metamorfose em insetos

746
746

O campo do membro 702 Especificação dos campos do membro: Genes Hox e ácido retinóico 703 Crescimento do broto de membro precoce: fatores

Eversão e Diferenciação dos Discos Imaginais

Informações adicionais & Especulações
A determinação dos discos imaginais da perna e da asa 750 Remodelação do sistema nervoso 753

xiv

Tabela dos Conteúdos

Controle Hormonal da Metamorfose de Insetos
A biologia Molecular da Atividade da Hidroxiecdisona 757

754

Hermafroditismo

795
795

Hermafroditismo no Nematóide C. elegans Hermafroditismo em Peixes 797

Informações adicionais & Especulações
Controle ambiental sobre a forma e a função da larva 761

Determinação ambiental do sexo

798

Interações hormonais múltiplas no desenvolvimento da glândula mamária 762
Estágio embrionário Adolescência 765 Gravidez e lactação 762 765

Determinação Sexual Dependente de Temperatura em Reptéis 798 Determinação Sexual Dependente da Localização em Bonellia viridis e Crepidula fornicata 799

Resumo

800

Determinação do sexo 773
Determinação Sexual Primária 774 Determinação Secundária do Sexo 774 As Gônadas em Desenvolvimento 775

20

Regulação ambiental do desenvolvimento animal 805

21
806

Determinação cromossômica do sexo em mamíferos 774

REGULAÇÃO AMBIENTAL DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Sugestões ambientais usadas pelos organismos para completar seus desenvolvimentos 806
A colonização larval 806 Refeições de sangue 808 Simbiose no desenvolvimento

Determinação sexual primária dos mamíferos: Genes cromossômicos Y para a determinação dos testículos 777
SRY: O Determinante Sexual do Cromossomo Y 778

808

Diferenças ambientais previsíveis como sugestões para o desenvolvimento 810
Sazonalidade e sexo: Afídios e Volvox Diapausa 812 810

Determinação sexual primária em mamíferos: Genes autossômicos na determinação de testículos 780
SOX9: Reversão Autossômica na Displasia Campomélica 780 SF1: A Ligação Entre SRY e as Trajetórias Desenvolvimentais Masculinas 780

Plasticidade fenotípica: Polifenismo e regras de reação 813
Polifenismo sazonal em borboletas 814 Polifenismo nutricional 816 Determinação sexual dependente do ambiente

Determinação sexual primária em mamíferos: Desenvolvimento ovariano 781
DAX1: Um Potencial Gene Determinante de Ovário no Cromossomo X 781 Wnt4a: Um Potencial Gene Determinante de Ovário em um Autossomo 781

817

Fatores ambientais imprevisíveis controlando o desenvolvimento animal 818
Defesas induzíveis contra a predação 819 Plasticidade fenotípica e mudanças no ambiente 820

Informações adicionais & Especulações
Assimilação Genética 821

Determinação sexual secundária em mamíferos
Regulação Hormonal do Fenótipo Sexual Testosterona e Diidrotestosterona 783 Hormônio Anti-Mülleriano 784 O Sistema Nervoso Central 785

782
782

A contínua plasticidade do desenvolvimento

822

O sistema imune: Desenvolvimento no adulto 822 Aprendizado: Um sistema nervoso adaptável ao ambiente 823

Informações adicionais & Especulações
O Desenvolvimento de Comportamentos Sexuais 787

DISTÚRBIOS AMBIENTAIS DO DESENVOLVIMENTO NORMAL Malformações e distúrbios 827 Agentes teratogênicos 828
Ácido retinóico como um teratogênico 829 Talidomida como um teratogênico 830 Álcool como um teratogênico 833 Outros agentes teratogênicos 835

827

Determinação sexual cromossômica em Drosophila 788
A Via do Desenvolvimento Sexual 788 O Gene Sex-lethal como o Pivô para a Determinação do Sexo 790 Os Genes transformer 793 doublesex: O Gene Comutador da Determinação Sexual 793 Genes-alvo para a Cascata de Determinação Sexual 794

Informações adicionais & Especulações
Estrógenos Ambientais 836

Interações genética-ambiental Resumo 837

837

Tabela dos Conteúdos

xv

A saga da linhagem germinativa 843
Migração das células germinativas 843
Migração das Células Germinativas em Anfíbios 843 Migração das Células Germinativas em Mamíferos 844

22

Mecanismos desenvolvimentais da mudança evolucionária 883
“Unidade de Tipo” e “Condições de Existência”
A Síntese de Charles Darwin 883 E. B.Wilson e F. R. Lillie 885

23
883

A evolução do desenvolvimento precoce: E. Pluribis Unum 885
A emergência dos embriões 885 Formação de um Novo Filo: Modificando os Caminhos do Desenvolvimento 887

Informações adicionais & Especulações
Teratocarcinomas e Células-Tronco Embrionárias 847 Migração de Células Germinativas em Aves e Répteis 848 Migração de Células Germinativas Primordiais em Drosophila 849

Modularidade: O pré-requisito para mudança evolutiva através do desenvolvimento 891
Modularidade 891 Dissociação: Heterocronia e Alometria Duplicação e Divergência 893 Co-opção 894 Progressão correlacionada 896 891

Meiose 850 Informações adicionais & Especulações
Grandes Decisões: Mitose ou Meiose? Espermatozóide ou Óvulo? 853

Restrições ao desenvolvimento

898

Espermatogênese

855
857

Espermiogênese

Informações adicionais & Especulações
Expressão Gênica Durante o Desenvolvimento do Espermatozóide 858

Restrições Físicas 898 Restrições Morfogenéticas 898 Restrições Filéticas 899 Evolução Conjunta do Ligante e Receptor: Isolamento Reprodutivo 901

Oogênese

860

Meiose oogênica 860 Maturação do Oócito em Anfibios 861 Conclusão da meiose: Progesterona e Fecundação 864 Transcrição Gênica em Oócitos 865 Oogênese Meroística em Insetos 867

O mecanismo genético do desenvolvimento da mudança evolucionária: Genes reguladores homólogos 902
Pax6 e o desenvolvimento do olho 902 BMP4 e a Morfogênese dos Membros 904 Genes Hox e a Evolução dos Vertebrados 905 Genes Hox e a Evolução dos Artrópodes 907 Caminhos homólogos do desenvolvimento 909

Informações adicionais & Especulações
A Origem dos Eixos Embrionários de Drosophila Durante a Oogênese 869 Oogênese em Mamíferos 870

Criando novos tipos de células: O mistério evolucionário básico 911 Uma nova síntese evolucionária 912

Informações adicionais & Especulações
O Reinício da Meiose nos Oócitos de Mamíferos 875

Fontes Para as Citações das Aberturas dos Capítulos C-1 Índice de Autores IA-1 Índice de Assuntos IA-2 Índice de Abreviaturas IA-3

Prefácio

O

s últimos anos do século 20 encontram a biologia do desenvolvimento retornando à posição que ela ocupou no início do século: a disciplina que unifica os estudos da hereditariedade, evolução e fisiologia. Em 1896, a primeira edição de B. Wilson do The Cell in Development and Inheritance anunciou “a verdade maravilhosa que uma única célula pode conter em seu interior sua extensão microscópica da soma-total da herança das espécies.” Hoje, a biologia do desenvolvimento está na vanguarda desse estudo de nossa herança natural. Nos seus aspectos moleculares, ela toca a química física na sua investigação dos mecanismos bioquímicos pelos quais proteínas diferentes são produzidas em células diferentes do mesmo genoma. Ela também está na liderança dos estudos evolucionários que procuram entender como mudanças macroevolucionárias ocorreram. Ela abriu recentemente uma área nova da biologia do desenvolvimento ecológico, onde mudanças ambientais são vistas criando alterações no desenvolvimento do organismo. Durante os últimos 3 anos, a biologia do desenvolvimento também expandiu para a medicina, fundindo-se com a genética clínica para criar uma ciência revitalizada da embriologia humana, uma ciência que já se tornou importante na explanação das malformações congênitas. A quinta edição do Biologia do Desenvolvimento foi revisada e reescrita para refletir essas revoluções que estão acontecendo. Aconteceram quatro mudanças importantes na estrutura do livro desde sua última edição. Primeiro, tornou-se impossível discutir os princípios fundamentais da embriologia sem o conhecimento da atividade gênica ou vias da transdução de sinais. Portanto, essa informação foi trazida dentro da seção introdutória do livro de modo que interações celulares, tais como fertilização e indução, podem ser apreciadas tanto no âmbito molecular quanto no morfológico. Segundo, novo interesse nos efeitos do ambiente no desenvolvimento normal e anormal conduziu a um novo capítulo. O Capítulo 21, “Regulação Ambiental do Desenvolvimento Animal,” diz respeito às vias pelas quais o meio ambiente afeta o fenótipo do organismo. Interesse na proteção ambiental e em controvérsias envolvendo a possibilidade de poluentes teratogênicos forçaram uma nova percepção das influências que o meio ambiente representa no desenvolvimento normal e anormal. Na verdade, os biologistas do desenvolvimento podem rapidamente encontrar-se à frente dos movimentos da conservação ecológica. As primeiras quatro edições deste livro buscaram integrar abordagens molecular, celular e orgânica à biologia do desenvolvimento; esta edição adiciona a dimensão ecológica. Terceiro, esta edição introduz novas ênfases nos papéis dos fatores parácrinos no desenvolvimento. Não somente os estudos da transdução de sinais estão colocados na seção introdutória deste livro, como a Parte V

Prefácio

xvii

da Quinta Edição inicia com uma visão geral das famílias do fator de crescimento fibroblástico, TGF-β, Wnt e Hedgehog dos fatores de crescimento e diferenciação. Quarto, este livro está conectado a um website onde estudantes e professores podem encontrar mais material em muitos tópicos selecionados. Tal material inclui (1) detalhes de experimentos que são extremamente especializados para serem colocados no texto, (2) informação histórica sobre áreas particulares da biologia do desenvolvimento e personalidades envolvidas, (3) implicações médicas de fenômenos particulares do desenvolvimento, (4) debates ou comentários em questões relevantes para o campo, e (5) atualizações do material do texto nessa área da biologia de crescimento cada vez mais rápido. Filmes e entrevistas gravadas estão incluídas e esses artigos de destaque poderão ser expandidos à medida que a tecnologia os tornar mais fáceis para serem usados. Esse website está conectado também a outros websites e podem ser usados para enriquecer a perspectiva de alguém sobre o que está acontecendo no desenvolvimento animal. A presença de um website nos permite manter o direcionamento deste livro às pessoas para as quais isso foi originalmente pretendido: estudantes dos últimos anos da graduação e do início da pós-graduação. Ele também me ajudou a não deixar o livro tornar-se um substituto para peso de papel. A visão de Roux foi que a biologia do desenvolvimento “algum dia constituiria a base de todas as outras disciplinas biológicas e, em continuada simbiose com essas disciplinas, desempenharia uma parte proeminente nas soluções dos problemas da vida.” Essas foram palavras audaciosas, até mesmo arrogantes há cem anos atrás; hoje, elas expressam uma aceitação amplamente sustentada. O desenvolvimento integra todas as áreas da biologia e desempenha um papel crucial em relacionar o genótipo ao fenótipo. O desenvolvimento pode ser estudado usando qualquer organismo e em qualquer nível de organização, de moléculas a filos. À medida que o campo continuar a se expandir e se aprofundar , uma palavra de advertência é requerida: a biologia do desenvolvimento não pode ser aprendida ou ensinada em um único semestre. Este texto é uma tentativa para prover cada pessoa com material suficiente para seu curso, mas um instrutor não necessita se sentir culpado por não determinar todos os capítulos, e os estudantes não necessitam se sentir privados se eles não lerem todos os capítulos. Isto é o começo do caminho, não sua conclusão.

Como usar o website
Qualquer pessoa pode entrar no website através de sua homepage [http://zygote.swarthmore.edu/index.html] ou através da sua lista de arquivos de capítulos localizada no [http://zygote.swarthmore.edu/info.html]. Alternativamente, nós colocamos acessos específicos endereçados em todo o livro onde quer que exista uma entrada relevante no momento da publicação. Todos esses endereços começam com [http://zygote.swarthmore.edu/] e são seguidos por um código dado no livro texto. Assim, a localização especificada na página 20 do livro é: http://zygote.swarthmore.edu/intro2.html Mais localizações estão sendo adicionadas no website, e essas podem ser acessadas entrando nos arquivos do capítulo. Em adição, clicando no botão “Outros Arquivos” abaixo de cada capítulo, as conexões para outros websites serão facilitadas. Divirta-se.

xviii

Prefácio

Agradecimentos
Esta edição, como suas precursoras, deve muito às sugestões e críticas dos estudantes em minhas classes de biologia do desenvolvimento e genética do desenvolvimento. O grupo de funcionários e docentes extremamente corporativo da Universidade Swarthmore também desempenharam papéis importantes na produção deste livro, e os bibliotecários da área de ciência E. Horikawa e M. Spencer merecem agradecimentos especiais por terem segurado volumes recentes na biblioteca enquanto eu estava escrevendo o livro. Os cientistas que revisaram estes capítulos forneceram enorme ajuda tanto na precisão técnica dos capítulos quanto nas sugestões para trabalho futuro. Esses investigadores incluem: S. Carroll, J. CebraThomas, E. M. De Robertis, S. DiNardo, E. Eicher, C. Emerson, G. Grunwald, D. J. Grunwald, M. Hollyday, L. A. Jaffe, W. Katz, R. Keller, K. Kemphues, D. Kirk, G. Martin, H. F. Nijhout, D. Page, R. Raff, R. Schultz, C. Stern, S. Tilghman, R. Tuan e M. Wickens. Eu também quero agradecer aos muitos cientistas que desviaram do seu caminho para ajudar a tornar esta edição melhor lendo porções específicas dos capítulos. Eles incluem: M. BronnerFraser, J. Fallon, N. M. Le Douarin, E. McCloud, J. Opitz, K. Sainio, H. Sariola, I. Thesleff e T. Valente. Se eu deixei alguém fora, por favor me desculpem. É desnecessário dizer que os julgamentos editoriais finais foram de minha responsabilidade. Meus agradecimentos especiais a Judy Cebra-Thomas que não somente me aconselhou em certos capítulos mas quem deu excelente ajuda durante meu período sabático permitindo-me terminar este livro. Agradecimentos também aos cientistas e filósofos, especialmente: C. van der Weele, R. Amundson, L. Nyhart, R. Burian, H. F. Nijhout, A. F. Sterling, K. Smith e A. I. Tauber, que participaram nos workshops de biologia do desenvolvimento da Sociedade Internacional para a História, Filosofia e Estudos Sociais da Biologia. Algumas das melhores críticas construtivas deste livro-texto vieram dessas pessoas. Andy Sinauer uma vez mais conseguiu reunir as mesmas e extraordinárias pessoas neste projeto, e foi um privilégio trabalhar com eles. Meus agradecimentos a ele e aos editores Nan Sinauer e Carol Wigg, coordenador de produção Chris Small, artistas John Woolsey e Gary Welch, designer Susan Schmidler, editor de texto Janet Greenblatt, e artista de layout Janice Holabird. As habilidades editoriais de Tinsley Davis são extremamente reconhecidas. Devido ao fato de que os prazos finais devem ser cumpridos e outro trabalho posto de lado, eu tenho que agradecer minha família por mais uma vez me permitir prosseguir com isso. Em particular, este livro nunca poderia ter sido completado se não fosse pelo encorajamento de minha esposa, Anne Raunio, que, como uma obstetra, gosta do lado mais prático da biologia do desenvolvimento. Meus agradecimentos a todos vocês.

SCOTT F. GILBERT 1 DE MARÇO DE 1997

Introdução à Biologia do Desenvolvimento
1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 35 79 2 Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 3 Base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial

I

.

Da mesma maneira. digerir alimentos antes que seus órgãos estivessem formados. Esse quer saber como o genótipo XX produz um ser feminino e como o genótipo XY produz um ser masculino. entre os genes herdados e o organismo adulto. mas passou outros 364 dias como um embrião e larva. Dizer que um inseto efêmero vive apenas um dia não significa nada para um biologista do desenvolvimento. ainda que sua aparência esteja sempre mudando. é desenvolvendo um embrião. Virgílio (37 A. O objetivo da biologia do desenvolvimento Para plantas e animais. Biologia do desenvolvimento é a ciência do vir a ser.C. Uma diferença marcante entre você e a máquina é que a máquina nunca é requisitada para uma função antes que esteja terminada. Dizer que mamíferos XX são geralmente fêmeas e mamíferos XY são geralmente machos. o único caminho para o desenvolvimento a partir de uma célula. 1900) Feliz é a pessoa que consegue discernir as causas das coisas. e a formação de um embrião é a tarefa mais árdua que alguém haverá de realizar. Diante de um problema. não explica a determinação sexual para um biologista do desenvolvimento. Para se tornar um embrião. Enquanto a maior parte da biologia estuda a estrutura adulta e função. Porém. porque o inseto pode ser adulto apenas por um dia. O embrião é o intermediário entre o genótipo e o fenótipo. Todo animal tem que estar em funcionamento enquanto se auto-constrói. É nosso dever como artistas transmitir juntamente com todos os seus elementos a emoção dessa permanente transformação. a ciência do processo. construir ossos a partir de uma massa e ordenar os neurônios antes mesmo de adquirir a capacidade de pensar. podemos estudá-lo a 1 . a biologia do desenvolvimento encontra maior interesse nos estágios mais transitórios. Teve que respirar antes que tivesse pulmões.) O CONCEITO DE EMBRIÃO é assombroso. Biologia do desenvolvimento é uma ciência excelente para pessoas que querem integrar diferentes níveis da biologia.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 1 Introdução ao desenvolvimento animal 1 A natureza parece nunca mudar. ou seja. o biologista do desenvolvimento pergunta porque os genes globina se expressam somente nas hemácias e como essas se tornam ativas apenas em certas fases do desenvolvimento (ainda não sabemos as respostas). Paul Cezanne (ca. você teve que construir a si mesmo a partir de uma única célula. um geneticista gostaria de saber como os genes globina são transmitidos de uma geração à outra. e um fisiologista pode fazer perguntas sobre a função da globina no corpo. As questões levantadas por um biologista do desenvolvimento são freqüentemente questões mais ligadas ao vir a ser do que ao ser propriamente dito.

A biologia do desenvolvimento está criando uma estrutura que integra a biologia molecular. e como são instruídos a se conectarem e ramificarem?) e. tem-se dado grande ênfase a um quinto problema: • O problema da evolução. a nível de órgãos ou sistema de órgãos (p. Essa criação de forma ordenada. e como fatores ambientais acionam a diferenciação de mais hemácias?). Uma única célula. Como diferenças na ativação do gene globina permitem o fluxo de oxigênio da mãe para o feto. O estudo do desenvolvimento tornou-se essencial para a compreensão de qualquer área da biologia. ex. e biologia evolucionária. os olhos estão na nossa cabeça e não nos pés ou intestinos. essas questões têm sido subdivididas em quatro problemas gerais da biologia do desenvolvimento: • O problema da diferenciação. Biologia do desenvolvimento é um dos campos que mais tem crescido e também um dos mais emocionantes da biologia. células do sangue. Quando dizemos que o cavalo de um dedo só de hoje. se desenvolve e gera centenas de células de diferentes tipos . Desde que cada célula do corpo contém o mesmo conjunto de genes..2 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento níveis molecular e químico (p. e como os fatores que ativam sua transcrição interagem uns com os outros e com o DNA?). pelo contrário. Nossas células diferenciadas não são distribuídas aleatoriamente. pesquisa do câncer. • O problema da morfogênese. são organizadas em intrincados tecidos e órgãos. células gordurosas. ecologia. seríamos considerados horrivelmente mal formados. e como esse ser adulto produz um outro ser? Cada espécie tem suas próprias respostas. é chamada morfogênese. e quais as informações no núcleo e no citoplasma que permitem tal funcionamento? Recentemente.. Esses órgãos estão dispostos de tal maneira que: dedos estão nas pontas e não no meio de nossas mãos. Como essas células são separadas para formar a próxima geração. ex. neurônios.células musculares. até mesmo. Se cada célula de nossos braços tivesse realizado apenas mais uma série de divisões. Como as células se auto-organizam e formam um arranjo correto? • O problema do crescimento. e como o mRNA da globina deixa o núcleo?). mas algumas generalizações podem ser feitas. ex.. Tradicionalmente. o ovo fertilizado. A evolução envolve mudanças herdadas durante o desenvolvimento. Biologistas do desenvolvimento podem estudar qualquer organismo e todo tipo de célula. Quais são as células capazes de produzir globina. células epidérmicas. Parte dessa emoção vem dos assuntos estudados. e assim por diante. precisamos entender como esse mesmo conjunto de instruções genéticas pode produzir diferentes tipos de células. estamos dizendo que mudanças no desenvolvi- . imunologia. biologia celular. Essa geração de diversidade celular é chamada diferenciação. poderíamos amarrar nossos sapatos sem nos abaixar. Somos maiores do que um ovo. O espermatozóide e o óvulo são células muito especializadas. neurobiologia. linfócitos. teve um ancestral de cinco dedos. Como vasos capilares são formados em cada tecido. ex. anatomia. a níveis celular e tissular (p. porque estamos apenas começando a entender o mecanismo molecular do desenvolvimento animal. Outra parte da emoção vem do papel unificador que a biologia do desenvolvimento assume nas ciências biológicas. existem duas questões fundamentais para a biologia do desenvolvimento: Como um ovo fertilizado origina um ser adulto. o que assegura a continuidade da vida que passa de uma geração à outra.. Como os genes globina são transcritos. • O problema da reprodução. mas como as células sabem quando devem parar de se dividir? Se cada célula de nossa face realizasse mais uma divisão celular. Somente eles podem transmitir instruções para produzir um organismo de uma geração para outra. a níveis ecológicos e evolucionários (p. Assim. Os problemas da biologia do desenvolvimento O desenvolvimento é realizado por duas funções principais: gera diversidade e ordem celular dentro de cada geração. fisiologia.

são formados por um processo relativamente lento de mudança progressiva. Essa fusão. estimula o ovo a iniciar o desenvolvimento. A vida de um novo indivíduo é iniciada pela fusão do material genético de dois gametas. produz o *Do Latim germen.ovo fertilizado ou zigoto. Essas células são chamadas blastômeros e. 2. A cada dia nós repomos mais de um grama de células de pele (fazendo com que as células mais velhas se desprendam assim que nos movemos). Aristóteles realizou esse procedimento e observou a formação dos principais órgãos. chamada fertilização. o endoderma. mesoderma de mesos (“meio”) e endoderma de endon (“dentro”). mas a maioria dos padrões de embriogênese compreende variações em quatro temas: 1. o espermatozóide e o óvulo. ao fim da clivagem. Os nomes das três camadas germinativas são do Grego: ectoderma de ektos (“fora”) mais derma (“pele”). produz todas as células do corpo. Por todo reino animal existe uma incrível variedade de tipos embrionários. que dividido através da mitose. Essa série de redistribuição de células é chamada de gastrulação. Em quase todos os casos. dadas as restrições impostas pela necessidade do organismo sobreviver enquanto se desenvolve? Os estágios do desenvolvimento animal De acordo com Aristóteles. a ciência começa com a curiosidade: “é graças a curiosidade que as pessoas começaram a filosofar. Mas o desenvolvimento não cessa no nascimento. Portanto. . porque a maioria dos organismos nunca pára de se desenvolver. Ocorrência de clivagem imediatamente após a fertilização. Qualquer um pode se admirar com esse fenômeno. significa “broto” ou “rebento” (a mesma raiz da palavra germinação). se referindo ao fato de que entre a fertilização e o nascimento. E ainda mais do que dissipar essa admiração. Como resultado da gastrulação. e a curiosidade permanece desde o início do conhecimento.1. Clivagem é uma série de divisões mitóticas extremamente rápidas. Como mudanças no desenvolvimento criam novas formas de corpo? Quais modificações hereditárias são possíveis. Após a redução na taxa de divisão mitótica. o primeiro grande embriologista da história. mas cientistas são os que procuram descobrir como o desenvolvimento realmente ocorre. e nossa medula óssea sustenta o desenvolvimento de milhões de novos eritrócitos a cada minuto de nossas vidas. ou mesmo na vida adulta. As principais características do desenvolvimento animal estão ilustrados na Figura 1.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 3 mento da cartilagem e dos músculos ocorreram ao longo de muitas gerações de embriões nos ancestrais do cavalo. O ectoderma. ainda que ordinário. um em relação ao outro. Organismos pluricelulares não se formam de imediato. o qual chamamos de desenvolvimento. a camada exterior. eles geralmente formam uma esfera conhecida como blástula. o embrião típico contém três regiões celulares chamadas camadas germinativas*. Os estágios subseqüentes do desenvolvimento são coletivamente chamados de embriogênese. ao contrário.” O desenvolvimento de um ser a partir do ovo tem sido motivo de admiração através da história da humanidade. os blastômeros passam por mudanças dramáticas quanto às suas posições. onde o enorme volume citoplasmático do zigoto é dividido em numerosas células menores. como a disciplina que estuda processos embrionários e outros do desenvolvimento. camada interior. novo conhecimento só faz aumentá-la. O estudo do desenvolvimento animal tem sido tradicionalmente chamado de embriologia. o desenvolvimento de um organismo pluricelular começa com uma única célula . O simples procedimento de se abrir um ovo de galinha a cada dia do seu período de incubação de três semanas proporciona uma notável experiência quando se observa desde uma fina camada de células até o total desenvolvimento da ave. produz as células da epiderme e do sistema nervoso. o organismo em desenvolvimento é conhecido como embrião. nos últimos anos tem sido comum se falar em biologia do desenvolvimento.

Estágios que vão da fertilização até o nascimento são coletivamente conhecidos como embriogênese. pulmões. rins. um sapo. gônadas). etc.1 Histórico do desenvolvimento de um representante animal. Esse processo é chamado organogênese. começa em épocas diferentes. as células interagem umas com as outras e se reorganizam para produzir tecidos e órgãos. Esse tubo originará o cérebro e a coluna vertebral). Gametogênese. camada do meio. 3. . Uma vez que as três camadas embrionárias estão estabelecidas. e o mesoderma. tecidos conjuntivos (ossos. dá origem a diversos órgãos (coração. músculos. fígado. Também durante a organogênese. (Nos vertebrados. vasos sangüíneos) e células sangüíneas. tendões.4 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Espermatozóide Mórula Blástula Oócito Célula germinativa (“Germ plasm”) Oócito (gameta feminino) GAMETOGÊNESE Adulto sexualmente maduro Blastóporo Gônada Ectoderma Mesoderma Estágios larvais imaturos Endoderma Local das células embrionárias Blastocele Espermatozóide (gameta masculino) INCUBAÇÃO (NASCIMENTO) Figura 1. a organogênese é iniciada quando uma série de interações celulares induzem as células ectodérmicas da porção mediana do dorso a formar o tubo neural. Muitos órgãos contêm células de mais de uma camada embrionária. revestimento do tubo digestivo e órgãos associados (pâncreas. As regiões responsáveis por produzir células embrionárias são mostradas em cores. e não é incomum o exterior de um órgão ser derivado de uma determinada camada e o interior de outra.). que é completa no adulto sexualmente maduro. dependendo da espécie.

Os procariotos (do grego karion. a divisão celular não é mitótica. em muitas espécies. Essa separação entre células somáticas (que dão origem a um corpo individual) e células germinativas (que contribuem para a formação de uma nova geração) é freqüentemente uma das primeiras diferenciações que ocorrem durante o desenvolvimento animal. Ao invés disso.3). As células germinativas finalmente migram para as gônadas. possuem um tegumento nuclear bem formado circundando os seus cromossomos. na qual o tegumento nuclear se parte e os cromossomos replicados são igualmente divididos entre as células filhas (Figura 1. dependendo apenas se as células possuem um envoltório nuclear ou não. Todas as outras células do corpo são chamadas células somáticas. os cromossomos filhos permanecem ligados a pontos adjacentes na membrana celular. onde se diferenciam em gametas. Nossa herança eucariótica Os organismos estão divididos em dois grupos principais. não existe tegumento celular para se partir. também.2). os gametas podem ser liberados e participar de uma fertilização dando início a um novo embrião. compostos por proteínas histonas. A seqüência de aminoácidos de uma proteína procariótica é a reflexão direta da seqüência de DNA do cromossomo. 4. O DNA eucariótico reveste complexos protéicos específicos. Os cromossomos procarióticos normalmente são hélices duplas de DNA. chamados nucleossomos. uma parte especializada do citoplasma do ovo dá origem às células que são precursoras dos gametas. Mais ainda. Essa diferença fundamental entre os eucariotos e procariotos influencia a maneira como esses grupos organizam e utilizam seu material genético. Os nucleossomos organizam o DNA em estruturas compactas e são importantes na designação de qual gene irá se expressar em qual célula. Em ambos os grupos. a estrutura de um gene eucariótico é mais complexa do que a de um gene procariótico. O DNA de um gene eucariótico que codifica uma proteína. e um simples protista eucariótico possui 10 vezes. Essas células são chamadas de células germinativas. onde estão incluídas as arqueobactérias e as eubactérias. células linfáticas. a quantidade de DNA encontrada na maioria dos procariotos complexos.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 5 algumas células sofrem longas migrações do seu lugar de origem até sua localização final. significa “núcleo”). e finalmente colocam os cromossomos em diferentes células filhas. células pigmentadas e gametas. geralmente. O desenvolvimento de gametas. Os eucariotos que incluem os protistas. . Esses pontos de ligação são separados entre si pelo crescimento da membrana celular. chamado de gametogênese. normalmente não é completado até que o organismo tenha se tornado fisicamente maduro. As células eucarióticas geralmente possuem diversos cromossomos. sendo destinadas à função reprodutiva. Como observado na Figura 1. Além disso. Cromossomos eucarióticos também são muito diferentes dos cromossomos procarióticos. plantas e fungos. é dividido de tal forma que a seqüência completa de aminoácidos da proteína é derivada de segmentos descontínuos de DNA (Figura 1. Nos procariotos. O organismo adulto finalmente sofre envelhecimento e morre. O DNA entre os segmentos freqüentemente contém seqüências que estão envolvidas na regulação do momento e lugar em que o gene é ativado. não possuem um núcleo verdadeiro. não se desenvolve o fuso mitótico e. Nas bactérias não existem histonas. Na maturidade. células eucarióticas sofrem mitose. A maior parte dos ossos de nossa face são provenientes de células que migraram ventralmente da região dorsal da nossa cabeça. a informação herdada necessária para o seu desenvolvimento e metabolismo se encontra codificada nas sequências de ácido desoxirribonucléico (DNA) dos cromossomos. animais. pequenas e circulares consistindo de aproximadamente 1 milhão de pares de bases. Essas células migrantes incluem os precursores das células sangüíneas. ou mais.1.

Gene DNA Éxon 1 Íntron 1 Éxon 2 Íntron 2 Éxon 3 Núcleo Transcrição Transcrição RNA nuclear mRNA Tradução Citoplasma mRNA Processamento de RNA mRNA Tradução mRNA Proteína Proteína Procariotos e eucariotos têm mecanismos diferentes de regulação do gene. Mas a existência de envoltório nuclear em eucariotos proporciona a oportunidade de se obter um tipo de regulação celular totalmente novo. o RNA transcrito deve ser processado para que possa passar através do envoltório nuclear.2 (A) CÉLULA PROCARIÓTICA (B) CÉLULA EUCARIÓTICA Envoltório nuclear Resumo dos passos pelos quais as proteínas são sintetizadas a partir do DNA.6 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. Desenvolvimento entre eucariotos unicelulares Todos os organismos eucarióticos pluricelulares se desenvolveram de protistas unicelulares. um novo nível de complexidade foi adicionado. ainda não havia sido provado se o núcleo continha alguma informação hereditária ou de desenvolvimento. e o DNA e a RNA polimerase necessária para a transcrição estão do outro. Os genes são descontínuos e um envoltório nuclear separa o DNA do citoplasma. (B) Expressão de genes eucarióticos. Os ribossomos. que são responsáveis pela tradução. A regulação pela qual o mRNA pode passar para o citoplasma. ele é imediatamente traduzido em uma proteína enquanto o seu outro terminal está sendo transcrito do DNA (Figura 1. Algumas das melhores evidências para essa teoria vieram de estudos onde organismos unicelulares foram fragmentados em pedaços . Eucariotos simples nos deram os primeiros exemplos da morfogênese direcionada pelo núcleo. transcrição e tradução são eventos simultâneos e coordenados. Controle da Morfogênese no Desenvolvimento em Acetabulária Há um século. Sendo assim. Regiões codificadoras do DNA são colineares com o produto protéico. Em ambos.4). o uso da superfície da célula para mediar cooperação entre células individuais e as primeiras ocorrências de reprodução sexual. Entre a transcrição e a tradução. Assim. (A) Expressão procariótica (bacteriana) do gene. estão de um lado do envoltório nuclear. o DNA é transcrito por enzimas chamadas RNA polimerases para produzir RNA. que é extremamente importante para o organismo em desenvolvimento. Quando o RNA mensageiro (mRNA) é produzido nos procariotos. torna a célula capaz de selecionar quais das mensagens recém-sintetizadas serão traduzidas. nos procariotos. É nesses protistas que as características básicas do desenvolvimento apareceram primeiro.

quase todas as partes morreram. o pedúnculo e o rizóide (Figura 1. O rizóide está localizado na base da célula onde essa é presa ao substrato.6A). O tamanho da Acetabulária e a localização do seu núcleo permitiram que pesquisadores Diagrama de mitose em células animais. os cromossomos duplicados (cada duplicata de cromossomo é um cromatídeo) são separados. regenerando todo a complexa estrutura celular (Figura 1.3 nucleados e anucleados (revisão por Wilson.5) O controle nuclear da morfogênese celular e a interação do núcleo e citoplasma estão muito bem demonstrados nos estudos da Acetabulária. Quando vários protistas foram fragmentados. Anáfase: Os cromossomos duplicados (chamados cromatídeos) são separados. Núcleo Cromossomos filhos Metáfase: Os cromossomos se alinham no equador da célula. Durante a interfase o DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. os cromosssomos se alinham no equador da célula e se inicia a anáfase. . No entanto.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 7 Prófase: O envoltório nuclear quebra e um fuso se forma entre dois centríolos. os fragmentos que continham núcleo foram capazes de sobreviver. Na metáfase. 1986). Na telófase os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Figura 1. Essa enorme célula individual (2 a 4 cm de comprimento) consiste de três partes: o disco reprodutivo. Interfase: DNA é duplicado em preparação para a divisão celular. Cromatídeos do cromossomo Cromatina Nucléolo Região do centrômero Fuso em desenvolvimento Centríolos Áster Envoltório nuclear Nucléolo Envoltório nuclear rompe Prometáfase: Os cromossomos se ligam às fibras dos fusos. Durante a prófase. Telófase: Os cromossomos atingem os pólos mitóticos e a célula começa a invaginar. Cada pólo contém o mesmo número e tipos de cromossomos que continha a célula antes da divisão. O núcleo individual da célula se localiza dentro do rizóide. o envoltório nuclear quebra e forma-se um fuso entre os dois centríolos.

de outra célula. (Cortesia de O. se o núcleo for removido da célula de Acetabulária em estágio inicial do desenvolvimento. crenulata. Ribossomos se juntaram ao mRNA e estão sintetizando proteínas (que não podem ser vistas). A informação no citoplasma não será usada por várias semanas. J. Assim.8 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento DNA Ribossomos RNA Figura 1. Fragmento anucleado morre . antes de formar o disco reprodutivo. Hämmerling descobriu que quando um núcleo de uma determinada espécie era transplantado para o pedúnculo de outra. mas é uma tarefa que pode levar semanas para ser realizada.5 Regeneração do fragmento nucleado do protista unicelular Stylonychia. Como é mostrado na fotografia. Uma porção de DNA de Escherichia coli se estende horizontalmente por essa microfotografia eletrônica. e (2) o material contendo essa informação entra no citoplasma muito antes dessa produção ocorrer. que devem ser acumuladas em certa porção da célula e então organizadas em estruturas complexas específicas da espécie. A. um disco normal se formará semanas depois. L.6B). Hämmerling tirou proveito dessa singular característica e trocou núcleos entre duas espécies morfologicamente distintas. Transcrições de RNA mensageiro podem ser vistas dos dois lados. o novo disco em formação finalmente assumia a forma associada com o núcleo do doador (Figura 1. Esses estudos sugerem que (1) o núcleo contém informação específica sobre o tipo de disco reprodutivo produzido (isto é.) removessem o núcleo de uma célula e o substituísse por outro. mediterranea e A. envolvendo a síntese de um grande número de proteínas. Jr.4 Transcrição e tradução simultânea em procariotos. Nos anos 30. ainda que o organismo irá morrer. Os fragmentos anucleados sobrevivem por algum tempo. Miller. mas finalmente morrem. contém informação genética que especifica as proteínas necessárias para a produção de um certo tipo de disco reprodutivo). O núcleo transplantado da célula realmente direciona a síntese de seu disco reprodutivo espécie-específico. O mRNA pode ser visto aumentando de tamanho. Além disso. foi considerado que o núcleo era o controlador do desenvolvimento da Acetabulária. da esquerda para a direita. A formação de um disco reprodutivo é um evento morfogênico complexo. Fragmento anucleado morre Corte Núcleo Fragmento nucleado se regenera Corte Figura 1. essas duas espécies têm discos reprodutivos muito diferentes. indicando a direção da transcrição.

(B) Efeitos da troca de núcleos entre duas espécies de Acetabulária. Núcleos foram transplantados para fragmentos de rizóides anucleados.) Uma hipótese atual. Fica claro pela discussão anterior. Muitos anos mais tarde. uma vez que o RNA é destruído. Harris. No entanto. Estruturas de A. não pode mais haver a formação do disco reprodutivo. mediterranea Núcleos transplantados Núcleo Núcleo Rizóide Rizóide 1 cm Rizóide 1 cm A estrutura do disco reprodutivo é a do núcleo doador Figura 1. inibe completamente a formação do disco reprodutivo quando adicionada à água marinha na qual cresce a Acetabulária. Cada unidade é uma célula singular. A porção com o núcleo finalmente formou um novo disco. Em células nucleadas. Garcia e Dazy (1986) também demonstraram que a síntese da proteína é especialmente ativa no ápice da Acetabulária. Kloppstech e Schweiger (1975) estabeleceram que o mRNA derivado do núcleo se acumula nessa região. uma enzima que cliva RNA. da mesma forma o fez a extremidade apical do pedúnculo. esse efeito é permanente. O rizóide contém o núcleo. Em células anucleadas. a parte intermediária do pedúnculo não formou o disco reprodutivo. estruturas de A.6 (A) Acetabulária mediterranea (esquerda) e A. conforme esperado. Mas deve ser notado que o . Ribonuclease. no entanto. que a transcrição nuclear tem um papel importante na formação do disco reprodutivo da Acetabulária. Por isso. crenulata Pedúnculo A. é que o núcleo sintetiza um mRNA estável. mediterranea não estão sombreadas. Hämmerling postulou (aproximadamente 30 anos antes de sabermos da existência do mRNA). (Fotografias cortesia de H. um novo disco pode ser formado após a eliminação da ribonuclease. crenulata (direita). sendo de alguma forma guardadas dormentes próximo à extremidade do pedúnculo. proposta para explicar essas observações.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 9 (B) Disco reprodutivo (A) Disco reprodutivo Pedúnculo A.7). Hämmerling fracionou uma Acetabulária jovem em diversas partes (Figura 1. presumivelmente porque um novo mRNA é então produzido pelo núcleo. posicionado em estado dormente no citoplasma até a formação do disco reprodutivo. Essa hipótese é amparada por uma observação publicada por Hämmerling em 1934. que as instruções para a formação do disco reprodutivo se originavam no núcleo. crenulata estão sombreadas.

de uma ameba para a de um flagelado (Figura 1. Durante a maior parte do seu ciclo de vida. a ameba tem que criar centríolos para servir como corpos basais do flagelo (centros organizadores de microtúbulos). Diferenciação em Ameboflagelados Naegleria Um dos casos mais marcantes de “diferenciação” em protistas. Durante esse período. Nessas condições.10 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Disco reprodutivo e pedúnculo regenerados Extremidade apical do pedúnculo Porção central do pedúnculo Sem regeneração Rizóide e núcleo Regeneração total Figura 1. cada N. a N. Nesse organismo unicelular. mediterranea citoplasma também cumpre uma parte essencial na formação desse disco. ao invés de existirem diversos tipos de células diferenciadas em um único organismo. quando as bactérias são diluídas (tanto pela água da chuva quanto pela água nos experimentos). As moléculas de tubulina são organizadas em microtúbulos. Diferenciação para a forma de flagelado ocorre aproximadamente em uma hora (Figura 1. Fulton e Walsh (1980) mostraram que a tubulina dos flagelos de Naegleria não existe . gruberi desenvolve rapidamente uma forma aerodinâmica e dois longos flagelos anteriores. alimentando-se de bactérias do solo e dividindo-se por cisão. essa célula única tem estruturas celular e bioquímica diferentes nos diferentes estágios de sua vida. esses são posteriormente arranjados para permitir o movimento flagelar. é aquele de Naegleria gruberi. Esse organismo ocupa um lugar especial na taxonomia protista porque pode mudar sua forma. assim como criar o próprio flagelo. das quais a mais abundante é a tubulina. mesmo estando no citoplasma.7 Habilidade regenerativa de diferentes fragmentos da A. O mRNA não é traduzido durante semanas.9). a expressão do disco reprodutivo é controlada não somente pela transcrição nuclear como também pelo controle de tradução do RNA citoplasmático. Portanto. gruberi é uma ameba típica. No entanto. o “desenvolvimento” é controlado em ambos estágios de transcrição e de tradução. que são usados para encontrar regiões mais abundantes em bactérias. Algo no citoplasma controla quando as mensagens devem ou não ser utilizadas. Os corpos basais e os flagelos são compostos de diversas proteínas.8).

Linha superior corada com Iodo/Lugol. Então. esse antibiótico previne a síntese da tubulina. que é o agrupamento de moléculas de tubulina para a produção do flagelo. não é somente a tubulina que produz o flagelo. emergência de flagelos visíveis (D) 120 minutos.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 11 (A) (B) (C) (D) Figura 1. Tal controle pós-tradução. está evidente no flagelo do espermatozóide e nos cílios da medula espinhal e do trato respiratório. é visto em toda a natureza. parece que o mRNA para a tubulina foi produzido durante os primeiros vinte minutos após a diluição e usado logo em seguida. 1984.) . Notamos também um outro processo que permanece extremamente importante no desenvolvimento de todos os outros animais e plantas. os pesquisadores manipularam transcrições em vários estágios com actinomicina D. (B) 25 minutos. onde uma proteína não é funcional até que esteja ligada a outras moléculas. e esses por sua vez agrupados de forma ordenada. 1984). Até mesmo processos celulares têm a sua própria “morfogênese” baseada em interações moleculares entre os fragmentos de proteína. Quando adicionada anteriormente à diluição do alimento. cortesia de C. a tubulina ainda é produzida em tempo normal (aproximadamente 30 minutos mais tarde). linha inferior corada com um anticorpo fluorescente à proteína tubulina dos microtúbulos.8 em seu estágio de ameba. será discutido melhor mais tarde. (A) 0 minutos. Transformação de Naegleria gruberi da forma amebóide ao estado flagelado. Para mostrar isso. se a actinomicina D é adicionada 20 minutos após a diluição. Existem em torno de 300 outras proteínas em cada flagelo. uma droga antibiótica que seletivamente inibe a síntese do RNA. mostrando flagelos maduros e forma aerodinâmica do corpo (de Walsh. Walsh. Vimos então. que o desenvolvimento em eucariotos unicelulares pode ser controlado nos estágios de transcrição. No entanto. Em mamíferos. e o movimento flagelar depende da orientação adequada dessas proteínas uma em relação a outra. A transformação é iniciada pela eliminação do alimento (bactérias) da colônia de Naegleria. Mais ainda. ao passo que mRNA extraído de células diferenciadas continha muitas mensagens desse tipo (Walsh. É produzida de novo (“desde o começo”). mostrando síntese de nova tubulina. temos aqui um excelente exemplo de controle transcricional de um processo de desenvolvimento: O núcleo da Naegleria responde a mudanças ambientais sintetizando o mRNA para tubulina flagelar. tradução e pós-tradução. Esse arranjo. começando com uma nova transcrição no núcleo. detectável para tubulina flagelar. Essa interpretação foi confirmada quando foi demonstrado que o mRNA extraído da ameba não continha mensagem alguma. Portanto. (C) 70 minutos. pelo qual a tubulina é polimerizada em microtúbulos.

10 Sexo em bactérias.) a lin bu a tu e ç da m e co es r nt l a Sí a g e fl am o de rp r nç to s co ela ca o en al n t is de lag m ula m ve os e pa cél nda isí ão a f el r i m u v aç m ag gr s. Aos 80 minutos. houve sexo. Quando dois paramécios se juntam. Algumas células de bactérias estão cobertas de numerosos apêndices (pilos) sendo capazes de transmitir genes para uma célula recipiente (sem pilos) através de um pilus sexual.) As Origens da Reprodução Sexual A reprodução sexual é outra invenção dos protistas que teve um profundo efeito em organismos mais complexos. (Segundo Fulton. mas o sexo é realizado através de conjugação. . praticamente toda a população desenvolveu flagelo. Amebas que vinham crescendo em um meio enriquecido com bactéria são lavadas afim de se eliminar as bactérias no tempo 0. Reprodução na ausência de sexo é uma característica de organismos que se reproduzem por cisão. As bactérias são capazes de transmitir genes de um indivíduo para o outro por meio dos pilos sexuais (Figura 1. eles se unem através de seus aparelhos orais formando uma conexão citoplasmática através da qual podem trocar material genético (Figura 1. não há discriminação nos genes quando uma ameba se divide ou quando uma hidra brota células para formar uma nova colônia. Essa transmissão é independente da reprodução. se reproduzem por cisão. Cada micronúcleo migratório atravessa a ponte citoplasmática e se funde com o micronúcleo estacionário (“fertilizante”). 1977. Brinton.10). degeneram. Protistas são também capazes de reorganizar genes sem reprodução. O micronúcleo remanescente divide-se mais uma vez para formar um micronúcleo estacionário e um micronúcleo migratório. por exemplo. A reprodução envolve a criação de novos indivíduos. Sexo sem reprodução também é comum entre os organismos unicelulares. (Cortesia de C. dos quais todos. Ainda que não tenha ocorrido reprodução. Carnahan. Jr. exceto um.9 Diferenciação do fenótipo flagelado em Naegleria. Cada macronúcleo (que controla o metabolismo do organismo) degenera enquanto o micronúcleo passa por meiose para produzir oito micronúcleos haplóides.11). o pilus sexual está realçado por partículas virais que se ligam especificamente àquele estrutura. criando um novo núcleo diplóide em cada célula. C. Os paramécios. o m or os A asai rred Fl o m p l el or f c ta b a F m ag se to Fl co co rp os 100 Porcentagem da população com flagelo 80 Células de corpo com forma flagelar 60 40 20 0 0 20 40 60 Tempo após suspensão (minutos) 80 100 Figura 1.12 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. Deve-se notar que sexo e reprodução são dois processos separáveis e distintos. Sexo envolve a combinação de genes de dois indivíduos distintos em um novo arranjo. Esse núcleo diplóide se divide mitoticamente fazendo surgir um novo micronúcleo e um novo macronúcleo quando os dois parceiros se separam. e J. Nessa figura.

Aqui está uma reprodução sexual.) A união desses dois processos distintos.12 mostra o ciclo de vida da Chlamydomonas. Esses setores especializados contêm componentes reprodutivos específicos que permitem a fusão dos citoplasmas. no entanto. Com a evolução da reprodução sexual. 1985.13). deixando cada um com genes que diferem daqueles com os quais iniciaram o processo. 1975). O outro avanço é o mecanismo pelo qual os parceiros reprodutivos diferentes se reconhecem um ao outro. é visto em eucariotos unicelulares.. 1975. dois importantes avanços foram alcançados. . macronúcleos degeneram Todos menos um dos micronúcleos de cada parceiro degeneram Micronúcleo estacionário Micronúcleo migratório Micronúcleo restante se divide para formar um micronúcleo estacionário e um migratório Micronúcleos migratórios atravessam a ponte citoplasmática e fertilizam os micronúcleos estacionários do parceiro Núcleo diplóide se forma e sofre divisões mitóticas para gerar um novo macronúcleo e dois micronúcleos quando os paramécios se separam Figura 1. pois cromossomos são realinhados durante as divisões meióticas onde mais indivíduos são formados. O primeiro é o mecanismo da meiose (Figura 1. Seguindo-se à aglutinação. Em Chlamydomonas. A Figura 1. Esse organismo é geralmente haplóide. A aglutinação dos flagelos permite que regiões específicas das membranas celulares se juntem. juntam-se os citoplasmas e seus núcleos se fundem para formar um zigoto diplóide. (Strickberger. Bergman et al. Note que nesse tipo de reprodução sexual protista.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 13 Micronúcleo Macronúcleo Fuso meiótico Ponte citoplasmática Dois paramécios formam ponte citoplasmática Micronúcleos passam por meiose. Goodenough e Weiss. os indivíduos mais iniciam a fusão estendendo um tubo de fertilização. os gametas são morfologicamente idênticos e a distinção entre espermatozóide e óvulo ainda não aconteceu. o reconhecimento ocorre primeiro nas membranas flagelares (Figura 1. em reprodução sexual. portando apenas uma cópia de cada cromossomo (como os gametas dos mamíferos).11 União de paramécios através da ponte citoplasmática. sexo e reprodução. estão divididos em dois grupos de parceiros: mais e menos. Esse zigoto é a única célula diplóide do ciclo de vida e passará por meiose para formar quatro novas células de Chlamydomonas. formando 8 núcleos haplóides por célula. Quando se encontram. pelo qual o complemento diplóide dos cromossomos é reduzido ao estado haplóide (discutido em detalhe no Capítulo 22). Os indivíduos de cada espécie.14. onde dois paramécios podem trocar material genético.

Após a primeira metáfase. podem se reproduzir assexuadamente quando separadas. . Durante a segunda divisão.13 Sumário da meiose. os dois cordões podem se unir para produzir uma célula diplóide que pode sofrer meiose para formar quatro novos organismos haplóides. MEIOSE I Envoltório nuclear Núcleo Cromossomos homólogos Cromatídeos homólogos Cromatina Interfase Prófase I precoce Meia prófase I Prófase I tardia Metáfase I O envoltório nuclear se rompe e cromossomos homólogos (cada cromossomo sendo duplo. Durante a prófase. com os cromatídeos juntos no centrômero) se alinham em pares. O DNA e as proteínas associadas replicam durante a interfase. Rearranjos cromossômicos podem ocorrer entre os quatro cromatídeos homólogos neste momento. (Segundo Strickberger. o envoltório nuclear se rompe e os cromossomos homólogos (cada cromossomo é duplicado.12 Reprodução assexual (mitótica) Parceiro tipo mais (haplóide) Parceiro tipo menos (haplóide) Reprodução sexual em Chlamydomonas.) Reprodução sexual Acasalamento Fusão citoplasmática Zigoto (diplóide) Maturação (meiose) Germinação Dois parceiros tipo mais e tipo menos Figura 1. com os cromatídeos ligados no centrômero) se alinham aos pares.14 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes. 1985. ambas haplóides. Respeitando certas condições. o centrômero se divide. deixando cada nova célula com uma cópia de cada cromossomo. Duas linhagens. Reagrupamentos cromossômicos podem ocorrer entre quatro cromatídeos homólogos nesse estágio.

Os flagelos que interagem. envolvendo a cooperação entre células individuais. Goodenough. mitose e meiose são aperfeiçoadas. No Capítulo 4.também é usado para estender processos do espermatozóide e óvulo do ouriço-do-mar.Tal cooperação intercelular se torna ainda mais importante com a evolução de organismos multicelulares. por tradução e pós-tradução.. MEIOSE II Anáfase I Telófase I Os dois cromossomos homólogos originais são segregados em células diferentes Metáfase II Anáfase II O centrômero se divide Telófase II Cada nova célula tem uma cópia de cada cromossomo .) Esse tubo conecta e se funde com um local específico no indivíduo menos. torcemse um em torno do outro.polimerização da proteína actina . Os microfilamentos se estendem da célula doadora (abaixo) para a célula recipiente (acima). existe um mecanismo para processar o RNA através da membrana nuclear. 1975 e Bergman et al.000x) de uma ponte citoplasmática conectando os dois organismos. veremos que o reconhecimento e fusão de espermatozóide e óvulo ocorrem de uma maneira espantosamente semelhante a desses protistas. Eucariotos unicelulares parecem ter os elementos básicos do processo de desenvolvimento que caracterizam os organismos mais complexos: a síntese celular é controlada pela regulação transcricional. É interessante que o mecanismo usado para estender esse tubo . (de Goodenough e Weiss. as estruturas de genes individuais e cromossomos são como serão através da evolução eucariótica. aderindo nas pontas (flexas). e a reprodução sexual existe. (A) Varredura por micrografia eletrônica (7000x) de par em acasalamento.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 15 (A) (B) Figura 1. com permissão de U. 1975.14 Microfilamentos Duas etapas do reconhecimento no acasalamento de Chlamydomonas. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão (20.

um princípio muito importante tem-se desenvolvido: a divisão ordenada de uma célula para gerar um número de células que são organizadas de uma maneira previsível. as divisões celulares pelo qual uma única célula de volvocacea produz um organismo de 4 a 64 células ocorrem em uma seqüência muito rápida e com ausência de crescimento celular. enquanto as células anteriores permanecem pequenas e biflageladas. como o Chlamydomonas. As Volvocaceanas Os organismos mais simples entre as volvocaceanas são reuniões ordenadas de numerosas células. e normalmente o faz. Os dois próximos gêneros da série volvocacea exibem um outro princípio importante do desenvolvimento: a diferenciação de tipos celulares em organismo individual. (F) Volvox carteri. Um único organismo de volvocacea do gênero Gonium (Figura 1. produzir um organismo novo completo por mitose (Figura 1. cada uma com seu próprio flagelo. As células reprodutivas se diferenciam das células somáticas. BD. (D) Eudorina elegans. Aqui todas as 64 células são originalmente similares. relativamente poucas células podem se reproduzir. lembram Chlamydomonas. Todas. O primeiro caminho envolve a divisão ordenada da célula reprodutiva e a subseqüente diferenciação da sua progênie em diferentes tipos de células. Nesses organismos. somáticas. A complexidade aumenta do Chlamydomonas unicelular ao Volvox pluricelular.B). 25µm. F.15 Representante da ordem dos Volvocales. toda a célula pode. por exemplo. As células menores.) (A) (B) (C) (D) (E) (F) . cada uma parecida ao protista unicelular Chlamydomonas. Em todos os gêneros já mencionados. Nos gêneros Pleodorina e Volvox. e no Eudorina.16 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Eucariotos coloniais: A evolução da diferenciação Um dos mais importantes experimentos da evolução foi a criação de organismos pluricelulares.16 A. Em um gênero relacionado. células destinadas a se tornarem gonídios são separadas no começo do desenvolvimento e nunca desenvolvem características somáticas. Pandorina. (E) Pleodorina californica. porém. (B) Gonium pectorale com oito células Chlamydomonas-símiles em um disco convexo. E. a esfera contém 32 ou 64 células organizadas em um padrão regular. Aqui. Barra em A é de 5µm. 50µm (Cortesia de D.15). somente aquelas Figura 1. Parece ter havido diversos caminhos pelo qual uma única célula evoluiu para uma disposição pluricelular. Kirk. Na Pleodorina californica. mas as posteriores desdiferenciam e rediferenciam como células assexuadas reprodutivas chamadas gonídios. (A) o protista unicelular Chlamydomonas reinhardtii. consiste de uma placa plana contendo de 4 a 16 células. coletivamente referidos como a família das Volvocaceas ou volvocaceanas. 16 células formam uma esfera. Como ocorre na maioria dos embriões animais. menos o Chlamydomonas. discutiremos apenas dois deles (veja o Capítulo 23 para uma discussão mais completa). as células da região anterior são restritas à uma função somática. são membros da família das Volvocaceas. Esse caminho para a multicelularidade pode ser visto em uma notável série de organismos pluricelulares. (C) Pandorina morum.

(C) Volvox carteri maduro. eles primeiro sofrem meiose para produzir herdeiros haplóides dos dois parceiros em números iguais. a reprodução sexual é isogâmica. Ainda que as volvocaceas mais simples sejam consideradas organismos coloniais (porque cada célula é capaz de existência independente e perpetuação da espécie). essa separação de células germinativas das células somáticas no início do desenvolvimento é característica de muitos filos animais e será discutida em maior detalhe no Capítulo 13. cortesia de D. estrutura e motilidade. são derivadas de células que originalmente parecem e funcionam como células somáticas antes de crescer e se dividir para formarem uma nova progênie. incluindo seu parente unicelular Chlamydomonas. uma típica colônia de 128 células tem 48 células somáticas e uma colônia de 64 células tem 24 células somáticas. carteri temos um organismo verdadeiramente celular com dois tipos de células independentes e distintos (somático e reprodutivo). Células germinativas (gonídia) começaram a se dividir em novos organismos. são inteiramente especializadas para reprodução. 1982. Em muitas espécies de Chlamydomonas. Nos Volvox. Embora todas as volvocaceas. [other. em outros membros do gênero. Isso é chamado heterogamia. Dessa maneira. e muito poucas células são capazes de produzir novos indivíduos.1921. e a relação do número de células somáticas para o número de células reprodutivas é normalmente 3:5. também são capazes de reprodução sexual. As células reprodutivas nunca desenvolvem um flagelo funcional e nunca contribuem para motilidade e outras funções somáticas do indivíduo. no V. carteri.assim como as várias espécies de volvocaceas coloniais . células reprodutivas como as da Pleodorina. inativo. existe uma divisão do trabalho completa: as células reprodutivas que vão criar a nova geração são colocadas de lado durante a divisão das células reprodutivas que estão formando um novo indivíduo. Em algumas espécies de Volvox. quase todas células são somáticas. a colônia normalmente tem 128 ou 64 células. C de Kirk et al. já que os gametas haplóides que se encontram são similares em tamanho.12. A maioria das células são incapazes de se reproduzir. Aqui vemos um gameta especializado para retenção de recursos nutricionais e de desenvolvimento e outro gameta especializado para transporte de núcleos. que envolve a produção de óvulos grandes e relativamente imóveis por um parceiro do acasalamento e espermatozóides pequenos e móveis pelo outro parceiro (veja Visões Colaterais & Especulações). incluindo a ilustrada na Figura 1. No entanto.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 17 Figura 1. Mas as volvocaceas maiores desenvolveram uma forma especializada de heterogamia.html#intro1] .16 (A) (B) (C) Reprodução assexuada nas volvocaceanas. Em P. chamada oogamia. (B) Cada uma das células de E. em outras espécies de Chlamydomonas .. as volvocaceas incluem os organismos mais simples que têm macho e fêmea distinguíveis. Embora nem todos os animais separem suas células reprodutivas das células somáticas (e as plantas raramente o fazem). Em todas as volvocaceas. como o V. ambos requeridos para a perpetuação da espécie (Figura 1.) células do lado posterior podem se reproduzir. Assim. e possuem caminhos diferentes para desenvolver o óvulo ou o espermatozóide.16C).gametas nadadores de diversos tamanhos são produzidos por parceiros de acasalamentos diferentes. californica. Quando as condições permitem aos zigotos germinar. (A e B segundo Hartmann. elegans se divide e produz uma nova colônia. a reação da fertilização se assemelha à do Chlamydomonas porque resulta na produção de um zigoto diplóide dormente. No entanto. Kirk. (A) Colônia madura de Eudorina elegans. capaz de sobreviver a condições ambientais severas. se reproduzam predominantemente por meios assexuados. Isso envolve a produção e fusão de gametas haplóides.

chamadas gonídios. o Volvox está entre os organismos mais simples a exibir a divisão de trabalho entre dois tipos de células diferentes. Como conseqüência disso. elas são parentes. 1988.17). cada gonídio divide-se rapidamente 11 ou 12 vezes. pelo qual o embrião se vira com o lado certo para fora através de movimentos celulares que fazem lembrar movimentos de gastrulação no embrião animal (Figura 1.17 Embriogênese Adulto com juvenis Adulto com gonídios maduros Expansão de adultos e juvenis Reprodução assexual em V. são potencialmente imortais. Como já foi mencionado. quando isso acontece. está entre os organismos mais simples a incluir a morte como uma parte regular. da sua história de vida. No fim da clivagem. todas as células que estarão presentes no adulto. entram em um estado semelhante à clivagem do desenvolvimento embrionário para produzir seres juvenis dentro do adulto. (Segundo Kirk. Um agrupamento de Figura 1. o volvox embrionário se inverte e é finalmente liberado do progenitor. Através de uma série de movimentos celulares semelhantes à gastrulação. Considere o histórico de vida do Volvox carteri quando se reproduz assexuadamente (Figura 1.18 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações Sexo e Individulidade em Volvox S imples como é. O ciclo sexual total dura dois dias. nenhuma das duas células resultantes pode ser considerada ancestral ou progênie. a morte se torna uma parte essencial da vida para qualquer organismo pluricelular que estabelece divisão de trabalho entre células somáticas e células germinativas (reprodutivas). A morte chega para uma ameba apenas se ela é ingerida ou sofre um acidente fatal. passam por senescência e morrem.) Maturação dos gonídios Expansão continuada da matriz extracelular Expansão continuada de juvenis Liberação de juvenis Morte de células somáticas . Cada adulto assexuado é um esferóide contendo aproximadamente 2000 pequenas células somáticas biflageladas ao longo de sua periferia e por volta de 16 grandes células reprodutivas assexuadas. o Volvox compartilha muitos traços que caracterizam o ciclo de vida e histórico de desenvolvimento de organismos muito mais complexos. Porém. A ameba que vemos sob um microscópio não tem ancestrais mortos! Quando uma ameba se divide. geneticamente programada. Parte dessa divisão é assimétrica e produz as 16 células grandes que irão se tornar um novo conjunto de gonídios. As células somáticas do progenitor. Morte e Diferenciação Organismos unicelulares que se reproduzem através de uma simples divisão celular. foram produzidas de cada um dos gonídios. a célula morta não deixa prole.progenitores . carteri. Quando as células reprodutivas (gonídios) estão maduras. sem gonídios. Quando maduro. Mas o embrião está “virado de dentro para fora”: seus gonídios estão do lado de fora e os flagelos de suas células somáticas estão apontando para o interior da esfera oca de células. enquanto a colônia juvenil amadurece. tais como as amebas. incluindo nós mesmos. dispostas em umas das extremidades do interior. Essa condição adversa é corrigida por um processo chamado inversão.18).

carteri produzidos assexuadamente. carteri. Em V. Kirk. O embrião se utiliza desse buraco para fazer a inversão e depois o fecha. (Kirk et al.19 “Células garrafas” próximas à abertura do fialoporo. 1988). Além do mais. Em linhagens laboratoriais possuindo mutações desse gene. cortesia de D. ( Kirk et al.. FJ são cortes sagitais através do centro do embrião. as células somáticas abandonam suas tendências suicidas.G). desse modo criando a tensão que causa a curvatura da lâmina celular interconectada. 1982. como assinala David Kirk. 1982. Essas células permanecem estreitamente conectadas através de pontes citoplasmáticas próximas a seus ápices alongados. incluindo sua própria cria.) (C) (H) das células que as produzem (Pommerville e Kochert. O que acontece às células somáticas do “progenitor” Volvox agora que as jovens “deixaram o lar”? Tendo produzido uma cria e sendo incapazes de uma nova reprodução. “Dessa maneira emerge”. Para ser mais exato.19). (D) (I) (E) (J) células em forma de garrafa abre um buraco em um dos lados do embrião produzindo tensão sobre a camada de células interconectadas (Figura 1. essas células somáticas morrem. visualizado por microscopia diferencial de interferência. Kirk. Kirk.. H-J).18 (B) (G) Inversão dos embriões V. as células liberam para o uso de outras. sintetizando um conjunto de proteínas que causam a morte e a dissolução Figura 1. e as células serão capazes de se tornarem gonídios (D. foi identificado um gene* específico que tem um papel importante regulando a morte das células (Kirk. As células se curvam e se reúnem em um dos pólos (C-E. ganham a habilidade de se reproduzirem * Esse gene (regA) foi clonado e mostrou codificar uma proteína que age para reprimir (direta ou indiretamente) todos os genes cujos produtos são requeridos pela célula para se desenvolver como gonídio. Antes da inversão. A-E são micrografias eletrônicas de varredura de embriões completos. Posteriormente. Mutações de perda da função impedirão a proteína de agir. Quando as células mudam a sua forma. 1982).CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 19 (A) (F) Figura 1. um buraco (o fialoporo) abre-se no topo do embrião (A. nessa morte. “um dos grandes temas da vida no planeta Terra: Alguns morrem para que outros possam viver”. o embrião é uma esfera côncava de células conectadas.) .F. elas cometem suicídio. cortesia de D. todo o nutriente acumulado durante toda a vida. as colônias juvenis são enzimaticamente soltas do progenitor e nadam livres.B. comunicação pessoal).

[intro2. carteri sob condições naturais. tomba em silêncio. Volvox recémeclodido carregando essa mutação (A) é indistinguível do esferóide tipo-selvagem. assim como o é para um camundongo ou o homem. Esses volvox morreriam em minutos se a poça secasse. carteri se reproduzindo assexuadamente a maior parte do tempo. ano após ano? O estímulo para mudança do modo assexual para o modo sexual de reprodução em V. ”E pergunta: “Vale a pena?” Para Volvox carteri.20 Mutação de um único gene (chamado regenerador somático A) elimina a programação de morte em células V. vai para o fundo juntar-se a seus ancestrais. certamente que sim. Quando sua hora chegar. porque teve filhos e não é mais necessário. carteri é devido a uma proteína (B) Figura 1. carteri nada livremente. No entanto.21 advento da inevitável morte natural no reino animal. que podem fertilizar os óvulos.html] Entra o sexo Mesmo o V. na natureza se reproduzem sexualmente uma vez por ano. “Esse é o primeiro Figura 1. carteri. Como esses organismos tão simples prevêem a chegada de condições adversas com acuidade suficiente para produzir uma geração sexual no tempo certo. indica que a morte das células tem um papel importante na sobrevivência do V. os gonídios de ambos parceiros passam por uma embriogênese modificada que leva à formação de óvulos nas fêmeas e espermatozóides nos machos. escreveu. Durante a maior parte desse tempo.20 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) assexuadamente e se tornam potencialmente imortais (Figura 1. V. Quando os gametas estão maduros. Desenvolvimento sexual de gonídios Pacotes de espermatozóide Indutor sexual Espermatozóide Macho assexuado Gonídio Desenvolvimento embrionário modificado dos gonídios resultando em produção de gametas Macho sexuado Óvulos Indutor sexual Óvulo Fêmea assexuada Meiose e germinação Fêmea sexuada Zigotos . carteri vive em pequenas poças rasas que temporariamente se enchem com as águas das chuvas da primavera e secam no calor do verão. Machos e fêmeas são indistiguíveis na sua fase assexuada. pacotes de espermatozóide (contendo 64 ou 128 espermatozóides cada). O zigoto resultante tem paredes duras que podem resistir à seca. Quando as chuvas da primavera fazem o zigoto germinar. uma geração de indivíduos morre. Ao alcançar a fêmea o pacote se rompe em espermatozóides individuais. Quando a chuva enche esses pequenos reservatórios na primavera. V. os zigotos interrompem a sua dormência e criam uma nova geração para reproduzirem-se assexuadamente até que as águas ameacem secar novamente. calor e frio. sofrendo meiose para produzir machos e fêmeas haplóides que se reproduzem assexuadamente até o calor induzir novamente o ciclo sexual. carteri é capaz de sobreviver se tornando sexual pouco antes da secagem das poças. Volvox deve morrer. cada célula do mutante irá se dividir para formar ( regenerar) um novo esferóide que irá repetir esse ciclo do desenvolvimento potencialmente imortal. O fato desses mutantes nunca terem sido encontrados na natureza. carteri. Como Hegner. Quando o faz. momentos antes das células somáticas do esferóide tipo-selvagem começarem a morrer. como Leeuwenkoek observou. e uma nova geração geneticamente diferente é produzida. são liberados e nadam para as fêmeas. Quando a proteína indutora sexual está presente. as células somáticas desse mutante se rediferenciam como gonídios (B).Mas para o Volvox a morte parece inevitável. O naturalista Joseph Wood Krutch (1956) colocou isso de uma forma mais poética: A ameba e o paramécio são potencialmente imortais.. o zoologista de Johns Hopkins. reproduzindo-se assexuadamente. mas o V. produzindo zigotos inativos que sobrevivem ao calor e à seca do alto verão e ao frio do inverno. e tudo em nome do sexo..20). Finalmente. Reprodução sexual em V.

1908).22. que se dobra formando uma lesma migratória (com a ponta na frente). Essa descoberta explica uma observação feita há quase 90 anos. quando atinge uma área iluminada. Observamos. É melhor considerá-lo como uma ameba social. porque células inicialmente iguais são diferenciadas em dois tipos alternativos de células. multiplicar-se. Os espermatozóides são liberados para nadar para a fêmea onde fertilizam os óvulos para produzir zigotos dormentes (Figura 1. Em adição a esse ciclo sexual. cada uma tornando-se uma nova mixameba. Ainda que reservatórios temporários formados pela água das chuvas sequem sob o calor do verão. Diferenciação e Morfogênese em Dictyostelium O CICLO DE VIDA DO DICTYOSTELIUM. Essa proteína é tão poderosa que concentrações menores que 6x10-17 fazem com que os gonídios sofram um padrão modificado de desenvolvimento embrionário que resulta na produção de óvulos ou espermatozóides. O grex começa a migrar (se o ambiente está escuro e úmido) com sua ponta anterior um pouco levantada.* O ciclo de vida desse organismo fascinante é ilustrado na Figura 1. representando 15 a 20 porcento de toda população celular. descobriram que o ciclo sexual poderia ser iniciado esquen- tando placas com V. As células do pedúnculo morrem. carteri à temperaturas que poderiam ser encontradas em um reservatório raso durante o fim do verão. transformam-se em células-esporo. Dictyostelium tem sido um maravilhoso organismo experimental para biologistas do desenvolvimento. existe a possibilidade para sexo em Dictyostelium. formam o pedúnculo tubular. parecido com a formação de tecidos em organismos * Embora chamado coloquialmente um “fungo celular pegajoso”.21). dezenas de milhares dessas amebas se juntam para formar um fluxo corrente de células que convergem em um ponto central. formam vacúolos e aumentam de tamanho levando a massa de células pré-pedúnculo que havia ficado nos quatro-quintos posteriores do grex (Jermyn e Williams. A lesma (geralmente lhe é dado um título mais dignificado de pseudoplasmódio ou grex) mede normalmente de 2 a 4 mm de comprimento e é envolvida por uma bainha viscosa. À medida que as células pré-pedunculares se diferenciam. . que o desenvolvimento está criticamente ligado ao ecossistema ao qual o organismo se adaptou para sobreviver. novas mixamebas são liberadas. O pedúnculo começa na parte centro-anterior da célula. se enquista em uma parede grossa e sofre divisões meiótica e mitótica. mas as células posteriores. esporo e pedúnculo. enquanto as células prépedunculares começam a secretar um revestimento extracelular estendendo um tubo através do grex. as células somáticas dos volvox assexuados produziam a proteína sexual indutora. elevadas acima do pedúnculo. também. Subseqüentemente. nem é consistentemente pegajoso. Um outro tipo de organização multicelular derivada de organismos unicelulares é encontrada no Dictyostelium discoideum. se alimentando de bactérias e se reproduz por cisão binária. uma solitária ameba haplóide (chamada myxamoebae ou “ameba social” para distingui-las de espécies de amebas que sempre permanecem solitárias) vive em troncos caídos. Volvox encontrou um meio de sobrevivência: usa o calor para induzir a formação de indivíduos sexuados cujo acasalamento produz zigotos capazes de sobreviver sob condições que matam o organismo adulto. Essas se dispersam. Duas amebas podem fundir-se para criar uma célula gigante. que digere todas as outra células do agregado. Quando tiver esgotado seu suprimento de comida.. de que “na intensa radiação solar do verão de Nebraska. Em seu ciclo vegetativo. uma ponta surge no topo desse monte. É também um organismo onde células individuais se juntam para formar uma estrutura coesa composta por tipos de células diferenciadas. Dictyostelium não é um fungo (como Neurospora). e por fim. Quando tiver ingerido todos seus vizinhos. 1991). realizando uma orgia sexual reprodutiva em poças de água da chuva de apenas duas semanas” (Powers.1993). Quando isso era feito. Sendo a quantidade da proteína secretada por um indivíduo suficiente para iniciar o desenvolvimento sexual em mais de 500 milhões de volvox assexuados. Volvox é capaz de aparecer. dependendo do sexo genético do indivíduo (Sumper et al. e o grex se diferencia em um corpo de frutificação composto de células esporos e pedúnculo. a migração cessa. um único volvox indutor pode converter um reservatório inteiro para a sexualidade.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 21 sexual indutiva de 30-kDa. Qual é a fonte dessa proteína indutora sexual? Kirk e Kirk (1986). As células anteriores. Aqui se amontoam uma sobre a outra sob forma de um cone chamado de agregado apertado ou justo.

1967. Embora o movimento seja direcionado para um ponto central. A agregação é iniciada à medida que cada célula começa a sintetizar o cAMP. 1989). mais complexos. esse pára de se movimentar e forma um corpo de frutificação que libera mais esporos. Antes. e forma-se um agregado de pseudoplasmódio. Durante as 5 horas seguintes. as células se juntam umas às outras para formar correntes. 1975). cuja estrutura química está mostrada na Figura 1. ocorre agregação em pontos centrais. Células vizinhas respondem ao cAMP de duas maneiras: ou iniciando sua movimentação de acordo com as pulsações de cAMP. as células são vistas mover-se por aproximadamente 20µm / min durante 100 segundos. os locais de agregação são determinados pela distribuição das amebas (Keller e Segal. e finalmente todas se juntam no centro. 1969). Shaffer. ou acompanhando a liberação de seu cAMP próprio (Robertson et al. Esporos haplóides originam mixamebas. Os números referem-se às horas decorridas desde que a diluição nutricional iniciou a seqüência desenvolvimental. Tyson e Murray.. A medida que diminui o suprimento alimentar. grex) 15 h 14 h 16 h 17 h MIGRAÇÃO CULMINAÇÃO 20 h 12 h Esporos 23 h 10 h AGREGAÇÃO Mixamebas 9 h Corpo de frutificação 6 h Fluxos celulares maduro 24h Figura 1. Essa substância foi posteriormente identificada como adenosina 3’. a células não respondem mais aos pulsos de cAMP por vários minutos. 1970. A agregação de milhares de amebas em um único organismo é um feito incrível de organização e convida à experimentação para resolver perguntas sobre os mecanismos envolvidos. Bonner et al. Esse movimento cessa após aproximadamente 4 minutos.. A primeira pergunta é: O que induz a ameba a se agregar? Microcinematografia de espaçamento temporal mostrou que não ocorre movimento direcionado durante as primeiras 4-5 horas após carência nutricional. e em seguida recomeça. Bonner (1947) e Shaffer (1953) mostraram que esse movimento é devido à quimiotaxia: as células são guiadas para os centros de agregação por uma substância solúvel. Finalmente.23A. porém. Antes. essas convergem em correntes maiores. que podem reproduzir-se assexualmente para formar mais mixamebas haplóides.22 Ciclo vital de Dictyostelium discoideum. 1972. não é um simples movimento radial.. Não há células “dominantes” que começam a secreção ou controlam as outras. O .22 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Lesma (Pseudoplasmódio. AGREGAÇÃO DE CÉLULAS DE DICTYOSTELIUM. Em seguida.5’ monofosfato cíclico (cAMP) (Konijn et al.

as bandas escuras são células que pararam de se mover e se arredondaram.23B-D). Células centrais secretam cAMP em intervalos regulares. enquanto as células remanescentes.. 1989. O resultado é a espiral rotatória de cAMP e a migração vistas na Figura 1. à medida que o cAMP interage com as células que recebem e propagam o sinal. As bandas claras são compostas de células migratórias alongadas. Essa habilidade de células mudarem seus destinos desenvolvimentais. É interessante que as mesmas fórmulas matemáticas predizem o comportamento de certas reações químicas e a formação de novas estrelas em galáxias espirais rotatórias (Tyson e Murray.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 23 (A) Adenina (B) (C) (D) Figura 1. As células na área permanecem insensíveis às novas ondas de cAMP até que o cAMP ligado seja removido dos receptores por outra enzima da superfície celular. (D) As células formam correntes. Siegert. Quimiotaxia de amebas de Dictyostelium devida à ondas espirais de cAMP. À medida que chega cada onda.23 resultado é uma onda giratória em espiral de cAMP. cortesia de P. é tomada uma decisão de modo tal. (A) estrutura química do cAMP. as células que recebem a parte frontal da onda começam a migrar com uma velocidade diferente daquela das células atrás delas. as regiões de alta concentração de cAMP na cultura aparecem mais claras que aquelas de baixa concentração de cAMP.) . O cAMP das células secretoras dilui o cAMP radiativo. posteriores. é iniciada movimentação em direção à fonte de cAMP. as células que agora se encontram no final anterior após a cirurgia (e que originalmente estavam destinadas a formar esporos). que células anteriores virem células pedunculares e células posteriores virem esporos. as células dão mais um passo para o centro. em geral estão destinadas a formar esporos. e enzimas adenilciclases (que sintetizam cAMP a partir de ATP) são ativadas. e cada secreção difunde para fora como um onda concêntrica. Porém. 1989).D) Ondas espirais de amebas movendo-se em direção à fonte inicial de cAMP. Como células móveis e imóveis dispersam a luz diferentemente. De alguma maneira.23.* A diferenciação de amebas individuais em células pedunculares (somáticas) ou esporos (reprodutivas) é uma questão complexa. 1981. a remoção cirúrgica da parte anterior da lesma não elimina a capacidade do grex formar um pedúnculo. A matemática de tais reações de oscilação prevê que a difusão de cAMP seria inicialmente circular. O cAMP recém-formado ativa seus receptores próprios. (B de Tomchick e Devreotes. * A bioquímica dessa reação envolve um receptor que liga o cAMP. Em vez disso. Devreotes. As ondas são mapeadas saturando-se papel de filtro com cAMP radioativo e colocando-o sobre uma colônia em agregação. a fotografia reflete movimento celular. assim como aqueles de seus vizinhos. (C. Raper (1940) e Bonner (1957) demonstraram que as células anteriores normalmente formam pedúnculo. (B) Visualização de várias “ondas” de cAMP no meio. a espiral de movimento ainda pode ser vista movendo-se em direção ao centro. que se propaga através da população de células (Figura 1. agora formam o pedúnculo (Raper. Quando a radioatividade no papel é registada (colocando-o sobre filme de raiosX). No entanto. a fosfodiesterase (Johnson et al. cortesia de F. realiza-se transcrição específica de genes. 1989). (C) Essa microfotografia em campo escuro processada digitalmente mostra cerca de 107 células. 1940). Quando essa ligação ocorre. C e D de Siegert e Weijer.

Assim. Loomis. Porém. Assim. Células de Dictyostelium foram coradas com um anticorpo fluorescente que se liga à glicoproteína 24-kDa e foram em seguida observada sob luz ultravioleta.24 Células de Dictyostelium sintetizam um adesivo. Dictyostelium é um “organismo multicelular em tempo parcial” que não forma muitos tipos de células (Kay et al. Como essas células individuais aderem entre si para formar um organismo coeso? Este é o mesmo problema que enfrentam as células embrionárias. muitos dos princípios do desenvolvimento demonstrados por esse “simples” or- . A adesão célula-célula é mediada por uma glicoproteína de 24. 1978. 1988). Se essas células são tratadas com anticorpos que se ligam a essa proteína e a mascaram. quando a lesma estiver migrando. alcançando um patamar de coesividade máxima aproximadamente após 8 horas de inanição. No entanto. 1988). Essa proteína é sintetizada a partir de mRNA recém-transcrito e fica localizada nas membranas celulares das mixamebas. o segundo sistema de adesão celular. e assim compensar por partes faltantes. pouco após a inanição nutricional. as células se tornam progressivamente mais adesivas. Essa glicoproteína de 80-kDa também é sintetizada durante a fase de agregação. células de metazoários também usam moléculas de adesão celular para formar os tecidos e órgãos do embrião. e a solução que evoluiu para os protistas é a mesma que aquela usada pelos embriões: moléculas de adesão celular reguladas pelo desenvolvimento. 1989). Enquanto estão crescendo mitoticamente em bactérias. e seus corpos de frutificação só atingirão aproximadamente um terço de seu tamanho normal. Knecht et al. comunicação pessoal). e que são necessários para a morfogênese de células individuais para formar um organismo coerente.0000 Da (24-kDa) que está ausente em células em crescimento mas pode ser vista pouco depois dessa fase (Figura 1. células de Dictyostelium não aderem umas às outras. Uma vez que essa agregação inicial tiver ocorrido.. inclusive naqueles dos mamiferos. Veremos esse fenômeno em muitos embriões. Dictyostelium evoluiu para três sistemas de adesão célula-célula regulados pelo desenvolvimento. 1987.. A proteína ou grupo de proteínas que intervem no terceiro sistema pode existir somente em células pré-esporo e pode ser responsável pela separação de células pré-esporo de células pré-pedúnculo (Loomis. parece ser necessário para a retenção de um número de células suficientemente grande para a formação de grandes corpos de frutificação (Müller e Gerisch. Um terceiro sistema de adesão é ativado tardiamente no desenvolvimento. Essa proteína não foi vista em amebas que tinham apenas parado de se dividir. as células não irão aderir umas às outras e todo desenvolvimento subseqüente cessa. Se apresentar defeitos ou estiver ausente nas células. é chamada regulação.24. Como veremos em capítulos subseqüentes. é estabilizada por uma segunda molécula de adesão celular. uma vez que a divisão celular cessa. Loomis. como mostrado aqui – 10 horas após o fim da divisão celular – amebas individuais são vistas apresentando essa proteína em suas membranas celulares e são capazes de aderir umas às outras. de acordo com sua localização dentro do organismo inteiro. MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULAR EM DICTYOSTELIUM. glicoproteína 24-kDa. lesmas pequenas se formarão. e os organismos multicelulares mais complexos não se formam pela agregação de células anteriormente independentes.24 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. No entanto.

e moléculas indutoras da diferenciação estão agora começando a ser isoladas de organismos metazoários. Informações adicionais & Especulações Evidência e Anticorpos A Biologia. Aqui. a evidência perda-de–função precisa ser amparada por muitos controles demonstrando que agentes causadores de perda de função derrubam especificamente aquela função em particular. elas tinham ganho uma função adesiva somente por expressar essa glicoproteína em particular nas suas superfícies celulares. o papel das proteínas da superfície celular para a coesividade celular pode ser visto através do reino animal. Evidência correlativa dá um ponto de partida para investigações. caçoando de tais inferências correlativas.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 25 ganismo também aparecem em embriões de filos mais complexos. esses mesmos anticorpos acham a proteína em membranas celulares de mixameba logo que as células param de se dividir e tornam-se competentes para agregar (veja Figura 1. a glicoproteína 24-kDa nada tinha a ver com a adesão propriamente. Como vimos. presu– mivelmente por ligar–se a glicoproteína 24-kDa. . Os fragmentos de anticorpo impediram as células de aderir entre si. O tipo mais forte de evidência é evidência-de-ganho-de-função. antes. o início do primeiro evento estimula um segundo e mesmo em situações onde nenhum desses eventos ocorre usualmente. Tais células agora aderiram umas às outras mesmo nos estados vegetativos. Experimentos semelhantes foram recentemente realizados em células de mamíferos (veja capítulo 3). ou que a adesão celular e a síntese da glicoproteína 24-kDa sejam eventos separados. crescendo vegetativamente. que usualmente não expressa essa proteína e não tem capacidade de adesão. Assim. porém.24). Essa evidência de ganho-de-função é mais convincente que outros tipos de análise. da Silva e Klein (1990) e Faix e colaboradores (1990) obtiveram tal evidência para mostrar que a glicoproteína 80-kDa é uma molécula adesiva. ela ainda não exclui outras inferências.. anticorpos marcados com fluorescência para uma certa glicoproteína de 24 kDa. Quando esses fragmentos ligantes de antígeno (chamados Fragmentos Fab) foram adicionados às células competentes para agregação. não marcam células vegetativas em divisão. bloquear a glicoproteína também causaria a inibição da agregação celular. Aqui. tal como qualquer outra ciência. existe uma correlação entre a presença dessa glicoproteína da membrana celular e a capacidade de agregação. Como exemplo. teínas de membrana em geral). Nesse caso. as células não puderam se agregar. é também possível que adesão celular leve as células a sintetizar essa nova glicoproteína. Em seguida. Ou talvez. Esse tipo de evidência é chamado evidência-deperda-de-função. e nada mais. Por exemplo. e infere-se que um evento estimule o outro. Knecht e colaboradores (1987) tomaram os anticorpos que ligam essa glicoproteína 24-kDa e isolaram seus sítios ligantes de antígeno (as partes da molécula do anticorpo que reconhecem o antígeno). Vários tipos de evidência serão apresentados neste livro. A habilidade de células individuais sentir um gradiente químico (como a resposta da ameba ao cAMP) é muito importante para a migração celular e morfogênese durante o desenvolvimento animal. recolocaram-no em mixameba bem-alimentada. vamos usar a análise da adesão celular em Dictyostelium. é possível que os anticorpos tenham matado a célula (o que poderia acontecer se a glicoproteína 24-kDa for um crítico canal de transporte). Assim. O primeiro e mais fraco tipo de evidência é a evidência correlativa. Usando uma técnica introduzida pelo laboratório de Gerisch (Beug et al. são feitas correlações entre dois ou mais eventos. mas é necessária para o funcionamento da verdadeira molécula adesiva (como através da estabilização de pro- * Em uma carta irônica. bloqueando sua função. para demonstrar a presença de determinadas moléculas adesivas celulares no embrião em desenvolvimento. Se bem que mais forte que a evidência correlativa. o próximo passo foi usar aqueles mesmos anticorpos para bloquear a adesão de mixamebas. não trata de fatos. Isolaram o gene para essa proteína e o modificaram de uma maneira a motivá-lo ser expresso continuamente. Recentemente. o que normalmente não fazem.* Como então ir para além da mera correlação? No estudo da adesão celular em Dictyostelium. trata de evidências. iniciados pela mesma causa subjacente. mas não se pode afirmar com certeza que um evento estimula outro somente baseado em correlações. A presença dessa proteína na membrana celular dessas células em divisão foi confirmada por marcação com anticorpos. Embora se possa inferir que a síntese dessa proteína causa a adesão das células. Isso foi necessário porque o todo da molécula de anticorpo contém dois sítios ligantes de antígeno que iriam ligar-se artificialmente de maneira cruzada e aglutinar as mixamebas. Isso também impediria a adesão celular. não são todos de equivalente vigor. A ocorrência simultânea dos dois eventos pode mesmo ser coincidência e os eventos não terem relação um com o outro. Assim. Sies (1988) demonstrou uma notável boa correlação entre o número de cegonhas vistas na Alemanha Ocidental de 1965 até 1980 e o número de bebês nascidos durante esses mesmos anos. Ainda mais. 1970).

vemos uma decisão dicotômica simples. 1995). (A) Grex (pseudoplasmódio) corado para presença de uma proteína pré-esporo específica (regiões claras). Wang et al. 1987).. A síntese desse lipídeo de baixo peso molecular é regulada geneticamente. 1985. 1987). induz a formação de células pedunculares.. [other. (B) Grex semelhante corado após tratamento com enzimas que degradam cAMP. (A e B de Wang et al. a diferenciação de células pré-esporo é mais provavelmente controlada por pulsos contínuos de cAMP. 1989. Os dois principais candidatos são o fator indutor de diferenciação (DIF) e o cAMP. parece induzir a diferenciação de um determinado tipo de célula. e. pode tornar-se uma célula da epiderme ou um neurônio.b). pois há cepas mutantes de Dictyostelium que formam somente o precursor de células-esporo e não de células pedunculares. 1983. as células pré-esporo perdem suas características de diferenciação (Figura 1. C de Wang e Schaap. como a proteína de Volvox. Esse fator. quando lesmas são colocadas em um meio contendo uma enzima que destrói cAMP extracelular. O mecanismo pelo qual DIF induz 20 porcento das células do plasmódio (grex) a tornar-se tecido peduncular ainda é controverso (veja Early et al.) . 1988a.. Não é visto produto pré-esporo específico.. O corante usado liga-se à parede de celulose das células pedunculares.html#intro3] Embora DIF estimule amebas a tornarem-se células pré-pedúnculo. Quando adicionado às amebas isoladas ou mesmo às células pré-esporo (posteriores). A diferenciação em uma célula-pedúncu- lo ou em uma célula-esporo reflete um dos principais fenômenos da embriogênese: a seleção pela célula de uma trajetória desenvolvimental.26 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento DIFERENCIAÇÃO EM DICTYOSTELIUM. Uma determinada célula num embrião de vertebrado por exemplo. As células freqüentemente selecionam um determinado destino desenvolvimental quando alternativas estão disponíveis. Todas as células do grex tornaram-se células pedunculares. porque somente dois tipos celulares são possíveis. Morris et al. 1995). (A) e (C) (B) mostram os efeitos de se colocar lesmas Dictyostelium em um meio contendo enzimas que destroem cAMP extracelular.. cortesia dos autores. células penduculares conseguem se diferenciar (Kay e Jermyn. (C) Amplificação maior de uma lesma tratada com DIF (na ausência de amônia). Quando DIF é adicionado a essas culturas de mutantes. em amebas agregadas. Como uma célula torna-se uma célula de pedúnculo ou uma célula de esporo? Embora os detalhes não sejam totalmente conhecidos o destino de uma célula parece ser regulado por certas moléculas difusivas. Altas concentrações de cAMP iniciam a expressão de mRNA pré-esporo específico. e novos mRNAs específicos pré-pedúnculo são encontrados no citoplasma celular (Williams et al. DIF pode agir através da liberação de íons de cálcio de compartimentos intracelulares no interior da célula (Schaulsky e Loomis. Em Dictyostelium. Schaap e van Driel.25. 1988a. é eficaz em concentrações muito baixas (10-10M). tal como o fator indutor de sexo em Volvox. DIF parece ser necessário para a diferenciação da célula peduncular. Além disso. (A) (B) Figura 1.25 Substâncias químicas que controlam a diferenciação em Dictyostelium.

com alguma células similares no posterior.Portanto. as células pré-pedúnculo do posterior migram para formar o disco basal e os cálices do saco de esporos. Essa migração provavelmente é devida a repetidos pulsos de cAMP que ain- da estão emanando da ponta apical do agregado. 1979. cessa de migrar e sofre a diferenciação final em esporos e pedúnculo. enquanto células equivalentes do quinto anterior se tornam células pedunculares? A resposta pode estar na observação de que as células originais não são todas iguais. 1986. As células novas são adicionadas à região anterior do tubo. mas se separam de modo que a maioria das células prépedúnculo se encontrem na parte anterior do grex. Ao mesmo tempo. Uma vez completo. 1991). o agregado tomba sobre um dos lados e forma o grex migratório. Mee et al.26). Isso estende o pedúnculo até que esse eleve a caixa de esporos acima da superfície. Assim. há também algumas células pré-pedúnculo espalhadas através da parte posterior. como podem células nos quatro-quintos posteriores da lesma se diferenciar em células-esporo. Agrega as células umas às outras. 1992).. um outro grupo de células pré-pedúnculo começa a secretar uma segunda nova proteína (proteína B). forçando-o mais para dentro da estrutura culminativa. Weijer et al. (Segundo Harwood et al. tendem a permanecer na porção posterior (McDonald e Durston. as células prépedúnculo A do anterior migram para o centro e se tornam células pré-pedúnculo B. as células pstO. porém. Células prépedúnculo B são vistas na parte central da porção anterior do grex. respondem de maneira diferente ao cAMP e mostram adesividade muito mais alta que células jejuadas imediatamente após a mitose. e migram mais lentamente em direção ao anterior. Dentro de cada agregado. de modo que atraem as células pré-pedúnculo para a ponta da agregado (Matsukuma e Durston. 1991. mas não para células pré-esporo. Williams e colaboradores (1989) acharam que células pré-esporo e pré-pedúnculo podem ser diferenciadas em agregados precoces e que estão distribuídas de modo aleatório através desses montes hemisféricos. que mostraram que células não-alimentadas durante a parte tardia do ciclo celular.. as tendências para certos destinos foram estabelecidas até mesmo antes do grex começar a migrar. Células pré-pedúnculo podem ser distinguidas pela sua secreção de proteína A da matriz extracelular para espaços intercelulares. Quando o grex se encontra na luz solar.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 27 Informações adicionais & Especulações Como o Grex Sabe Qual Lado Está Para Cima S E TODAS AS AMEBAS do grex começarem no mesmo nível. enquanto amebas expostas à inanição durante o fim do ciclo. Algumas células pstA migram para o tubo central de células pstB. As células pré-pedúnculo A constituem a maior parte do anterior do grex. o AMP cíclico parece ter várias funções no desenvolvimento de Dictyostelium. Esse trabalho foi confirmado e ampliado por Ohmori e Maeda (1987). Esses pulsos são quimiotácticos para células pré-pedúnculo. No centro da porção anterior do grex.. induz diferenciação de células pré-esporo e dirige a migração de células pré-pedúnculo para a parte anterior do agregado. e quando entram em contato com o tubo central. Representação esquemática mostrando que células pré-esporo e pré-pedúnculo estão em geral misturadas no estágio precoce da agregação. para sua matriz extracelular.26 Regulação da diferenciação de células pedunculares durante a fase de culminação do crescimento de Dictyostelium. migram ativamente para o anterior. 1984). as células pstA que tinham ficado na região posterior do Figura 1. enquanto a maioria das células pré-pedúnculo são conhecidas como células prépedúnculo A (pstA) (Figura 1. Essas células são chamadas células pré-pedúnculo B (pstB). Durante esse processo (chamado culminação). Takeuchi. o grex se apóia em um dos terminais fazendo com que as células traseiras se tornem sua base. diferenciam-se em células pstB. Esse tubo se diferencia para tornar-se o pedúnculo. Nos estágios precoces da culminação. Outro grupo de células pré-pedúnculo. estão espalhadas de maneira esparsa através das células pré-esporo. sintetizando componentes de uma nova matriz extracelular. 1984. Siegert e Weijer. Cálice superior Células pré-pedúnculo A Células pré-pedúnculo B Células pré-pedúnculo AB Direção do movimento celular Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Guarda da retaguarda Pré-pedúnculo A Células pré-esporo Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Disco basal interior Disco basal exterior Cálice Inferior Pré-pedúnculo AB Pré-pedúnculo B Agregado Grex Culminante precoce Culminante médio Pré-pedúnculo B Culminante tardio . a maioria das células pré-pedúnculo. Amebas sujeitas à inanição durante a parte precoce de seu ciclo celular tendem a se mover para a porção anterior do pseudoplasmódio. A maioria das células pré-pedúnculo estão nos 20 porcento anteriores do grex. enquanto células pré-esporo permanecem no que se tornará a região posterior do grex.

Harwood et al.. Sempre que a amônia estiver exaurida (quer naturalmente ou experimentalmente). que fosforila um inibidor da expressão gênica do pedúnculo. veja Singer. A luz solar dissipa a amônia na parte anterior do grex. Bonner e colaboradores (1985). Portanto..28 ilustra os principais rumos evolutivos do desenvolvimento metazoário. Inibe a ação de DIF (Wang e Schaap. Essas células não migram para a região central anterior. *Plantas passam por padrões igualmente complexos e fascinantes de desenvolvimento embrionário e pós-embrionário.* A Figura 1. Esse cAMP é necessário para ativar a proteína quinase cAMP-dependente (PKA). uma vez que os níveis de cAMP se elevam (pela remoção da amônia). O inibidor fosforilado não pode mais inibir os genes pedúnculo-específicos. a PKA pode inativar o inibidor dos genes formadores do pedúnculo (Figura 1. [intro. migração de células pré-pedúnculo. A amônia inibe a conversão de células pstA em pstB e proíbe a continuação da formação do pedúnculo cAMP (Gross et al. Harwood et al. Wang et al. Newell e Ross. 1992). diferenciação e culminação peduncular Padrões desenvolvimentais entre metazoários Como o restante deste livro se ocupa do desenvolvimento de metazoários ..28 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento grex migram para as bordas da região préesporo e diferenciam-se no invólucro dos esporos e disco basal (Williams e Jermyn. 1991. a culminação começa (Schindler e Sussman. foi tomada a decisão de enfocar neste texto. nem se diferenciam em células do pedúnculo (Firtel e Chapman. 1989). Os dados sugerem que quando PKA é ativada. 1983. 1992). 1992) Amônia Repressor ativo da diferenciação e de genes de migração peduncular PKA inativa cAMP PKA ativa Migração continuada do grex Luz solar Repressor inativo (fosforilado) Transcrição do gene da proteína B da matriz extracelular. 1992). a inclusão de um tratamento abrangente do seu desenvolvimento teria dobrado a extensão deste livro. Experimentos recentes sugerem que esses dois fatores causam a difusão de amônia da lesma. 1990. A seqüência pela qual a formação de esporos é inibida. Para uma revisão.apresentaremos um visão panorâmica dos seus padrões desenvolvimentais. A amônia é produzida copiosamente por lesmas migratórias e reprime a culminação. A concentração mais alta de cAMP ativa a PKA. não fosforilam certas proteínas. 1985). 1977. e Harwood et al. o desenvolvimento das plantas difere significativamente daquele dos animais. sugeriram que como a luz causa difusão mais rápida da amônia. o desenvolvimento dos animais. No entanto. Podemos ver que a maioria das espécies de metazoários pertence a um de dois principais ramos de animais: protostomatas e deuterostomatas. 1997. 1977. Células pré-pedúnculo contendo PKA nãofuncional. Bonner et al. (Baseado em modelos de Bonner et al. os esporos são levantados 2 mm acima do solo. 1990). 1985.. apresenta diversos caminhos evolutivos ramificados. A observação mais impressionante é que a vida não evoluiu segundo uma linha reta. e inibe a produção de cAMP nas células pré-pedúnculo (Schindler e Sussman. No estado fosforilado. . o inibidor é inativo.. Harwood et al. remove o inibidor permitindo assim. não está clara. Finalmente. permitindo maior produção de cAMP nas células pré-pedúnculo.27 Uma hipótese para a iniciação coordenada da culminação e diferenciação de células pedunculares em Dictyostelium..27). 1982.animais multicelulares que atravessam estágios embrionários de desenvolvimento . O gatilho para a culminação parece ser a luz solar ou a baixa umidade.. Por isso. de onde podem ser dispersos pelo vento ou um animal que passa.4html] Figura 1. A amônia parece inibir a produção do pedúnculo pelos menos de duas maneiras.. passa a fosforilar um repressor que estava inibindo a expressão dos genes de diferenciação do pedúnculo. o progresso da culminação.

o arqueócito. Uma esponja tem três tipos principais de células somáticas.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 29 BILATERIA DEUTEROSTOMATAS PROTOSTOMATAS RADIATA PARAZOA Vertebrados Ascídios (Tunicados) Moluscos Equinodermos Artrópodos Anelídeos Nematelmintos Platelmintos Cnidários (Celenterados) Poríferos (Esponjas) Segmentados Não-segmentados Larva trocófora Clivagem em espiral gastrulação protostosomal da ma lo qu es ag em Li nh ag Clivagem radial gastrulação deuterostomal nh Li SIMETRIA BILATERAL Platelmintos primitivos (acelomados) SIM ET RA RIA DIA Larvas planulóides Protozoários coloniais primitivos Protistas flagelados Figura 1. os esquemas em geral são todos semelhantes ao mostrado aqui. ao menos. a dois grupos de metazoários. pode se diferenciar em todos os outros Li L nh ag em ac elo Larva dipleura (tornária) ce ps eu do ce lo m ad em m ad a izo a . que alguns taxonomistas sequer consideram-nos metazoários (chamando-os.28 Principiais divergências evolucionárias em animais existentes. mas um deles.) Os Poríferos Considera-se que os protistas coloniais deram origem. Um desses grupos é o Porífero (esponjas). porém. (Outros modelos são possíveis. Esses animais desenvolvem-se de um modo tão diferente daquele de qualquer outro grupo de animais. ambos passando por estágios embrionários. “parazoários”).

em alguns casos. junto ou próximo da abertura intestinal. admite-se que os arqueócitos móveis colecionam células de sua espécie. O ânus se forma mais tarde em outro local. cada uma que se re-forma contém somente células de uma espécie (Wilson. os blastômeros em estágio de clivagem. tornadas ocas. constituindo assim. a maioria dos deuterostomatas formam suas cavidades corpóreas a partir de bolsas mesodérmicas estendendo-se do intestino (formação enterocélica). a abertura bucal é formada depois da abertura anal. são assim chamados porque a boca é formada em primeiro lugar. nos deuterostomatas (do Grego significando “boca depois”).30 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento tipos. Isso é chamado clivagem radial. por ser desprovida de revestimento mesodérmico. Porém. As células de uma esponja quando passadas por uma peneira. Ainda mais. os blastômeros são perpendiculares ou paralelos uns aos outros. Na maioria dos deuterostomatas. Porém. esses seres não têm tubo digestivo. A cavidade corpórea desses animais se forma a partir de uma previamente sólida corda de células mesodérmicas. Nesses animais. a maioria dos metazoários tem simetria bilateral. Esses filos bilaterais são classificados como platelmintos. Protostomatas e deuterostomatas diferem na maneira pela qual são clivados. Assim. o mesoderma é rudimentar. 1997). A outra grande divisão dos Bilateria é a linhagem dos deuterostomatas. enquanto prostostomatas em geral formam suas cavidades corpóreas tornando oco um bloco sólido de mesoderma (formação esquizelóide). corais e hidras) e ctenóforos (medusas de crista). consistindo de células escassamente disseminadas em uma matriz gelatinosa. Também. Protostomatas ao contrário. assim chamados porque têm simetria radial tal como um tubo ou uma roda. alguns traços embriológicos acentuam esse parentesco. Pensa-se que todos os Bilateria descendam de um tipo primitivo de platelminto. São por isso considerados sofrer clivagem espiral. As diferenças entre as duas divisões de Bilateria estão ilustradas na Figura 1. Enquanto os platelmintos são desprovidos de celoma (cavidade corpórea). e os três-quartos restantes do embrião também irão se desenvolver . Esponjas não contém mesoderma. apesar de passarem por estágios embrionários e larvais. na maioria dos deuterostomatas. tal reagregação é espécie-específica: se células individuais de esponja de duas espécies diferentes forem misturadas. têm uma extensa variedade de tipos de clivagem. A maioria dos filos são celomados. 1978). não havendo portanto verdadeiros sistemas de órgãos em Porífero. Se um único blastômero é removido de um embrião quadricelular de ouriço-do-mar ou camundongo. esponjas são muito pouco parecidos com a maioria dos metazoários (veja Fell. incluem os filos dos moluscos. mas não das outras (Turner. Os Radiatas incluem os cnidários (medusas. produzida durante a gastrulação. Nesses casos. os nematelmintos (e rotiferas) têm uma cavidade corpórea diferente daquela de todos os outros animais. Os filos nessa divisão incluem os chordatas e os equinodermos. e foram considerados parecidos com as larvas de certos celenterados contemporâneos. Protostomatas (do Grego. “boca primeiro”). sistema circulatório. Além disso. artrópodos e vermes. podem regenerar novas esponjas a partir de células individuais. Protostomatas e Deuterostomatas O outro grupo de metazoários emergindo dos protistas coloniais é caracterizado pela presença de três camadas germinativas durante o desenvolvimento. isto é. protostomatas ou deuterostomatas. nervos ou músculos. têm maior capacidade de regular seu desenvolvimento do que os prostostomatas. Muitas espécies formam blástulas compostas por células que estão em ângulos agudos relativamente ao eixo polar do embrião. Em primeiro lugar. possuem uma cavidade corporal revestida por mesoderma. deve-se mencionar que há muitas exceções a essas generalizações. 1907). os Bilaterias. Esses platelmintos foram os primeiros a ter mesoderma verdadeiro (embora não tivessem ficado ocos para formar uma cavidade corpórea).29. tal blastômero irá desenvolver-se em um organismo inteiro. Embora possa parecer estranho classificar seres humanos e cavalos no mesmo grupo que estrelas-do-mar e ouriços-do-mar. Alguns membros do grupo constituem os Radiatas.

Esse tipo de ovo. tanto o blastômero isolado como os restantes se desenvolveriam em embriões parciais – cada um carente daquilo que foi formado a partir dos outros. o ovo amniótico carrega seu próprio suprimento de água e nutrientes. como os tunicados. e o cório. há cerca de 255 milhões de anos. a alantóide.CAPÍTULO 1 Introdução ao Desenvolvimento Animal 31 (A) PROTOSTOMATAS 1. Ainda. e os embriões de certos deuterostomatas. Desenvolvimento semelhante de proteções do ovo permitiram aos artrópodes serem os primeiros invertebrados sobre a terra. Clivagem espiral (B) DEUTEROSTOMATAS 1. que interage com o ambiente externo. é considerado ter-se originado dos ancestrais anfíbios dos répteis. O todo dessa estrutura está contido em uma casca que permite a difusão de oxigênio. Assim. seletivamente permitindo materiais chegar ao embrião. ao mesmo tempo sendo suficientemente dura para proteger o embrião de agressões ambientais. que contém fluido banhando o embrião. O ovo amniótico permitiu aos vertebrados vagar pela terra longe de suprimentos de água existentes. a travessia final dos limites entre água e terra ocorreu com a modificação do estágio mais precoce do desenvolvimento – o ovo.29 normalmente. o âmnio. Exceções à todas essas tendências gerais evoluíram secundariamente em certos membros de cada grupo. na qual restos do metabolismo embrionário são coletados. Desenvolvimento esquizocélico Celoma Blastocele Mesoderma se divide Mesoderma 2. A evolução dos organismos depende de alterações herdadas em seu desenvolvimento. Um dos maiores avanços evolucionários – o ovo amniótico – ocorreu entre os deuterostomatas. se a mesma operação fosse realizada em um embrião de lesma ou de verme. que armazena proteínas nutrientes. (A maioria dos vertebrados por exemplo. não tem uma formação estritamente enterocélica da cavidade corporal.30).) . não sofrem regulação se os blastômeros são deles removidos. O ovo é fertilizado internamente e contém a gema para nutrir o embrião em desenvolvimento. Porém. Ao passo que a maioria dos anfíbios é obrigada a voltar para a água para procriar e permitir o desenvolvimento de seus ovos. Desenvolvimento enterocélico Celoma Blastocele Bolsa Intestinal Bolsas se destacam Mesoderma Intestino 3. exemplificado pelo da galinha (Figura 1. Tendência à regulação Intestino Embrião de de 4 células Um blastômero excluído Desenvolvimento interrompido Embrião de de 4 células Um blastômero excluído Duas larvas normais se desenvolvem Figura 1. Tendências principais dos prostostomatas e deuterostomatas. Clivagem radial 2. Tendência a não regulação Intestino Intestino 3. contém quatro bolsas: o saco vitelínico.

H. Rev. No presente livro. Annu. Rev. 1995. Cell Biol. A. Evidence for the formation of cell aggregates by chemotaxis in the development of the slime mold Dictyostelium discoideum. In S. U. Konijn. Evidence for positional differentiation of prestalk celIs and for a morphogenetic gradient in Dictyostelium. J.1997). J. F.. Abe. A. A.. Sunderland. II. da Silva.-C. acrasinase and the sensitivity to acrasin in Dictyostelium discoideum. Embryology: Constructing the Organism. aned Raunio. L. E. 32: 232-246. J. clivagem. encontraremos apenas uma pequeníssima amostra deles. M. G. E. veja Gilbert e Raunio. J. Estamos apenas observando o conjunto das marés ao nosso alcance. T. Constitutive overexpression of the contact A glycoprotein enables growth-phase celIs of Dictyostelium discoideum to aggregate. Genes Dev. A. 31: 597-629. Cell differentiation and flagellar elongation in Naegleria gruberi: Dependence on transcription and translation. Faix. gastrulação e construção do plano do corpo vertebrado.. R. Exp. Mason..). 106: 1-26. J. R.30 Embrião Intestino Âmnio Cavidade amniótica Alantóide Cório Gema Saco vitelino (A) (B) Diagrama do ovo amniótico do pinto. and Weiss. J. and Walsh. S. C. 85: 346-360. Sinauer Associates. 1947. 1985. Alantóide A biologia do desenvolvimento proporciona um sortimento infinito de fascinantes problemas e animais. (A) Incubação de três dias. Gerisch. V. D. . and Cremer. Exp. and Noegel. Early. O âmnio prove o meio fluido no qual cresce o embrião. 1969. o endoderma se transforma no intestino e envolve a gema. Raunio (eds. Flagellar membranes and the agglutination reaction. Morphol. F. Gametic differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. Jawitz. 67: 623-637. G. C. and Martin. B. Hall. Bonner. A origem das membranas será detalhada no capítulo 9. J. J. pH affects fruiting and slug orientation in Dictyostelium discoideum. Q. the sponges. and Dazy. Berkley. D. Kempff. 1990. Riedel. Goodenough. 1980. W. A role for cAMP-dependent protein kinase A in early Dictyostelium development. Fell. Bonner. 1975. J. Firtel. 9: 2709-2716. Cell 83: 91-99. Coodenough. Finalmente. Biol. 1997. Biol. O’Keefe. Gametic differentiation in ChIamydomonas reinhardtii. Exp. and Wolfe. mostrando o desenvolvimento das membranas envolvendo o embrião. Fulton. (B) Incubação de sete dias. servindo para ilustrar os princípios mais importantes do desenvolvimento animal (para uma cobertura mais completa da diversidade do desenvolvimento animal através dos filos. J. Hay. and Klein. Embryology: Constructing the Organism.. Zool. EMBO J.. 1970. LITERATURA CITADA Bergman. Sunderland. 1990. MA. A. S. Bonner. O cório é derivado em parte do ectoderma e estende-se do embrião até a casca (onde irá trocar oxigênio e gás carbônico e obter cálcio da casca). K. Cell adhesion transformed D.. Biol. Goodenough. 1997. Gilbert and A. M.. O mesoderma extra-embrionário se estende do embrião para prover vasos sangüíneos para e de várias regiões fora do embrião. discoideum cells: Expression of gp80 and its biochemical characterization. M. Acrasin. 1977. U. Beug. MA. Cell wall lysis and microfilament associated mating structure activation in wild-type and mutant strains. and Williams.. D. and Chapman. Cell 58: 23-29. 140: 139-148. Capítulos posteriores se concentrarão nos mecanismos genéticos e celulares pelos quais ele é elaborado. Garcia. G. Microbiol. 67: 606-622. A. A theory of the control of differentiation in the cellular slime molds. e a alantóide coleta resíduos nitrogenados que seriam perigosos para o embrião. J. C. Cell Res. and John. M. A evolução do âmnio e das outras membranas extra-embrionárias constituiu uma grande linha divisória entre aqueles vertebrados cuja reprodução está ligada à água (anamniotas) e aqueles que podem se reproduzir em áreas secas (amniotas). L. 1957. P. um certo chauvinismo deuterostossômico pode ter ficado aparente. Sinauer Associates. 1975.. W. Cell Biol. H. A gema será finalmente rodeada pelo saco vitelínico que permite a entrada de nutrientes nos vasos sangüíneos. 87: 207-213. Dev. A. Fulton. 20: 72-87.. T. A. Porifera. Spatial distribution of poly(A) + RNA and protein synthesis in Acetabularia mediterranea. W. C. Após uma breve visão dos princípios genéticos e celulares relevantes para a biologia do desenvolvimento.. Bonner..32 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 1. P. Embora uma tentativa de cobrir as variações importantes que ocorreram no reino animal tivesse sido feita. Gilbert.. M. 63: 147-158. I. III. Specific inhibition of cell contact formation in Dictyostelium by univalent antibodies. 1986. Biol. A. T. J. investigaremos os estágios precoces da embriogênese animal: fertilização. G. Cell Biol. A. T. T. 1990. Cell differentiation in Naegleria gruberi. enquanto todo o oceano do desenvolvimento se estende à nossa frente. Gerisch. Dev. 4:18-28. Embryol. S.

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controla a herança. as técnicas da biologia molecular realizaram uma reaproximação entre embriologia e genética. nem como eram levados a se expressarem.1). Na realidade. entre genética e embriologia. está todo o campo do desenvolvimento embrionário”. os dois campos se ligaram novamente a tal ponto que se torna necessário uma discussão prévia da genética molecular neste texto. que viria a ser a pedra angular da genética moderna. Questões do desenvolvimento animal que não poderiam ser consideradas há uma década. como ovos fertilizados davam origem a organismos adultos. Aqui Thomas Hunt Morgan (1926) estava verificando que o único caminho de genótipo para fenótipo. nós os chamamos de genes. Divergiram na década de 1920. porém. e os genes postulados. por seu valor intrínseco. estão sendo agora resolvidas por um conjunto de técnicas envolvendo síntese de ácidos nucléico e hibridização. passava através de processos desenvolvimentais. JONATHAN BARD (1990) Os segredos que me enlaçam e cativam são em geral segredos da hereditariedade: como uma semente de pêra vira uma pereira em vez de um urso polar. um grupo de cientistas começou a estudar. quando Morgan redefiniu a genética como a ciência que estuda a transmissão dos traços em oposição à embriologia. A teoria dos genes. cada um tornando-se partidário na controvérsia sobre qual dos dois compartimentos do ovo fertilizado . Porém. Entretanto.. embriologia e genética não eram consideradas ciências separadas. gravada no ovo. ora em curso. elementos construtores de formas. Dois jovens embriologistas americanos. teve origem em uma controvérsia no campo da embriologia. Em fins século XIX. Este capítulo procura situar essas novas técnicas dentro do contexto do diálogo.. tornaram-se parte desse grupo de “embriologistas fisiológicos”. Edmund Beecher Wilson e Thomas Hunt Morgan (Figura 2. na extensão em que estrutura pode ser expressa por informação.o núcleo ou o citoplasma . a ciência que estuda a expressão desses traços. aos quais os caracteres se referem. as observações de Mendel não indicaram onde na célula ficavam esses elementos hereditários. CYNTHIA OZICK (1989) “E NTRE OS CARACTERES que fornecem os dados para a teoria. No começo do século vinte. As origens embriológicas da teoria dos genes Núcleo ou Citoplasma: Qual Controla a Hereditariedade? Mendel chamou-os Formbildungelementen. é na terminologia de Mendel que vemos como no século dezenove os conceitos de herança e desenvolvimento estavam intimamente entrelaçados.Genes e desenvolvimento: Introdução e técnicas 2 O que gostaríamos de saber é se a estrutura é determinada diretamente pela informação codificada no DNA. 35 . Durante a última década.

muito avançou as hipóteses cromossômicas do desenvolvimento. citoplasmas. está o poder de diferenciação dos estágios precoces do desenvolvimento. T. eles acreditavam que os padrões herdados de desenvolvimento eram causados pela criação de novas moléculas do gameta interativo. W. mostrado aqui em aproximadamente 1899). Bischoff. a disputa já estava bem ativa.. e não no núcleo.. produz-se embriões com defeito.) (B) Thomas Hunt Morgan (1866-1945). Uma escola associada a Oskar Hertwig.36 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (B) Figura 2. N. na fase precoce da embriologia e da determinação sexual. Wilhelm Roux e Theodor Boveri. que acreditavam que estruturas pré-formadas não poderiam causar tão enormes mudanças durante o desenvolvimento. Wilson (1856-1939. Em seu experimento mais crucial. Allen. L. quando os elementos básicos da teoria dos genes estavam se encontrando – mostra Morgan usando uma lente manual para identificar moscas. embora todo o núcleo de segmentação esteja presente. Wilhelm His e seus colegas. Esse grupo era desafiado por Eduard Pflüger. Parece não haver escape da conclusão que no citoplasma. (Wilson era também reconhecido como um dos melhores violoncelistas amadores do país. Em 1897 Morgan relatou: Aqui. . Morgan aliou-se a esse último grupo e obteve dados que interpretou com sendo consistentes com o modelo citoplasmático da herança. B. Essa fotografia . devido à perda de parte do citoplasma. ele removeu citoplasma do récem-fertilizado ovo ctenóforo (geléia de crista). que desenvolveu a teoria dos genes a partir da embriologia. ao contrário. um embriologista cujo trabalho. (B) cortesia de G. Timmins.tomada em 1915. (A) cortesia de W.1 (A) (A) E. propunha que os cromossomos do núcleo continham os elementos construtores de formas.) Quando Morgan e Wilson entraram nesse debate.

b) demonstraram uma correlação crítica entre cromossomos nucleares e o desenvolvimento organizacional. Wilson (1905) e Nettie Stevens (1905a. Wilson pensou que o material formador de órgãos que Morgan havia removido do citoplasma de ovos de ctenóforo. por isso. Stevens (1861-1912). chegamos à notável conclusão que a herança pode. Para uma análise mais detalhada das interações entre Morgan e Wilson que levaram à teoria dos genes. se não o local da formação de energia. Wilson escreveu uma elogiosa carta de recomendação. se não idêntica. Boveri fertilizou óvulos de ouriço-do-mar com altas concentrações de seu espermatozóide e obteve ovos que haviam sido fertilizados por dois espermatozóides. uma ex. que treinou tanto com Boveri como com Morgan. realizando a pesquisa que correlacionou o número de cromossomos X com o desenvolvimento sexual. o fator controlador da herança. já havia sido para ali secretado pelos cromossomos nucleares (Wilson. Stevens (Figura 2. (A) (B) Figura 2. Boveri declarou que cada cromossomo tinha uma natureza individual e o controle de diferentes processos vitais. tornou-se o maior proponente do ponto de vista de que os elementos formadores se encontravam nos cromossomos nucleares. esses ovos formaram quatro pólos mitóticos e dividiram o ovo em quatro. o fator controlador dessa energia e.. fertilização e divisão celular. Para Wilson (1905) “Os materiais citoplasmáticos parecem ser apenas o meio imediato ou a causa eficiente da diferenciação.2B). e ainda procuramos sua determinação primária nas causas que residem mais profundamente. Essa conjectura transforma-se em certeza quando nos voltamos para os fatos da maturação (meiose).. 1967. apesar de saber que ela seria uma rival na pesquisa (veja Brush. E assim.” Parte do maior apoio para a hipótese cromossômica da herança estava vindo dos estudos embriológicos de Theodor Boveri (Figura 2. salientando a necessidade da presença do núcleo para regeneração dos protozoários (veja capítulo 1): Esse fato presume que o núcleo é. as fêmeas tinham dois cromossomos sexo-específicos em cada núcleo (XX). Todos convergem em direção da conclusão de que a cromatina é o elemento essencial para o desenvolvimento. (B) Nettie M. nesse ínterim. embriologia e genética – um feito biológico que. 1904).. um pesquisador na Estação Biológica de Nápoles. ser efetuada pela transmissão física de um dado composto químico do progenitor para a descendência.. E. (B) cortesia do Instituto Carnegie de Washington. veja Gilbert (1978. [(A) cortesia de Baltzer.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 37 Wilson. enquanto machos tinham somente um cromossomo X (XY ou XO).2 O caráter singular do cromossomo foi mostrado por Boveri e Stevens. Mesmo assim. vista aqui em 1904 quando era estudante de pósdoutorado. Defendeu vigorosamente essa idéia em seu livro A Célula no Desenvolvimento e na Herança (1896).” Fotografia tirada em 1908. à substância conhecida como nucleína. Wilson (1895) não se esquivou das conseqüências dessa conclusão* Agora. Assim. confirmando suas qualidades como as melhores possíveis. 1894. ** Wilson era um dos amigos mais íntimos de Morgan. Ambos estavam contra Morgan nessa questão. mostrou que em 92 espécies de insetos (e um cordato primitivo). Na primeira clivagem. B. (A) Theodor Boveri (1862-1915) cujo trabalho Wilson (1918) comentou: “conseguiu a verdadeira fusão de citologia. talvez. que considerava Stevens sua melhor estudante de pós-graduação. 1978). Parecia que uma estrutura nuclear. ao menos. a cromatina é sabida ser intimamente semelhante. Boveri então separou os blastômeros e demonstrou que cada célula se desenvolvia anormalmente e de maneiras diferentes por ter cada célula diferentes tipos de cromossomos. 1987) e Allen (1986).2 A). não fica atrás de qualquer outro de nosso tempo. em vez de duas células (veja capítulo 4). Morgan apoiou inteiramente o pedido de Stevens para fundos de pesquisa.estudante de Morgan.que a análise demonstra ser um composto químico toleravelmente bem definido. quando os estudos cromossômicos e embriológicos de Boveri estavam no seu apogeu. o cromossomo X. Morgan discordou da interpretação de que *Note-se que Wilson está escrevendo sobre unidades construtoras de forma na cromatina em 1896 – antes da redescoberta do trabalhos de Mendel ou do estabelecimento da teoria dos genes.] . composto de ácido nucléico (um complexo ácido orgânico rico em fósforo) e albumina. estava controlando o desenvolvimento sexual** . O Cromossomo X como uma Ponte Entre Genes e Desenvolvimento Em adição à evidência de Boveri.

[gene1. mutações ligadas ao X apareciam antes de mutações em outros cromossomos. os embriologistas consideraram os geneticistas como irrelevantes e mal-informados. ele considerou o conjunto de cromossomos como uma característica sexual secundária. Conforme proclamado por Richard Goldschmidt (1938). e na capacidade dos geneticistas de obter rapidamente resultados concretos e matematicamente verificáveis. 1987. Hostilidade entre embriologia e genética também emergiu. em 1911mostrou que fatores reguladores da cor dos olhos. 2. os genes controlam o padrão”.3). Os geneticistas teriam que produzir evidência que os genes controlam os estágios precoces da embriogênese. argumentaram que não poderia haver uma teoria genética do desenvolvimento até que ao menos três principais desafios fossem resolvidos: 1. Morgan deu-lhe um fundamento científico. 1986. tornou-se disciplina autônoma. Morgan começou a obter várias mutações correlacionadas com o sexo. desenvolvendo seu vocabulário próprio. 1937). organismos favorecidos. em última análise. “O desenvolvimento. revistas. uma ciência empírica sobre procriação de animais e plantas. o que o levou a começar a visualizar os genes como fisicamente ligados um ao outro no cromossomo. Paul e Kimmelman. (Como ele logo iria mostrar. . professorados e regras de evidência. Just (1939) (Figura 2. em geral. evitou considerá-los ligados fisicamente. como répteis). vascularização alar). Os geneticistas teriam que explicar fenômenos como a determinação do sexo em certos invertebrados (e vertebrados. Quase todos genes conhecidos na época afetavam a modelagem das etapas finais (cor dos olhos. Morgan mostrou que os traços para ambos sexos e cor branca dos olhos estão correlacionados de alguma maneira com a presença de um dado cromossomo X. é a produção ordenada de um padrão e assim. forma das asas e sexo segregavam-se juntos com o cromossomo X. os geneticistas o farão. sociedades. entretanto.) Em 1910. 1978. A “conversão” de Morgan para a hipótese cromossômica ocorreu depois de obter dados contrários às suas teorias (veja Allen.html] A cisão entre a embriologia e a genética A evidência de Morgan proporcionou uma base material para o conceito do gene. O embriologista Morgan tinha demonstrado que cromossomos nucleares eram responsáveis pelo desenvolvimento de caracteres herdados. Ross Granville Harrison (1937). Ao contrário. Reciprocamente. Conforme enunciado por Just (citado por Harrison. 3. forma das cerdas. Embriologistas como Frank Lillie (1927). Movida pelo desejo de progredir no conhecimento da reprodução de animais e plantas (e seres humanos). Lederman. Sapp. nos quais o ambiente determina o fenótipo sexual. Os geneticistas acreditavam que os embriologistas eram antiquados e que o desenvolvimento viria a ser inteiramente explicado como o resultado da expressão gênica. a genética logo se tornou a ciência biológica predominante nos Estados Unidos (veja Allen.38 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento os cromossomos determinavam o sexo. Enquanto criava Drosophila para uma série de experimentos sobre evolução. controlada por alguma substância citoplasmática determinadora do sexo. Os geneticistas teriam que explicar como cromossomos – que eram considerados idênticos em cada célula do organismo – direcionam tipos diferentes e variáveis de citoplasmas celulares. 1978. cor do corpo. Gilbert. Hans Spemann (1938) e Ernest E. Se os embriologistas não olharem para a embriogênese em termos da atividade dos genes. Na década de 1930. os embriologistas estavam interessados em saber como uma mosca forma o seu dorso e não no número de cerdas no seu dorso. porque defeitos no cromossomo X não são mascarados pelo cromossomo homólogo no macho. 1988). 1989). obviamente. A genética havia sido. Porém.

Várias tentativas foram feitas para sintetizar as duas disciplinas. B cortesia de T. (A) Frank Lillie encabeçou o Laboratório de Biologia Marinha em Woods Hole e foi um líder na pesquisa sobre fertilização e endocrinologia reprodutiva. (C) Ernest E.3 (C) Embriologistas tentaram impedir a genética de “conquistar” seu território na década de 1930.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 39 (A) (B) Figura 2. Já temos teorias que referem os processos do desenvolvimento à ação dos genes e consideram toda performance como nada mais que a consecução dos potenciais dos genes. Horder. [gene2. mas sua primeira integração bem-sucedida veio no fim da década de . Até que os geneticistas puderam demonstrar a existência de variantes herdadas durante a fase precoce do desenvolvimento e até que os geneticistas tiveram uma bemdocumentada teoria sobre como os mesmos cromossomos podiam produzir diferentes tipos de células. (B) Hans Spemann (à esquerda) e Ross Harrison (à direita) aperfeiçoaram operações de transplante para descobrir quando eram determinados os eixos do corpo e dos membros. Argumentaram que os geneticistas não possuíam um mecanismo para explicar como os mesmos genes nucleares podiam criar tipos celulares diferentes durante o desenvolvimento. não pareceria impróprio apontar para um perigo dessa ameaçada invasão. Numa retórica. (A cortesia de V. Woods Hole. Tais teorias são totais e demasiadamente unilaterais. por dirigir nossa atenção exclusivamente para o genoma. Just fez descobertas cruciais sobre fertilização. os embriologistas em geral não sentiram a necessidade de basear sua embriologia na ação dos genes. enquanto movimentos celulares. Rejeitou a genética e enfatizou o papel da membrana celular na determinação dos destinos das células.) O debate tornou-se deveras veemente.html] Primeiras tentativas da genética do desenvolvimento Porém. refletindo as ansiedades políticas do fim da década de 1930. C cortesia do Laboratório de Biologia Marinha. diferenciação e todos os processos desenvolvimentais são de fato realizados pelo citoplasma. Hamburger. O prestígio do sucesso desfrutado pela teoria dos genes poderia facilmente tornar-se um obstáculo para a compreensão do desenvolvimento. alguns cientistas acharam que nem a embriologia nem a genética estavam completas uma sem a outra. Harrison (1937) alertou: Agora que a necessidade de relacionar os dados da genética com a embriologia está sendo usualmente reconhecida e a sede de conhecimento dos geneticistas começa a impeli-los em nossa direção.

1996.* Além disso. e atribuiu os efeitos desses genes mutantes a defeitos no mesoderma axial que normalmente teriam ajudado a induzir o eixo dorsal. 1991.html] Evidência para a equivalência genômica Ainda permanecia uma outra grande objeção para uma embriologia baseada na genética: Como poderiam genes nucleares dirigir o desenvolvimento se os genes eram os mesmos em cada tipo celular? Essa equivalência genômica não estava provada mas era assumida (porque cada célula é o descendente mitótico do ovo fertilizado) e um dos primeiros problemas da genética do desenvolvimento era o de determinar se cada célula de um organismo tinha o mesmo genoma que outra. Harwood. 1991. às vezes. 1996.alterando a estrutura durante seu desenvolvimento e observando quais eram as conseqüências dessa operação. 1986. Keller. Também analisava como esses genes podiam afetar os primórdios que dão origem a essas estruturas. No entanto. Na salamandra. Ao mesmo tempo. Embora uma história completa do desenvolvimento precoce da genética do desenvolvimento ainda permaneça por ser escrita. por parte de dois embriologistas. A asa da Drosophila. Assim. o geneticista do desenvolvimento tem que estudar primeiro o desenrolar do desenvolvimento (isto é. os resultados da perturbação do desenvolvimento) para depois.. Drosophila. O estudo da regeneração do olho da salamandra demonstrou que mesmo células adultas diferenciadas podem reter o seu potencial de produzir outros tipos celulares. Salome Gluecksohn-Schoenheimer (agora S. Gluecksohn-Schoenheimer (1938) considerou que no trabalho com camundongos não era possível fazer o que os embriologistas experimentais deveriam estar fazendo . 1988. 1993. por parte de embriologistas que estavam estudando a regeneração de tecidos excisados. “parecia favorável para pesquisas sobre a ação desenvolvimental dos genes”. [gene3. quando o gene do T-locus foi clonado e sua expressão detectada pela técnica da hibridização in situ (discutida mais adiante neste capítulo). 1995. Ambos haviam sido treinados em embriologia na Europa e tinham aprendido genética nos Estados Unidos com estudantes de Morgan. conforme proclamou corretamente. a remoção da retina *As observações de Gluecksohn-Schoenheimer levaram 60 anos para ser confirmadas através da hibridização do DNA. Waddington (1939) isolava diversos genes que causavam malformações alares na mosca das frutas. tentaram achar mutações que afetassem o desenvolvimento precoce e processos afetados por esses genes.que os genes atuam somente sobre a modelagem final do embrião e não sobre seus principais esquemas de construção – foi contrariada. Gluecksohn Waelsch) e Conrad Hal Waddington. Gluecksohn-Schoenheimer (1938. o geneticista do desenvolvimento: Enquanto o embriologista experimental desenvolve um dado experimento e em seguida estuda seus resultados. chegar a conclusões sobre a natureza do “experimento” realizado pelo gene. causavam desenvolvimento aberrante da porção posterior do embrião. Sander. Burian et al. os genes para os produtos desses outros tipos de células devem ainda estar presentes. Gilbert. Gluecksohn-Schoenheimer e Waddington. 1940) mostrou que mutações nos genes de Brachyury do camundongo. . mais informações sobre suas turbulentas origens podem ser encontradas em Oppenheimer. Em vez disso. Metaplasia A primeira evidência para equivalência genômica veio após a 2a Guerra Mundial.40 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1930. embora normalmente não expressos. Portanto. uma das principais objeções ao modelo genético do desenvolvimento levantadas pelos embriologistas . Wilkinson e colaboradores (1990) acharam que “a expressão do gene T tem um papel direto nos eventos precoces da formação do mesoderma e na morfogênese da notocorda”. 1981. um novo tipo de cientista era necessário. e Morange.

A formação da lente por células diferenciadas da íris representa metaplasia (ou transdiferenciação). cortesia de R. esses melanossomos são ingeridos por macrófagos que entram no local da ferida). as proteínas do cristalino. (A) Olho normal.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 41 neural promove sua regeneração a partir da retina pigmentada. a se desdiferenciar expelindo seus melanossomos (os grânulos pigmentados que dão ao olho a sua cor. A regeneração do tecido lenticular da íris (a assim chamada regeneração Wolffiana a partir da pessoa que primeiro a observou em 1894) foi intensamente estudada. vista respectivamente nos dias 5. portanto. 7. em seguida. e divisões mitóticas se sucedem. W. Uma vez formada uma nova lente. a lente normalmente se desenvolve a partir de uma camada de células epiteliais da cabeça. 16. Yamada e seus colegas (Yamada. A íris dorsal continua a se dividir. As células da íris pigmentada começam. Retina pigmentada Retina neural Íris dorsal Lente Figura 2.4). 1991). a transformação de um tipo celular diferenciado em outro (Okada. Dumont e Yamada. 1972) acharam que após a remoção de uma lente. seu DNA se replica. Os núcleos do lado dorsal da íris começam a sintetizar quantidades enormes de ribossomos. Essas células começam então a sintetizar os produtos diferenciados de células lenticulares. A nova lente estará completa no dia 30. e uma nova lente pode ser formada a partir das células da íris dorsal. Essas proteínas são fabricadas na mesma ordem que no desenvolvimento normal da lente. uma série de acontecimentos leva à produção de uma nova lente a partir da íris (Figura 2. A íris da salamandra. Esses eventos não são a via normal pela qual a lente dos vertebrados é formada. 1966. 9. 1954. Como será visto em detalhe mais tarde. Reyer. (B-G) Regeneração da lente.) (B) (C) (A) (D) (E) (F) (G) . não-operado no estágio larval da salamandra Notophtalmus viridiscens. induzida pelas células retinais precursoras subjacentes. 18 e 30. não havia perdido gene algum daqueles usados na diferenciação das células da lente. formando um globo de tecido desdiferenciado na região da lente removida. as células do lado dorsal da íris cessam sua atividade mitótica.4 Íris ventral Regeneração Wolffiana da lente da salamandra a partir da margem dorsal da íris. (de Reyer.

Hoffner. fotografia cortesia de M. a punção do oócito nesse local induz o fuso e seus cromossomos a fluir para fora do ovo (Figura 2. Ocorre rearranjo citoplasmático interno e a finalização da meiose perto do pólo animal da célula. três técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas: (1) um método para enuclear ovos do hospedeiro sem destruí-los. (3) um método para transferir tais núcleos para dentro do ovo sem danificar o núcleo ou o oócito. Se cada núcleo fosse idêntico ao núcleo do zigoto. O ovo hospedeiro é agora considerado estar ativado (as reações de fertilização necessárias para iniciar o desenvolvimento foram completadas) e enucleado. Quando um oócito de rã-leopardo (Rana pipiens) é perfurado com uma agulha limpa de vidro. seria o de conseguir que esse núcleo gerasse todo outro tipo de célula diferenciada no organismo. Algum citoplasma acompanha o núcleo para seu novo lar. DiBerardino e N. o núcleo de uma célula diferenciada sofreu qualquer restrição funcional irreversível. o ovo sofre todas as mudanças citológicas e bioquímicas associadas à fertilização. mas a razão do citoplasma doador para o receptor é somente de 1:105. A bela R.) Membrana cicatriza .42 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Clonagem de Anfíbios: A Restrição da Potência Nuclear O teste definitivo sobre se. antes que tal experimento pudesse ser feito. quando transplantado para um ovo ativado enucleado. e o citoplasma do doador não parece afetar o resultado dos experimentos. Essas técnicas foram desenvolvidas na década de 1950. o núcleo de cada célula deveria ser capaz de direcionar todo o desenvolvimento do organismo. Esse fuso meiótico pode ser facilmente localizado quando empurra os grânulos pigmentados do pólo animal. (Segundo King. Briggs e King demonstraram que núcleos da célula da blástula podiam direcionar o desenvolvimento de girinos completos quando transferidos para o citoplasma do oócito. Enquanto a maioria dos núcleos da blástula podiam produzir girinos completos.5). A passagem de um núcleo para o ovo é conseguida pela ruptura de uma célula doadora e transferência do núcleo liberado para o oócito por meio de uma micropipeta. pipiens na fotografia foi derivada dessa maneira. em primeiro lugar por Robert Briggs e Thomas King que combinaram a enucleação com a ativação do ovo. ou não. Porém. O que acontece quando núcleos de estágios mais avançados são transferidos para oócitos ativados e enucleados? Os resultados de King e Briggs (1956) estão delineados na Figura 2.5 Procedimento para o transplante de núcleos da blástula para ovos ativados enucleados de Rana pipiens.6. (2) um método para isolar núcleos doadores intactos. As dimensões relativas do fuso meiótico foram exageradas para demonstrar a técnica. 1966. Em 1952. houve um dramático decréscimo da capacidade dos núcleos derivados de estágios mais tardios direcionar o desenvolvimento direto até o estágio de Pólo animal Agulha de vidro Fuso meiótico isolado Micropipeta Fuso meiótico Grânulos pigmentados Remoção dos cromossomos e do fuso da célula Ovo ativado enucleado Extração e lise da célula doadora Núcleo doador inserido na célula enucleada Figura 2.

Em alguns casos. Porém. 1978. obtiveram resultados sugerindo que os núcleos de algumas células diferenciadas podem permanecer totipotentes. transferia-se o núcleo da blástula para vários outros ovos). e (2) as células intestinais de um girino tão jovem poderiam não se qualificarem .7). pipiens) foi isolado e inserido no oócito ativado e enucleado. em lugar dos dois usuais). esses núcleos eram totipotentes (Figura 2. Quando núcleos de células somáticas de girinos no estágio de broto caudal foram usados como doadores.) Girinos (Rana pipiens) nadando normalmente Horas a 18oC girino. sete desses girinos (de dois núcleos originais) se metamorfosearam em rãs adultas férteis (Gurdon e Uehlinger. Gurdon havia transferido núcleos do endoderma intestinal de girinos Xenopus que se alimentavam. A ordenada mostra a porcentagem desses transplantes capazes de produzir blástulas que podiam em seguida direcionar o desenvolvimento para o estágio do girino nadador (Segundo McKinnell. não ocorreu desenvolvimento normal. que podem migrar até o intestino. células somáticas parecem perder sua capacidade de direcionar desenvolvimento completo à medida que se tornam definidas e diferenciadas.6 Porcentagem de embriões de transplantes nucleares que se desenvolvem normalmente á Bl st a ul ta r a di a ul pr G ec e oc a ul ta r a di N êu ru la G ás tr ás tr m ard co c om o s n t o c n e os iri m in G ati ir b G o br Gráfico de transplantes nucleares bem sucedidos.4 porcento) promoveram o desenvolvimento até o estágio do girino que se alimentava. 1956). Entre 276 núcleos transferidos. Esses núcleos doadores continham um marcador genético (um nucléolo por célula. e a progressiva restrição da potência nuclear durante o desenvolvimento parece ser uma regra geral. que os distinguia dos núcleos do hospedeiro. Porém. Clonagem de Anfíbios: A Pluripotência de Células Somáticas John Gurdon e seus colegas. usando métodos ligeiramente diferentes de transplante nuclear na rã Xenopus. Transplantes seriados (que requeriam colocar um núcleo intestinal em um ovo e quando o ovo tinha se transformado em blástula. embora células de Xenopus tenham retido suas potências por um período de desenvolvimento mais longo (Prancha 1). King e seus colegas criticaram esses experimentos assinalando que: (1) não haviam sido tomadas suficientes precauções para ter certeza que células germinativas primordiais. nervos e assim por diante – de um girino vivente. para ovos ativados enucleados. A abscissa representa o estágio no qual o núcleo doador (de R. Além disso. núcleos das células intestinais dos girinos foram capazes de gerar todas linhagens de células – neurônios. em função da idade do desenvolvimento nuclear. 1962).CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 43 Estágio desenvolvimental dos embriões e girinos dos quais foram retirados os núcleos to ca a ud l ía co Figura 2. 1966). Gurdon também achou uma progressiva perda de potência no decorrer do desenvolvimento. aumentavam o rendimento para 7 porcento (Gurdon. As exceções a essa regra mostraram ser muito interessantes. somente 10 (1. núcleos de células germinativas de girinos do estágio de broto caudal (que irão finalmente dar origem a um organismo completo após a fertilização). células do sangue. Assim. foram capazes de direcionar desenvolvimento completo em 40 porcento das blástulas que se desenvolveram (Smith. é possível que alguns núcleos celulares diferenciados sejam diferentes de outros. não foram usadas como fontes de núcleos.

Briggs.7 EXPERIMENTO Ovo não-fertilizado (cepa 2 – nu) Girino (cepa 1 – nu) Procedimento empregado para obter rãs maduras de núcleos intestinais de girinos de Xenopus. um único núcleo celular diferenciado ainda retinha potências incríveis. nenhum dos transferidos de primeira geração progrediu além da formação do tubo neural. numerosos girinos foram gerados (Gurdon et al. Embora esses girinos tivessem morrido antes de atingir o estado alimentar. Para responder a essas críticas. O ovo de tipo selvagem (2 nucléolos por núcleo. porém.. 1977. a proteína característica de células adultas da pele. em alguns casos o desenvolvimento do embrião é sustado. 1979). porém. 1978. 1975). 1967.44 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2. 2-nu) é irradiado para destruir os cromossomos maternos. uma rã inteiramente nova é formada tendo um genótipo 1-nu. reter a habilidade . pouco após a gastrulação. 1968. e um núcleo intestinal de um girino marcado (1-nu) é inserido. Um único núcleo derivado de uma hemácia de uma rã adulta (que nem se replica e nem sintetiza RNA) pode sofrer mais de 100 divisões após ser transplantado para um oócito ativado e. em outros casos. Por transplantes seriados. cada uma continha queratina. Essas células mostraram estar diferenciadas. Em alguns casos não ocorre divisão. Gurdon e seus colegas cultivaram células epiteliais da membrana natatória de rãs adultas. ainda. (Segundo Gurdon. McKinnell.) Irradiação UV destrói comossomos do ovo Núcleo intestinal epitelial é inserido no ovo irradiado Micropipeta Núcleo intestinal Ovo receptor irradiado RESULTADOS Blástula Blástula Blástula Sem divisão Girino Girino (morre) Embrião anormal Rã adulta (Cepa 1 – nu) como um tipo de célula verdadeiramente diferenciada porque células de girinos que se alimentam ainda contêm plaquetas de gema (DiBerardino e King. Quando núcleos dessas células foram transferidos para oócitos ativados e enucleados de Xenopus.

o citoplasma do oócito humano pode não responder a sinais emitidos por um núcleo de uma célula em estágio avançado. e substituição por pronúcleos de outro (Figura 2. Similarmente. Além disso. podem envolver diferenças na fisiologia do desenvolvimento das rãs Rana e Xenopus. 1983). se tanto. desenvolveu-se até esse estágio quando núcleos de embriões de 4 células foram transferidos para zigotos enucleados (McGrath e Solter. núcleo algum de uma célula documentadamente especializada. a partir de células diferenciadas. Assim. é uma formidável tarefa. Em animais controle. o estômago. Sally Hennen (1970) mostrou que o sucesso desenvolvimental de núcleos doadores pode ser ampliado tratando-se esses núcleos com espermina e resfriando os ovos para dar tempo ao núcleo de se adaptar ao citoplasma do ovo. enquanto alguns núcleos de células diferenciadas dividem-se raramente. existe pouca dúvida de que eles são extremamente pluripotentes. mesmo existindo um debate sobre a totipotência de tais núcleos. cada núcleo no corpo contém a maioria (se não todos) dos mesmos genes. reconhecer uma restrição geral de potência concomitante ao desenvolvimento. podem ser reativados para produzir os nervos. essa habilidade não poderia ser extrapolada para células humanas. os núcleos das células diferenciadas não foram capazes de gerar animais adultos quando colocados em células ativadas e enucleadas. se desenvolvem até o blastócito (blástula). prosseguiram até a geração de girinos normais. mesmo se rãs adultas pu- dessem ser geradas de núcleos diferenciados. muitos genes não usados na pele ou em células sangüíneas. pela remoção de pronúcleos (haplóides) de espermatozóide e óvulo de um zigoto.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 45 de gerar girinos natatórios (Orr et al. foram tratados dessa maneira. Podemos olhar para esses experimentos de clonagem de anfíbios de duas maneiras. facilmente ver que o genoma da célula diferenciada é notavelmente potente em sua habilidade de produzir todos os tipos celulares do girino anfíbio.8. Segundo. Os núcleos da clivagem das rãs dividem-se rapidamente. Enquanto mais de 90 porcento dos zigotos enucleados do camundongo. ou o coração de um girino natatório. Deve ter ficado óbvio da discussão precedente que clonar um indivíduo totalmente desenvolvido. Embora DiBerardino (1987) tenha observado que “até o presente. 62 porcento daqueles núcleos que iniciaram desenvolvimento normal. Esses zigotos reconstruídos começam a se dividir e são então implantados no útero. no estágio de broto caudal. Além das dificuldades éticas e técnicas do trabalho com o organismo humano. nenhum dos núcleos conseguiu gerar tais girinos. Certamente. Em outras palavras. Algumas das diferenças entre os resultados dos laboratórios de Briggs e de Gurdon. Quando se transfere um núcleo de uma célula diferenciada para o citoplasma do oócito. nem de uma célula adulta tenha mostrado ser totipotente”. se está pedindo ao núcleo para reverter para condições fisiológicas às quais ele não está acostumado. Primeiro. tal núcleo pode no entanto instruir a formação de todos os órgãos do girino natatório. Falhas em replicar DNA rapidamente podem levar a quebras cromossômicas: tais anormalidades foram vistas em muitas células de girinos clonados. Mesmo em anfíbios. DiBerardino. Assim. recebendo pronúcleos de outros zigotos. McGrath e Solter. 1984). os genes para o desenvolvimento do girino completo não pareceram ter sido perdidos pelas células do endoderma. Acredita-se que a espermina remova histonas da cromatina podendo “re-acertar” a atividade dos núcleos. nem um único embrião (de 81). núcleos de embriões de 8 células . Os camundongos resultantes exibem o fenótipo do núcleo doador. Transplante nuclear foi conseguido em camundongos. Informações adicionais & Especulações Clonando Mamíferos por Prazer e Lucro C LONAR SERES HUMANOS a partir de células previamente diferenciadas parece ser o objetivo de editores de jornais e novelistas. 1986.. Quando núcleos do endoderma de girinos de Rana pipiens. 1989).

mas não a placenta*) também não puderam apoiar o desenvolvimento. 1987.9 Experimento de Steward demonstrando a totipotência de células do floema da cenoura. todavia. 1983. em todos esses casos. Esse fluido (é realmente o endosperma da semente do coco) contém os fatores e nutrientes necessários para o crescimento da planta e os hormônios exigidos para a diferenciação. permitindo que os pronúcleos (flexa) penetrem na célula. as espécies mamíferas diferem muito em termos de temFigura 2. (Segundo McGrath e Solter.46 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (C) (B) (D) Figura 2. (C) Essa vesícula é misturada com vírus Sendai (que induz a fusão de membranas nucleares) e é inserida no espaço entre a zona pelúcida e o outro ovo enucleado.) po de ativação e implantação uterina. Em contraste com núcleos de ouriços-do-mar ou anfíbios. Por isso. Stice e Robl. Em 1958. (B) A membrana celular forma uma vesícula ao redor dos pronúcleos no interior da pipeta de enucleação. Um embrião de célula única. incubado em colcemida e citocalasina para relaxar o citoesqueleto. Usando modificações técnicas. 1988. a clonagem de Elvis Presley a partir de células diferenciadas não é algo com que possamos contar. Wilmut e colaboradores (1997) mostraram que é possível clonar um carneiro a partir de um núcleo de célula de glândula mamária adulta. 1989. porcos e coelhos foram capazes de direcionar o desenvolvimento completo quando transplantados para oócitos ativados e enucleados (Prather et al. Prather et al. (D) O vírus Sendai proporciona a fusão do ovo enucleado e os pronúcleos envoltos pela membrana. Essa habilidade foi dramaticamente demonstrada em células de cenouras ou tabaco. Porém. cortesia dos autores. é seguro com uma pipeta de sucção. Sob essas condições. C. os núcleos vieram de embriões pré-implantados. A membrana celular não está rompida. núcleos de embriões pré-implantados de gado. (cujas células são totipotentes) não dão suporte para o desenvolvimento total. Células livre do calo continuam a se desenvolver em suspensão Floema de raiz Corte transversal da raiz Planta jovem Planta embrionária transferida para meio de cultura de agar Planta de cenoura madura no agar Planta de cenoura madura Proliferação de massa celular (calo) em meio de cultura de leite de coco . 1991).. A pipeta de enucleação perfura a zona pelúcida (a proteína que envolve o ovo) e aspira a membrana celular adjacente e a área da célula contendo os pronúcleos. Tais experimentos provavelmente fracassam porque núcleos de blastômeros não funcionam de maneira normal no citoplasma zigótico. (A) A pipeta de enucleação é retirada e o citoplasma contendo os pronúcleos é removido do ovo. Nem todos blastômeros mamíferos são os mesmos. os núcleos dos blastômeros precoces do camundongo *Cada blastômero da massa celular interna é totipotente no sentido de reter sua capacidade de formar células de qualquer tipo no organismo. Os núcleos haplóides derivados do espermatozóide e do óvulo. [gene4.8 Procedimento para transferir núcleos para o ovo ativado enucleado de mamifero. Recentemente. a continuidade do citoplasma limitado pela membrana está indicada pela flexa. F. Esse resultado poderá ter importantes conseqüências agrícolas e legais (Prather. Willadsen (1986) produziu carneiros de termo completo a partir de núcleos transplantados de blastômeros do estágio de 8 células. Essa capacidade permite o aparecimento de gêmeos. Pequenos pedaços de floema são isolados da cenoura e rodados em grandes frascos contendo leite de coco. não se juntaram ainda.html] Clonagem de Plantas Somente nas plantas os núcleos de células diferenciadas de organismos adultos podem ser facilmente vistos como capazes de direcionar o desenvolvimento de outro organismo adulto. Steward e seus colegas estabeleceram um processo pelo qual os tecidos diferenciados de raízes de cenouras podiam dar origem a toda uma nova planta (Figura 2. os tecidos proliferam e formam uma massa e massa celular interna (os blastômeros que formam o embrião.. 1989).9). Willadsen.

. a lactose). até agora não resolvido. algumas dessas subunidades estão rearranjadas ou mesmo suprimidas do genoma. Cada célula tem todas as subunidades gênicas das imunoglobulinas. É o problema repetidas vezes declarado. Se a lactose está ausente do citoplasma. *A grande exceção a essa regra da constância dos genes – os genes das imunoglobulinas – é discutida no Capítulo 10. esse grupo de novas enzimas aparecem. em contraste com anfíbios e mamíferos (nos quais as células germinativas são destacadas como uma linhagem distinta de células no início do desenvolvimento). 1970). Além disso. Os genes para a proteína globina podem ser encontrados em células da pele. diferentes padrões ou configurações específicos. Mas. quando encontram a lactose. A continuação da rotação leva ao desbastamento de células individuais do calo para o meio de suspensão. que são proteínas que embora não sejam usualmente sintetizadas por bactérias ou levedos. o mesmo genoma pode produzir dois estados citoplasmáticos funcionalmente diferentes. não é tão surpreendente que uma única célula de uma planta possa se diferenciar em outros tipos de células e formar um clone geneticamente idêntico (clone. o modelo do operon demonstrou como uma substância do ambiente podia efetuar a expresão gênica diferenciada. Steward. entre dois campos da pesquisa em biologia é provavelmente aquela entre a genética e a embriologia. Porém. e os genes para as queratinas da pele podem ser encontrados em neurônios cerebrais. plantas e animais se desenvolvem de maneira diferente. regeneram as partes faltantes) é uma prática agrícola comum. mas em linfócitos. formando uma planta de cenoura completa e fértil (Steward et al. isso ainda deixa sem resposta outra grande questão levantada pelos embriologistas: Se o núcleo de cada célula no organismo tem os mesmos genes. as plantas normalmente derivam seus gametas de células somáticas. dependendo da presença ou não de determinado composto (no caso. adquirir a propriedade de confeccionar moléculas com novos. uma vez que a explicação geral para a expressão diferencial da expressão gênica foi estabelecida.. Em micróbios. Por exemplo. Curiosamente.e. ou no mínimo. Sobre E. ao menos. a propagação vegetativa de plantas por corte (i. coli e elefantes: O modelo operon Na maioria dos casos estudados. o resto da planta é capaz de se desenvolver. Portanto. O terceiro desafio . muitos biologistas concordaram que: a maior lacuna.a explicação de como o ambiente pode direcionar o desenvolvimento – foi prontamente compreendida. o genoma é o mesmo de célula para célula no organismo. de como células com genomas idênticos podem se tornar diferenciadas. essa citação vem de Jacques Monod (1947). a bactéria Escherichia coli só sintetiza β-galactosidase e outras enzimas digestoras de lactose. ainda para ser preenchida. porções de plantas que quando nutridas. Monod lançou a hipótese que o fenômeno da adaptação enzimática podia oferecer a solução para o problema de como genomas idênticos podem sintetizar diferentes moléculas “específicas”. Essas células dão origem a nódulos celulares semelhantes a raízes que continuam a crescer enquanto permanecem em suspensão. significando “ramo”). A partir desses nódulos. como podem esses genes fazer com que essas células se tornem diferentes? *Pouco tempo após a 2a Guerra Mundial. do grego klon. Conforme veremos. 1964. essas enzimas não são sintetizadas. com a introdução de lactose no citoplasma. Porém. serão sintetizadas se os microorganismos encontrarem um novo substrato. um geneticista microbiano trabalhando na síntese de enzimas adaptativas. porém.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 47 desorganizada chamada calo. colocados em um meio solidificado com agar.

O livro de Waddington (1962). permaneceram cépticos a respeito da extrapolação de bactérias a embriões. uma proteína repressora codificada por genes liga-se ao sítio operador adjacente aos genes estruturais. o gene torna-se capaz de transcrever mRNA. Em sistemas indutivos. Muitos geneticistas microbianos explicitamente ligaram enzimas indutivas a conceitos embriológicos. Em 1961. Além disso. Com isso. A diferenciação deveria ser vista não em termos anatômicos. No entanto. Essa perspectiva foi também salientada em Hereditariedade e Desenvolvimento (1963). enfatizando a complexidade do desenvolvimento e a diversidade da performance embriológica. Jacob e Monod enfatizaram que o mecanismo de controle do operon-símile pode ser parte da regulação gênica universal. 1979). o indutor liga-se à proteína repressora alterando sua conformação de forma a impedir a ligação ao operador. o mesmo genoma pode sintetizar diferentes enzimas. impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor que inciaria a transcrição.48 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Monod não foi o único cientista a achar que micróbios unicelulares poderiam explicar a diferenciação multicelular. essa criatura microscópica. Waddington aprovou especialmente esse modelo porque significava que os genes não são apenas ativos. as regras simples que esperavam encontrar. poderá ser difícil perceber a diferença entre um geneticista e um embriologista. Spiegelman via uma semelhança fundamental entre a indução de novos tipos celulares no embrião e a indução de novas enzimas em microorganismos. Em um importante trabalho de 1961. Novos Padrões na Genética e no Desenvolvimento. começa com um capítulo relacionando o modelo do operon de Jacob e Monod com o controle da expressão gênica no desenvovimento dos anfíbios. Dessa maneira. à medida que eles avançam em sua ciência para além daquilo que cada um poderia ter conseguido isoladamente. entenderá o elefante. mas reativos. que conclui: Na geração anterior. O agente molecular responsável deveria ser chamado “o indutor”. mas como “produção controlada de padrões enzimáticos únicos”. e apelaram para a unidade da natureza e. O problema da diferenciação não podia mais ser visto como uma propriedade estrutural dos tecidos. O modelo do operon foi imediatamente introduzido nos textos de embriologia por cientistas que procuravam a síntese da genética com a embriologia. Jacob e Monod sintetizaram dados sobre a indução da β-galactosidase levando à construção do modelo do operon. respondendo às mudanças no citoplasma. Esse é o termo técnico usado em embriologia para descrever a habilidade de uma célula produzir uma substância capaz de influenciar a diferenciação de outra. porém. Estando presente. Essa redefinição focaliza a atenção para a relação entre os genes do núcleo e as propriedades do citoplasma. síntese de embriologia com genética por John Moore. se alguém entender a bactéria. Esse modelo postula que a pequena molécula do indutor causava a transcrição de diferentes genes em E. mostrou um caminho. que pode ser traduzido formando proteína. poucos embriologistas ou geneticistas teriam previsto que a síntese dos seus campos de trabalho teria se tornado possível por estudos com a bactéria Escherichia coli. dependendo da presença ou não do respectivo indutor. coli (Figura 2. sem embrião próprio. Eles conectaram seus resultados ao “problema fundamental da embriologia química que é a compreensão do porquê células dos tecidos não expressam constantemente todos os potenciais contidos em seu genoma”. Julgavam ser válida a extrapolação. Waddington considerou genes e citoplasma como mutuamente interativos. um grupo de pesquisadores acreditava que micróbios eram um excelente (e facilmente estudado) modelo para diferenciação embrionária. Como sugerido por Monod (veja Judson. a síntese de uma enzima adaptativa em presença do seu substrato deveria ser discutida como uma “indução”.10). Muitos embriologistas.html] No fim da década de 1950. mas passar a ser considerado uma propriedade bioquímica de células individuais. O microbiologista Sol Spiegelman (1947) declarou que a embriologia estava sendo prejudicada por sua própria terminologia. Na próxima década. . em última análise. [gene5.

coli. previne ligação a o (D) O repressor da lactose é solúvel Genes estruturais O gene i do tipo selvagem pode produzir repressor para ambos cromossomos que se ligam a o na ausência de lactose Genes estruturais Síntese diferencial de RNA A desejada unificação não ocorreu tão rapidamente como esperado por Moore.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 49 (A) O operon lac Figura 2. emergiu na década de 1960 um consenso de que as células regulam seu desenvolvimento através da expressão gênica diferencial. coli. Porém.10 Gene indutor Promotor Operador Genes estruturais para utilização da lactose (B) Quando não há lactose disponível Genes estruturais Proteína repressora produzidas por i liga-se a o (C ) Quando a lactose está disponível Não há transcrição de genes estruturais Regulação diferencial de genes em E. (B) Quando a lactose não está disponível. coli. forma-se repressor tipo-selvagem capaz de tornar indutível o gene original da β-galactosidase. baseado na evidência embriológica a favor da equivalência genômica e do modelo do operon de E. inibindo a transcrição pela RNA polimerase do promotor (p). fazendo começar a transcrição. alterando sua forma. uma proteína repressora produzida pelo gene i liga-se ao sítio repressor (o). não há transcrição de RNA de β-galactosidase a não ser que a lactose esteja presente. Os três postulados da expressão gênica diferencial eram os seguintes: . o que faz com que a proteína não possa mais se ligar ao DNA operador . (D) A solubilidade dessa proteína é demonstrada em estudos com o mutante de E. Genes estruturais Lactose mRNA RNA polimerase β-galactosidase mRNA é transcrito Lactose combinando com o repressor. Como bactérias eram os modelos para tal atividade. (C) Quando o indutor lactose está presente. combina com a proteína repressora. (A-C) No estado induzível de tipo-selvagem. expressão em geral significava transcrição de mRNA. Quando células bacterianas haplóides com um gene indutor nãofuncional (i-) são tornadas parcialmente diplóides com o gene tiposelvagem (i+).

B de Burkholder.11. (A de Ursprung et al. Prancha 31). tais células morrem sendo substituídas por células diplóides não politênicas agrupadas em certas regiões da larva (veja Capítulo 19).13). Esses tufos apareciam em lugares diferentes nos cromossomos em cada tecido. uma larva de inseto tem duas populações celulares diferentes. Porém. (B) Fotografia ao microscópio eletrônico de uma pequena região de um cromossomo politênico de Drosophila. retendo o potencial de serem expressos. 1024 (210). formadas por cerca de 10.12). Ursprung. As bandas escuras estão altamente condensadas comparadas com as regiões interbandas. Os genes não-usados das células diferenciadas não são destruídos ou mutados. Só uma pequena porcentagem do genoma está sendo expressa em cada célula. Beermann estudando o mosquito Chironomus e Becker (1959) estudando Drosophila. Burkholder. e crescem expandindo seu volume até 150 vezes. seu aparecimento mudava com o desenvolvimento dessas células (Figura 2. ou mesmo mais hélices duplas paralelas de DNA em lugar de somente uma (Figura 2. os DNAs de todas as células diferenciadas são idênticos. Essas células não sofrem mitose. Cada núcleo celular contém o genoma completo estabelecido no ovo fertilizado. 3. Em termos moleculares. Os quatro cromossomos estão conectados em seus centrômeros. D. A maior parte tem cromossomos politênicos. acharam regiões cromossômicas que estavam “estufadas”. Os dois primeiros postulados já foram discutidos. Durante a metamorfose. Após a eclosão. e uma porção do RNA sintetizado é específica para aquele tipo de célula. alguns tufos podiam ser Figura 2. (A) Cromossomos politênicos de células da glândula salivar de Drosophila melanogaster. Os genes estruturais para a álcool desidrogenase (ADH).11 Cromossomos politênicos. Ainda mais. 1968. formando um denso cromocentro.. Beermann (1952) mostrou que o padrão de distribuição das bandas de cromossomos politênicos era idêntico ao longo da larva e que não se notavam perdas ou adições de qualquer região cromossômica quando diferentes tipos de células eram comparados (Figura 2. aldeído oxidase (Aldox) e octanol desidrogenase (ODH) foram mapeados nas posições designadas nesses cromossomos. cortesia de H. O terceiro – que só uma pequena parte do genoma está ativo produzindo produtos específicos dos tecidos – foi primeiro testado em larvas de insetos.000 células. cortesia de G. 2. Tais cromossomos sofrem replicação de DNA na ausência de mitose. 1976. contendo portanto 512 (29).) Aldox .50 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento 1.

1966. Beermann (1961) apresentou evidências que esses tufos representam um afrouxamento localizado de cromossomos politênicos (Figura 2. Duas espécies intercruzadas diferentes de Chiromonus foram encontradas: uma produzindo grande quantidade de proteína salivar e a outra não (Figura 2. Beermann concluiu que a informação genética necessária para a síntese dessa proteína salivar está presente nessa banda distal do cromossomo e que sua produção dependia de transformação em uma região estufada. (B) Hibridização do RNA de uma proteína da gema com um cromossomo da glândula salivar larval de Drosophila. . Cruzando duas moscas híbridas. Notar que o gene para a proteína está presente no cromossomo da glândula salivar. (A) Uma região do conjunto cromossômico da mosca Chiromonus tentans. C.12 Identidade genômica em cromossomos politênicos. Altos produtores tinham dois tufos (um em cada cromossomo homólogo).. Wensink. (B) De Barnett et al. O cruzamento de produtor com não-produtor resultou em larvas produzindo quantias intermediárias de proteína salivar. produtores intermediários tinham apenas um.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 51 estimulados ou inibidos por certas mudanças fisiológicas causadas pelo calor ou por hormônios (Clever. Os produtores tinham uma tufo grande (anel de Balbiani) em determinada banda. fotografia cortesia de P. a capacidade de produzir proteína salivar segregou-se de forma Mendeliana: 1 alto produtor: 2 intermediários:1 não-produtor. Ashburner e Berondes. Notar a constância do número de bandas nos diferentes tecidos. 1972. (A) Segundo Beermann. e não-produtores nenhum tufo.15).14) e que são sítios de síntese ativa de RNA. Ashburner. 1952. Os grãos escuros (flexa) mostram onde a mensagem da proteína radioativa da gema se ligou aos cromossomos. (A) Glândula salivar (B) Túbulos de Malpighi Tecido retal Intestino Figura 2. 1980. apesar da proteína não ser aí sintetizada. 1978). esse tufo não existia nos não-produtores.

1963) . tentans. (B) Diagrama da região passando por estufamento. (Cortesia de M.52 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2. (D. (C) larva de 115 horas. 78D) estufam mais tarde. Ashburner. mostrando o enorme tufo BR2. B mostra o isolamento de BR2 do cromossomo 4 de C. 1975). Grossbach. porém. a maioria não estufa de modo algum durante o período. cortesia de U. (A.16 A. 1973. (A de Grossbach. Transcrição de BR2 foi demonstrada incubando glândulas salivares isoladas com precursores de RNA (A) (B) Figura 2.E) estágio pré-pupa (após 4 horas). Outras bandas (71DE. B segundo Beermann. de preparações coradas.B) larva de 110 horas.14 Terminação proximal do cromossomo 4 da glândula salivar de Chiromonus pallidivitatus.13 Seqüência de estufamentos de uma porção do cromossomo 3 da glândula salivar de Drosophila melanogaster. O BR2 pode ser isolado por microdissecção devido seu tamanho excepcional.) (A) (B) (C) (D) (E) Prova adicional de que tufos cromossômicos produzem mRNA vem de estudos sobre tufos do anel de Balbiani (BR2) em Chironomus tentans. Notar o estufamento e a regressão das bandas 74EF e 75B. A Figura 2. mostrando o extenso tufo no cromossomo politênico. e seus produtos podem ser analisados por autoradiografia (Lambert e Daneholt. (A) Fotomicrografia em contraste de fase.

mostrou que o DNA estufado (Puff de DNA) . 1975. Correlação de padrões de estufamento com funções especializadas nas células das glândulas salivares de Chironomus pallidivitatus.tinha-o transcrito ativamente (Figura 2. ser extraído da porção BR2 do cromossomo dissecado (Lambert. Produtores intermediários têm somente um cromossomo 4 com uma região estufada BR4(SZ) em cada célula salivar realizando a secreção. indicando que é ativo na síntese protéica (Wieslander e Daneholt. 1961. 1972). O cromossomo intacto 4 pode ser dividido em três regiões. 1977). 2 e 3 (BR1.B) Isolamento da região BR2 de Chironomus tentans por micromanipulação. BR3). Larvas com altos níveis de secreções granulares têm células salivares glandulares com tufos BR4(SZ) em ambos cromossomos 4 (coloridos).16C).15 radioativos.e nenhum outro local .CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 53 BR4(SZ) Alto produtor Não-produtor BR2 Todos produtos intermediários BR1 BR3 Alto produtor (A) (B) (C) Produtores Intermediários Não-produtor Figura 2. pode posteriormente ser visto produzindo proteínas em ribossomos citoplasmáticos. Assim. (B) Cromossomo 4 de uma célula salivar. Esse RNA era excepcionalmente grande – cerca de 50. (A) Cromossomo de uma célula produzindo uma secreção granular e mostrando um anel de Balbiani adicional [BR4(SZ)]. (A e B de Lambert e Daneholt. O RNA radioativo pôde. fotografias cortesia de B. (C) Transcrição da região BR2 mostrado por uma auto-radiografia in situ após hibridização do BR2 RNA com a preparação cromossômica. (A e B segundo Beermann. um RNA transcrito de uma banda específica de DNA.) (A) (B) BR 2 Figura 2.16 (C) (A. que estufa na glândula salivar larval. C de Lambert. especificamente hibridizado para a região BR2 do cromossomo. Esse mesmo RNA pôde ser isolado de polissomos sintetizadores de proteínas. BR2. uma contendo BR2. (C) Evidência genética que a síntese de uma importante proteína salivar depende da formação de tufos BR4(SZ). O grande segmento de RNA radioativo.000 bases. em seguida. Beermann.) . enquanto larvas sem essas secreções não têm tais tufos. 1972. cortesia de W. mostrando somente anéis de Balbiani 1. Lambert.

Para encontrar e analisar os genes que são responsáveis pelo desenvolvimento embrionário. essas devem se re-anelar sob condições adequadas de força iônica e tempo. novas técnicas tiveram que ser aperfeiçoadas. Assim. Por exemplo. (A) Se a hélice de DNA for separada em duas fitas. 1968). Se presente em quantidades suficientemente grandes em comparação com o DNA. RNA sintetizado a partir de uma região particular do DNA poderia ser esperado ligar-se à fita do qual foi transcrito (Figura 2. Para medir essa hibridização. Esse problema foi superado isolando o RNA e fazendo uma cópia complementar de DNA (cDNA) na presença de precursores radiativos. De maneira semelhante. De maneira semelhante.17 Hibridização de ácidos nucléicos. se o DNA é cortado em pequenos pedaços e cada pedaço dissociado em duas fitas simples – desnaturado – cada fita na solução deverá achar e reunir-se com seu parceiro complementar. uma das fitas de ácido nucléico (a sonda) é em geral marcada pela incorporação de nucleotídeos radioativos. para permitir a formação de híbridos de fitas duplas. Em células que sintetizam essa proteína. Essa enzima pode produzir DNA de um molde de RNA (Figura 2. não eram os genes causadores da diferenciação celular. o gene permanece reprimido. Isso pode ser feito em tubo de ensaio contendo o RNA. conseguido variando a temperatura ou as condições iônicas da solução em que ocorre a renaturação (Wetmur e Davidson. não sendo necessário preocupar-se com a diluição (A) Condições de desnaturação (calor. E embora esses genes dos tufos eram ativos em células que já se haviam diferenciado (como aquelas da glândula salivar). Essa técnica envolve fortalecimento de pedaços de fitas simples de RNA e DNA. em células que não usam essa proteína. precursores radioativos de DNA e a enzima viral transcriptase reversa. em geral. A maioria das técnicas para análise de genes eucariotos baseia-se na hibridização de ácidos nucléicos. quando lhe é dado tempo suficiente para isso. adicionar RNA (em grande quantidade em comparação com DNA) RNA hibridiza com uma fita de DNA . álcali) Condições de re-anelamento Figura 2. Um problema técnico que inicialmente atormentou os estudos de hibridização de ácidos nucléicos foi a dificuldade em conseguir colocar quantidades suficientes de radioatividade na molécula de RNA.54 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Portanto. os tufos nos cromossomos salivares estão produzindo mRNA ativamente. o gene está ativado. o RNA irá substituir uma das fitas de DNA nessa região.18). O DNA é sintetizado in vitro. se o DNA for separado em suas duas fitas.17). RNA pode ser esperado hibridizar especificamente com o gene que o codifica. As condições de renaturação devem ser tais que ligação específica entre fitas complementares seja mantida e combinações não específicas sejam dissociadas. Isso é. uma extensão curta de DNA (chamado de iniciador ou primer). (B) RNA Desnaturar. Hibridização de ácido nucléico Poucos genes puderam ser analisados como aqueles nos tufos politênicos de Chiromonus. o RNA deve ficar capacitado a se ligar a genes que o codificam.

Tabela 2. nem mesmo cromossomos individuais. De modo geral. tornando-o extremamente útil para a detecção de pequenas quantidades de RNAs específicos. o DNA pode hibridizar tanto com o gene que produziu o RNA (embora a outra fita) e com o próprio RNA.1. o pesquisador anela um iniciador consistindo de 15 resíduos de desoxitimidina (dT15) ao final 3' da mensagem. Esses pedaços são freqüentemente chamados de fragmentos de restrição.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 55 dos precursores radiativos. A seqüência de dupla fita lida em uma direção é idêntica à seqüência lida da frente para trás na outra direção. 1975). Entretanto. desnaturando o híbrido de dupla fita e clivando o RNA.1 Sítio enzimático* Enzimas de restrição comumente usadas Derivação Reconhecimento e clivagem EcoRI BamHi HindIII SalI SmaI HhaI HaeIII AluI Escherichia coli Bacillus amyloliquifaciens Haemophilus influenzae Streptomyces albus Serratia marcescens Haemophilus haemolyticus Haemophilus aegyptius Arthrobacter luteus G AA T T C C T TAA G G G AT C C C C TAG G A AG CTT TTC GA A G TC GAC CAG C T G CCC GGG GGG CCC GCG C C GCG GG CC CC GG AGCT T C GA * Todos os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição têm um centro de simetria. transcreve uma fita de DNA complementar. começando no iniciador dT15. Além disso. Nathans e Smith. Por exemplo. essas endonucleases são enzimas bacterianas que reconhecem seqüências específicas do DNA e o clivam nesses sítios (Tabela 2. desde a década de 1970 a hibridização de ácido nucléico permitiu aos biologistas do desenvolvimento realizar o que Boveri aspirava: isolar e amplificar regiões específicas do cromossomo. cepa H). por isso. A maioria dos mRNA possui uma longa cadeia de resíduos de adenosina (AAAn) no terminal 3’ da mensagem (a ser discutida no Capítulo 12). A primeira fase desse processo consiste no corte de DNA nuclear em pedaços distintos. essa seria uma pré-condição para colocar o químico em uma posição a qual lhe permitiria analisar (o material hereditário) com mais minúcias que o morfologista. o DNA é clivado em cada sítio onde aparece a seqüência GGATCC. quando DNA humano é incubado com a enzima BamHI (de Bacillus amyloliquifaciens. todos terminando com G em um dos lados e GATCC no outro (Figura 2. dessa maneira. por incubação de DNA com uma endonuclease de restrição (geralmente chamada de enzima de restrição). considerando que as técnicas de sua época nunca seriam suficientes para permitir-lhe estudar como os genes criam embriões. Os produtos são fragmentos de DNA de vários tamanhos. O cDNA pode ser separado aumentando o pH da solução. A técnica principal para isolar e amplificar genes individuais é chamada clonagem de genes. Transcriptase reversa em seguida. .19). Havia necessidade de uma técnica especial de amplificação gênica: Porque não é somente o núcleo. mas certas partes de certos cromossomos de certas células que precisam ser isolados e coletados em quantidades enormes para análise.html#gene6] mRNA Anelar iniciador mRNA Clonagem de DNA genômico Já em 1904 Theodor Boveri desesperava-se. Transcriptase reversa mRNA cDNA Álcali cDNA Figura 2.18 Método para preparar DNA complementar (cDNA).[other.

permitindo ao plasmídeo replicar centenas de vezes em cada bactéria. Esse vetor pode ser aberto por incubação com essa enzima de restrição. Esse composto é incolor. coli. o gene da β-galactosidase é destruído pela inserção.1982). um vetor pode ser construído contendo apenas um sítio sensível à BamHI. Para distinguir entre colônias bacterianas que incorporaram DNA estranho e aquelas que não o fizeram. O poli-ligante é suficientemente curto (e tem o número correto de pares de bases) de modo a não interferir com a atividade enzimática da β-galactosidase. porque é possível que os “terminais adesivos” do sítio da enzima de restrição sofram uma renaturação entre si mesmos. Essas bactérias não vão produzir a cor azul do corante. replicadas em células bacterianas. Esses são chamados plasmídeos recombinantes ou. e é azul a não ser quando está complexado com uma molécula como galactose. Usualmente esses vetores são moléculas circulares de DNA. e os filtros incubados em uma solução contendo o RNA radioativo (ou sua cópia de cDNA) do gene que se *O corante é 5-bromo-4-cloroindol. se um plasmídeo não incorporou um fragmento de restrição ao sítio de enzima de restrição no poli-ligante. Após a abertura. Mesmo que as bactérias e os plasmídeos sejam misturados em condições que encorajam as bactérias a incorporar os plasmídeos. São usados plasmídeos resistentes a drogas ou vírus especialmente modificados (que são muito úteis na clonagem de grandes fragmentos de DNA). coli são cultivadas em ágar contendo ampicilina.Assim.19 é pUC18. Quando essas células são lisadas. O poli-ligante se situa dentro de um gene lacZ que codifica a ß-galactosidase de E. 1978). e (3) um poli-ligante. produzem colônias incolores no ágar. se o plasmídeo incorporou um fragmento de DNA. os pedaços do DNA cortado serão incorporados a esses vetores (porque seus terminais são complementares aos terminais abertos do vetor) e ligados covalentemente. um pedaço curto de DNA artificial que contém os sítios enzimáticos de restrição para várias dessas endonucleases.1973. Em seguida. as células tratadas de E. ele pode ser misturado com os fragmentos de DNA humano. colocando-os em uma solução contendo a enzima DNA ligase. produzidos também por BamHI. Somente aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo (com seu gene dominante. . independentemente do cromossomo bacteriano. Mas nem todos plasmídeos incorporaram um gene estranho.. Em muitos casos. ampicilina-resistente) sobrevivem. Células de cada uma dessas colônias são colocadas em um finíssimo filtro de nitrocelulose ou nylon. O processo de clonagem começa quando os fragmentos de restrição do DNA nuclear são misturados aos plasmídeos abertos pUC18 e a eles são ligados. Ele contém (1) um gene resistente a drogas. geralmente. mas quando transformado pela β-galactosidase forma um precipitado azul *.56 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento O próximo procedimento na clonagem do gene é incorporar esses fragmentos de restrição em vetores de clonagem. O processo total fornece plasmídeos bacterianos. Para evidenciar aquelas bactérias que incorporaram plasmídeos. o gene da β-galactosidase (lacZ) está funcional e a β-galactosidase resultante torna o corante azul. Colônias incolores são então selecionadas quanto a presença de um gene específico. DNA recombinante (Cohen et al. O resultado é o aparecimento de “colônias azuis”. as fitas de DNA são separadas por aquecimento. ocasionando o fechamento do plasmídeo. cada um contendo um único pedaço de DNA humano. que torna a bactéria imune à ampicilina e permite ao pesquisador selecionar aquelas bactérias que incorporaram um plasmídeo. Entretanto. Blattner et al. o ágar também contém um corante chamado Xgal. seu DNA adere aos filtros. A ß-galactosidase codificada pelo gene do plasmídeo cliva a galactose do corante permitindo que adquira a conformação azul. (2) uma origem para a replicação de DNA. O plasmídeo ilustrado na Figura 2. um vetor freqüentemente usado por biologistas moleculares (Vierra e Messing. coli sensíveis à ampicilina e sem o gene da β-galactosidase. Por exemplo. AmpR. nem todas as bactérias incorporam um plasmídeo. Os plasmídeos recombinantes putativos assim formados são então incubados com células de E..

a seqüência do mRNA ou gene não é conhecida. agora. Portanto.19). Finalmente. Essa colônia é então isolada e cultivada. A radioatividade nessas regiões é determinada por auto-radiografia. Isso é chamado clonagem de expressão. produzindo bilhões de bactérias. Apesar desse procedimento parecer muito lógico e fácil. Os plasmídeos recombinantes podem ser separados do cromossomo da E. milhões de clones individuais devem ser selecionados. coli por centrifugação. ser selecionadas em uma única placa. O número de fragmentos aleatórios que devem ser clonados para a obtenção do gene desejado. as proteínas aderem ao papel e podem ser identificadas por anticorpos dirigidos contra àquela proteína. aproximadamente 100. aumenta com a crescente complexidade do genoma do organismo*. freqüentemente o número de colônias a serem selecionadas é astronômico. cada uma contendo centenas de plasmídeos recombinantes idênticos.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 57 Sítio Hind III Sítio BamHI Sítio Eco RI Poli-ligante Plasmídeo cortado no gene lacZ Quebra endonucleolítica por BamHI Fragmentos de gene humano incubados e ligados em um plasmídeo Plasmídeo recombinante com gene lacZ interrompido DNA humano Quebra endonucleolítica por BamHI Mistura com bactérias (lacZ–. Para detectar um gene específico de um genoma de mamífero. Meio contendo ampicilina “Colônias azuis” Aplicação das colônias “incolores” nos círculos do papel de filtro. lisar para expor o DNA mRNA radioativo Papel de filtro incubado com mRNA radioativo do gene a ser clonado Preparação de auto-radiografia para indicar os clones bacterianos com fragmento de DNA que formou um híbrido com o DNA radioativo . sensível à amp. Esse fragmento pode ser separado do DNA plasmídico. e somente aquele DNA deverá ser capaz de ligar o RNA radioativo ou a sonda de cDNA. Após a lise das colônias bacterianas no papel de filtro. Outra maneira comum de selecionar os clones é usar um plasmídeo que tem seu sítio da enzima de restrição próximo a um vigoroso promotor bacteriano (tal como aquele para ß-galactosidase). uma mancha escura é produzida sobre cada colônia contendo o plasmídeo recombinante que carrega o gene específico (veja Figura 2. seu DNA deve estar no filtro. Filme sensível a raios-X é colocado sobre o papel tratado. e incubando o DNA do plasmídeo com BamHI libera-se o fragmento de DNA extranho que contém o gene.000 colônias podem. “Colônias incolores” quer clonar. emitidos pelo RNA radioativo.) Figura 2. Em alguns casos. As bactérias transcreverão o cDNA e o traduzirão em proteína. e os plasmídeos referidos como vetores de expressão. usando como exemplo a inserção de uma seqüência de DNA humano em um plasmídeo com um sítio sensível à BamHI. Os elétrons de alta energia. somente aquelas áreas serão radioativas.19 Um protocolo geral para clonar DNA. *Complexidade se refere ao número de diferentes tipos de genes no núcleo. devendo-se então estimar a seqüência a partir da seqüência de aminoácidos da proteína). Apesar que milhões de clones precisam ser selecionados. Se o plasmídeo contém aquele gene. tornando-os escuros quando o filme é revelado. permitindo ao pesquisador possuir microgramas de seqüências de DNA purificado contendo o gene específico. sensibilizam os grãos de prata no filme.

Se o gene não está presente. fragmentos menores adquirem uma maior velocidade que os maiores quando impulsionados pela mesma energia. O DNA também foi levado por esse fluxo de tampão. o DNA deve ser colocado em uma superfície plana. Drosophila teve uma importância crítica na descoberta desses genes. e isso é feito por transferência. o papel de nitrocelulose e as toalhas por ação capilar. que foi em seguida submetido à uma corrente elétrica. E. Southern (1975). Antennapedia. Filtro de nitrocelulose ou nylon Espaçadores Desnaturar fragmentos de DNA à fitas simples em álcali Papel-toalha Contatos de papel de filtro Peso Figura 2. E=1/2 mv2. e os fragmentos de DNA resultantes foram separados em uma eletroforese em gel. Isso é uma função da equação de energia cinética. Os fragmentos de DNA carregados negativamente migraram em direção ao pólo positivo. As posições do DNA no papel diretamente refletem a posição dos fragmentos de DNA no gel. Suporte Cuba com solução tampão Gel Colocar filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon sobre gel: colocar papel-toalha e peso Digestão com restrição e eletroforese em gel de agarose Colocar gel no papel de filtro úmido entre 2 espaçadores . levando junto o DNA. é um gene cujo produto protéico é essencial para inibir a formação de estruturas da cabeça no tórax. mas foi detido pelo filtro de nitrocelulose. As misturas de fragmentos foram colocadas em fendas em um dos lados do gel. Lewis confirmou que alguns desses genes são responsáveis pela formação de partes básicas do corpo (veja Capítulo 14). algumas vezes chamadas de transferências Southern devido a seu inventor. os fragmentos menores movendo-se mais rapidamente do que os maiores. colocado sobre um papel de filtro saturado com tampão de alta força iônica. o DNA foi transferido do gel ao papel de nitrocelulose. O gel é. nos anos 60. a mosca desenvolve um conjunto extra de pernas saindo das cavidades orbitais (veja Figura 14. Papel de nitrocelulose (capaz de ligar DNA de fita única) foi colocado diretamente sobre o gel e coberto com múltiplas camadas de papel-toalha secas. O DNA de fita única é retido pelo papel de nitrocelulose. DNA de numerosos organismos vertebrados e invertebrados. O tampão de transferência atravessa o gel. encontramos que ela é inversamente proporcional à raiz quadrada da massa. Resolvendo para velocidade. E. Após a separação. O papel de filtro abaixo do gel estava em comunicação com o interior de uma cuba contendo tampão de alta força iônica. os genes clonados de um organismo podem ser sondados com cDNAs radioativos derivados do mRNA de outras espécies. Se o gene é expresso na cabeça (como sucede em um mutante específico).20 Transferência Southern. Um deles. os pesquisadores retornaram o gel a um pH neutro e em seguida o colocaram sobre um papel de filtro úmido suportado por uma estrutura de plástico (Figura 2. Portanto. Iniciando com Morgan. Holland e Hogan. Uma das descobertas mais excitantes da moderna biologia do desenvolvimento foi verificar que genes usados para processos específicos de desenvolvimento em um organismo. antenas crescem onde deveriam estar as pernas. foram tratados com uma enzima de restrição. M. 1986). 1984. * Como a hibridização não pode ser feita dentro do gel.. assim. esses genes foram mapeados e. podem ser usados para processos similares em outro organismo.28). DNA é tratado com enzimas de restrição e os fragmentos resultantes são colocados em um gel e separados por eletroforese. Mc Ginnis et al. Após fixar pelo calor os fragmentos de DNA no papel de nitrocelulose (de outra forma eles *Considerando a mesma relação carga/massa. O tampão caminhou para cima através do gel e do filtro de nitrocelulose para as toalhas de papel. em seguida. Poderia tal gene existir em vertebrados? Evidências desses genes em vertebrados apareceram em transferências de DNA. o DNA é desnaturado em fitas únicas. B. Após a desnaturação das fitas de DNA em álcali.20. Papel de nitrocelulose ou um filtro de nylon é colocado sobre o gel e o conjunto coberto com toalhas de papel.58 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Hibridização de DNA: entre e intra espécies Clones podem ser selecionados por qualquer segmento de nucleotídeos radioativos.

1977) tornou-a um procedimento padrão em muitos laboratórios de biologia molecular. McGinnis. Funde-se (anela-se) então um iniciador (primer) radioativo de DNA (aproximadamente 20 pares de bases) complementar ao DNA do vetor imediatamente 3' ao gene clonado.. cortesia de W. usa-se um vetor contendo o gene clonado e se isola uma fita única do DNA circular (Figura 2. (Porque essas seqüências dos vetores são conhecidas. esses genes se mostraram extremamente importantes na formação do eixo do corpo dos vertebrados. Similarmente. existe a possibilidade de que um didesoxi-A seja colocado em lugar do desoxi-A. As estruturas dos desoxinucleotídeos e dos didesoxinucleotídeos estão representadas na Figura 2. Os números ao lado das transferências indicam os tamanhos das bandas. No tubo com didesoxi-A.1984.23. Enquanto o desoxirribonucleotídeo não tem um grupo hidroxila (OH) no carbono 2' do seu açúcar. o conjunto foi incubado com cDNA radioativo de uma porção do gene Antennapedia de Drosophila. outro didesoxi-A e assim por diante. Essa secção radioativa do gene Antennapedia foi usada para selecionar uma biblioteca genômica de clones de DNA derivados do genoma dessas diferentes espécies. no tubo com didesoxi-G. O iniciador tem uma ponta 3' livre à qual mais nucleotídeos podem ser adicionados.21 Transferência Southern do DNA de vários organismos usando uma sonda radioativa do gene Antennapedia de Drosophila melanogaster.) Drosophila Besouro melanogaster 10 10 Galinha Camundongo Ubx ftz 10 10 3 3 3 3 Antp 1 1 1 1 se desprenderiam). (de McGinnis et al. o novo DNA será complementar ao gene clonado.22). Assim. Um autoradiograma do papel de nitrocelulose mostrou onde o DNA radioativo encontrou seu semelhante. humanos e pintos) têm genes que hibridizam com essas seqüências.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 59 Figura 2. o didesoxirribonucleotídeo não tem grupos hidroxila em ambos os carbonos. entretanto. também. quando a DNA polimerase está sintetizando DNA do iniciador. (Coloquialmente esse baixo rigor das transferências ao longo dos filos é chamado “transferências de zoológico”. A simplicidade da técnica de seqüenciamento “didesoxi” de Sanger (Sanger et al. mesmo que um didesoxirribonucleotídeo possa ser ligado a uma crescente cadeia de DNA pela DNA polimerase. . ele interrompe o crescimento da cadeia por não ter um grupamento 3' ao qual se ligaria um novo nucleotídeo. Não se espera que as seqüências de espécies tão diversas sejam perfeitamente idênticas e por essa razão o rigor da hibridização é diminuído trocando as soluções salinas. Os resultados desses experimentos (Figura 2. 2' e 3'. Assim. Cada um dos tubos contém a subunidade polimerizante da DNA polimerase e um diferente didesoxinucleosídeo trifosfato: um tubo contém didesoxi-G. a cadeia tem o potencial de parar toda vez que um G é inserido. sugerindo que genes similares a Antennapedia existem nesses organismos. (O processo foi comparado à uma dança folclórica grega na qual uma pequena porcentagem dos dançarinos em potencial tem um braço em uma tipóia). em quilobases. Seqüenciamento de DNA Dados de seqüência podem dar informações sobre a estrutura da proteína codificada e podem identificar seqüências regulatórias de DNA que certos genes têm em comum. pesquisadores encontraram clones contendo genes que se parecem com o Antennapedia. Coloca-se o DNA alvo e o iniciador juntamente com todos os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfatos em quatro tubos de ensaio. muitos organismos contêm vários genes que formarão híbridos com esse fragmento gênico radioativo. iniciadores oligonucleotídicos podem ser facilmente sintetizados ou adquiridos comercialmente). Como veremos no Capítulo 16. sempre que a polimerase coloca um A na cadeia crescente.. por razões óbvias). a cadeia pára. Autoradiografia mostra que os genes de Drosophila contêm várias porções que são como as do gene Antennapedia em termos de estrutura.21) mostraram que mesmo vertebrados (camundongos. No início. Se isso acontecer.

22 O método didesoxi de seqüenciar DNA.60 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Fita única desnaturada de DNA de plasmídeo recombinante Iniciador Subunidade polimerizante de DNA polimerase I de E. . dCTP e dTTP Seqüência da fita do iniciador Seqüência complementar Fragmentos maiores Fragmentos menores Figura 2. A diferença é evidenciada em cores. Guild).23 Comparação entre desoxinucleotídeos e didesoxinucleotídeos. Adenina Adenina Base 1 Base 2 Adenina Desoxiadenosina trifosfato (açúcar desoxirribose) (A) Didesoxiadenosina trifosfato (açúcar didesoxirribose) (B) Figura 2. coli + dATP. (B) O terminal 3' de uma cadeia que terminou pela incorporação de um didesoxinucleotídeo não tem um grupo hidroxila 3' terminal para continuar a polimerização do DNA. (A) Estruturas dos dois tipos de nucleotídeos. A fotografia contém a região da auto-radiografia que mostra essa seqüência (Cortesia de G. dGTP.

cada uma terminando com o resíduo A.24A).19). O tubo com didesoxi-A. Genes clonados dessa maneira são muito importantes porque eles não têm íntrons.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 61 Em cada tubo estão sendo feitas milhões de cadeias e por essa razão eles conterão uma população de cadeias. Acoplando um fragmento GATCC/ G aos terminais rombudos desse pedaço de DNA cria-se um corte artificial de restrição BamHI. Podemos ter também uma biblioteca de oócitos vegetais de Xenopus. do ouriço-do-mar. Os fragmentos de DNA radioativo resultantes serão separados por eletroforese. Para encontrar mRNAs específicos do endoderma em ouriço-do-mar. cada um contendo um cDNA representando uma molécula de mRNA. isso é feito tomando os RNAs mensageiros de uma célula ou tecido e convertendo-os em fitas de DNA complementar. algumas interrompidas no primeiro sítio possível.24B). em gastrulação.24B). por exemplo. A população de mRNA foi. Isso os tornou clonáveis em vetores que foram abertos com a enzima de restrição EcoRI.24C). obtem-se a seqüência do DNA complementar àquela do gene clonado. convertida em uma de cDNA pelo uso da transcriptase reversa (veja Figura 2. Tais coleções de clones derivados de mRNAs são freqüentemente chamadas de bibliotecas. podemos ter uma biblioteca de fígado de embrião de camundongo de 16 dias. podemos “clonar” os mRNA de diferentes tipos de células e compará-los. Lendo escada acima. No próximo passo. Quando adicionados às células bacterianas. os cDNAs de fita dupla foram ligados a “finais” de EcoRI que estão disponíveis no comércio. possuíam três coleções de moléculas . então. Esse fago é construído de tal maneira que ao ser cultivado em uma placa de Petri. outras no último e algumas em sítios intermediários. Bibliotecas têm sido extremamente úteis no estudo de desenvolvimento como demonstram os esforços de Wessel e colaboradores (1989) em verificar diferenças nos RNAs de diferentes partes do embrião. o que permite a inserção em um vírus ou plasmídeo clivado por essa enzima (Figura 2. usando precursores radioativos. Levando esse procedimento um passo à frente (com o auxílio de DNA polimerase e S1 nuclease). conterá cadeias com diferentes e distintos comprimentos. foram gerados aproximadamente 4 milhões de fagos recombinantes. Usando polimerase I de E. as quais capturam as caudas de poli(A) das mensagens (veja legenda da Figura 2. O próximo passo envolvia selecionar os fagos recombinantes. O resultado é uma “escada” de fragmentos onde cada “degrau” é uma seqüência de nucleotídeos de comprimento diferente. representando mensagens presentes somente em uma parte específica daquela célula. Wessel e colaboradores prepararam uma biblioteca de cDNA de embriões gastrulantes. adicionando-lhes “finais” apropriados com DNA ligase. Dessa forma. coli o cDNA de fita única foi transformado em fita dupla. esses genes podem ser transcritos e em seguida traduzidos nas proteínas que codificam. podemos transformar essa população de cDNA de fita única em outra contendo pedaços de cDNA com fitas duplas. representando todos os genes ativos produzindo proteínas hepáticas embrionárias. Quais deles representariam mRNAs encontrados no endoderma e não em outras camadas celulares? Wessel e seus colegas isolaram populações de mRNAs do mesoderma. Agora. Assim. O DNA foi misturado com os braços de um fago λ geneticamente modificado (veja Figura 2. Essas fitas de DNA podem ser inseridas em plasmídeos. Como mostra a Figura 2.24A. Depois prepararam cDNAs marcados de cada uma das populações de mRNA. ectoderma e endoderma. os fagos que incorporaram o DNA (e assim destruíram o gene da ßgalactosidase) produzem placas incolores (Figura 2. O mRNA dessas amostras (a maior parte do RNA de células eucarióticas é ribossômico) foi isolado por passagem em esferas com oligo-dT. Análise de mRNA através de bibliotecas de cDNA Agora podemos retornar à especificidade da transcrição de mRNA: É possível isolar populações de mRNA que caracterizam certos tipos de células e estão ausentes em todas as outras? Para encontrar esses RNAs.

Como resultado.24D). agora clonado em vetores virais de cDNA radioativos. Se um mRNA estivesse presente no endoderma. isso foi confirmado. em gastrulação. do ouriço-do-mar foram cultivados e amostras de numerosas colônias— cada uma contendo milhares de fagos— colocadas em dois filtros de nitrocelulose (Figura 2. Os filtros foram lavados para a remoção de cDNA radioativo não hibridizado. o DNA recombinante produzido daquela mensagem deveria ligar cDNA radioativo do endoderma e não deveria encontrar um mRNA em qualquer outro lugar. mas o mesmo clone não deveria ser radioativo quando exposto a mRNA ectodérmico ou mesodérmico. mas não no ectoderma ou mesoderma. o outro papel incubado com sondas radioativas para ambos. secos e expostos em filmes para raios-X.62 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Preparação de cDNA clonável Região codificadora mRNA Anela iniciador oligo (dT) (B) Inserção de cDNA de dupla fita no vetor viral (bacteriófago λ) DNA de fago λ BamHI Região codificadora mRNA Transcriptase reversa “Braço esquerdo” “Braço direito” cDNA mRNA Hidrólise alcalina cDNA de dupla fita preparado como descrito em (A) Inserir cDNA nos terminais do DNA do fago λ. Um desses papéis de filtro foi incubado com cDNA radioativo feito a partir do mRNA total do endoderma. ligou somente cDNA radioativo produzido . O conjunto foi colocado em solução de álcali para a lise dos fagos e obtenção de DNA de fita única. mesoderma e ectoderma. ligar Não é necessário para a replicação do fago Braços contêm todos os genes necessários para a replicação. aquela mancha de DNA recombinante do endoderma deveria ser radioativa (pois foi ligado ao cDNA radioativo do endoderma). Os fagos recombinantes representando os mRNAs do embrião. Um fago recombinante. mas muito pequeno para o empacotamento cDNA DNA polimerase I Região codificadora cDNA S1 nuclease Região codificadora Fita dupla cDNA Adicionar finais Bam HI cDNA do mRNA. cada uma representando a população de mRNA de uma das três camadas germinativas. em particular.

discutida no texto. coli pelo fago Lise Placa Zona de lise indicando clones do fago Tratar filtros com solução alcalina para lisar os fagos e desnaturar o DNA liberado Camada de bactérias E. (D) As placas são transferidas para papel de nitrocelulose e tratadas com álcali para lisar os fagos e desnaturar DNA localmente. permitindo ao pesquisador procurar por um mRNA encontrado em um tipo de tecido mas não em outro. coli Incubar com sonda radioativa para endoderma Incubar com sonda radioativa para mesoderma e ectoderma Figura 2. O fago contendo esse gene pode agora ser cultivado em grandes quantidades e caracterizado. Técnicas bioquímicas podem distinguir placas de fagos recombinantes daquelas que não têm o gene inserido. Esses filtros são então incubados com sondas radioativas (usualmente cDNA) de um tecido. desenvolvido por Mary Lou Pardue e Joseph Gall (1970). (A) RNA mensageiro é isolado e feito seu cDNA. Sonda radioativa DNA de fago de fita única ligado ao filtro Preparação dos autoradiogramas Clone de DNA representando o mRNA encontrado no endoderma mas não no mesoderma ou ectoderma de mRNA do endoderma. Para a seleção da biblioteca diferencial de cDNA. coli formando placas. a mesma biblioteca de fagos foi selecionada com sondas radioativas de dois tecidos diferentes. bacteriófagos. que é em seguida transformado em dupla fita e adicionado de fragmentos finais de restrição. portanto. (B) Os “genes” cDNA são inseridos em vetores especialmente modificados. representava um mRNA encontrado no endoderma e não no mesoderma ou ectoderma. coli Filtros de nitrocelulose Infecção de E. nesse caso. o clone endoderma-específico que foi mencionado) ele é cultivado em . Técnicas de localização de RNA Hibridização In Situ O processo de hibridização in situ. (C) Os fagos contendo o DNA recombinante lisarão E. permite ao pesquisador visualizar as posições de ácidos nucléicos específicos dentro de células e tecidos.24 Protocolo usado para organizar bibliotecas de cDNA.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 63 (C) Preparação da biblioteca de clones do fago (D) Seleção da biblioteca de fagos clonados Transferir alguns fagos para filtros de nitrocelulose Fago híbrido Adicionar à camada de células de E. Se um clone específico é considerado interessante (por exemplo.

transferências Northern (nome não se relaciona com o inventor) transferem RNA entre os mesmos suportes e da mesma maneira. realizada em montagem integral. a lâmina é coberta com uma emulsão fotográfica transparente para auto-radiografia. Esse DNA adere somente às regiões onde está localizado o RNA complementar. e o gene clonado é isolado tratando o vetor recombinante com enzimas de restrição. A Figura 2. são denominados transferências Northern de desenvolvimento. Continuando a gastrulação.B mostra hibridização in situ usando o cDNA específico para células endodérmicas. Os cDNAs da gástrula foram misturados com grandes quantidades de mRNA de oócitos.64 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento grandes quantidades. e com uma visão de amplas regiões de expressão gênica.25C mostra uma hibridização in situ. em um gel. o cDNA radioativo se liga unicamente onde está presente o mRNA complementar. cientistas podem observar órgãos inteiros (e organismos) sem seccioná-los. torna-se necessário o uso de secções microscópicas extremamente finas. Podemos ver que o mRNA para essa proteína endodérmica é inicialmente sintetizado durante o estágio de blástula mesenquimatosa e continuamente durante todo o resto do desenvolvimento. Quando o cDNA radioativo é adicionado às células fixadas apropriadamente em lâminas de microscópio. diretamente acima de onde o cDNA radioativo foi ligado. o DNA radioativo se liga a ele e pode ser detectado por auto-radiografia. A distribuição temporal na transcrição de vários genes pode ser visualizada por transferência de mancha. Transferências Northern Podemos também determinar a expressão temporal e espacial de RNAs executando uma transferência de RNA (freqüentemente chamada transferência Northern). o cDNA (e portanto o mRNA) se localiza de forma ainda mais precisa — entre a região do intestino posterior e o intestino médio no tubo endodérmico.26B mostra que a acumulação desse mRNA no estágio de prisma é restrita ao endoderma (Wessel et al. A Figura 2. ou brancas quando vistas com iluminação em campo escuro. A Figura 2. A transferência Northern na Figura 2. que sintetiza uma proteína necessária para a produção de células mesodérmicas na parte posterior do embrião de camundongo. A transcrição de certos genes pode ser específica para tecidos ou tempo. Esse é transformado em fita única e tornado radioativo.1989). O cDNA encontra mRNAs somente no endoderma da gástrula precoce do ouriço-do-mar. Enquanto transferências Southern transferem fragmentos de DNA do gel para o papel. Após eliminação do cDNA não fixado. Após transferência dos RNAs separados para o papel de nitrocelulose ou membrana de nylon. Para isso eles extraíram o mRNA da gástrula e fizeram cópias cDNA dessas mensagens. em um embrião de camundongo com 10. no espaço e no tempo. Se houvesse hibridização entre o mRNA dos oócitos e o cDNA da gástrula. A sonda reconhece o mRNA codificado pelo gene Brachyury (discutido na página 40). parecem escuras quando visualizadas diretamente. Trabalhando com sondas radioativas e emulsões..25A. se o mRNA para aquele gene está presente em um determinado estágio embrionário. Assim. Dessa maneira. Assim. o conjunto é incubado em uma solução contendo um fragmento radioativo. Sargent e Dawid (1983) isolaram da gástrula de Xenopus um mRNA que não estava presente no ovo. onde vários estágios são comparados simultaneamente.5 dias. Hibridização in situ e transferências Northern fornecem as melhores evidências em favor da transcrição diferencial de RNA. As manchas resultantes. Uma técnica mais recente para hibridização in situ utiliza sondas que ligam reagentes coloridos. Por exemplo. significaria que o cDNA era derivado .26A mostra uma transferência Northern de desenvolvimento para a expressão de um gene endoderma-específico durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar. O pesquisador pode extrair RNAs mensageiros do embrião em vários estágios de desenvolvimento e submetê-los à eletroforese lado a lado. mono-fita. de DNA de um determinado gene. Autoradiogramas desse tipo. pode-se visualizar aquelas células (ou mesmo regiões dentro das células) que acumularam um tipo específico de mRNA.

e nesse estágio é encontrada na porção posterior do embrião. em fundo escuro.25 Enzima fosfatase alcalina Corante (precipitado azul escuro) Núcleo Corante Anticorpo para biotina Biotina (incolor) Sonda complementar a mRNA de Brachyury tendo resíduos de biotina em suas uridinas mRNA de Brachyury Hibridação in situ. Wessel. C do laboratório do autor. (A. O cDNA radioativo usado como sonda foi preparado do gene clonado. o embrião foi tratado com anticorpos para biotina.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 65 (B) (A) (C) Figura 2. em montagem integral. Esse cDNA radioativo se liga ao mRNA do endoderma da gástrula precoce do ouriçodo-mar (A) e ao endoderma do intestino médio e posterior da gástrula tardia do ouriçodo-mar (B). Fotografias coloridas da hibridização in situ. de um embrião de camundongo de 9.24).5-10. Colorir para a presença de fosfatase alcalina permite que se determine a localização de um mRNA específico. cortesia de G. Após eliminar a parte da sonda que não se ligou ao mRNA de Brachyury (e inativar qualquer atividade endógena de fosfatase alcalina do embrião).. Esses anticorpos foram ligados às enzimas do tipo fosfatase alcalina. (C) Hibridização in situ. em montagem integral.) . estão nas Pranchas 22.1989. de hibridação in situ. feito a partir de mRNA endoderma-específico (veja Figura 2. 23 e 25.5 dias corado para mRNA de Brachyury. Embriões fixados foram incubados em uma sonda para mRNA de Brachyury (a fita antisense complementar ao mRNA) que foi sintetizada usando uridina biotinilada.B) Fotomicrografias. mostrando a localização de mRNA endodermaespecífico em embrião de ouriço-do-mar. Essa mensagem é transcrita em células formando novo mesoderma. (A e B de Wessel et al.

DG21) é muito mais transitória. a população de DNAs de fita única é transformada em uma população de fita dupla. enquanto a atividade de outros (DG56. Nenhum deles é expresso antes da transição da blástula mediana em 7 horas.27). (B) Transferência Northern no estágio de prisma. O uso de PCR para encontrar mRNAs raros está ilustrado na Figura 2. . Entretanto. Se um gene estava sendo transcrito em um determinado estágio. por amplificar especificamente somente aquela mensagem.26 Transferência Northern para um gene específico no endoderma do ouriço-do-mar. Essa técnica tem sido extremamente útil em casos onde a quantidade de ácido nucléico para estudo é muito pequena. após aproximadamente 7 horas. deixando uma população de cDNAs gástrula-específico. Alguns genes (DG76.28 mostra o esquema temporal de expressão para 17 genes que são ativos em vários estágios da gastrulação. Os RNAs foram aplicados diretamente (sem prévia eletroforese em gel) a filtros de nitrocelulose de modo que cada filtro tinha RNAs de todos os estágios.. a ligação do cDNA radioativo foi observado por auto-radiografia. que foi em seguida incubado com cDNA radioativo de um clone endoderma-específico. essas regiões laterais podem ser preparadas. a clonagem de subtração gera um conjunto de clones estágio-específicos cujo mRNA é encontrado em alguns estágios. separadamente. Como a seleção dupla de bibliotecas de cDNA. dos estágios de zigoto a broto caudal do girino e. Wessel. cortesia de G. Os oligonucleotídeos foram preparados de forma a permitir uma hibridização com fitas opostas e lados opostos da seqüência alvo. seria muito difícil descobrir usando os métodos padrão de clonagem. mRNA total (10 µg por estágio) foi submetido à eletroforese em gel de agarose. isolaram seus RNAs. no entanto. Alguns genes (DG64. Encontrando mensagens raras pela reação da polimerase em cadeia A reação da polimerase em cadeia (PCR) é um método de clonagem in vitro que pode produzir enormes quantidades de um fragmento específico de DNA a partir de uma pequena quantidade de material de partida (Saiki et al. Ligação com cDNA radioativo detectou mRNA somente no endoderma. ou em alguns tecidos mas não em outros (Figura 2. por exemplo. oócito e gástrula. no filtro. um milhão de vezes (Rappolee et al. Se os oligonucleotídeos reconhecem seqüências no DNA. Esse método pode ser usado para clonar um gene específico ou para determinar se um gene específico está ativamente transcrevendo RNA em um determinado órgão ou tipo de célula. (A) Transferência Northern de desenvolvimento. Mostrou-se que esse mRNA é sintetizado durante o estágio de blástula do mesênquima e aumentado ao longo do desenvolvimento. pode amplificar uma única molécula de DNA por um fator de vários milhões em poucas horas e o faz em um tubo de ensaio.) de um mRNA presente em ambos os estágios.. 1989. PCR. Lytechinus variegatus. 1988).66 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Ovo Clivagem Blástula Blástula Mesenquimatosa Blástula precoce Blástula tardia Prisma Plúteo (B) Ectoderma / mesoderma Endoderma Figura 2. escolhe-se um DNA para ser amplificado. separam-se as duplas hélices do DNA. DG81) começam a ser transcritos na gástrula mediana. Após eliminacão do cDNA não ligado. Após a fixação (calor) dos RNAs no filtro. Os cDNAs foram transformados na forma de dupla fita (pela DNA polimerase) e inseridos em veículos de clonagem. mas não em outros. O método padrão de clonagem usa microorganismos vivos para amplificar o DNA recombinante. RNA total do endoderma foi eletroforisado (pista 2) próximo ao mRNA do resto do ouriço-do-mar (pista1). DG81) são mantidos após a ativação. Para isso. o cDNA radioativo daquele gene encontraria seu complemento nos mRNAs daquele estágio. (de Wessel et al. O gel foi transferido para papel tratado e os mRNAs aderidos ao papel.. Embriões de camundongos. DG39) são expressos imediatamente depois. mostrando acumulação de mRNA de acordo com o estágio específico desse gene. Essa técnica é denominada de clonagem de subtração. Os mRNAs de um grupo de células são purificados e convertidos a cDNA por transcriptase reversa. Se fosse necessário saber se o embrião de camundongo na fase de pré-implantação contém o mRNA para uma proteína determinada. mostrando que o mRNA está presente no endoderma (com algum mesoderma aderido) mas não no ectoderma. DNA de fita única derivado de um específico clone “gastrular”. (Se a tentativa é isolar o gene ou mRNA para uma proteína específica de seqüência conhecida. Usando DNA polimerase e S1 nuclease.29. foi marcado radioativamente e incubado com os filtros. na fase de pré-implantação têm muito pouco mRNA e não se pode obter milhões desses embriões para estudo. Em seguida. às quais são adicionados dois pequenos oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma porção da mensagem procurada. enquanto outros (DG72.1985). então o mRNA estava presente originalmente. Essas moléculas híbridas com dupla fita foram removidas por filtração. a técnica do PCR permite encontrar essa mensagem com poucos embriões. A transferência de manchas na Figura 2. Sargent e Dawid usaram embriões.

de genes em estágios embrionários. obtem-se um esquema temporal para a atividade de genes específicos. Os cDNA de gástrula que não encontraram seqüências complementares nos mRNAs de oócitos. 1985.. A linha r5 representa um controle de RNA ribossômico que deve estar sempre presente.28 Colocar em veículo de clonagem Transferências de mancha no desenvolvimento mostram os tempos em que 17 genes de Xenopus estão transcrevendo ativamente.) Blástula Estágio Clone Gástrula Nêurula Plasmídeo recombinante contendo DNA para mRNA específico para gástrula Broto de cauda Horas após a fertilização . Justapondo essas tiras. cortesia de I. eram produtos de genes ativos na gástrula mas não nos oócitos.27 cDNA de dupla fita específico de gástrula Adicionar ligantes Clonagem de subtração de genes de gástrula expressos diferencialmente em Xenopus laevis.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 67 Extrair mRNA Oócito mRNA total de oócito Hibridizar cDNA de gástrula que encontra mensagem complementar em mRNA de oócito cDNA de gástrula sem seqüência complementar a mRNA de oócitos Extrair mRNA Gástrula mRNA total de gástrula Fazer cDNA de mRNA cDNA de gástrula DNA polimerase S1 nuclease Figura 2. Acumulação específica de mRNA no citoplasma é registrada embebendo mRNA total. Esses genes foram clonados fazendo o cDNA de fita dupla e adicionando ligantes para permitir sua inserção em veículos de clonagem. Sargent. em papel de nitrocelulose e incubando a tira de papel com DNA radioativo derivado de um clone de cDNA específico de gástrula. Figura 2. (de Jamrich et al. cDNA foi produzido para mensagens isoladas de gástrula e hibridizado com mRNA de oócitos. Dawid e M.

prepara-se um conjunto de diferentes iniciadores. o número de fitas novas com a sequência entre os dois iniciadores aumenta exponencialmente. todo mRNA é convertido a DNA de dupla fita pela transcriptase reversa e DNA polimerase. cada um possivelmente complementar ao DNA. Essas fitas são.) Usando DNA polimerase termoestável de T. iniciando o ciclo novamente. Para determinar se um tipo particular de mRNA está presente. taq polimerase estende fitas complementares a partir dos iniciadores 2 cópias Primeiro ciclo de sínteses resulta em duas cópias da seqüência alvo de DNA Desnatura DNA Hibridiza iniciadores Segundo ciclo Estende novas fitas de DNA 4 cópias Segundo ciclo de sínteses resulta em quatro cópias da seqüência alvo de DNA Figura 2. (Iniciadores específicos são produzidos com base na seqüência que se procura. cada fita de DNA sintetiza seu complemento. a DNA polimerase pode sintetizar uma nova fita. Os finais 3' desses iniciadores estão face a face de modo que a replicação é através do DNA alvo. desnaturadas e os iniciadores são hibridizados a elas. por sua vez. Se a seqüência específica estiver presente. Se é conhecida apenas a seqüência da proteína codificada pela mensagem. aquaticus.29 Protocolo para a reação de polimerase em cadeia (PCR). Esfriar a 37oC para permitir hibridização dos iniciadores a DNA Quando aquecido a 72o C. Uma vez hibridizado o primeiro iniciador. Esse DNA é desnaturado e dois conjuntos de iniciadores são adicionados. Dessa maneira. os iniciadores se hibridizarão aos seus terminais opostos.68 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Finais da seqüência do polipeptídeo RNAs que codificam o amino terminal (iniciador 1) RNAs que codificam o carboxi terminal (iniciador 2) RNA iniciador 1 DNA alvo RNA iniciador 2 1 cópia Primeiro ciclo Aquecer a 95oC para desnaturar DNA. . sintetizando oligonucleotídeos que codificam o amino terminal da proteína e oligonucleotídeos complementares aqueles que codificam o carboxi terminal da proteína).

aquela região específica estará amplificada 220 vezes (um pouco mais de um milhão). Essa extração cria um sítio vazio onde outros genes podem ser colocados. o que é realmente crucial é conhecer a função daquele gene no desenvolvimento. Em transfecção. A probabilidade de incorporação de tal fragmento de DNA no cromossomo é relativamente pequena. (Cortesia de O. Ritvos.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 69 Essa enzima não é a DNA polimerase normal de E.1981).. 1980). de órgãos embrionários de camundongo. Uma vez sintetizada a segunda fita. Retrovírus são vírus contendo RNA.. onde a temperatura atinge valores próximos de 900C. tirando e repondo certos genes de células embrionárias. (A confirmação poderia ser feita por transferência Southern. Pedaços de DNA clonados podem ser modificados (se desejado). Essa é uma técnica especialmente útil para injetar genes em ovos recentemente fertilizados. como na Figura 2. colocando-as em vetores de clonagem. coli.30 Ovário de rato Adulto Ovário de camundongo Rim de camundongo Rim de camundongo Salivares de camundongo Pâncreas de camundongo Pulmão de camundongo Embrião de 14 dias Sem adição de DNA Determinando a função do gene: células e organismos transgênicos Técnicas de inserção de DNA novo em uma célula Apesar de ser importante conhecer a seqüência de um gene e seu esquema temporoespacial de expressão. mRNA de activina foi encontrado no ovário do camundongo adulto (como esperado) e também em vários órgãos embrionários. Figura 2. Isso mostra que o mRNA original com essa seqüência estava presente na amostra. onde pulsos de alta voltagem “empurram” o DNA para dentro da célula. Essas bactérias vivem em fontes de água quente (como aquelas do Yellowstone National Park) ou nos respiradouros térmicos de submarinos. novos genes podem ser introduzidos na mosca. Essas DNA polimerases podem suportar temperaturas próximas à ebulição e o PCR se utiliza dessa adaptação evolucionária.30). e genes clonados inseridos no centro do elemento P. e colocados em células por vários meios. é uma polimerase de bactérias como Thermus aquaticus ou Thermococcus litoralis. A possível função de activina nesses orgãos será discutida no Capítulo 17. O segundo iniciador é adicionado e agora ambas as fitas podem sintetizar novo DNA. Essas seqüências de DNA. na qual uma solução contendo o gene clonado é cuidadosamente injetada no núcleo da célula (Capecchi. eles podem ser isolados. Outra técnica é a eletroporação. são elementos transponíveis de ocorrência natural que podem ser integrados como vírus em qualquer região do genoma da Drosophila. ele pode se integrar ao DNA e prover o embrião de um novo gene (Spradling e Rubin.1980. 1982). A integração é consumada devido às duas seqüências idênticas (longas repetições terminais) nos terminais do DNA retroviral. Ainda mais. via elementos P. activina. Além disso. Quando o elemento P recombinado é injetado em um oócito de Drosophila. o pesquisador pode remover genes de um fago ou plasmídeo clonado e reinserir o gene em vetores retrovirais. O mRNA desses órgãos foi convertido em DNA e amplificado através de 20 ciclos de replicação.31). Dentro da célula hospedeira eles produzem uma cópia de seu DNA (usando sua própria transcriptase reversa). a cópia se transforma em dupla fita e se integra em um cromossomo do hospedeiro. ela é separada de seu complemento por desnaturação em alta temperatura. Uma técnica muito direta é a microinjeção. em condições de cultura onde as outras células são destruídas (Perucho et al. Usando enzimas de restrição apropriadas. Robins et al. de ocorrência natural. Em Drosophila. que podem ser integrados no genoma. Sucessivos ciclos de desnaturação e síntese amplificarão essa região do DNA de forma geométrica. Vetores retrovirais são produzidos removendo os genes do empacotamento viral (necessários para a saída dos vírus da célula) do centro de um retrovírus de camundongo. o DNA é incorporado diretamente na célula por incubação em uma solução determinada onde a célula o incorpora. sendo necessário misturar o DNA com outro gene que permite a sobrevivência das raras células que o incorporaram. para a síntese de um fator de crescimento. Quando submetido à eletroforese esse fragmento amplificado é facilmente detectado.) . O DNA foi submetido sucessivamente à eletroforese e transferência Southern usando uma sonda radioativa para uma parte do gene de activina. Após vinte turnos. pois os núcleo haplóides do espermatozóide e do óvulo são relativamente grandes (Figura 2. Retrovetores virais infectam células de camundongo com eficiência próxima de 100%. pode-se usar essas cópias amplificadas para clonagem. Um método mais “natural” para introduzir genes na célula é colocar o gene clonado em um elemento transponível ou vetor retroviral. Esses são regiões móveis de DNA. Evidência fornecida por PCR. Técnicas recentes permitem estudar a função do gene.

. a proteína codificada por Hoxa-3 liga-se ao DNA. em três gerações — o camundongo quimérico. mas a célula inteira) pode ser injetada em outro embrião de camundongo em fase precoce. está agora presente em ambas as cópias dos cromossomos dentro do genoma do camundongo. Se as células tratadas se tornaram parte da linha germinal do camundongo. mas outra porção de células é derivada também das células precursoras tratadas. Essas linhagens têm sido particularmente úteis na determinação das funções de regiões reguladoras que ladeiam os genes. corpo de bode e cauda de serpente. Wagner. Camundongos com genes estáveis de outros indivíduos são chamados camundongos transgênicos. alguns de seus descendentes levarão. que darão origem ao próprio embrião.33).) Camundongos quiméricos As técnicas descritas têm sido usadas recentemente para transferir genes para todas as células do embrião de camundongo (Figura 2. e as células internas.. alguns dos seus gametas serão derivados da célula doadora. Hoxa-3 é semelhante a vários genes de Drosophila que são conhecidos como controladores da expressão gênica de segmentos específicos no embrião precoce. que formarão a porção fetal da placenta. gerar todas as células do embrião (Gardner.70 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 2.1986).31 Injeção de DNA (de genes clonados) em um núcleo (neste caso. mas em lugar de adicionar genes. a célula precursora tratada estará integrada no embrião do hospedeiro. .1981. uma cópia do gene inserido. O termo é apto: refere-se a um monstro mitológico com cabeça de leão. 1968. * É crítico notar a diferença entre uma quimera e um híbrido. O resultado é um camundongo quimérico*. Uma quimera resulta quando células de constituição genética diferente aparecem no mesmo organismo. 1972). Os descendentes heterozigotos. (de Wagner et al. no acasalamento produzirão 25% de embriões carregando duas cópias do gene inserido em cada célula de seu corpo (Gossler et al. Quando cruzado com um camundongo do tipo selvagem. As técnicas são similares àquelas que produzem camundongos transgênicos. Esse problema foi superado pela técnica chamada de endereçamento de genes (às vezes. Seria possível que Hoxa3 de maneira similar estaria regulando a expressão gênica espaço-específica nos mamíferos? Chisaka e Capecchi isolaram o gene Hoxa-3.32). porque cada uma delas pode. Em outras palavras. eles mutaram o gene Hoxa-3 pela inserção de um grande pedaço de DNA que continha um gene resistente à neomicina. cortesia de T. se isolada. Experimentos com genes com endereçamento (Gene targeting ou Knockout) A análise de embriões precoces de mamíferos foi durante muito tempo prejudicada pela dificuldade em criar e selecionar mutações que afetam a fase inicial do desenvolvimento embrionário. cortaram-no com uma enzima de restrição e inseriram nesse sítio um gene para resistência à neomicina (Figura 2. um pronúcleo de um ovo de camundongo). Essas células internas são chamadas células embrionárias precursoras (células tronco). Esses genes mutantes Hoxa-3 foram eletroporados em células embrionárias precursoras que eram sensíveis à neomicina. Assim. Um híbrido resulta da união de dois genomas diferentes dentro da mesma célula: o descendente de um genitor de genótipo AA e outro de genótipo aa é um híbrido Aa. destruindo a habilidade da proteína Hoxa-3 em se ligar a DNA. chamada de “Knockout”). exatamente como sua correspondente na Drosophila. Essas células podem ser isoladas do embrião de um camundongo e cultivadas. elas podem ser tratadas como descrito. E. o camundongo heterozigoto e o camundongo homozigoto — um gene que foi clonado de um outro indivíduo. A nova célula embrionária precursora (não somente o DNA. de modo a incorporar novo DNA. Uma vez em cultura. Moustafa e Brinster. portanto. Assim. Algumas de suas células são derivadas das células embrionárias precursoras do hospedeiro. Durante o desenvolvimento do camundongo existe um estágio onde somente estão presentes dois tipos de células: as células externas. endereçar genes significa trocar alelos do tipo selvagem por outros mutados. Chisaka e Capecchi (1991) usaram essa técnica para estudar a função do gene Hoxa3 no desenvolvimento do camundongo.

As células precursoras heterozigotas são microinjetadas em um blastócito de camundongo e se integram nas células do embrião. as células embrionárias precursoras transgênicas se integram às celulas precursoras do hospedeiro. Esse embrião é colocado no útero de um camundongo fêmea grávida e se desenvolve em um camundongo quimérico. O gene adicionado (o transgene) pode ser de qualquer fonte eucariótica. O camundongo resultante é uma quimera composta de células do tipo selvagem do embrião hospedeiro e de células heterozigotas Hoxa-3. Aqui. As quimeras são acasaladas com camundongos do tipo selvagem e se algumas das células doadoras se integraram à linhagem das células germinativas. Se as células precursoras doadoras contribuíram para a linha germinativa. alguns dos descendentes serão heterozigotos Produção de camundongos transgênicos. das células precursoras. mas tais células podem ser selecionadas cultivando as células precursoras em neomicina. as enzimas envolvidas no reparo de DNA e replicação incorporam o gene mutante em lugar da cópia normal.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 71 Células embrionárias precursoras Trofoblasto Cultura de células embrionárias precursoras Gene clonado no vetor Mistura de células embrionárias precursoras com o gene clonado Seleção de células embrionárias precursoras que incorporaram o transgene Microinjetar células precursoras transgênicas no embrião hospedeiro Integração das células no hospedeiro Injetar no útero Camundongos quiméricos Figura 2. . Aqui. Células embrionárias precursoras de um camundongo são cultivadas e o genoma alterado pela adição de um gene clonado. As células resultantes têm um gene Hoxa-3 normal e um Hoxa-3 mutado. Esse é um evento raro. o gene Hoxa-3 mutado substituiu um alelo normal desse gene por um processo chamado recombinação homóloga. Cruzando heterozigotos. mas aquelas que adquiriram resistência pelo gene incorporado sobrevivem. A maioria das células morre com a droga. pode ser gerada uma linhagem de camundongos que é homozigota ao alelo adicionado. As células transgênicas são selecionadas e injetadas em um embrião hospedeiro de camundongo na sua fase precoce. Essa seria uma linhagem transgênica. e o camundongo quimérico é cruzado com um do tipo selvagem. parte dos descendentes serão heterozigotos ao alelo adicionado.32 Camundongos transgênicos heterozigotos Camundongos transgênicos homozigotos Uma vez dentro do núcleo dessas células.

Esses camundongos mutantes homozigotos não possuem as glândulas tireóide. (B) Os genes Hoxa-3 clonados são cortados com uma enzima de restrição. onde recombinação homóloga troca o gene do tipo selvagem pela cópia mutada. [gene7. (A) Células embrionárias precursoras (ES) são cultivadas a partir de uma massa celular interna.72 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) Massa celular interna Blastócito neo r Cultura de células embrionárias precursoras (ES) Eletroporação Recombinação homóloga Célula precursora embrionária (B) gene Hoxa-3 Endonucleases de restrição gene neor gene Hoxa-3 mutado com o gene neor inserido Hoxa-3 Figura 2. O camundongo resultante é uma quimera composta de tecidos Hoxa-3 heterozigotos e tecidos Hoxa-3 do tipo selvagem. As células são selecionadas pela sua resistência à neomicina.33 Técnica de endereçamento de genes (gene targeting). e aproximadamente 25% de sua cria deve ser de homozigotos mutantes de Hoxa-3. Nesse caso o gene alvo é o Hoxa-3. (C) As células ES heterozigotas selecionadas são inseridas na massa interna de células de um embrião do tipo selvagem. Cruzando os animais quiméricos com camundongos do tipo selvagem produz-se descendentes Hoxa-3 heterozigotos se as células ES contribuíram na linhagem germinativa. Esses genes Hoxa-3 mutantes são eletroporados em células ES. e aproximadamente 25% de seus descendentes devem levar duas cópias do gene mutado Hoxa-3. endereçando genes pode-se analisar as funções de determinados genes durante o desenvolvimento de mamíferos. e o blastócito é retornado ao útero. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si. Os animais heterozigotos podem ser cruzados entre si. paratireóide e timo! Dessa maneira. e um gene neomicina-resistente é inserido na região que codifica o sítio de ligação da proteína ao DNA. Seleção de células ES heterozigotas por sua resistência à neomicína (C) Injeção de células ES heterozigotas no blastócito Injeção dos blastócitos no útero Produção de camundongos quiméricos Heterozigotos Cruzamento de quiméricos com tipo selvagem Cruzamento de camundongos heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3+ Heterozigotos Hoxa-3¯/ Hoxa-3¯ Homozigoto para o gene Hoxa-3.html] .

Nesse caso. Figura 2.. Dessa maneira.35)..34B). de acordo com Rosenberg et al. Abaixo está o embrião do tipo selvagem.34A). ao passo que T7 polimerase produz transcritos antisense. o promotor T3 está em orientação normal e o promotor T7 está revertido. 1985. RNA antisense permite ao biologista do desenvolvimento determinar a função dos genes durante o desenvolvimento e analisar a ação dos genes em animais. mas é importante ressaltar que os genes eucariotos que codificam proteínas têm vários sítios regulatórios (Figura 2. Os promotores estão em orientação oposta com respeito ao cDNA do Krüppel. O promotor bacteriano iniciará a transcrição da mensagem na “direção errada” quando for incubado com RNA polimerase e nucleosídeos trifosfato.1985). Isso causa uma depleção funcional da mensagem. e um dos maiores sucessos resultantes de clonagens e seqüenciamentos é a nova “anatomia” do gene eucarioto. injetado com a mensagem Krüppel antisense no estágio embrionário precoce. em outro vetor. (A) Produção da mensagem antisense (neste caso. Mensagens antisense podem ser produzidas usando cDNA clonado e fazendo sua reclonagem em reverso.) mRNA antisense Krüppel T7 RNA polimerase T3 promotor T3 RNA polimerase T7 promotor Embrião normal Embrião normal infectado com RNA “antisense” Krüppel . as larvas da mosca morrem pela falta dos segmentos torácico e abdominal anterior (Figura 2. Esses resultados foram confirmados quando RNA antisense foi produzido a partir do gene Krüppel de Drosophila. O transcrito complementar é chamado RNA antisense porque é o reverso da mensagem original. (B. respectivamente). não possuem os segmentos torácico e abdominal anterior.CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 73 Determinando a função de uma mensagem: RNA antisense Outro método para determinar a função de um gene é fazer cópias “antisense” de sua mensagem. ao gene Krüppel da Drosophila) colocando o fragmento de cDNA clonado para a mensagem Krüppel entre dois vigorosos promotores. está localizado diretamente a montante do gene (antes do início) e é (A) mRNA de consenso (sense) Krüppel (B) Embrião mutante Krüppel Producão de RNA antisense para examinar a função dos genes no desenvolvimento. Descreveremos a estrutura do gene com mais detalhe no Capítulo 10. o RNA antisense se liga à mensagem normal. (B) Resultado da injeção da mensagem Krüppel antisense em um embrião precoce (estágio blastodérmico sincicial) de Drosophila antes que a mensagem Krüppel seja produzida. o ácido nucléico dupla-fita resultante é degradado (enzimas do citoplasma das células digerem ácidos nucléicos de fita dupla).34 Reinvestigação de velhos problemas com novos métodos A união da embriologia com a biologia molecular está permitindo ao biologista do desenvolvimento uma nova apreciação de como trabalham os genes na construção de um organismo. Acima está o mutante causado pela falta do genes Krüppel. mutante e o tratado com antisense. T3 polimerase permite a transcrição de mRNA de consenso. Os promotores reconhecem RNA polimerases diferentes (dos bacteriófagos T3 e T7. Ambos os embriões. Estamos em meio à uma revolução nos nossos conhecimentos sobre desenvolvimento. próximo a um vigoroso promotor bacteriano. uma situação semelhante é criada quando grandes quantidades de RNA antisense contra a mensagem Krüppel são injetados em embriões precoces da mosca (Rosenberg et al. Quando grandes quantidades de RNA antisense são injetadas ou transfectadas em células contendo o mRNA normal desse gene. A figura central é um embrião do tipo selvagem pouco antes de eclodir. o promotor. de outra forma isso seria inacessível à análise genética. como se houvesse uma mutação eliminatória para aquele gene. é sintetizado um transcrito que é complementar aquele natural (Figura 2. Se esse gene está ausente. Um sítio. Krüppel é crítico para a formação do tórax e do abdômen da mosca.

ou ainda em um íntron dentro do gene). No momento. o oócito (Figura 2. levando em cada núcleo o gene luciferinase com a região regulatória ZP3. 28 pares de bases a montante do sítio onde a transcrição do gene é iniciada. a ligação de diferentes fatores de transcrição aos promotores e intensificadores de genes específicos é um dos mecanismos que controlam a produção de proteínas diferentes a partir de genomas idênticos.. (com 150 pares de bases) e o fundiram ao gene para a luciferinase de vaga-lume. Fatores protéicos que se ligam ao intensificador permitem sua interação com o promotor e. Parece. a seqüência de DNA com 150 pares de bases foi necessária e suficiente para ativar o gene (qualquer gene!) no oócito. a montante do gene. a hibridização in situ localizou mRNA de luciferinase em um único tipo de célula. mas a maioria dos genes ligados ao desenvolvimento são ativados em tempos e células específicos. (No exemplo ZP3. a montante. ZP3 é a principal proteína ligante de espermatozóide na superfície do óvulo de camundongo.74 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento o sítio onde se liga a RNA polimerase. Um sítio intensificador sensível a estrogênios é encontrado no primeiro íntron do gene ZP3.35 Estrutura básica de um gene regulado pelo desenvolvimento.) O gene recém-construído. O intensificador freqüentemente está mais acima. está uma segunda região chamada intensificadora. GATAA. Esses genes precisam ser ativados por fatores que se ligam ao intensificador e ao promotor. É uma glicoproteína sintetisada pelo oócito durante sua maturação em óvulo (Roller et al. ela ativa o gene ZP3 ligando-se a essa sequência de DNA no promotor. Eles usaram enzimas de restrição para isolar o DNA da região 5'. a montante. Em camundongos transgênicos fêmeas. Alguns promotores (como aqueles usados por produtos relacionados ao metabolismo geral da célula) não precisam ser ativados por intensificadores. então. aproximadamente 95 pares de bases a montante do sítio de início da transcrição. Dentro dessa região de 150 pares de bases (de 99 a 86 pares de bases a montante do gene estrutural ZP3) existe a seqüência 5’-GATAA-3' que liga uma proteína chamada OSP-1.. O que permite a esse gene ser ativado somente nos oócitos? Lira e colaboradores (1990) isolaram o gene para ZP3. Está sendo usada aqui como um “gene repórter” para monitorar onde o DNA a montante pode causar sua expressão. o sítio OSP-1. (Não é necessário dizer que essa enzima produtora de luz não é encontrada em camundongos. Como detalharemos no Capítulo 4. com a transcrição do gene pela RNA polimerase. contendo a região a montante do gene ZP3 ligada ao gene estrutural para luciferinase. está sendo investigado como é regulado o gene codificador de OSP-1. Um exemplo é a ativação do gene para ZP3. consideraram que seqüências responsáveis por ativação oócito-específica podem existir até mais longe. Proteínas que se ligam ao promotor e aos intensificadores interagem para regular a transcrição do gene. determinaram sua seqüência e encontraram um sítio promotor. conseqüentemente. Assim. que ZP3 é sintetizado em oócitos porque eles têm a proteína OSP-1 que se liga a certas seqüências de DNA que são parte de seu promotor (Schickler et al.37). Figura 2. Como veremos no Capítulo 10. Como hipótese. foi injetado em zigotos de camundongo para criar animais transgênicos. Localizada em algum lugar dentro do gene (a jusante ou a montante.1989).) Intensificador Promotor Éxon Íntron Éxon Íntron Éxon Intensificador “a montante do gene” Intensificador “a jusante” do gene . Uma transferência Northern mostra que o mRNA para essa proteína é sintetizado somente em oócitos em crescimento e não pode ser detectado em nenhum outro tipo de célula (Figura 2.1992). está localizado no promotor.36). OSP-1 é encontrada somente em oócitos em maturação. mas pode ser encontrado dentro de um íntron ou no terminal 3'. O promotor da maioria dos genes codificadores de proteínas é encontrado no terminal 5' (a montante) do gene.

cortesia de P. uma palavra de alerta. quando luciferinase foi ligado ao promotor do gene ZP3.) . Rim Fígado Músculo Testículos Útero (A) (B) Figura 2. (B) Magnificação (160x) de dois folículos ovarianos contendo oócitos em maturação.. Em capítulos posteriores (especialmente Capítulo 21). Nesses casos o organismo herda a habilidade para responder aos sinais do ambiente. RNA de vários tecidos (10µg por pista) e oócitos (125ng) foram submetidos à eletroforese e transferidos para papel de nitrocelulose. Entretanto.36 Transferência Northern de RNA de ZP3 acumulado no camundongo. (A) Visão do ovário inteiro (60x). a qual apareceu onde foi expressa sob a direção do promotor de ZP3. Wassarman).CAPÍTULO 2 Genes e Desenvolvimento 75 Figura 2. permitindo que genes diferentes possam se tornar ativos em diferentes células. Oócito Ovário Cérebro Embrião de 13 dias Coração Intestino Uma conclusão e um alerta Depois de quase um século.37 Hibridização in situ da expressão do gene repórter luciferinase. veremos outros exemplos do controle ambiental do desenvolvimento: determinação de sexo temperatura-dependente em répteis. e a diferenciação. Esse conhecimento está ajudando a explicar como a informação herdada é utilizada para construir os planos básicos do corpo e os tipos específicos de células do organismo em desenvolvimento. Caso o tom celebratório deste capítulo deixou a impressão de que desenvolvimento é somente uma função da atividade gênica é necessário relembrar do Capítulo 1. estado amebóide e flagelado (Naegleria) e gonídios sexual e assexual (Volvox) é determinada pelo ambiente. (de Roller et al. estamos começando a entender como as células regulam a expressão diferenciada de seus genes. Wassarman. A sonda radioativa era dirigida à mensagem luciferinase. dos neurônios e linfócitos em mamíferos. que a distinção entre talo e esporo (Dictyostelium). Um fragmento radioativamente marcado do gene ZP3 foi usado como sonda do mRNA. 1990. mas não é possível predizer o fenótipo a partir do genótipo.1989. desenvolvimento em insetos dependente da dieta. dependente de experiência.. cortesia de P. especialmente dentro dos oócitos. (de Lira et al. A mensagem ZP3 foi encontrada somente no ovário.

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e 79 . Neste Capítulo. os neurônios da retina devem penetrar no cérebro para inervar as regiões do córtex cerebral que analisam a informação visual. Além disso. introduziremos as vias de mudança pelas quais as células do embrião em desenvolvimento criam órgãos funcionais do corpo. onde a lente não pudesse nela focalizar os raios de luz. Salmo 139 (ca. se todas as células têm o mesmo potencial genético? Em alguns casos. porque ela mesmo é parte integrante e majoritária daquela ordem. neurônios bipolares e células ganglionares) estão organizados para permitir que a retina seja funcional? • Como são os órgãos construídos a partir de tecidos? As células retinais do olho estão situadas atrás da córnea e da lente a uma distância exata. os vários tipos de células presentes na retina neural (as três camadas distintas de fotoreceptores.A base celular da morfogênese: Afinidade celular diferencial 3 Mas a natureza não é atomizada. Todas essas conexões devem estar precisamente ordenadas. a natureza só pode ser percebida pela mente humana. Como as células são instruídas para percorrer certas rotas e parar quando atingem uma região específica do corpo? • Como crescem órgãos e suas células. como o de precursores de nossas células pigmentadas. entretanto. Quando observamos a anatomia detalhada de um tecido como a retina neural. O que impede a formação de um olho em outras partes do corpo. vemos um arranjo preciso e intrincado de muitos tipos diferentes de células. Paul Weiss (1960) Eu fui criado terrivelmente e maravilhosamente. mas também sua morfogênese em arranjos multicelulares tais como tecidos e órgãos. Sua padronização é inerente e primária. e como é esse crescimento coordenado ao longo do desenvolvimento? As células do olho devem crescer juntas. e a ordem subjacente à beleza é nela demonstrada. Nosso intestino. U m corpo não é meramente uma coleção de tipos de células distribuídas ao acaso. Desenvolvimento envolve não só a diferenciação celular. células germinativas e glândula supra-renal. está constantemente descartando células e regenerando outras. e como se formam órgãos em determinados locais? Olhos se desenvolvem na cabeça. mais ainda. mas em nenhum outro lugar. A retina seria inútil se estivesse situada atrás de um osso ou outro lugar qualquer.c). 500 a. as células devem percorrer longas distâncias para alcançar seu destino final. Existem quatro questões majoritárias participando do arcabouço de discussões sobre morfogênese: • Como se formam tecidos a partir de células? De que modo células da retina neural aderem a outras células da retina neural e não se associam às celulas da retina pigmentada ou da íris que estão próximas a elas? De que modo. e as células da retina raramente dividem-se após o nascimento. • Como células migrantes atingem seu destino.

aderindo a algumas células ou migrando sobre outras.1 Sumário dos principais processos morfogenéticos em células mesenquimatosas e epiteliais ± . Se mais células fossem regeneradas do que aquelas descartadas. Townes e Holtfreter conseguiram observar o comportamento das células recombinadas (Figura 3. Se o número de células regeneradas fosse menor. Considerando a descoberta de que tecidos de anfíbios se dissociavam em células isoladas quando colocados em soluções alcalinas. e as células mesenquimatosas. também se desenvolveu um debate sobre o papel da superfície celular na formação do embrião. eles prepararam suspensões de células isoladas provenientes de cada uma das três camadas germinativas dos anfíbios. fortemente ligadas umas às outras em camadas ou tubos. Células podem seletivamente reconhecer outras. Parecem existir duas vias principais pelas quais células se comunicam umas com as outras para que se efetue a morfogênese. A maneira pela qual esses processos se completam pode diferenciar entre células epiteliais e mesenquimatosas (Figura 3. Duas ou mais dessas suspensões de células isoladas poderiam ser combinadas de várias maneiras. Usando embriões de espécies que tinham células de diferentes tamanhos e cores. as células aderiam umas às outras. seriam produzidos crescimentos cancerosos. A morfogênese nessas duas classes de células se dá através de um limitado repertório de processos celulares: (1) direção e número de divisões celulares. e muitos pesquisadores mais antigos pensavam até que a superfície celular não era uma parte vital da célula. formando agregados em placas de Petri cobertas com agár. Just (1939) sugeriam que a superfície celular diferia em tipos diferentes de células. e (6) mudanças na composição da membrana celular e da matriz extracelular. sua velocidade mitótica é cuidadosamente controlada.1). logo após a formação do tubo neural. A primeira é através de substâncias difusíveis que são sintetizadas por um tipo de célula e que mudam o comportamento de outros tipos celulares. Essas substâncias incluem hormônios. Neste capítulo veremos como superfícies de células adjacentes interagem durante o desenvolvimento. visando localizar as células em sítios apropriados dentro de tecidos e órgãos. Afinidade celular diferencial Assim como a demonstração da importância dos genes no desenvolvimento gerou desentendimentos entre pesquisadores. cada um será detalhado em capítulos subseqüentes. O segundo método involve contato entre superfícies de células adjacentes. (4) crescimento celular. O que controla essas diferenças na velocidade de crescimento? Todas essas perguntas se referem a aspectos do comportamento celular.2). Observações sobre fecundação e desenvolvimento embrionário precoce feitas por E. Essas afinidades podem ser para superfícies de outras células ou para moléculas da matriz extracelular secretadas pelas células. A superfície celular parece a mesma em todos tipos de células.80 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento ainda assim. (5) morte celular. E. Existem dois grupos principais de células no embrião: células epiteliais. e quando o pH era normalizado. mas a análise moderna da morfogênese se inicia com os experimentos de Townes e Holtfreter em 1955. Figura 3. isoladas e funcionando como unidades individuais. o paradigma dominante na morfogênese envolve afinidade celular diferencial. o intestino não poderia digerir o alimento. ocorrem na superfície celular. Os eventos moleculares que intermediam o reconhecimento seletivo de células e sua transformação em tecidos e órgãos. Enquanto o paradigma dominante na genética do desenvolvimento é a expressão diferencial do gene. (2) mudanças na forma das células. fatores de crescimento e morfógenos. (3) movimento celular.

PROCESSO CÉLULAS MESENQUIMATOSAS AÇÃO MORFOLOGIA EXEMPLO Condensação cartilagem Mesênquima se torna epitélio Mesêquina da cartilagem Divisão celular Mitose para produzir mais células (hiperplasia) Mesênquima dos membros Morte celular Célula morre Mesênquima interdigital Migração Célula se move em tempos e lugares determinados Mesênquima do coração Secreção de matriz e degradação Síntese ou remoção da camada extracelular Mesênquima da cartilagem Crescimento Células ficam maiores (hipertrofia) Células gordurosas CÉLULAS EPITELIAIS Dispersão Epitélio mesênquima (estrutura inteira) Degeneração do ducto Mülleriano Delaminação Epitélio mesênquima (parte da estrutura) Hipoblastos de de galinha Mudança de forma ou crescimento Células permanecem ligadas com alteração da morfologia Neurulação Migração celular (intercalação) Linhas do epitélio se fundem para formar menos linhas Gastrulação de vertebrados Divisão celular Mitose dentro da linha ou outra direção Gastrulação de vertebrados Secreção de matriz e degradação Síntese ou remoção da camada extracelular Formação de órgãos vertebrados Migração Formação de bordas livres Ectoderma de galinha .

Ele verificou que essas células migram para sua camada germinativa apropriada. formando uma estrutura reminescente do tubo neural. a segregação celular resulta em uma camada epidérmica externa. como antes.3B).3E). verificaram que células reagregadas se tornavam espacialmente segregadas.3D). enquanto o mesoderma tem afinidades positivas para ambas as células. Em primeiro lugar. Quando células axiais mesodérmicas (notocorda) são adicionadas à suspensão de células presuntivas. Na sua configuração final. Em segundo lugar.3A).3C). enquanto que células ectodérmicas se localizam em seu . as células da placa neural migram para o centro. As células epidérmicas presuntivas migram para a periferia. em lugar de permanecerem misturadas. 1955. Células epidérmicas presuntivas de embriões pigmentados e células da placa neural de embriões não pigmentados são dissociadas e misturadas entre si. ectodérmicas e endodérmicas. Em nenhum caso as células permaneceram misturadas ao acaso. um tecido neural localizado centralmente. Ou seja. quando as três camadas germinativas são misturadas entre si. e uma camada de tecido mesodérmico entre eles (Figura 3. Holtfreter interpretou esse fato em termos de afinidade seletiva. que injetou células individuais de específicas camadas germinativas de volta na cavidade gastrular de anfíbio. As células reagrupamse de tal forma que um tipo (aqui. (Modificado de Townes e Holtfreter. o endoderma é interno e o mesoderma se situa na região entre eles. as células epidérmicas foram encontradas na periferia do agregado e as células mesodérmicas no seu interior.82 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Células epidérmicas presuntivas Segregação de tipos de células Dissociação de células Reagregação espontânea Células da placa neural Seção através da bola de células segregadas Figura 3. cada tipo de célula se posicionava em sua própria região. um tipo de tecido envolvia o outro completamente. epidérmicas e neurais. O mesoderma migra centralmente à epiderme. as células têm a capacidade de distribuirem-se em suas próprias posições embriológicas. quando células epidérmicas (ectodérmicas) e mesodérmicas foram ajuntadas para formar um agregado misto. aderindo à sua superfície interna (Figura 3. Tais afinidades preferenciais foram também observadas por Boucaut (1974). o ectoderma está na periferia. a epiderme presuntiva) cobre o outro. Entretanto.2 Reagregação de células da nêurula de anfíbios. o endoderma se separa do ectoderma e mesoderma e é então envolvido por eles (Figura 3. A superfície interna do ectoderma tem uma afinidade positiva pelas células mesodérmicas e uma afinidade negativa para o endoderma.) Os resultados de seus experimentos foram surpreendentes. e na maioria dos casos. O mesoderma também migra centralmente em relação ao intestino ou endoderma (Figura 3. Assim. Células endodérmicas encontram posições no endoderma do hospedeiro. os pesquisadores observaram que as posições finais das células reagregadas refletiam suas posições embriônicas. A mimetização da estrutura embrionária normal por agregados celulares também pode ser vista na recombinação de células da epiderme e da placa neural (Figura 3. De alguma maneira.

perde sua afinidade pelas células vizinhas e pela matriz extracelular externa. Cada célula tem também uma alta afinidade para a matriz extracelular (camada hialina) que cobre o embrião.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 83 Epiderme + mesoderma Mesoderma + endoderma Epiderme + Mesoderma + endoderma Placa neural + epiderme Placa neural + Mesoderma axial + epiderme Epiderme Endoderma Mesoderma Epiderme Epiderme Mesoderma Mesoderma (A) Mesoderma (B) Endoderma (C) Placa neural (D) Epiderme (E) Placa neural Figura 3. células precisam interagir de forma diferente com outras populações celulares em tempos específicos. um grupo específico de células. e uma baixa afinidade para as proteínas dentro da cavidade embrionária (blastocele). pois células embrionárias não mantêm uma única relação estável com outras células. Assim. ao iniciar-se a gastrulação. durante seu desenvolvimento. Isso deveria ser esperado. A terceira conclusão de Holtfreter e seus colegas foi que afinidades seletivas mudam durante o desenvolvimento. Mais recentemente. no pólo vegetal da blástula. Essas mudanças de afinidade causam a perda de contato das células Distribuição e reorganização de relacionamentos embrionários espaciais em agregados de células embrionárias de anfíbios.) . afinidade seletiva parece ser importante para fornecer informação posicional às células embrionárias.4).3 ectoderma. os experimentos de Fink e McClay (1985) demonstraram esse comportamento no ouriço-do-mar. todas as células parecem ter a mesma afinidade umas pelas outras. (Modificado de Townes e Holtfreter. que mostrou uma clara correlação entre mudanças de adesão in vitro e o comportamento da célula embrionária. enquanto adquire simultaneamente afinidade pelas fibrilas protéicas que forram a blastocele (Figura 3. Na blástula. 1955. Para que ocorra o desenvolvimento. Essas mudanças na afinidade celular foram dramaticamente confirmadas por Trinkaus (1963). Entretanto.

Dessa maneira. suas propriedades adesivas terão que mudar novamente. devem agora aderir para formar os rudimentos do anel esquelético. não se distribuem ao acaso. Aumento de afinidade por fibrilas da bastocele. A reconstrução de agregados de embriões tardios de aves e mamíferos foi obtida pelo uso da protease tripsina para dissociar as células entre si (Moscona. 1962). as células se distribuíram de acordo com seu tipo celular. Em 72 horas. a camada hialina. O resultado é que essas células migram para a blastocele (flechas) e formarão o esqueleto. mas se movem ativamente para criar organização tissular. 1987). 1952). com suas vizinhas e a migração para dentro da blastocele. onde elas formarão o esqueleto da larva.84 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. (A) Na blástula do ouriço-do-mar. Essas células.5 mostra a “reconstrução” do tecido da pele de um embrião de camundongo de 15 dias. então. elas reconstruíram a organização do tecido original (Moscona. mudanças na superfície celular produzem um enfraquecimento das afinidades pelas células vizinhas e camada hialina e um aumento de afinidade pelas proteínas da cavidade interna da blastocele. Quando as células isoladas resultantes foram misturadas em um frasco e agitadas de modo que a força de cisalhamento destruísse adesões não específicas. Quando elas começam a formar esse esqueleto. Quais forças dirigem o movimento celular durante a morfogênese? Em 1964. O modelo termodinâmico de interações celulares A células. Giudice. a epiderme foi reconstituída. Tais mudanças na afinidade celular são extremamente importantes nos processos da morfogênese. Malcolm Steinberg propôs um modelo que explicava o direcionamento da . Essas mudanças na adesão são específicas temporalmente e também específicas para as células precursoras esqueléticas (McClay e Ettensohn. As células da pele são separadas por enzimas proteolíticas e depois agregadas em uma cultura rotatória. 1961.4 (A) Camada hialina Células da blástula (B) Sumário das modificações na adesão celular de células precursoras do esqueleto (encaixadas). cada célula tem alta afinidade por suas vizinhas e por seu substrato. Essa reconstrução de tecidos complexos a partir de células únicas é chamada de agregação histotípica. A Figura 3. que tinham sido “antisociais” entre si desde seu ingresso na blastocele. (B) Enquanto progride o desenvolvimento. Fibrilas da blastocele Alta afinidade por células vizinhas e camada hialina Decréscimo de afinidade por células vizinhas e camada hialina. As células epidérmicas migram para a periferia. e as dérmicas migram para o centro. formou-se uma camada de queratina e folículos de pêlo são vistos na região dermal.

elas formam agregados de células organizadas ao acaso. derme e folículos pilosos primários. (C) Agregados após 24 horas. Portanto. Steinberg mostrou que certos tipos de células sempre migram para o centro quando combinadas com determinados tipos de células. é interna em relação a um segundo tipo. 1979. (de Armstrong. células do coração migram internamente às células neurais da retina. e a topografia final é independente das posições de partida (Figura 3. após algumas horas. (D) Seção através de um agregado mostrando migração de células epidérmicas para a periferia. interagem para formar um agregado com a menor energia livre interfacial (Figura 3. em dois dias. Um dos tecidos finalmente envolve o outro. (E) Nova diferenciação dos agregados (72 horas). Além disso. Os mesmos tipos de interações podem ser observados quando agregados esféricos de tecidos são colocados em contato. com as células pigmentadas localizadas internamente às células neurais da retina. Quando suspensões de células isoladas desses dois tipos são misturadas.6 ilustra as interações entre culturas de células pigmentadas e células neurais da retina. 1989.8).) (E) Folículos de pêlo . mostrando epiderme e derme reconstituídas. A Figura 3. Entretanto.6 Agregados formados pela mistura de células da retina neural (não pigmentada) de um embrião de galinha de 7 dias com células pigmentadas da retina (escuras). são vistos agregados de células distribuídas ao acaso. completa com folículos de pêlo e camada queratinizada. mostrando a epiderme. Moscona. (A) Seção através da pele embrionária. e células do coração migram centralmente em relação à retina pigmentada. Por exemplo. Usando células derivadas de tecidos embrionários tripsinisados. (B) Suspensão de células isoladas de pele tanto da derme como da epiderme. mas migram perifericamente quando combinadas com outras. Se a posição final de um tipo de célula. (A) Cinco horas após a mistura das suspensões de células isoladas. as células pigmentadas da retina não são mais vistas na periferia. (As células pigmentadas espalhadas são provavelmente células mortas). (C) Após dois dias. uns com os outros. C. tais interações obedecem a uma hierarquia (Steinberg. então a posição final de A será sempre interna a C. Essa observação levou Steinberg a propor que as células misturadas. duas distintas camadas são vistas. 1970). Em outras (A) (B) (C) (D) Derme Derme Epiderme Camada queratinizada (A) (B) (C) Figura 3. células pigmentadas da retina migram internamente às células neurais da retina.5 Epiderme Derme Reconstrução da pele a partir de uma suspensão de células de pele de um embrião de camundongo de 15 dias. (B) Em 19 horas. já não se observa células pigmentadas da retina na periferia dos agregados.) Folículo piloso primário distribuição celular baseado em princípios termodinâmicos. e a posição final de B é interna a um terceiro tipo. B. B. Armstrong. cortesia de A.7). A.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 85 Figura 3. cortesia de P. a maioria das células pigmentadas da retina estão localizadas em uma massa central interna rodeadas pelas células da retina neural. (de Monroy e Moscona.

ω bb). originará diferentes números de contatos estáveis entre tipos de células. o essencial é que tenham diferenças em suas forças de adesão. ou a arquitetura celular que permite à substância ser concentrada diferencialmente. Uma condição final idêntica é obtida. como é característico para óleo e água. Células A localizadas centralmente às células B (A) DISTRIBUIÇÃO (B) AO ACASO (C) SEPARAÇÃO Figura 3. não vai haver distribuição. vai haver distribuição com centralização das células do tipo A. então. (A) Distribuição ocorre quando a força adesiva média entre diferentes tipos de células (ωab) é menor que a força adesiva média homotípica (A-A ou B-B) (ωaa. porque o sistema já atingiu o equilíbrio termodinâmico. as células A e B não mostram basicamente nenhuma adesividade entre si – então as células A e B formarão agregados separados. Alternativamente. Os movimentos que ocorrem visam restaurar uma nova configuração de equilíbrio para as células. distante da periferia palavras. . reagregadas ou os tecidos são mantidos intactos e colocados em contato. o embrião precoce pode ser considerado como existindo em um estado de equilíbrio até que alguma mudança na atividade gênica altere as moléculas na superfície celular. Para que as células sejam distribuídas.) Colocar tecidos juntos. e a mistura dos tipos de células será ao acaso. bem encaixados Dissociar os tecidos e reagregar Movimento do tecido B para envolver o tecido A Movimento das células A para dentro. Na forma mais simples desse modelo. se os tecidos são transformados em suspensões de células isoladas e. 1989. haverá uma completa separação. As células mais adesivas se localizam centralmente. Esse modelo termodinâmico é chamado hipótese da adesão diferencial. A quantidade desse produto da superfície celular. A posição final de agregados compostos de dois tipos de tecidos é independente de sua posição inicial. o agregado permanecerá com uma mistura de células ao acaso. (C) Se as ligações A-B são muito mais fracas que a média das adesões homotípicas. (De acordo com Armstrong. todas as células poderiam ter o mesmo tipo de “cola” distribuída na sua superfície. e se a força da conexão A-A é maior do que aquela entre A-B ou B-B. Se as células dos tipos A e B têm diferentes forças de adesão. Nessa hipótese. Finalmente.7 Tecido A Tecido B Espalhamento de um tipo de célula sobre outro tipo. as células se rearranjam na forma termodinamicamente mais estável.86 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. as diferenças termodinâmicas poderiam ser causadas por vários tipos de moléculas de adesão. Se a força da conexão A-A é menor ou igual a da conexão A-B.8 Distribuição como um processo tendendo à estabilidade termodinâmica máxima. se a conexão A-A tiver uma força muito maior do que a conexão A-B – em outras palavras. (B) Se a força das adesões A-B é maior ou igual à média das adesões homotípicas.

Esses dados sugerem que as hierarquias da distribuição celular. in vivo. quando os blastemas são de níveis diferentes. Quando um membro anterior é amputado no antebraço. Foty e seus colaboradores encontraram uma completa correlação entre a tensão superficial do tecido e sua tendência de distribuir-se no centro ou na periferia de um agregado misto. [cell1. uma massa de células desdiferenciadas (blastema regenerativo). a tensão superficial de cada tecido poderia ser calculada em dines por centímetro. que se divide e diferencia formando um novo membro. nesse caso. então. e mediram a tensão superficial dos tecidos em termos da habilidade desses em retornar à forma esferóide original. Blastemas do pulso. Entretanto. estão surgindo evidências para essa hipótese em estudos de regeneração de membros na salamandra. são colocados juntos em cultura. e (2) essa distribuição realmente ocorre durante o desenvolvimento? Foty e colegas no laboratório de Steinberg (1994) analisaram a tensão superficial interfacial em vários tecidos embrionários. Entretanto.) Antebraço Cotovelo Pulso . o local “sendo conhecido” regenera somente o pulso e os dígitos. cotovelo ou antebraço foram enxertados na junção blastema-toco de um membro posterior regenerando a partir da meia coxa. refletem diferenças que são usadas pelo corpo. forma-se um blastema regenerativo parecido. essas propriedades são maiores no pulso e menores no antebraço. Os blastemas de membro anterior migraram distalmente até o nivel correspondente do membro posterior do hospedeiro e regeneraram uma nova estrutura (Figura 3. na construção de novos órgãos. o toco remanescente forma na sua ponta. do antebraço para baixo. onde formou um pulso ao nível do tarso do pé. Parece.9). Membros de salamandra têm alguns atributos surpreendentes. em lugar disso. in vivo. mas nenhum envolve o outro (Figura 3. que as propriedades adesivas des- sas células formam um gradiente ao longo do eixo proximodistal. entretanto. o blastema do cotovelo se moveu ao nível do joelho e formou o resto do braço a partir desse ponto. cotovelo e cúbito. Tecidos com uma maior tensão superficial sempre se localizavam internamente quando misturados com outros de menor tensão superficial. de membros anteriores. era muito difícil planejar experimentos para testar. o tecido mais proximal (perto do corpo) envolverá o mais distal (Nardi e Stocum. Depois de três dias em cultura. o blastema proximal parecia tentar envolver as células mais distais. Parece que a distribuição pode ser explicada unicamente pelas tensões superficiais das células justapostas. o blastema do pulso foi deslocado até o fim do membro posterior em regeneração.10). 1983.html] Até recentemente. esse modelo de distribuição celular. formando o resto do membro. não é reformado o tecido do antebraço. Crawford e Stocum (1988) conseguiram relacionar essa distribuição de células in vitro ao processo de regeneração de membro ao vivo. Stocum. os agregados foram fixados e secionados. cortesia de D. Blastemas do mesmo nível fundiram em uma linha reta.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 87 Informações adicionais & Especulações Evidência para o modelo termodinâmico E Blastema não marcado vidências recentes para a hipótese da adesão diferencial surgiram em pesquisa com o objetivo de responder duas questões: (1) pode o fenômeno da distribuição ser explicado pela tensão superficial gerada pela adesão celular?. Eles comprimiram amostras de tecido entre as placas de vidro de um tensiômetro. o mais proximal (perto do corpo) envolve o mais distal. Quando os blastemas eram de diferentes níveis. O blastema do antebraço imediatamente regenerou um membro completo a partir do nível da meia coxa. O novo tecido do membro se inicia no local da amputação. Dessa maneira. Blastema marcado Pulso Cotovelo Antebraço Figura 3. (de Nardi e Stocum. Quando o membro é amputado no pulso. (Um membro de cada par foi marcado com tritio para distinguílo do outro).9 Distribuição quando blastemas de níveis iguais ou diferentes. vistas in vitro. Como é armazenada essa “memória posicional”? Nardi e Stocum (1983) demonstraram que colocando junto dois blastemas de membros de salamandra com o mesmo nível de origem eles se fundem. 1983). Aqui.

) Blastema de pulso Blastema de cotovelo Blastema de antebraço Blastema de coxa mediana Enxertar blastema no blastema em regeneração da coxa mediana Permitir crescimento externo dos enxertos A base molecular das adesões célula-célula As classes de moléculas de adesão celular A formação de tecidos e órgãos é mediada por eventos que ocorrem na superfície de células adjacentes. existem três classes de moléculas da membrana celular (principalmente proteínas) que estão particularmente envolvidas no controle de interações específicas com outras células (Edelman e Thiery. onde blastemas de membros anteriores em regeneração (em cores) enxertados em blastemas da coxa mediana (cinza) são deslocados para a região correspondente do membro posterior em regeneração (pulso ao tarso. e as moléculas encontradas no espaços extracelulares. o potencial genético pode se manifestar no processo mecânico da morfogênese. propiciam uma conexão importante entre o código genético unidimensional e o organismo tridimensional. A superfície celular inclui a membrana plasmática. Elas têm um papel crítico na separação de diferentes tecidos entre si.10 Distribuição in vivo. Essas moléculas fornecem vias de comunicação entre o citoplasma de células adjacentes e fornecem barreiras de permeabilidade e força mecânica às lâminas epiteliais. 1985): • Moléculas de adesão celular. antebraço à coxa mediana) onde iniciam a formação do membro anterior.88 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. A membrana plasmática é uma bicamada fluida lipídica que contém proteínas capazes de interagir com o ambiente externo. as moléculas diretamente abaixo dela e a ela associadas. • Moléculas de adesão a substrato. e permitem a separação espacial das lâminas epiteliais. Elas podem unir células em lâminas epiteliais e condensar células mesenquimatosas em agregados coesos. 1988. Células eucarióticas são envolvidas por uma complexa borda molecular chamada membrana plasmática (ou celular). • Moléculas da junção celular. Essas proteínas participam da adesão célulacélula. distalmente daquele ponto. Essas moléculas permitem ligação das células às suas matrizes extracelulares. cotovelo ao joelho. Elas incluem componentes da matriz extracelular e seus receptores situados na superfície da célula. Os padrões locais de expressão dessas moléculas da superfície celular. em direção a outras células. Certas proteínas têm seus sítios ativos apontando para fora. Modulando o aparecimento dessas moléculas. (de Crawford e Stocum. . Moléculas de adesão a substrato permitem o movimento de células do mesênquima e neurônios.

as células do mieloma só podem produzir nucleotídeos de purina de novo. Assim. e as células de poços positivos são semeadas em densidade suficientemente baixa para permitir que células individuais originem clones discretos. mesmo contendo a enzima (HPRT) que lhes permitiria utilizar a hipoxantina do meio. e que mudam enquanto a célula se desenvolve. células do mieloma não fundidas morrem por fome de purinas. Mais ainda. 1969).CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 89 Informações adicionais Anticorpos monoclonais e genética reversa Monitoramento de modificações da membrana celular através de anticorpos monoclonais. Os poços nos quais crescem os hibridomas são selecionados quanto à presença do anticorpo efetivo. denominados antígenos de diferenciação (Boyse e Old. as células são cultivadas em um meio contendo aminopterina.11 Protocolo para preparar anticorpos monoclonais. Após a fusão. Diferentes tipos de células possuem componentes da superfície celular que são diversos. 1980. Células são cultivadas em um meio contendo hipoxantina. sendo que cada linfócito B produz um único tipo de anticorpo. de modo que eles morrem igualmente. são freqüentemente reconhecidos por antisoros e. que foram mutados de modo a: (1) não sintetizar seus próprios anticorpos e (2) não ter a enzima de recuperação de purinas.) . Células de mieloma não fundidas não podem crescer nesse meio porque a aminopterina bloqueia a única via para sintetizar nucleotídeos purínicos. sem a enzima HPRT. Linfócitos B normais também não dividem-se em cultura. Devido a essa última alteração. não podendo usar as purinas do meio de cultura. Elas não podem produzir nucleotídeos de purina usando a via de recuperação mediada por HPRT e a aminopterina bloqueia também a via de novo. aminopterina e timidina (HAT). Esses linfócitos são tornados “imortais” pela fusão com células cultivadas de linfócito B de tumores (mielomas). selecionar anticorpos Cultivar clones de hibridomas individuais de poços positivos Secionar e cultivar clones cujos sobrenadantes testam positivo Figura 3. O produto da fusão do linfócito B e da célula do mieloma – o hibridoma – prolifera. por essa razão. Geralmente. As células fundidas (hibridomas) crescem e se dividem. A expressão de componentes da membrana muda no espaço e no tempo. Tal anticorpo é monoclonal.11). porque possui a enzima de recuperação de purina do linfócito B e as propriedades de crescimento do tumor. Os linfócitos B do camundongo começarão a produzir anticorpos contra cada um dos componentes estranhos dessas células. Células do baço de um camundongo imunizado são fundidas com células mutadas de mieloma. hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT). Esses componentes da membrana. Células B morrem nesse meio. Antígenos de diferenciação específicos podem atualmente ser identificados por anticorpos monoclonais (Figura 3. (de Yelton e Scharff. Esses clones são isolados e selecionados para o anticorpo efetivo. uma droga que inibe a via de síntese de novo da purina. sem enzima HPRT & Especulações Células de baço de camundongo Células de mieloma Fusão Seleção em meio HAT. esses anticorpos são produzidos injetando celulas estranhas em camundongos (ou células de camundongos de uma linhagem em animais de outra linhagem). Os hibridomas produzindo esse anticorpo podem ser cultivados e congelados. cada um Imunização Células mutantes de mieloma. tecido-específicos.

as membranas de todas as células da retina neural não são iguais. a célula começa a expressar outra molécula da membrana. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos em grandes quantidades e podem reconhecer antígenos (proteínas. Esse antígeno é também encontrado em outros tipos de células neuronais. Anticorpos monoclonais foram obtidos após injetar camundongos com homogenatos de tecido da cabeça de Drosophila. (Cortesia de G. Assim que as células epiteliais. elas expressam o antígeno 22C10. Por exemplo. Da proteína ao gene Como antígenos de diferenciação são proteínas cuja expressão é regulada no tempo e no espaço. Essa molécula é encontrada somente nos neurônios que se transformarão em fotorreceptores. e essas podem mudar durante a maturação da célula. Assim. lipídeos e carboidratos) que são fracamente expressos (Köhler e Milstein. ligamos anticorpos monoclonais às particulas de resinas e passamos homogenatos de retina em colunas contendo esse material (Figura 3. 1975).1984). 28H9. do disco mostram propriedades neuronais. A Figura 3.90 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Segmentos externos de fotorreceptores Somas de fotorreceptores (camada nuclear externa) Camada sináptica externa Camada nuclear interna (soma interneuronal) Camada sináptica interna Soma das células ganglionárias Axônios das células ganglionárias (A) (B) (C) (D) Mas logo em seguida.12 Especificidade da superíficie celular da retina neural de galinha. Como podemos realizar essa “genética reversa” indo da proteína para o gene? Em primeiro lugar. Cada um dos anticorpos monoclonais reconhece uma molécula diferente na membrana celular.) O anticorpo se liga somente ao antígeno reconhecido originalmente. Anticorpos monoclonais dirigidos contra tipos específicos de células. seria interessante saber como seus genes são regulados. (D) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece antígeno em um subconjunto de processos em células nervosas nas camadas sinápticas externas e internas. tendo um único linfócito B como sua fonte original.14). Célula epitelial não diferenciada Fotorreceptor Neurônio Neurônio sensorial fotorreceptor Vários antígenos não específicos 22C10 antígeno 24B10 antígeno 21A6 antígeno 28H9 antígeno Figura 3. Enquanto se procede a diferenciação. as membranas dos axônios e da soma do nervo. é denominado anticorpo monoclonal. (B) Seção de retina marcada com um anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece células retinais (mas não outras neuronais). por exemplo.) desses hibridomas secreta o anticorpo específico do linfócito B. regiões da mesma membrana celular podem ser diferentes. demonstraram numerosos antígenos de diferenciação aparecendo em diferentes tempos e lugares durante o desenvolvimento. e um painel de anticorpos foi testado em células do disco imaginal do olho larval que se diferenciavam em estruturas do olho. e a proteína ligada à resina é eluída (por soluções salinas) e submetida à eletroforese em gel para separá-la de um possível Fotorreceptor maduro Figura 3. (C) Seção retinal marcada com anticorpo monoclonal fluorescente que reconhece processos neuronais mas não corpos celulares na retina. diferentes antígenos se expressam na membrana celular. (A) Fotografia de contraste de fase de uma seção da retina neural de um pinto recém-eclodido. o conhecimento de como a proteína 24B10 se expressa poderia dar indicacões sobre os mecanismos genéticos da diversidade neuronal. em diferentes camadas espaciais da retina neural de um pinto recém-eclodido. Na verdade. contêm moléculas diferentes. Como está evidente nesta fotografia composta. 1885. membranas celulares de diferentes tipos de células contêm moléculas diferentes.. o antígeno 21A6 é expresso em certas regiões de fotorreceptores em maturação. e como essas mudanças são freqüentemente correlacionadas com mudanças morfológicas específicas (como mostra a Figura 3. não diferenciadas.13 mostra mudanças temporais na membrana celular de uma única célula epitelial de Drosophila enquanto ela se desenvolve em um fotorreceptor retinal. é característico de fotorreceptores retinais terminalmente diferenciados (Zipursky et al.13 Mudanças temporais na membrana celular correlacionadas com a morfogênese de uma célula retinal fotorreceptora da Drosophila. Grunwald. Tais anticorpos. o antígeno 24B10..12 mostra diferentes moléculas da superfície celular.13). A Figura 3.) . (Essa é uma coluna de imunoafinidade. (de Venkatesh et al. e outro antígeno. O meio no qual estão crescendo os hibridomas é testado quanto à presença de anticorpos que se ligam à população original das células estranhas. Nos estágios seguintes (aproximadamente 80 horas mais tarde).

CAG . antígeno 24B10 5 Eluir proteína purificada 24B10 do gel e seqüenciar o amino terminal Met-Glu-Glu-Thr-His-Tyr-Pro 6 Gerar uma seqüência mensageira possível e sintetizar uma seqüência complementar radioativa AUG . Venkatesh et al. fotografia cortesia de S. seqüenciar o clone positivo TCC ATG T T C GAT CGC GAG ATG GAG GAG ACG CAT TAC CCG CCC TGC ACC TAC AAC GTG ATG TGC Ser Met Phe Asp Arg Glu Met Glu Glu T h r His Ty r P r o P r o Cys T h r Ty r Asn Val Met Cys Seqüência esperada 8 Isolar e caracterizar gene .CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 91 Anticorpo monoclonal ao antígeno 24B10 Juntar anticorpo marcado ao antígeno 24B10. Por essa via.GTC .CC TAC . No caso da 24B10. 1985. O DNA de Drosophila de cada clone positivo foi seqüenciado para verificar se esse complementava a seqüência da proteína original isolada pelo anticorpo monoclonal.C T T . É necessário sintetizar oligonucleotídeos radioativos que se ligariam a uma seqüência de DNA capaz de codificar tal proteína. A região do gel contendo a proteína é separada..14 3 Adicionar homogenato de retina contendo antígeno 24B10 ( ) e outros antígenos ( ) • • Homogenato retinal Protocolo para encontrar o gene que codifica a proteína identificada por um anticorpo monoclonal.GG contaminante.T T G . (de Venkatesh et al. a proteína eluída da matriz do gel é parcialmente seqüenciada.C T T . podemos ir de uma rara proteína identificada por um anticorpo monoclonal a um pedaço específico do DNA genômico.) 7 Usar essa sonda para selecionar a biblioteca de fago do genoma da Drosophila..AAC . O oligonucleotídeo decodificado pela estrutura da proteína não precisa ser um par perfeito com a verdadeira seqüência.1984.AGG .. separar por eletroforese em gel e corar gel para proteína • • Proteína purificada.GAA .) 4 Depois que outros antígenos ( ) passam através da coluna. (Zipursky et al. na seção retinal 1 Cobrir partículas de resina com anticorpo monoclonal Localização de 24B10 por anticorpo monoclonal marcado com fluoresceína 2 Preparar coluna de imunoafinidade com partículas cobertas Figura 3. eluir material ( ) remanescente nas partículas. 1985. essas sondas radioativas foram usadas para selecionar uma biblioteca de clones de DNA recombinante contendo regiões do genoma de Drosophila.GAA . Benzer.TCC .

1968. cada um consistindo de um tipo de célula.92 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Moléculas de adesão celular Identificando moléculas de adesão celular e seu papel no desenvolvimento Os estudos de distribuição de Holtfreter e Steinberg não identificaram as moléculas envolvidas na adesão celular diferenciada. foram previamente marcadas com diferentes radioisótopos.1 lista algumas CAMs recentemente descobertas. Caderinas Íons de cálcio são freqüentemente necessários para a adesão celular. quatro classes principais de caderinas foram identificadas: Figura 3. Agregados coletores. incubando células de cartilagem marcadas com 3H e hepatócitos marcados com 14C em uma solução em rotação.15 Especificidade da associação célula-célula. Caderinas têm um papel crítico no estabelecimento e manutenção de conexões intercelulares.16). A tarefa seguinte é identificar as moléculas mediadoras da adesão celular e descobrir como conseguem realizar esse feito. As células isoladas. Experimentos similares estenderam essas conclusões às células do músculo e do fígado (Figura 3. 1971) demonstrou que diferentes tipos de células mostram uma adesão celular seletiva independente da distribuição das células. Roth (1968. 1987). isotípicas e heterotípicas. como as cateninas se ligam ao citoesqueleto de actina.15). como mostra a tabela abaixo. Caderinas interagem com outras caderinas de células adjacentes e são ancoradas na célula por complexos de proteínas chamados cateninas (Figura 3. cujas propriedades de adesão celular dependem de íons cálcio e as CAMs da superfamília de imunoglobulinas.. Mais ainda. Após seis horas. os agregados foram colhidos. lavados e determinados os números de células isotípicas e heterotípicas que aderiram ao agregado. elas integram as células epiteliais em uma unidade mecânica. e parecem ser cruciais para a segregação espacial de células e para a organização da forma animal (Takeichi. ele demonstrou que os agregados de cartilagem escolheram especificamente células de cartilagem. contendo pequenos agregados de células de cartilagem não marcadas. cujos domínios de ligação às células se parecem aqueles de moléculas de anticorpos. Ele modificou o ensaio de agregação rotatório. Contar células radioativas que aderiram ao agregado . (Dados de Roth. Esses estudos indicaram que tipos diferentes de células podiam usar diferentes moléculas de adesão. Os íons estabilizam as conformações adesivas de certas proteínas da superfície celular chamadas caderinas.) Contagem das células radioativas que aderiram ao agregado Célula isotípica marcada com 3 H (cartilagem) Célula heterotípica marcada com 14 C (fígado) Agregado (cartilagem) Rotação por seis horas Células isoladas marcadas em suspensão* Tipo de agregado Cartilagem Fígado Músculo peitoral Cartilagem 100 10 38 Fígado 6 100 49 Músculo peitoral 48 0 100 * Porcentagem do número médio de células coletadas pelos agregados isotípicos. A Tabela 3. Várias moléculas de adesão celular (CAMs). são colocados em um frasco de cultura giratório contendo células isoladas do mesmo tipo (isotípico) e de tipos diferentes (heterotípico). Roth et al. Medindo as células marcadas com 14C e 3H nesses agregados. foram identificadas e agrupadas em duas categorias gerais: as caderinas. Em embriões de vertebrados. O complexo caderina-catenina forma a clássica junção aderente que liga as células epiteliais entre si.

Presumivelmente. pois a P-caderina nas células uterinas é visualizada em contato com a P-caderina das células trofoblásticas de embriões de camundongos (Kadokawa et al.1 Classificação geral das principais moléculas de adesão celular (CAMs) Classe Caderinas (cálcio-dependente) CAM N-caderina (a. também chamada uvomorulina e L-CAM) é expressa em todas as células embrionárias precoces de mamíferos. 1989). NILE) Neurofascina CAM-celular LFA-1 CD4 glicoproteína (HIV receptor) Tipo celular Nervos.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 93 Tabela 3. rins Glia. Sítios de fosforilação Reconhecimento do sítio de adesão Figura 3. essa molécula é restrita a tecidos epiteliais de embriões e adultos. neurônios Neurônios de Drosophila Hepatócitos Linfócitos Indutor de células T • • E-caderina (caderina epitelial.k. L-CAM. caderinas que não têm o domínio extracelular podem interferir com o desenvolvimento. ligando as cateninas disponíveis com seus domínios citoplasmáticos.16 Sítio de ligação de cálcio Membrana celular Cateninas Actina Representação esquemática da adesão celular mediada por caderina. A importância dessas interações para o desenvolvimento normal é vista na Figura 3. A-CAM) P-caderina E-caderina (a. uvomorulina) N-CAM Ng-CAM (a.18. 1986). coração Placenta. rins.k. que fazem contato com a parede uterina (as células trofoblásticas) e o próprio epitélio da parede uterina (Nose e Takeichi. blástula de camundongo CAMs da super família de imunoglobulinas (cálcio-independente) Músculos. Caderina Ligação caderina-caderina Caderina . L1. Mais tarde.a. (de Takeichi. As cateninas podem se associar com o sistema de microfilamentos de actina. É possível que a P-caderina facilita a conexão do trofoblasto com o útero.a.. P-caderina (caderina de placenta) parece ser expressa primariamente em células placentárias do embrião de mamífero. epitélio Epitélio.a.k. 1991). Caderinas estão associadas com três tipos de cateninas. nervos. elas competem com as caderinas normais. lentes. mesmo no estágio de uma célula.

Roth e colaboradores demonstraram que células de fígado tendem a coletar células de fígado e que células retinais coletam outras células retinais.5 dias. Takeichi (1987) demonstrou que células retinais expressam N-caderina e células hepáticas expressam E-caderina. a epiderme expressa E-caderina e as células da crista neural nenhuma das duas. o tubo neural não se separa da epiderme (Detrick • . E-caderina é vista em suas superfícies celulares. Suporte para essa idéia veio de estudos nos quais diferentes genes de caderina foram transfectados em fibroblastos de camundongo.17. Caderinas promovem a aderência celular. inicialmente expressam N-caderina.17. e que a distribuição seria a esperada devido a essa diferença na expressão de caderinas. enquanto que os fibroblastos não tratados se associaram às células mesenquimatosas (que não expressam caderinas) (Nose et al. Também. 1988. Takeichi. Quando o mRNA para N-caderina de galinha é injetado em um dos dois blastômeros da primeira clivagem em embrião da rã Xenopus. que não expressam habitualmente qualquer tipo de caderina. • EP-caderina (C-caderina) é crítica na manutenção da adesão celular entre os blastômeros da blástula de Xenopus e é necessária para os movimentos normais de gastrulação (Figura 3. Fotografias obtidas em diferentes comprimentos de onda.1987). ligando-se ao mesmo tipo de caderina em outra célula. e os fibroblastos tratados passam a se ligar fortemente uns aos outros (Nagafuchi et al.18. células com E-caderina grudam em outras células que têm Ecaderina. quando as células migrantes chegam ao seu destino e começam a se agregar entre si para formar gânglios nervosos. 1979). elas tornam a expressar N-caderina (Hatta et al. 1986).1988). Células expressando N-caderinas rapidamente se isolam de células N-caderina-negativas in vitro. Lee e Gumbiner. Células da crista neural (que estão na porção mais dorsal do tubo neural). Na verdade essas células começam a se portar como células epiteliais. (Fotografias de K. Mais ainda. Os embriões que expressam N-caderina extra são muitas vezes caracterizados por amontoados de células e camadas tissulares engrossadas. Hatta e Takeichi.. mas passa a expressar N-caderina. estudos in vivo mostraram que caderinas podem ter um papel crítico nos fenômenos de distribuição ocorrendo dentro do embrião.17 Localização de duas diferentes caderinas durante a formação do tubo neural no camundongo. quando genes ativados de Ecaderina são transfectados em fibroblastos de camundongo cultivados e neles expressos (usualmente eles não expressam essa proteína). enquanto fibroblastos de P-caderina se ligavam a outros que expressavam P-caderina. Todos esses experimentos foram realizados com células cultivadas. da mesma forma. Em seguida. Fibroblastos expressando E-caderina aderiram a outros contendo E-caderina.. Heasman et al. 1994. o tubo neural (que expressa N-caderina) se separa das células que se transformarão em epiderme (a qual expressa E-caderina). 1995).1987). Ele também sugeriu que as observações de Townes e Holtfreter poderiam ser. os fibroblastos expressando E-caderina foram integrados nos túbulos epiteliais pulmonares (que expressam E-caderina). em uma camada única (Takeichi et al. mostram que o ectoderma externo expressa E-caderina predominantemente. cortesia de M. É intensamente expressa nas células do sistema nervoso central em desenvolvimento (Figura 3.. e anticorpos univalentes contra caderinas converterão um agregado de células tridimensional histotípico. ele expressa N-caderina. Foi usada marcação imunofluorescente dupla para localizar E-caderina (A) e Ncaderina (B) na mesma seção transversal do cérebro posterior de um embrião de camundongo de 8. Em embriões nos quais a epiderme e o tubo neural expressam a N-caderina extra. C de Rutishauser. enquanto anticorpos para N-caderina foram marcados com um segundo tipo de corante (que emite sua cor em outros comprimentos de onda). veja também Capítulo 7). e se separarão de outras células contendo N-caderinas em suas membranas. enquanto deixam o tubo neural. quando tecido pulmonar embrionário foi dissociado e sua recombinação permitida na presença de fibroblastos levando E-caderina ou de fibroblastos sem tratamento. Essa ligação é chamada ligação homofílica. elas perdem a expressão de N-caderina (veja Figura 3... Anticorpos para E-caderina foram marcados com um tipo de corante fluorescente (o qual fluoresce em um intervalo de comprimento de onda). Como foi discutido. Shimamura e H. Normalmente. Recentemente. neurônios sensoriais e outros tipos de células). (C) quando se forma o tubo neural. N-caderina é freqüentemente expressa em células que normalmente não a possuem. migrando como células individuais (para formar células pigmentadas. Assim.) N-caderina (caderina neural) é vista inicialmente nas células mesodérmicas no embrião em gastrulação enquanto elas perdem sua expressão de E-caderina. Entretanto. explicadas por expressão diferencial de caderinas. Expressão diferencial de caderina pode também explicar os dados de distribuição homotípica discutida anteriormente. ao passo que a invaginante placa neural cessa a expressão de E-caderina.94 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) Ectoderma Crista Neural Células migratórias Tubo neural E-caderina N-caderina (C) Figura 3. Matsunami. Expressão de caderinas é freqüentemente correlacionada com agregação e dispersão.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 95 (A) (B) Figura 3. (A) Quando oócitos são injetados com oligonucleotídeos antisense contra uma mensagem de caderina herdada maternalmente. N-CAM é necessária para uma ligação adequada de axônios às células musculares alvos (Covault e Sanes. Kintner. provavelmente. Uma situação similar parece ocorrer em insetos. fotografias cortesia de J.. Durante a neurulação as células com a proteína mutante não formam uma camada coerente.... Em embriões controle (direita). Assim.19).. porque de outra maneira eles poderiam artificialmente agrupar células e o efeito não poderia ser medido). as caderinas estão.1970).18 Importância de caderinas em manter a coesão entre células em desenvolvimento. anticorpos foram usados inicialmente para identificar moléculas de adesão celular em Dictyostelium. essas glicoproteínas são chamadas CAMs da superfamília de imunoglobulinas*. mas não são exatamente família “próxima”. Heasman e C. Fujimori et al.. [cell2. Landmesser et al. 1989). Essa estrutura extracelular com seus domínios globulares imobilizados por pontes dissulfeto. Além disso. as células internas permanecem juntas. uma “família”. tendo um papel principal na organização das células em tecidos..1986).) et al. 1988. e é mesmo possível que as imunoglobulinas sejam derivadas desse grupo de CAMs (Williams e Barclay. B de acordo com Kintner et al.html] CAMs da superfamília de imunoglobulinas Como discutimos no Capítulo 1. 1988. 1990). Isso levou à descoberta de uma glicoproteína de 80-kDa que é mediadora da adesão célula-célula durante a agregação no fungo pegajoso. (B) No estágio de quatro células. . Anticorpos à N-CAM podem quebrar essas ligações. Esses outros membros da superfamília têm estruturas semelhantes às imunoglobulinas. A mesma estratégia foi usada por Edelman e seus colaboradores (Brackenbury et al.html] N-CAM é um membro de uma classe de CAMs que não necessitam íons de cálcio e que têm uma estrutura semelhante (Figura 3. Tosney et al. 1994. (de Heasman et al. Lander. Gerisch e colegas (Beug et al. prepararam anticorpos contra Dictyostelium e os quebraram quimicamente de modo que somente suas regiões monovalentes ligantes de antígeno permanecessem – os fragmentos Fab. elas mesmas. os blastômeros que formam o lado esquerdo do sapo são injetados com um mRNA para N-caderina que não tem a região extracelular da caderina. 1986. Assim. N-CAM parece ser crítica para o empacotamento (fasciculação) de axônios para que se movimentem como uma unidade.1988). 1992. onde * A designação superfamília é freqüentemente usada porque as diferentes classes de moléculas de imunoglobulinas também constituem. (Os anticorpos bivalentes tiveram que ser quebrados.. 1990. as células centrais dispersam quando o hemisfério animal é removido. As CAMs da superfamília de imunoglobulinas podem ter um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso. 1977) que levou ao isolamento de uma molécula de adesão de células neurais (N-CAM). [cell3. permitindo que os axônios se dispersem (Fraser et al. se assemelha à molécula de imunoglobulina.

(B) Modelo para a adesão das CAMs da superfamília de imunoglobulinas. 1987. Goodman. L1 é necessária para a produção de certos axônios (Lemmon et al.) (A) (B) (C) . retardamento mental e inabilidade em controlar movimentos dos membros (Vits et al. L1 é uma proteína transmembrana com seis domínios globulares. cada uma com dois domínios. cada uma com cinco domínios. (A) Estrutura em andaime dos axônios fasciculados em um embrião de gafanhoto como visto em um microscópio de Nomarski.. Sua âncora na membrana pode ser a seqüência de aminoácidos de uma proteína transmembrana ou um lipídeo. a molécula de adesão celular de insetos. Expressão de fasciclina no sistema nervoso do gafanhoto em desenvolvimento. 1988). Expressão diferencial de CAM é crítica nos limites entre dois grupos de células. e neurogliana se assemelham a N-CAM e L1.20) ajudam a migração de axônios (Harrelson e Goodman. enquanto o anticorpo em (C) se liga a uma glicoproteína de membrana dos mais longitudinais fascículos de axônios. o corpo segrega diferentes células em diferentes regiões. Note que o anticorpo marca somente uma porção de cada axônio.C) Sistema nervoso embriônico como em (A). (A) N N N N N N ou N Domínios semelhantes à imunoglobulina Domínios semelhantes à fibronectina Extracelular ou Citoplasma CC IgM C N-CAM ou fasciclina II C L1 ou neurogliana N ou C Interações de N-CAM célula-célula Figura 3. (B. Células da notocorda não entram no tubo neural e nem células dermais trespassam para a epiderme. respectivamente. ISN é um neurônio intersegmental e con é um neurônio conectivo.19 (B) Moléculas de adesão da superfamília de imunoglobulinas. A com e P com são as comissuras anterior e posterior cujos axônios atravessam o segmento. e duas cadeias leves.96 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. As flechas mostram os mesmos locais em (B) e (C). N-CAM é um polipeptídeo com cinco domínios. Nesses lugares.20 as CAMs da superfamília de imunoglobulinas. 1994).. chamadas fasciclinas (Figura 3. (de Bastiani et al. 1989). cortesia de C.. Fasciclina II. A forma da molécula de IgM ligada à membrana tem duas cadeias pesadas. mas marcado com anticorpos monoclonais feitos para as glicoproteínas fasciclinas da superfície celular. e mutações de L1 no homem causam um espectro de anomalias caracterizada por hidrocefalia. O anticorpo em (B) reconhece um subconjunto de axônios nas comissuras anterior e posterior. (A) Três membros da superfamília de imunoglobulinas.

Edelman). enquanto as células mesenquimatosas. CAM-negativas anteriormente.21 Distribuição de diferentes CAMs em bordas tissulares. Células assim ligadas são chamadas “acopladas”. D conforme Darnell et al. as células mesenquimatosas recémagregadas expressam N-CAM (A) e as células ectodérmicas expressam E-caderinas (B) nas suas respectivas membranas celulares. Finas conexões servem como canais de comunicação entre células adjacentes (Figura 3. (B) Micrografia fluorescente de junções em fenda em túbulo renal de embrião de camundongo de 17 dias. (A) Moléculas da junção celular: proteínas da junção em fenda Junções em fenda são regiões intercelulares especializadas onde células adjacentes se encontram entre 15-40 nm de distância. Através do desenvolvimento da pena. cortesia de C. Sainio. (A de Peracchia e Dulhunty. Esse compartimento na gástrula de camundongo pode ser visto injetando o corante Lucifer Yellow em um célula e observando sua transferência a um pequeno grupo de células. 1985a.b). Essa segregagação pode ser conseqüência da diferença de CAMs nas populações adjacentes. como resultado de sua habilidade para expressar N-CAM. Por exemplo. (D) Estrutura da subunidade da junção em fenda.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 97 Figura 3... 1988. pelo menos alguns (B) (B) (D) Figura 3. Lo. 1985a. e pequenas moléculas (MW<1500) e íons podem passar livremente de uma célula para outra. (C) Compartimento formado por proteínas da junção de fenda entre células que se comunicam umas com as outras.B).) . (A) Micrografia eletrônica de uma fileira de junções em fenda ligando duas células justapostas. cortesia de K. 1986. B de Sainio et al. E-caderina. ou ambas as proteínas (Chuong e Edelman. 1992. C de Kalimi e Lo. cortesia de G. Enquanto as células mesodérmicas se reúnem para induzir o broto das penas no ectoderma. cortesia de C. 1976. Na maioria dos embriões.22 Espaço intracelular (15-40 nm) Canais de comunicação Membranas celulares Conexões (A) (D) Proteínas das junções em fenda. Peracchia.22A. começam a expressar N-CAM e se juntam para formar um agregado (Figura 3. penas são induzidas quando células mesenquimatosas derivadas do mesoderma se agrupam para formar uma bola de células imediatamente abaixo da epiderme da pele da galinha. (de Chuong e Edelman. diferentes grupos de células se separam umas das outras. As células ectodérmicas estão ligadas entre si por E-caderina.21).

) . Ainda mais.. Existem aproximadamente doze tipos de conexinas. 1979.. A importância de junções em fenda no desenvolvimento foi demonstrada em embriões de anfíbios e mamíferos (Warner et al. Warner.1995). foi injetado com (A) um anticorpo controle ou (B) um anticorpo contra a proteína da junção em fenda. mas parcialmente sobrepostos. o desenvolvimento posterior cessa. E. Seção de um girino de Xenopus no qual um dos blastômeros. a comunicação entre células. mediada por junções em fenda.. Se a compactação for inibida por anticorpos contra proteínas da junção em fenda. então.98 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) dos blastômeros precoces estão ligados por junções em fenda.22D). no desenvolvimento normal. (de Warner et al. Mesmo que a perda da proteína conexina-43 possa ser compensada em muitos tecidos. agora não podia permitir a passagem de íons ou moléculas pequenas de uma célula à outra. Os blastômeros tratados continuam a dividir-se. essas oito células se movem juntas para formar um embrião compacto. O lado formado pelo blastômero injetado não tem o olho e tem uma morfologia cerebral anormal. mas foi incapaz de se desenvolver de maneira normal (Warner et al. Apesar de frouxamente associadas entre si. logo após o nascimento.. Por exemplo. os girinos que resultaram das blástulas tratadas mostraram defeitos especificamente relacionados ao destino desenvolvimental da célula injetada (Figura 3. se os genes da conexina-43 forem derrubados por endereçamento de genes.23 (B) Efeitos da junção em fenda no desenvolvimento. Jongen e colaboradores (1991) observaram que em células acopladas por E-caderina. Evidências sugerem que caderinas permitem não só o contato entre as células como também modificam as proteínas tipo conexina. Autópsia desses animais mostra que o ventrículo direito – a câmara que bombeia sangue aos pulmões através da artéria pulmonar – está cheio de tecido que fecha a câmara e impede o fluxo de sangue (Reaume et al. 1984.. esses camundongos têm respiração convulsiva. aquela célula não formará junções em fenda e não será incluída no embrião (Bevilacqua et al. Podem ser usadas CAMs da superfamília de Figura 3. 1989). e não com outras. No embrião de camundongo. e algumas podem ser reguladas por caderinas. mas a compactação não ocorre (Lo e Gilula. Os canais da junção em fenda são feitos de proteínas chamadas conexinas. A habilidade de células em formar junções em fenda com algumas células. a progênie daquela célula que usualmente está ligada por junções de fenda. dessa forma permitindo que íons e pequenas moléculas solúveis passem livremente entre eles. 1984). A progênie de tal célula não morreu. Se RNA antisense contra as mensagens da junção em fenda é injetado em um dos blastômeros de um embrião normal de camundongo. Parece que a função da proteína conexina-43 pode ser assumida por outras conexinas. cria “compartimentos” fisiológicos dentro do embrião em desenvolvimento (Figura 3. se tornam cianóticos e morrem. permitindo que se juntem os citoplasmas de ambas as células (Figura 3. parece que ela é crítica para o desenvolvimento normal do coração. vários mecanismos pelos quais pode fazer ligações com membranas de outras células. o embrião ainda se desenvolverá. [cell4. seis conexinas idênticas da membrana se agrupam para formar um canal transmembrana contendo um poro central.html] A membrana celular tem. Em cada célula.22 C). os oito primeiros blastômeros são conectados entre si por junções em fenda. O complexo de junção em fenda de uma célula se conecta ao complexo de junção em fenda de outra célula. depende da função de caderinas.23). 1984).. Entretanto. Quando anticorpos contra proteínas da junção em fenda foram microinjetados em uma célula específica de uma blástula de Xenopus de oito células. cortesia de A. Os diferentes tipos de proteína conexina têm papéis separados. Mas. 1987). a proteína de junção em fenda conexina-43 é encontrada em quase todos os tecidos do embrião do camundongo em desenvolvimento. no estágio de oito células. Lee et al.

CAMs dependentes de cálcio e proteínas de junção. A micrografia eletrônica de varredura mostra a matriz extracelular na junção das células epiteliais (acima) e mesenquimatosas (abaixo). por vezes. Aqui. Epitélio Figura 3. Weiss (1945) e Tyler (1946) sugeriram que a célula. as células mesenquimatosas secretam uma frouxa lâmina reticular. Existem três componentes principais na maioria de matrizes extracelulares: colágeno. ou seja. Agora voltamos nossa atenção para esses componentes. Cada tipo de célula migratória prefere certas combinações de moléculas da matriz a outras combinações. a célula também pode se ligar a componentes específicos da matriz extracelular. uma lâmina de células epiteliais está adjacente a uma camada de tecido mesenquimatoso frouxo.24 Lâmina basal Colágeno Localização e formação da matriz extracelular no embrião de galinha. proteoglicanos e glicoproteínas grandes que são chamadas moléculas de adesão a substrato (Tabela 3. Como já mencionado. Um tipo de matriz é mostrado na Figura 3. (Cortesia de R. Mas isso não esgota seu repertório. Durante a última década foi demonstrado que esse tipo de interação é muito importante para a migração celular. L. pode interagir com seus substratos através do sistema chave-fechadura. quando cessar a migração e qual rota tomar.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 99 imunoglobulinas. Trelsted. Juntas. As células epiteliais sintetizam uma lâmina densa com base de glicoproteína. a matriz extracelular pode servir como o substrato no qual as células migram. Em algumas situações. ela pode separar dois grupos adjacentes de células e prevenir qualquer interação.html] A matriz extracelular A matriz extracelular consiste de macromoléculas secretadas pelas células no seu ambiente imediato.24. Em outros casos. mas os principais parecem envolver substâncias na matriz extracelular. Essas moléculas interagem de modo a formar uma estrutura insolúvel que pode ter várias funções no desenvolvimento. enquanto as células mesenquimatosas secretam a lâmina reticular feita primariamente de colágeno. como a migração de pássaros e borboletas monarca. O relacionamento entre a proteína da membrana celular e a molécula da matriz seria semelhante aquele entre enzima e substrato ou anticorpo e antígeno. A hipótese da afinidade diferencial a substrato postula que diferentes células reconhecem diferentes moléculas em várias matrizes extracelulares. entre a membrana celular e a matriz extracelular. essas camadas constituem a membrana basal da lâmina de células epiteliais.2). A base molecular da afinidade célula-substrato Afinidade diferencial a substrato A migração de células. [cell5. ou pode até induzir diferenciação em certos tipos celulares.) . depende da percepção de quando começar a migração. e essas moléculas orientam a célula para quando e onde migrar. As células epiteliais formaram uma apertada camada extracelular chamada lâmina basal. Existem muitos sinais que o ambiente pode dar às células.

Lâmina basal pode conter fibronectina. III. um dos açúcares do dissacarídeo tem um grupo amino e a unidade repetitiva é chamada glicosaminoglicano (GAG). COLÁGENO. encontrado nas matrizes extracelulares da pele. A interconexão de proteína e carboidrato forma uma matriz semelhante a uma rede. e V-XIII são também encontradas) que se organizam para formar fibrilas. tendões e ossos.3 lista os glicosaminoglicanos mais comuns.100 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Tabela 3. Tipos II. nidogen e outras glicoproteínas adesivas. perfaz quase 90 porcento do colágeno do corpo. Colágeno Tipo I. Vasos sangüíneos apresentam colágeno Tipo III. A Tabela 3. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Moléculas às quais células aderem permitindo-lhes que se movam. são rígidos.html] PROTEOGLICANOS. Usualmente. Existem numerosos tipos de colágeno servindo funções especiais. Proteoglicanos sulfatados compreendem uma proteína linear interna à qual estão ligadas cadeias de um ou mais glicosaminoglicanos sulfatados (condroitina. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Compostos de proteínas e dissacarídeos repetitivos (glicosaminoglicanos). e o Tipo IV é encontrado na lâmina basal produzida por células epiteliais (Vuorio. pulmões e outros órgãos.25. 1990. que é o principal suporte estrutural de quase todos os órgãos dos animais. a estrutura básica dos proteoglicanos é mostrada na Figura 3. Outros tipos de colágeno são encontrados ao longo do corpo. A consistência da matriz extracelular depende da relação entre colágeno e proteoglicanos. . mas também é encontrado na notocorda e no corpo vítreo do olho. é macia.2 Principais constituintes da matriz extracelular Matriz extracelular mesenquimatosa Lâmina basal das células epiteliais COLÁGENOS Moléculas longas e delgadas (Tipo I é o mais comum. Um trímero de glicoproteína com sítios de adesão para a membrana celular. Colágeno é importante para a formação da lâmina basal. o componente funcional majoritário da lâmina basal. COLÁGENO IV Os componentes estruturais majoritários da lâmina basal. (2) os carboidratos são cadeias lineares compostas de dissacarídeos repetitivos. usualmente com 60-70 nm de diâmetro. MOLÉCULAS DE ADESÃO DE SUBSTRATO Laminina. tenascina. que contêm predominantemente fibras de colágeno. e também está implicado na ramificação dos túbulos epiteliais nas glândulas salivares. Proteoglicanos estimulam e modulam movimentos celulares. Elas incluem fibronectina. especialmente em cartilagem. Fonte: Adaptado de Bard. Glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico. sua disponibilidade sugere que podem ter outras propriedades não conhecidas. Colágeno é uma família de glicoproteínas contendo altas porcenta- gens de resíduos de glicina e prolina. o proteoglicano envolve as células impedindo que elas se juntem (Figura 3. que tem uma alta porcentagem de proteoglicanos. Colágenos proporcionam força e estabilidade aos tecidos. condronectina e tenascina. e em muitos tipos de células móveis. Quase metade das proteínas do corpo são constituídas de colágeno. enquanto tendões. colágeno IV e glicosaminoglicanos. PROTEOGLICANOS DA MATRIZ Ácido hialurônico e proteoglicanos sulfatados são freqüentes na lâmina basal. uma enorme molécula (108 Da) que liga grandes quantidades de água. [cell6. São tipos específicos de glicoproteínas nas quais: (1) o peso dos resíduos de carboidratos é muito maior do que o da proteína. 1986). queratan e dermatan sulfato). suas fibrilas são como um fino “arame de galinheiro” e se organizam em um substrato semelhante a feltro. Cartilagem. Sua presença pode facilitar a passagem de produtos secretados pela lâmina. Ao contrário de outros colágenos. Colágeno Tipo II é mais evidente como secreção das células cartilaginosas. Na lâmina basal predominam os proteoglicanos que formam uma peneira molecular além de propiciar suporte estrutural.26). heparan.

Essas cadeias podem ser conectadas por glicosamino-glicanos mais longos (mostrado aqui como ácido hialurônico) para produzir redes complexas. córnea.3 Unidades dissacarídicas repetitivas de glicosaminoglicanos mais comuns encontradas em proteoglicanos da matriz Unidade dissacarídica repetitivaa Distribuição Glicosaminoglicano Ácido hialurônico Condroitina sulfato Dermatan sulfato Queratan sulfato Heparan sulfato Ácido glucurônico-Nacetilglucosamina Ácido glucurônico-Nacetigalactosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilgalactosamina sulfato Galactose-N-acetilglucosamina sulfato [Ácido glucurônico ou idurônico] N-acetilglucosamina sulfato Tecidos conjuntivos. Glicoproteínas ligantes estabilizam essas últimas associações. artérias. para produzir as cadeias de proteoglicanos. vasos sangüíneos Cartilagem. corpo vítreo Cartilagem. . córnea Pulmão. coração. veja Tabela 3. Entretanto. (Modificado de Cheney e Lash.) Tabela 3. O dissacarídeo repetitivo do glicosaminoglicano (tal como condroitina sulfato. 1981. osso. artérias Pele.25 Glicoproteínas ligantes Agregados de proteoglicanos A estrutura da subunidade e a montagem de um proteoglicano complexo. superfície celular a Essas são unidades repetitivas típicas desses glicosaminoglicanos.3) se liga a um esqueleto protéico relativamente pequeno (colorido).CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 101 Monômeros de proteoglicanos Pequenos glicosaminoglicanos (tal como condroitina sulfato) Proteína esqueleto Ácido D-glucurônico N-acetil-D-glucosamina Ácido hialurônico Ácido hialurônico Glicosaminoglicano Figura 3. algumas regiões de cada GAG podem ter sacarídeos ligeiramente modificados.

Axônios dos gânglios da raiz dorsal têm proteoglicanos de heparan sulfato entre suas proteínas da superfície celular. Uma maneira pela qual cadeias de glicosaminoglicanos.) Proteoglicanos também são importantes como mediadores de conexões entre tecidos adjacentes em um órgão. cortesia de N. Em alguns casos. condrócitos.1991). muito grande (460-kDa). eles reúnem células soltas para formar uma lâmina epitelial* (San Antonio et al. (A) Capa de hialuronidato envolve mioblastos de galinha. (A-C de Orkin et al. GLICOPROTEÍNAS EXTRACELULARES. hemácias fixadas) em distância significante da borda celular. Leonard e colaboradores (1989) propuseram esse como um possível mecanismo para explicar problemas esqueléticos em crianças nascidas de mães severamente diabéticas. e isso concentra o fator de crescimento localmente. laminina e tenascina. o receptor celular para o fator de crescimento freqüentemente não liga o fator com grande afinidade. Bernfield e Sanderson. D de Hadler et al. (D) Micrografia eletrônica de hialuronidato em solução aquosa mostra uma rede fibrilar ramificada. de proteoglicanos. inibindo a formação da cartilagem.. (B) quando os mioblastos são tratados com hialuronidase (a qual dissolve ácido hialurônico).. Vainio et al. 1991. Hadler. 1989.. 1985. cortesia de B.. macrófagos e certas células epiteliais (como hepatócitos e amniócitos).. Essas glicoproteínas grandes provavelmente são responsáveis pela organização de colágeno. Thesleff et al. (C) A capa também desaparece quando os mioblastos cessam a divisão e se juntam enquanto se diferenciam. Mioblastos em cultura excluem pequenas partículas (nesse caso. Entretanto. sintetizada por fibroblastos. Níveis excessivos de glicose inibem a síntese do esqueleto de proteína do proteoglicano.26 Capa de proteoglicanos envolvendo células móveis. a remoção desses proteoglicanos impede a proliferação ao seu redor. Fatores de crescimento são proteínas semelhantes a hormônios que regulam mitose ou diferenciação quando se ligam a determinadas células. podem funcionar é reter e apresentar fatores de crescimento para receptores celulares. Na verdade. Toole. proteoglicanos secretados por um tipo de célula são essenciais para o crescimento de células vizinhas.1985). das células de Schwann associadas (Ratner et al.102 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) (D) (C) Figura 3. tais como: fibronectina.. 1990). células endoteliais. Yayon et al. essa capa extracelular desaparece. No órgão. 1989. Uma função da fibronectina é servir como adesivo *Proteoglicanos de heparan sulfato são considerados como agregadores de condrócitos.1987. Fibronectina é um dímero de glicoproteína. proteoglicanos e células em uma estrutura ordenada. 1982. o fator é inicialmente ligado pelos carboidratos do proteoglicano. as células produtoras de cartilagem. de modo a ser possível a ligação com o receptor (Massagué. .. Matrizes extracelulares contêm uma va- riedade de outras moléculas especializadas. M.

É composta de três cadeias peptídicas. as células precardíacas. Outras regiões na fibronectina permitem ligações com colágeno.27 (A) (B) H 2N Domínio ligante de fibrina e heparina Domínio ligante de colágeno Sítio de alta afinidade Domínios para ligação de células da crista neural de aves RGDS CS1 COOH Fibronectina no embrião de galinha em desenvolvimento. O colágeno ligado por laminina é do Tipo IV (específico para lâmina basal). também migram sobre células que secretam fibronectina em suas superfícies (Heasman et al. ligando células a substratos. Fibronectina também organiza a matriz extracelular por ter vários pontos de ligação distintos.b). como as células germinativas. B conforme Dufour et al. Tenascina (também chamada citotactina) se assemelha a fibronectina em mais ou menos metade Figura 3. o sítio RGD e o sítio de alta afinidade. (A cortesia de J. O domínio para a ligação de fibroblastos compreende duas unidades. Como será visto em capítulos posteriores. precursoras de embriões do sapo.1981). Heparan e heparan sulfato são nomes dados a glicosaminoglicanos similares encontrados na matriz extracelular ou na superfície da célula. Como a fibronectina. 1990). A migração de células mesodérmicas na gastrulação é vista na superfície de fibronectina em muitas espécies. Lash. Células da crista neural de aves têm outro sítio necessário para sua mobilidade em um substrato de fibronectina. A adesão de células epiteliais à laminina (na qual elas se assentam e usam) é muito maior do que a afinidade de células mesenquimatosas pela fibronectina (à qual elas devem se ligar e liberar se deverá haver migração). Nem todas grandes glicoproteínas celulares promovem adesão celular. a laminina tem um papel na montagem da matriz extracelular.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 103 molecular em geral. Os retângulos representam domínios resistentes a proteases. Se embriões de galinhas são injetados com anticorpos à fibronectina.. 1988. tais como: colágeno e proteoglicanos. pode se ligar ao colágeno. e. (B) Estrutura e domínios de ligação na fibronectina. (A) Anticorpos fluorescentes para fibronectina mostram que a deposição de proteína no embrião de 24 horas se situa ao longo da lâmina basal de muitos órgãos. os precursores do coração. Em embriões de galinha.) *Heparina é uma porção de um proteoglicano de heparina secretada por mastócitos e basófilos. Domínios ligantes de células para fibroblastos Sítio II ligante de heparina Sítio II ligante de fibrina . heparina* e outras moléculas da matriz extracelular. Assim. a fibronectina parece ter um papel principal na migração das células precardíacas para a linha mediana do embrião. mudando a forma da célula e permitindo a migração celular (Hakomori et al. Presume-se que os sítios de ligação para heparina sejam os mesmos que os para heparan sulfato (Bernfield e Sanderson. Outros tipos de células.27).1984). Anticorpos fluorescentes à fibronectina demonstraram um gradiente da proteína no caminho de migração entre o endoderma e o mesoderma. e a região ligante de células da laminina reconhece principalmente células epiteliais e neurônios. ambos são essenciais para ligação da célula. as células precardíacas não migram para a linha mediana e desenvolvem dois corações separados. promovendo adesão celular e crescimento. e o movimento dessas células cessa quando a fibronectina é localmente removida. fibronectina tem também um papel importante na migração celular. como fibronectina.. as células do coração seguem o gradiente para novas posições se afastando da linha mediana (Linask e Lash.. glicosaminoglicanos e células. Se essa região for cortada e sofrer uma rotação. migram na fibronectina para se mover das laterais do embrião para a linha mediana. que interagindo com as moléculas apropriadas produz um alinhamento adequado de células e sua matriz extracelular (Figura 3. Laminina é um componente principal da lâmina basal. 1988a. As “rodovias” pelas quais se movem certas células migratórias são pavimentadas com essa proteína.

enquanto que as células não aderiram ou migraram bem sobre a tenascina. No lado citoplasmático. (Cortesia de M. que se torna o lugar de ligação na célula para essas grandes moléculas. serve como um sítio de ancoragem para os microfilamentos de actina que movimentam a célula. duas proteínas que se ligam aos microfilamentos de actina. e diferentes combinações binárias das subunidades α e β permitem que a integrina se ligue a determinadas moléculas extracelulares. No desenvolvimento da asa da Drosophila. Além disso. Horwitz e colaboradores (1986. as integrinas de Drosophila são compostas de subunidades α e β que atravessam a membrana celular. enquanto α4β1 se liga somente à fibronectina. se liga à fibronectina da matriz extracelular (Figura 3. 1985). Nas duas integrinas de Drosophila que são conhecidas. tenascinas parecem aumentar a síntese e secreção de proteases das células que nela se localizam (Werb et al. enquanto a integrina PS2 está na superfície superior do epitélio na asa presuntiva Figura 3. Então.. Chiquet. 1990).1990). 1993). dispostas em forma de letras. fora da célula. Diferentes quantidades relativas de fibronectina e tenascina podem gerar substratos de vários graus de adesividade. as ligações unindo a unidade β da integrina ao citoesqueleto. α2β1 se liga ao colágeno e laminina. Cada molécula de integrina tem duas subunidades distintas. 1987). Fibronectina e tenascina foram colocadas em placas de cultura de tecidos. A integrina PS1 está situada na superfície basal do epitélio na asa presuntiva dorsal. 1987. duas lâminas epiteliais são aproximadas. Ambas as características podem ser importantes na geração de vias para a migração celular. Tipos diferentes de células podem ter diferentes moléculas de integrinas com diferentes afinidades por moléculas da matriz extracelular (Hemler et al. diferentes células reagem de maneira diferente à tenascina. e na remodelação da matriz extracelular durante o desenvolvimento (Tan et al. 1990).. e é encontrada transitoriamente em várias matrizes extracelulares durante o desenvolvimento embrionário. a integrina se liga à talina e α-actinina. outras são arrebanhadas e se desligam da tenascina (Figura 3. Spring et al. No lado extracelular. Dentro da célula.29). Wehrle e Chiquet. Proteínas integrinas foram encontradas atravessando a membrana de numerosos tipos de células. as subunidades β são idênticas. Por exemplo. incluíndo vitronectina (encontrada na lâmina basal do olho). Entretanto. 1989). podem ser continuamente quebradas e refeitas por uma protease que cliva talina e está especificamente localizada em sítios da membrana celular onde a integrina se liga ao substrato. A habilidade de uma célula em ligar essas glicoproteínas adesivas depende da sua capacidade em expressar um receptor da membrana. A importância de integrinas é dramaticamente ilustrada durante a embriogênese de Drosophila. Essas duas integrinas freqüentemente funcionam em conjunto efetuando adesão tissular e celular durante o desenvolvimento. BronnerFraser. O resultado mostra que fibronectina foi o substrato preferido no plástico da cultura de tecidos.104 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento do comprimento da molécula. Essa ligação dupla permite o movimento da célula pela contração dos microfilamentos de actina contra a matriz extracelular fixa (veja Wang et al. Algumas células aderem a ela.. mas somente a unidade β conecta com o citoesqueleto interno. 1988.28 Inibição de adesão celular por tenascina. parece que o complexo receptor de fibronectina atravessa a membrana celular e une dois tipos de matrizes. Knudsen et al. Foi observado que o complexo receptor de fibronectina é capaz não só de ligar fibronectina no exterior da célula. como também proteínas do citoesqueleto dentro da célula.1985.. Como as integrinas de vertebrados.. α e β. Fibroblastos foram adicionados às placas podendo aderir e migrar. integrina se liga à seqüência arginina-glicina-aspartato (RGD) de várias proteínas adesivas em matrizes extracelulares. Os principais receptores de fibronectina foram purificados usando anticorpos monoclonais que bloqueiam a ligação das células à fibronectina (Chen et al. mas as subunidades α são diferentes. Receptores celulares para moléculas da matriz extracelular INTEGRINAS. Ambas as unidades α e β são necessárias para a ligação com fibronectina ou laminina. 1987)... Durante a migração. 1986) denominaram essa família de receptores protéicos como integrinas porque elas integram as plataformas intra e extracelulares permitindo que funcionem conjuntamente. Tamkun et al..) . fibronectina e laminina (Ruoslahti e Pierschbacher.. 1987.28. É possível que essa protease quebre a ponte entre o receptor de fibronectina e o citoesqueleto (Beckerle et al. Hemler.

(A) Imunofluorescência indireta corando os microfilamentos de actina de uma célula extendendo um lamelapódio. Outro grupo de proteínas que pode aderir células a proteínas da matriz extracelular são as glicosiltransferases da superfície celular. galactosiltransferase é uma enzima capaz de transferir galactose de um molécula doadora ativada (UDP-galactose) a uma unidade aceptora. cortesia de E. Enquanto o receptor integrina se liga a uma seqüência RGD na cadeia A de laminina. porque integrina é necessária para anexar músculos à epiderme e à parede do intestino.. As glicosiltransferases de membrana reconhecem o carboidrato receptor nas α Actinina Microfilamento de actina Figura 3. por exemplo. A enzima necessita de dois substratos para completar a catálise. onde elas são responsáveis por adicionar resíduos de açúcar a peptídeos para produzir glicoproteínas.1989). Galactosiltransferases são enzimas funcionais da membrana celular. Assim. As fibras de actina irradiam da grade ordenada do citoesqueleto para o lamelapódio.1989).29 Dupla função de integrinas ao se ligar com matrizes extracelulares e com o citoesqueleto interno.. nenhuma integrina se forma. Devem existir muitas galactosiltransferases com afinidades para diferentes moléculas aceptoras. O receptor usado pode ser importante em permitir que as células usem laminina ou como membrana basal (nesse caso a afinidade do receptor seria alta) ou como um substrato para a migração (na qual receptores de afinidade menor seriam usados). 1976. esses dois epitélios se encontram e aderem para formar a lâmina de duas camadas da asa. Algumas mutações de integrinas em Drosophila são letais.. o carboidrato aceptor e o açúcar ativado. 1989.1987. Yow et al. Na ausência dessa subunidade. Mutações nas integrinas produzem asas com regiões onde os dois epitélios se separam. existe uma deficiência nos genes codificando a subunidade β das integrinas de Drosophila. Lazarides.) . Existem numerosas glicosiltransferases. como evidenciado por bolhas entre as duas lâminas (Brower e Jaffe. B conforme Luna e Hitt.. tem uma afinidade relativamente baixa por laminina (Kd = 10-6 M). Wilcox et al. Integrinas não são as únicas moléculas capazes de se ligar à laminina e à fibronectina. GLICOSILTRANSFERASES. outro receptor protéico de laminina na membrana celular se liga a uma seqüência diferente (Y1GSR) na cadeia B1 (Graf et al.. enquanto a afinidade por laminina de seu receptor epitelial é muito mais alta (Kd=2 x10-9 M). 1985). Na mutação letal (1) myospheroid. Durante a metamorfose. e essas podem ser importantes para sua função (Horwitz et al.30).CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 105 (A) Fibronectina RGD Sítio de ligação de RGD Subunidade ß de integrina Extracelular Subunidade ß de integrina Sítios de ligação de cálcio Subunidade α de integrina Citoplasma α Actinina Vinculina Talina ventral. Essas enzimas ligadas à membrana são rotineiramente encontradas no retículo endoplasmático e nas vesículas de Golgi. e os músculos somáticos se contraem em esferas sem ligantes para a parede do corpo e do intestino (Leptin et al. 1992. 1988). cada uma específica para um dado açúcar e algumas mostrando também especificidade de substrato. (B) Diagrama especulativo relacionando a ligação do citoesqueleto à matriz extracelular através da molécula de integrina. (A de Lazarides. A integrina a3β1 de fibroblastos. Os receptores têm afinidade diferente por laminina. e sua adesão à matriz extracelular representa uma catálise “frustrada” (Figura 3.

Crescimento do osso. fibronectina e colágeno Tipo IV (Behrendtsen et al. e interferência com essa ligação pode impedir a implantação (Farach et al. Se o açúcar ativado está ausente. 1977a. e várias dessas enzimas interagem para amplificar a intensidade das enzimas digestivas (Figura 3. Turley e Roth. Eckstein e Shur. especialmente das células mesodérmicas migratórias. Kadokawa e colaboradores (1989) mostraram que Pe E-caderinas estão presentes tanto no tecido uterino como no trofoblástico no local da implantação. C de Shur. Shur. quando embriões de mamíferos se embebem no útero. regressão da cauda do girino e formação de órgãos ramificados (tais como: glândulas salivares.. Em células migratórias. 1992). Isso causa adesão. Por exemplo. 1994). (A e B modificado de Pierce et al.. Assim.106 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento (A) (B) Enzima glicosiltransferase NDP-açúcar + aceptor Glicosil transferase NDP + açúcar-aceptor Doador de açúcar ativado (NDP-açúcar) Aceptor insolúvel (C) Ligação Ligação de NDP-açúcar à glicosiltransferase Figura 3.b. Radioatividade insolúvel vista por radioautografia mostra que esse açúcar radioativo foi transferido às superfícies celulares. células podem ter muitos sistemas adesivos que lhes permitem ligar e/ou migrar em substratos específicos. tanto adesão como catálise são observadas (Toole. Terceiro. Sato et al.. (B) Interação entre glicosiltransferases e o grupo carboidrato (aceptor) na glicoproteína da matriz extracelular. Segundo. a adesão é crítica e a catálise não ocorre. (A) A reação padrão de glicosiltransferase. As células também usam sistemas múltiplos para remodelar tecidos por digestão. Em algumas instâncias (como fertilização no camundongo. as células ativam os genes para os inibidores dessas proteínas. onde a galactosiltransferase na membrana celular do espermatozóide interage com componentes carboidrato da matriz extracelular secretada pelo óvulo). e (3) estromelisinas que digerem proteoglicanos. Essas metaloproteinases incluem: (1) colagenases que digerem colágenos dos Tipo I. rins e pulmões) também requerem quebra da membrana basal. 1977a. Por exemplo.30 Catálise cliva açúcar de NDP e o adiciona ao aceptor Interações da superfície celular através de glicosiltransferases.) proteínas da matriz extracelular tal como a laminina. as células de fora do embrião (as células trofoblásticas) têm receptores para o colágeno e os proteoglicanos de heparan sulfato do endométrio uterino. 1979. essas adesões podem ser quebradas pela catálise. incubando seções microscópicas de um embrião de galinha de 10-somitos. na qual um açúcar é transferido de um carregador nucleosídeo difosfato a um receptor. cortesia de B. 1988. 1980. Dutt e colaboradores (1987) mostraram que as células trofoblásticas podem também aderir às células uterinas através das glicosiltransferases da superfície celular. ocorre a adesão (considera-se que isso ocorra durante a fertilização). (2) gelatinases que digerem elastina e colágenos IV e V. a fixação inicial do embrião de camundongo à parede uterina parece ser mediada por vários sistemas de adesão. 1993). Primeiro. . fibronectina e laminina.31). com UDP-[3H] galactose. Essa degradação controlada de moléculas da matriz extracelular é completada por um conjunto de enzimas coletivamente chamadas de Metaloproteinases degradativas de matrizes (Matrisian. Carson et al. enquanto outras são secretadas diretamente pelas células para dentro da matriz que será dissolvida. A ativação dos genes das metaloproteinases é realizada coordenativamente. eles “digerem” seu caminho através do epitélio do útero e através de sua membrana basal de laminina. Shur. Se o açúcar ativado está presente em pequenas quantidades. Logo após a ativação das metaloproteinases. II e III. Adesão diferencial resultante de sistemas de adesão múltipla Apesar de estarmos discutindo sistemas de adesão como unidades separadas.1987. os processos morfogenéticos de interação célula-célula são provavelmente realizados por combinações de moléculas de adesão celular. Algumas dessas enzimas estão ligadas à membrana celular. 1989). A produção e degradação controlada da matriz extracelular é parte essencial do desenvolvimento normal. 1976. Quando o segundo substrato aparece. 1992. (C) Marcação da glicosiltransferase da superfície celular... a migração é permitida.

A via JAK-STAT é muito importante na diferenciação de células sangüíneas e na ativação do gene de caseína na produção de leite (Briscoe et al. a JAK. O receptor ativo pode agora catalizar reações que fosforilam outras proteínas. e finalmente. antes dormente. Nesses casos.) Moléculas de receptores e vias de transdução de sinais Os destinos das células são freqüentemente determinados pelas interações em suas superfícies. Uroquinase é um ativador de plasminogênio. ainda. Proteínas JAK estão ligadas a cada um dos receptores (em suas respectivas regiões citoplasmáticas). . Groner e Gouilleux. Mas como que certas interações na superfície da célula causam a transcrição de genes específicos dentro do núcleo? As vias entre a membrana celular e o genoma são chamadas vias de transdução de sinais. elas parecem ser variações de um mesmo tema. que pode usar ATP para fosforilar proteínas. induzindo sua dimerização..31 Cascata de ativação de metaloproteinases de membrana. Se o sinal vem de células vizinhas difundindo-se de uma para outra é chamado parácrino. O ligante iniciador da reação pode estar ligado a uma célula ou matriz extracelular ou. onde uma molécula de receptor encontra seu ligante complementar. que cliva o plasminogênio dando plasmina. 1995). As STATs são fosforiladas pela forma ativa da uma família de quinases. 1996). JAK-STA A via JAK-STAT No Capítulo 2 discutimos um conjunto de fatores de transcrição inativos até que um sinal de outra célula produz sua fosforilação. Os receptores ativados têm agora sua própria atividade quinásica e podem fosforilar certos STATs inativos.32). ser uma molécula difusível. aqui serão mencionadas as principais. a fosforilação ativa um fator de transcrição. Várias vias foram descobertas. Esse fator de transcrição pode agora ativar (ou reprimir) um novo conjunto de genes. e agora ao serem aproximadas fosforilam o receptor em vários sítios. Como veremos. uma região transmembrana e uma região citoplasmática.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 107 Procolagenase Plasminogênio Ativação transcricional Uroquinase Plasmina Colagenase Ativa Estromelisina Colagenase muito ativa Prostromelisina Figura 3. fazendo com que esse se dimerize (que forme dímeros) (Figura 3. (Conforme Matrisian. Os dímeros são a forma ativa dos STAT que são translocados para o núcleo onde se ligam às regiões específicas do DNA. Quando a molécula difusível vem do sangue é considerada um sinal endócrino. Essa atividade é usualmente a de uma quinase. O tema é deveras elegante: cada receptor se estende através da membrana tendo uma região extracelular. 1992. um certo fator de diferenciação se liga a seus receptores membrana-abrangente. Quando um ligante é acoplado na região extracelular. Esses fatores de transcrição são as proteínas STAT (transdutores de sinais e ativadores de transcrição) (Ihle. Plasmina ativa as formas precursoras de estromelisinas e colagenases produzindo uma mistura de enzimas muito ativa capaz de digerir matrizes extracelulares. inclusive a si mesmo. sua forma muda e a porção citoplasmática passa a ter atividade enzimática. 1994.1995.

as proteínas JAK fosforilam umas as outras e os receptores vizinhos. O receptor tirosina quinase abrange a membrana e. sofre uma mudança conformacional que permite sua dimerização. vulvas de nematódeos e cânceres humanos chegaram à conclusão que estudavam o mesmo gene. Assim. Após a transmissão.108 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Figura 3. OCT1 um fator de transcrição geral. Quando os receptores são dimerizados. GR é o glucocorticóide receptor. Enquanto ligada ao receptor fosforilado pelo seu domínio SH2.32 Receptores de prolactina Prolactina A via JAK-STAT— nesse caso. onde o receptor tirosina quinase liga seu ligante específico. veja Groner e Gouilleux. Essa catálise é muito estimulada . A via RTK-Ras começa na superfície celular. Pesquisadores estudando olhos de Drosophila. 1995. Em combinações com outros fatores de transcrição (que presumivelmente esperavam sua chegada). Essa catálise é ajudada pelo fator de troca guanina nucleotídeo. (Para detalhes. A tirosina fosforilada no receptor é reconhecida por uma proteína adaptiva (Figura 3. As proteínas adptativas servem como uma ponte que liga a quinase fosforilada do receptor a um poderoso sistema intracelular de sinalização. e TBP o conjunto de proteínas responsável pela ligação de RNA polimerase. a proteína STAT ativa a transcrição do gene de caseína. ativada por mudança conformacional fazendo com que os receptores se fosforilem um ao outro em resíduos particulares de tirosina. a introdução de um ligante no receptor causa uma autofosforilação no domínio citoplasmático do receptor. ativando a quinase dormente desses receptores. a proteína de tipo selvagem Ras está na sua forma inativa e ligante de GDP. O gene de caseína é ativado durante a última fase do desenvolvimento da glândula mamária (lactogênica) e seu sinal é a secreção de prolactina.33)—especificamente. as tirosinas fosforiladas são reconhecidas por uma porção da proteína adaptativa chamada domínio SH2. Uma proteína JAK específica (Jak2) está “atrelada” nesses receptores. fatores de crescimento epidérmico e fatores de crescimento derivados de plaquetas. Isso permite que a proteína se dimerize e seja translocada para o núcleo onde se liga a regiões específicas de DNA. A Ras ligada a GTP é a forma ativa da proteína que transmite o sinal. a proteína adaptativa usa seu domínio SH3 para regular o ativador de uma proteína Ras G.) Receptores dimerizados ativos Extracelular Citoplasma Envoltório nuclear Núcleo Inicio da transcrição Promotor do gene de caseína -Ras RTK-R A via RTK-Ras A via de transdução de sinais RTK-Ras foi uma das primeiras vias a unir as várias áreas da biologia do desenvolvimento. quando conectado com seu ligante. ela troca um fosfato de outro GTP para transformar o GDP ligado em GTP. o GTP é hidrolizado a GDP. Normalmente. Ligantes que se ligam a RTKs incluem fatores de crescimento fibroblásticos. Esses dímeros têm uma atividade quinásica latente. Esses adicionam um grupo fosfato a um resíduo de tirosina (Y) de uma proteína STAT específica (nesse caso Stat5). um peptídeo de 9 aminoácidos da glândula pituitária anterior. Quando ativada pelo receptor ligante-acoplado. a via de ativação do gene de caseína por prolactina. Prolactina causa a dimerização dos receptores de prolactina nas células epiteliais do ducto mamário.

Como veremos mais tarde neste livro. Stokoe et al. incluindo acondroplasia. por exemplo. essa via é reforçada pela liberação de íons cálcio. fosforilando certos fatores de transcrição (que podem penetrar no núcleo para mudar os tipos de genes transcritos) e certos fatores de tradução (que alteram o nível de síntese de proteínas). mas atualmente é considerada como um conjunto maior de fatores de transcrição). Núcleo Modulação da transcrição pela complexação normal da proteína Ras à proteína ativadora de GTP-ase (GAP).. as proteínas GAP estimulam a hidrólise dessa ligação fosfato. A deficiência reside na proliferação mínima da cartilagem da placa de crescimento dos ossos longos. 1982). e retorna a Ras à sua forma inativa (Trahey e McCormick. Em muitos casos. O receptor tirosina quinase é dimerizado pelo ligante. mutações nessa via dão origem às formas mais comuns de nanismo. A proteína SH3 reconhece as fosfotirosinas e ativa as proteínas intermediárias (GRB2 e SOS). McCormick. (MAP quer dizer proteína associada à mitose.000 nascimentos. 1992). Sem a proteína GAP. 1988. Em humanos. Essa última quinase fosforila os fatores de transcrição que especificam o destino da célula ou a proliferação.. 1987. A lesão genética parece estar no gene que . Isso causa a autofosforilação do receptor. Ao mesmo tempo.1989). 1988).. essa via é crítica em numerosos processos desenvolvimentais.. considera-se que a cascata ativa o fator de transcrição Sina (Sevenless-in-Absentia). Aqui. a proteína Ras não catalisa eficientemente a hidrólise de GTP permanecendo em sua configuração ativa (Cales et al. Gibbs et al. o tórax e a cabeça crescem normalmente. e as mutações que tornam o gene oncogênico inibem a ligação da proteína GAP. as quais ativam a proteína Ras G por permitir a fosforilação da porção GDP da Ras. A MAPKKK fosforila a MAPKK que. Dickson et al. A proteína Ras coloca a proteína inativa Raf na membrana celular onde ela se torna ativa (Leevers et al.1994. que ocorre em 1 entre 50. pode fosforilar a MAP quinase. cuja presença é necessária para a diferenciação do fotorreceptor 7 (Carthew e Rubin. Realmente. mas os braços e as pernas são encurtados proximalmente. Por fim. que ao seu turno fosforila uma série de quinases. A proteína Raf é chamada MAP-quinase-quinase-quinase (MAPKKK).33 Ativação de eventos dependentes de cálcio e PKC Fator de transcrição ativo Fator de transcrição inativo A via RTK-Ras amplamente usada. por sua vez.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 109 Ligante Extracelular Citoplasma Receptor Figura 3. 1994). mutações no gene RAS estão relacionadas com uma grande proporção de tumores humanos (Shih e Weinberg. A Ras ativa é capaz de ativar a proteína quinase C (PKC). A proteína Ras ativa associa-se com uma quinase chamada Raf. Em olhos de Drosophila. a MAP quinase altera a expressão gênica.. Essa proteína de 120-kDa aumenta a atividade hidrolizante de GTP mais de 100 vezes. 1990.

e alguns “fatores de transcrição” podem ser utilizados para inibir a transcrição. Proteínas celulares não respeitam nossas fronteiras disciplinares. mesmo com um parceiro do tipo selvagem. 1994. Webster e Donoghue. FGFR normal: FGF se liga causando dimerização do receptor de FGF (B) FGFR dominante negativo Receptor de FGF FGFR normal FGFR mutante Domínio da tirosina quinase Sinal Receptores sem domínios intracelulares são inativos Sem sinal Excesso do receptor mutante pode seqüestrar o receptor normal do fator de crescimento. 1996).19. Os receptores FGF ativos. Esse heterodímero é inativo.34). Sem sinal Figura 3. quando presente em concentrações suficientemente altas. Rousseau et al. o receptor mutante compete com receptores FGF normais impedindo que suas proteínas sejam ativadas. Quando liga FGF. Aqui vemos que moléculas de adesão celular podem ser usadas para transdução de sinais. o efeito de FGF não é transmitido à célula. em um caso.110 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento codifica o receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3) (Figura 9. Quando fosforilados. Esse tipo de experimento será bem sucedido se a dimerização for crítica para a função do receptor. Quando ativado por um FGF. Portanto. . Amaya e colaboradores (1991) injetaram mRNA de uma forma mutante de um receptor FGF em embriões de duas células de Xenopus. mesmo se o outro parceiro é do tipo selvagem. Informações adicionais & (A) FGF Especulações Mutações negativas dominantes em receptores O significado funcional de uma molécula ligante pode ser verificado eliminando seu receptor. 1994). acionam um sinal através do citoplasma.html] * Nomes podem ser perigosamente ilusivos...34 Ensaio para receptor dominante negativo para a importância de um determinado receptor. O mutante dominante negativo não formará um dímero ativo. alguns fatores de transcrição podem ser usados para regular a tradução. O receptor de FGF (FGFR) é uma RTK transmembrana. Esse gene é expresso nas células da cartilagem em desenvolvimento na placa de crescimento dos ossos longos. As mutações nesse gene causam um fenótipo de ganho de função onde o mutante FGFR3 é ativo constitutivamente (isto é. esses se dimerizam e seus dois domínios de proteína quinase se fosforilam mutuamente. Uma maneira de fazer isso é criando mutações dominantes negativas de receptores. Realmente. Certos “fatores de crescimento” podem inibir o crescimento. Isso pode ocorrer em mutações naturais ou provocadas. Assim. Essas blástulas não conseguem responder ao FGF (Figura 3. o FGFR3 sinaliza o condrócito para parar de dividir e começar a diferenciação. e o que fazem depende do contexto da célula. Muitos compostos têm mais de uma função na célula. 1996. são dímeros de duas moléculas idênticas embebidas na membrana celular. Shiang et al. (A) Quando dímeros de FGF se ligam à porção extracelular desses receptores. Nesse experimento. produz um dímero inativo. [cell7. sem a necessidade de ser ativado por um FGF)* (Deng et al. (B) O receptor dominante negativo não tem o domínio da proteína quinase. embriões que não tinham receptores FGF funcionais tinham mesoderma posterior e lateral dramaticamente reduzido (Prancha 3)..

(A) A reação de fosfolipase C. Essas subunidades ativam enzimas fosfolipase C (PLC) que podem catalizar a formação de DAG e IP3. a via pode ser ativada pela via RTK. assim levando a um aumento do pH. Essa via é extremamente importante na ativação do espermatozóide e do óvulo.CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 111 A via do inositol fosfato Algumas vezes. DAG (em presença dos íons cálcio liberados) ativa a proteína quinase C. EGF. (B) Essa reação pode ser iniciada em dois pontos principais na membrana celular. etc). (B) RECEPTORES LIGADOS À PROTEÍNA G RECEPTORES LIGADOS À TIROSINA QUINASE (PDGF. que alterações na expressão do gene constituem somente um pequeno subconjunto do que faz o sinal. Neste ínterim.35 (A) Extracelular Fosfolipase C Citoplasma A via do inositol fosfato. A proteína quinase estimula o transportador sódio/hidrogênio a trocar íons hidrogênio celulares por íons sódio extracelulares. a via é iniciada quando o receptor transmembrana ligado à proteína G é ativado pela introdução do ligante. A ativação da via do inositol fosfato promove mudanças drásticas na fisiologia da célula pela liberação de íons cálcio do retículo endoplasmático. Ligante Ligante Extracelular Citoplasma Proteína G Via IP 3 PATHWAY PKC Atividade celular e mitogênese MAP quinase Receptor IP 3 Retículo endoplasmático . ambos necessitando de um aumento na concentração intracelular de íons cálcio. Em segundo lugar. transformando PIP2 em DAG e IP3. IP3 pode se ligar a um receptor para liberar íons cálcio do retículo endoplasmático. Figura 3. Essa ativação resulta na ligação de GTP à proteína heteromérica G e sua dissociação em subunidades ativas. a transdução de um sinal da superfície celular causa tantas mudanças. Primeiro.

Um ponto de iniciação é o receptor tirosina quinase. a presença de integrina ligada previne a ativação de genes que especificam a morte celular (Brooks et al. c-Fos. Na verdade. Um segundo ponto de iniciação é outra classe de receptores. Isso ativa a cascata Ras. Essa ativação dissocia a proteína G em suas subunidades. Estudos recentes mostraram que a ligação de integrinas à matriz extracelular . A matriz extracelular e a superfície da célula como fontes de sinais críticos para o desenvolvimento Bissell e colegas (1982. Portanto. Nishizuka.35.. é produzido pela ligação do receptor da célula T ao antígeno (Figura 3. Montgomery et al. finalmente produzindo c-Jun. fosfolipase C (PLC1-y1. O resultado é a elevação de íons intracelulares de cálcio e um aumento no pH intracelular. 1994). onde dois sinais são necessários.112 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento A via pode ter dois pontos iniciais (Figura 3. Cruzamentos entre vias Representamos as vias principais como se fossem cadeias lineares. algumas vezes chamado de receptores serpentina. liberando uma grande quantidade de íons cálcio no citoplasma. um fator de transcrição que se liga ao intensificador de IL-2 e ativa sua expressão (Liet al. 1993. ou seja. Essa comunicação cruzada pode ser vista na Figura 3. Shilling et al.. Em alguns casos.. pois entre elas existem ruas e avenidas que fazem as conexões entre elas. a matriz extracelular é uma fonte importante de sinais que podem ser transduzidos para o núcleo para dar expressão gênica específica. esse ativa a proteína G. 1995) propuseram que a matriz extracelular é capaz de induzir expressão gênica específica em tecidos em desenvolvimento. alteram não somente a transcrição de genes. Fosfolipase C pode catalisar a hidrólise de fosfatidilinositol 4. podem produzir a proteína AP-1. c-Fos e c-Jun. as quais ativam outro conjunto de fosfolipase C. 1986. cada um produzindo um dos dois peptídeos de um fator de transcrição envolvido na produção de interleucina 2 (IL-2. Isso é visto durante o desenvolvimento de linfócitos. Esse sinal ativa uma segunda cascata de quinases. as mudanças nos íons hidrogênio e cálcio. Streuli et al. PLC-β1 e PLC-β2. 1986). 1991.4. Cada passo é um ponto de regulação em potencial e um potencial ponto de interseção). Elk-1.1996).. Martins-Green e Bissell. a proteína G heteromérica. onde a informação flui em conduítes únicos. Como veremos em capítulos posteriores. ativador do gene c-fos que sintetiza c-Fos. onde a indução de fatores de transcrição específicos dependem da ligação célula-substrato (Liu et al.4. também conhecida como fator de crescimento da célula T). Berridge. essas vias são apenas as principais estradas pelas quais se escoa a informação. DAG ativa a proteína quinase C. mas também a tradução de mRNA e a replicação de DNA. que por sua vez ativa a bomba de proteína que troca íons sódio por íons hidrogênio (Swann e Whitaker. as tirosina quinases ativadas podem interagir com um tipo de enzima.5-trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). Deve-se lembrar também que a célula tem numerosos receptores e está constantemente recebendo muitos sinais simultaneamente. 1991. mencionado anteriormente. Muitas vezes.5-trifosfato e diacilglicerol. especialmente aqueles do fígado e da glândula mamária. Um fator.36). O segundo sinal vem da glicoproteína B7 na superfície da célula que apresenta o antígeno. IP3 é capaz de abrir canais de cálcio do retículo endoplasmático.35. que também tem um domínio SH2 que reconhece as tirosinas autofosforiladas). 1994.. onde duas vias reforçam uma a outra. a transcrição de genes requer dois sinais. Os dois peptídeos. Esses receptores estão relacionados com outro tipo de proteína G. Quando o ligante liga-se ao seu receptor. Esses dois tipos de fosfolipase C podem clivar PIP2 em inositol 1. criando um fator de transcrição. porque têm sete domínios transmembrana e “serpenteiam” através da membrana. 1994).5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1. Notenboom et al. 1996). (Essa pode ser a razão da existência de tantos passos entre a superfície da célula e o núcleo. Além de ativar a proteína Ras G.. efetuadas por essa via.

CAPÍTULO 3 A base celular da morfogênese 113 CÉLULA APRESENTADORA DO ANTÍGENO SINAL 1 Citoplasma SINAL 2 MHC II Antígeno Receptor da célula T B7 CD28 Extracelular Citoplasma RAF T-LINFÓCITO ELK-1 ativa transcrição de c-fos Intensificador de interleucina 2 Fator de transcrição AP-1 Núcleo Transcrição de IL-2 Figura 3. N-CAM e caderinas de uma célula vizinha (Bixby et al. O segundo sinal vem da ligação da proteína CD28 à proteína B7 que está na superfície da célula apresentante do antígeno. As duas subunidades. Interações recíprocas na superfície celular Quando duas células interagem durante o desenvolvimento. Caderinas (mesmo as solúveis) podem dimerizar receptores FGF exatamente como os ligantes normais de FGF.. pode estimular a via RTK-Ras. 1994b. 1995). ativação transcricional e fenômenos de desenvolvimento característicos das respostas do FGF celular (Figura 3. 1994. Comunicação cruzada é quase certa acontecer quando as moléculas de adesão celular são também transdutores de sinais.. Doherty et al. O primeiro sinal dirige a síntese de uma subunidade do fator de transcrição AP-1. formam o fator de transcrição AP-1 que pode ativar intensificadores específicos para a célula T como os que regulam a produção de interleucina 2. como também pode estimular a interação da célula com o L1. Williams et al. A outra subunidade é sintetizada sob direção do segundo sinal. 1995). O primeiro sinal vem de receptores que ligam o antígeno apresentado na superfície das células B ou macrófagos. c-fos e c-jun. Essa indução recíproca é mediada por interações na membrana . causando a liberação de íons cálcio. ambas são modificadas na maioria das vezes..37. Williams et al.. 1994a. Clark e Brugge.36 Dois sinais são necessários para efetuar a diferenciação de linfócitos T.

veremos com mais detalhes essas interações morfogenéticas. . Niswander et al. duas células (ou grupo de células) são adjacentes. Estudos recentes mostraram que essa ordenação é devida às moléculas na superfície dessas células. [cell8. ou “ligações cruzadas” de receptores de FGF das membranas celulares opostas podem ativar seus domínios quinase. O peptídeo age na célula vizinha ocasionando a produção da proteína Wingless (Wnt). Essas incluem adesão diferencial de uma célula a outras. 1994.37 Possíveis interações de moléculas de adesão celular com receptores de FGF. por sua vez. enquanto o tecido no outro lado produz Wingless. como também. Estamos agora no estágio onde podemos iniciar o estudo da embriogênese precoce e ver a integração entre os processos orgânicos. celular.html] A superfície celular é um lugar extremamente importante para interações desenvolvimentais. genéticos e celulares no desenvolvimento animal. O resultado é a estabilização de uma borda onde o tecido em um lado secreta proteína Hedgehog. 1995). subdivisões cerebrais e membros em mamíferos (Figura 3. Esse elemento podia imaginar que o corpo era formado por uma miríade de “pequenos corpos sensíveis” que se juntavam para formar um agregado. Nessa via. a adesão diferencial de um tipo de célula a uma matriz extracelular e a comunicação de sinais para a diferenciação e divisão celulares. Os receptores FGF podem ser “seqüestrados” pelas moléculas de adesão e colocados juntos. é também secretada e se liga à célula vizinha. o ensaista francês Denis Diderot pôs a questão da morfogênese no sonho febril de um físico. Isso pode ser feito pela interação de moléculas de adesão opostas. Essa borda é crítica na produção de segmentos e apêndices em Drosophila. A proteína Wingless..114 PARTE I Introdução à Biologia do Desenvolvimento Citoplasma Molécula de adesão celular Receptor FGF Extracelular Citoplasma Sinal Figura 3.38. mas ele não podia imaginar como esse agregado poderia se tornar um animal. estimulando-a a continuar a síntese de Hedgehog. Uma via intensamente usada é o sistema Wingless-Hedgehog. Ingham. Wilder e Perrimon. 1994. Em capítulos subseqüentes. Em 1782. uma delas produz a proteína Hedgehog e a secreta.

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Padrões de Desenvolvimento 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 5 Clivagem: Criando multicelularidade 121 167 209 II 253 341 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 7 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 8 Especificidade axônica 307 9 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma .

.

fecundar um óvulo. significando “animais do esperma”). Embora os detalhes da fecundação variem de espécie para espécie. Saindo da obscuridade iguais opostos avançam. portanto. porém. O óvulo ativa o metabolismo do espermatozóide que é essencial para a fecundação. o microbiologista holandês que co-descobriu o espermatozóide em 1678. Sempre substância e aumento. sempre distinção. isso assegura que o espermatozóide e o óvulo sejam da mesma espécie. Estrutura dos gametas Existe um diálogo complexo entre óvulo e espermatozóide. 1871) (gametas) se fundem para criar um novo indivíduo com potenciais genéticos derivados dos dois genitores. Sempre uma criação de vida. em última análise. Isso é geralmente conseguido com a permissão de somente um espermatozóide entrar no óvulo e a inibição da entrada de qualquer outro. • Regulação da entrada do espermatozóide para o interior do óvulo. sejam elas cômicas ou trágicas.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 121 Fertilização: Iniciando um novo organismo 4 Desejo e desejo e desejo Sempre o desejo procriativo do mundo. e o espermatozóide retorna a mensagem ativando o metabolismo do óvulo necessário para o início do desenvolvimento. • Ativação do metabolismo do ovo para começar o desenvolvimento. Espermatozóide Foi somente no século XIX que o papel do espermatozóide na fertilização tornou-se conhecido. e a segunda é a de iniciar no citoplasma do ovo aquelas reações que permitem o desenvolvimento. acreditou inicialmente que ele continha animais parasitas vivendo em seu interior (daí o termo espermatozóides. sempre sexo. Ele se volta para nada menos que a composição da próxima geração. Anton van Leeuwenhoek. realiza duas atividades separadas: sexo (a combinação de genes derivados dos dois pais) e a reprodução (criação de novos organismos). temos que considerar as estruturas do espermatozóide e do óvulo – dois tipos de células especializadas para a fertilização. A fecundação. é na realidade mais importante que todas as outras finalidades na vida humana. DARWIN. em geral. WALT WHITMAN (1855) F ERTILIZAÇÃO (FECUNDAÇÃO) é o processo pelo qual duas células sexuais O objetivo final de todas as intrigas amorosas. Somente um espermatozóide pode. Leeuwenhoek (1685) escreveu que 121 . • Fusão do material genético do espermatozóide e do óvulo. a primeira função da fecundação é a de transmitir genes dos pais para a prole. Sempre uma tessitura de identidade. Porém. Na maioria dos casos. Assumiu originalmente que esses nada tinham a haver com a reprodução do organismo onde se encontravam. posteriormente chegou a acreditar que cada espermatozóide continha um embrião pré-formado. A SCHOPENHAUER (CITADO POR C. os eventos da concepção consistem. de quatro atividades principais: • Contato e reconhecimento entre espermatozóide e óvulo. Assim. antes de investigar esses aspectos da fecundação.

Prevost e J. mas sim os agentes ativos da fertilização. Hertwig procurou um organismo adequado para observações microscópicas detalhadas e descobriu que o ouriço-do-mar Mediterrâneo. desenhou uma figura do que pretendia encontrar: um ser humano pré-formado (“homúnculo”) dentro do espermatozóide (Figura 4. Na parte frontal desse núcleo haplóide comprimido está a vesícula acrossômica. Somente em 1876. Nicolas Hartsoeker. Eles propuseram que o espermatozóide penetra o óvulo e contribui materialmente para a geração seguinte.1). ele estava voltando a uma noção da procriação enunciada por Aristóteles 2000 anos antes. pode . A fertilização estava finalmente reconhecida como a união de espermatozóide e óvulo. que os “animais espermáticos” eram parasitas. contendo enzimas que digerem proteínas e açúcares complexos. von Kolliker descreveu a formação do espermatozóide a partir de células contidas em testículos adultos. [fert2. Acreditava que o espermatozóide excitava o desenvolvimento do óvulo de maneira semelhante aquela pela qual o ímã comunica sua presença ao ferro. J. os convenceram que “existe uma íntima relação entre sua presença nos órgãos e a capacidade fecundadora do animal”. livre de espermatozóide. acopladas à conhecida ausência de espermatozóides na mula estéril. o outro co-descobridor do espermatozóide.2). um sistema de propulsão para movimentar o núcleo. Leeuwenhoek era continuamente desapontado em suas tentativas de achar um embrião pré-formado nos espermatozóides. A maioria dos investigadores consideravam o espermatozóide como sem importância (Veja Pinto-Correia. Notou também que apenas um espermatozóide era visto penetrar em cada óvulo e que todos os núcleos do embrião derivavam dos núcleos fundidos por ocasião da fertilização. o núcleo haplóide se torna muito aerodinâmico e seu DNA altamente comprimido. Fol fez observações semelhantes e detalhou o mecanismo de penetração do espermatozóide. Toxopneustes lividus. nunca recebeu muita aceitação. L.122 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. Spallanzani demonstrou que sêmen filtrado de rã. era perfeito para isso. não fecundava óvulos. Dumas afirmaram que os espermatozóides não eram parasitas. mesmo sob alto aumento. Após misturar espermatozóide e óvulo em suspensões. Essas observações. e não o espermatozóide. também. A combinação das melhores lentes de microscópio e da teoria celular. Em 1924. e que a fêmea meramente proporcionava o solo nutriente no qual as sementes eram plantadas. por isso. Kolliker ridicularizou a idéia que o sêmen poderia ser normal e ainda assim tolerar a presença de um número enorme de parasitas.1 A criança humana pré-formada no espermatozóide. porque implicava num enorme desperdício de vida em potencial. negou que haveria qualquer contato físico entre espermatozóide e óvulo. porém. Sob esse aspecto.html] Cada espermatozóide consiste de um núcleo haplóide. B. [fert1. conforme representada por Nicolas Hartsoeker (1964). Por mais que tentasse. Essa crença de que o espermatozóide continha um organismo embrionário inteiro. Notaram a existência universal de espermatozóides em machos sexualmente maduros e sua ausência em indivíduos imaturos ou idosos. era o agente da fertilização. Durante o transcorrer do amadurecimento. que o fluido viscoso retido pelo papel de filtro. espermatozóides eram sementes (tanto sperma como sêmen significam “semente”). e a união dos gametas do ouriço-do-mar permanece como um dos exemplos de fertilização melhor estudado. Essas assertivas não foram em geral levadas em consideração até a década de 1840. Mas ainda assim. derivada do aparelho de Golgi. Não somente era freqüente na região e sexualmente maduro a maior parte do ano. e um saco de enzimas que permitem a entrada do núcleo no óvulo. levaram a uma reapreciação da função espermática. deixando somente certas organelas modificadas para exercer a função espermática (Figura 4. demonstraram a entrada do espermatozóide no óvulo e a união de seus núcleos. A maior parte do citoplasma do espermatozóide é eliminada durante o amadurecimento. Ele acreditava. como seus óvulos eram abundantes e transparentes. 1997. para detalhes sobre essa extraordinária história). independentemente. Oscar Hertwig e Hermann Fol. Hertwig repetidas vezes observou o espermatozóide entrando no óvulo e viu a união dos núcleos dessas células. quando A.html] A primeira evidência sugerindo a importância do espermatozóide na reprodução veio de uma série de experimentos realizados por Lazzaro Spallannzani em fins de 1700. Concluiu.

os quais consistem exclusivamente da proteína dimérica. Um axonema é formado pelos microtúbulos que emanam do centríolo na base do núcleo do espermatozóide (Figuras 4. Essas enzimas armazenadas são usadas para lisar os invólucros externos do óvulo.2 e 4. e o aparelho de Golgi forma a vesícula acrossômica na futura extremidade anterior. (Segundo Clermont e Leblond. Os flagelos são estruturas complexas. a tubulina. A dineína hidrolisa moléculas de ATP e pode converter a energia química liberada em Golgi remanescente Centríolo Flagelo Centríolo Flagelo Vesícula acrossômica e grânulo Núcleo Mitocôndrias Cauda Microtúbulos Porção final Aparelho de Golgi Mitocôndrias Figura 4. o outro tem forma de C e tem apenas 11 protofilamentos (Figura 4. Juntos.3). Em algumas espécies (como o nematelminto parasitário Ascaris).CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 123 ser considerado como uma vesícula secretória modificada. A sua principal porção motora é chamada axonema.3B). O tamanho do espermatozóide maduro foi aumentado em relação às outras figuras. Aqui vemos os 13 protofilamentos interligados.) . Os meios pelos quais o espermatozóide é impulsionado variam de acordo com o modo pelo qual a espécie se adaptou às condições ambientais. Um modelo tridimensional de um microtúbulo completo está apresentado na Figura 4. O citoplasma remanescente é descartado e o núcleo se condensa. Essas proteínas são usadas para estender um processo de forma semelhante a um dedo durante os estágios precoces da fertilização. porém. A força para a propulsão do espermatozóide é proporcionada pela dineína. o reconhecimento mútuo entre espermatozóide e óvulo envolve moléculas desse processo acrossômico. Em muitas espécies. Na maioria das espécies. um espermatozóide é capaz de viajar por longas distâncias agitando o seu flagelo. O centríolo produz um longo flagelo na parte que virá a ser a extremidade posterior do espermatozóide. Em ouriços-do-mar e várias outras espécies. existe uma região de moléculas globulares de actina entre o núcleo e a vesícula acrossômica. contendo 13 protofilamentos. o acrossomo e o núcleo constituem a cabeça do espermatozóide.3C.2 Axonema Mitocôndrias Centríolo Núcleo Membrana plasmática Vesícula acrossômica Porção mediana Pescoço Cabeça do espermatozóide A modificação de uma célula germinativa para formar um espermatozóide de mamífero. O centro do axonema consiste de dois túbulos centrais rodeados por uma fileira de nove duplas de microtúbulos. 1955.3B). Embora a tubulina seja a base da estrutura do flagelo. tais como os ouriços-do-mar. só um microtúbulo está completo. o espermatozóide viaja por movimentação amebóide de extensões lamelipodiais da membrana celular. Realmente. outras proteínas também são críticas para a função do flagelo. As mitocôndrias (pontos abertos) agrupam-se ao redor do flagelo perto da base do núcleo haplóide e são incorporadas na parte mediana do espermatozóide. uma proteína apensa aos microtúbulos (Figura 4.

Esses indivíduos não têm dineína em suas células ciliadas e flageladas. cortesia dos autores. 1976). As subunidades α-tubulina e β-tubulina são semelhantes. Machos com essa doença são estéreis (espermatozóide imóvel). e o microtúbulo pode mudar de tamanho polimerizando e despolimerizando subunidades de tubulina em qualquer um dos lados. A energia para mover o flagelo e assim impulsionar o espermatozóide vem dos anéis de mitocôndrias localizadas na região do pescoço do espermatozóide (veja Figura 4. porém. 1975.. (A) Seção transversal do flagelo de um espermatozóide mamífero. Phillips. susceptíveis à infeções brônquicas (cílios respiratórios imóveis).) (A) (C) (B) Membrana plasmática Trave radial Cabeça da trave Nexina Subfibra A Subfibra B Microtúbulo central MICROTÚBULO DUPLO Braço interno de dineína Braço externo de dineína AXONEMA energia mecânica que propulsiona o espermatozóide. C de Amos e Klug. A segunda (“B”) porção da dupla contém somente 11 (ocasionalmente 10) protofilamentos. não idênticas. e Tilney et al. 1973. e têm 50 porcento de probabilidade de ter o coração do lado direito de seu corpo (Afzelius. O diagrama esquemático mostra a associação de protofilamentos de tubulina em um microtúbulo duplo. mostraram que essa mesma proteína estabiliza os microtúbulos flagelados impedindo seu espalhamento.. (C) Um modelo tridimensional do microtúbulo “A”. (A cortesia de D. Essa proteína é geralmente vista dentro do núcleo. Como sua espessura diminui na direção apical. M. O arranjo “9 + 2” dos microtúbulos com os braços de dineína foi conservado nos axonemas em todo o reino eucarioto. mostrando o arranjo “9 + 2” dos microtúbulos e outros componentes flagelares. Essa energia pemite o deslizamento ativo das duplas externas de microtúbulos. Em muitas espécies (notavelmente mamíferos) uma densa camada de fibras se interpôs entre a bainha mitocondrial e o axonema.3 O aparelho de movimentação do espermatozóide. Asai. onde dobra e aperta a cromatina em agregados. (B) Diagrama interpretativo do axonema. 1977. 1996).2). sugerindo que é extremamente adequado na transmissão de energia para a movimentação. Multigner e colaboradores (1992). Outra importante proteína flagelar parece ser a histona H1.. as fibras provavelmente previnem que a cabeça . levando o flagelo a se curvar (Ogawa et al. 1974. A primeira (“A”) porção do par duplo é um microtúbulo normal compreendendo 13 protofilamentos.124 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. mostrando o axonema central e as fibras externas. A importância da dineína pode ser avaliada em indivíduos com a síndrome genética chamada de tríade de Kartagener. B segundo De Robertis et al. No entanto. Essa camada fibrosa enrijece a cauda do espermatozóide. o que as torna estruturas imóveis.

mas continua a acumulá-lo ativamente. Enquanto o espermatozóide eliminou a maior parte do seu citoplasma. ocorre um surto de síntese protéica pouco após a fecundação. O volume do óvulo do ouriço-do-mar é de aproximadamente 2 x 10-4 µm3. Assim. Após sua expulsão para a luz dos túbulos seminíferos. O óvulo Todo o material necessário para o começo do crescimento e desenvolvimento tem que estar armazenado no óvulo maduro.4 mostra seus tamanhos relativos. Porém. A representação do óvulo do ouriço-do-mar e do espermatozóide na Figura 4. Assim. Mesmo óvulos com gema relativamente esparsa são comparativamente grandes.000 vezes aquele do espermatozóide. Na maioria dos organismos. o óvulo em desenvolvimento (chamado de oócito antes de tornar-se haplóide) não somente conserva seu material. que atuam como reservatórios de alimento para o embrião em desenvolvimento. Em muitas espécies isso é conseguido pelo acúmulo de proteínas na gema do ovo. mas ainda não têm a capacidade de se ligar ao óvulo e fertilizá-lo. As células embrionárias precoces precisam de um certo suprimento armazenável de energia e aminoácidos. esse mRNA permanece dormente até após a fertilização (veja Capítulo 12). • Fatores morfogenéticos. • Ribossomos e tRNA. enquanto o espermatozóide e o óvulo têm componentes nucleares haplóides iguais. os espermatozóides são armazenados no epidídimo. Parecem estar localizadas em diferentes regiões do óvulo e se segregam em células diferentes durante a clivagem (veja Capítulo 13). assim como de alterações da membrana plasmática que permitem que ela se torne mais fluida (Yanagimachi. quando discutirmos a diferenciação das células germinativas. as mensagens para proteínas sintetizadas durante o desenvolvimento inicial já estão acondicionadas no oócito. Assim. Esses estágios finais do amadurecimento espermático (chamado capacitação) não ocorrem antes do espermatozóide ter permanecido no interior do trato reprodutivo feminino durante um certo tempo.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 125 do espermatozóide balance abruptamente. A síntese protéica é conseguida pelos ribossomos e tRNA. Os espermatozóides liberados durante a ejaculação podem se mover. • RNA mensageiro. RNAs. como a gema. Será longo o período a transcorrer antes do embrião ser capaz de se alimentar ou obter alimento de sua mãe. onde adquirem a capacidade de se mover. 1994). O embrião precoce precisa produzir muitas de suas próprias proteínas. corpo gorduroso) e viajam através do sangue materno para o ovo. mais de 10. gametas femininos das aves são enormes células singulares que se tornaram entumecidas pela acumulação de gema. Entretanto. a diferenciação do espermatozóide não se completa nos testículos.000 a 50. A síntese e a colocação desses materiais será tratada no Capítulo 22. * Os conteúdos do óvulo variam muito de espécie para espécie. Muitas proteínas da gema são sintetizadas em outros órgãos (fígado. Estima-se que os óvulos do ouriço-do-mar contêm de 25.000 tipos diferentes de mRNA. e certos oócitos de anfíbios produzem até 1012 ribossomos durante a prófase meiótica. assim como os vários componentes do óvulo maduro. . o espermatozóide sofreu extensa modificação para assegurar a passagem de seu núcleo para o óvulo. substâncias químicas protetoras e fatores morfogenéticos:* • Proteínas. Sintetiza ou absorve proteínas. preexistentes no óvulo. O óvulo em desenvolvimento tem mecanismos especiais para sintetizar ribossomos. o óvulo tem ainda um notável reservatório citoplasmático acumulado durante seu amadurecimento. Esse armazém citoplasmático inclui proteínas. em algumas espécies. Essa mobilidade é conseguida através de mudanças no sistema gerador de ATP (possivelmente através da modificação da dineína). Essas moléculas dirigem a diferenciação celular em certos tipos de células.

o núcleo do óvulo ainda é diplóide. [fert3. O componente principal desse envoltório forma uma esteira fibrosa sobre o óvulo. Acima da membrana plasmática está o envoltório vitelínico (Figura 4.6). ouriços-do-mar). Nos mamíferos. o núcleo já é haplóide no momento da fertilização. (Segundo Epel. Em algumas espécies (por exemplo.) Envoltório vitelínico Camada gelatinosa Espermatozóide Membrana plasmática Grânulo de gema Grânulo cortical Mitocôndria Núcleo Substâncias químicas protetoras. estar equipado para enfrentar esses fatores.7). Imediatamente abaixo da membrana plasmática do óvulo está uma fina casca (de aproximadamente 5µm) de um citoplasma gel-símile chamado de córtex. 1977. necessitando. por isso. e o espermatozóide penetra antes das divisões meióticas estarem completas. Essa esteira é suplementada por extensões de glicoproteínas da membrana plasmática e pontes proteináceas vitelínicas que aderem a esteira à membrana (Mozingo e Chandler. O espermatozóide dos mamíferos tem que passar por essas células para fertilizar o óvulo*.html] Dentro desse enorme volume de citoplasma reside um grande núcleo. Muitos óvulos contêm filtros ultravioleta e enzimas de reparos de DNA que os protegem da luz solar. alguns óvulos contêm moléculas que predadores potenciais acham desagradáveis. O embrião não pode fugir de predadores ou movimentar-se para um ambiente mais seguro. a gema de óvulos de aves contém até mesmo anticorpos. O óvulo do mamífero é também rodeado por uma camada de células. essas moléculas polimerizam-se *Em mamíferos. O termo corona radiata refere-se àquelas células foliculares imediatamente adjacentes à zona pelúcida. Envolvendo o citoplasma está a membrana plasmática do óvulo. • . as coberturas extracelulares do óvulo estão divididas em duas regiões: A zona pelúcida e o cumulus. Durante a fertilização. o envoltório vitelínico é uma matriz extracelular separada e grossa chamada zona pelúcida. 1991). O citoplasma nessa região é mais duro que o citoplasma interno e contém altas concentrações de moléculas globulares de actina. O envoltório vitelínico é essencial para a ligação espécie-específica do espermatozóide. as células do cumulus (Figura 4. são as células mais internas do cumulus. Em outras espécies (incluindo muitos vermes e a maioria dos mamíferos).5. A camada cumular representa células foliculares ovarianas que estavam alimentando o óvulo quando da sua liberação do ovário. O estágio do núcleo do óvulo no momento da entrada do espermatozóide está ilustrado na Figura 4.126 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4.4 Estrutura do óvulo do ouriço-do-mar durante a fertilização. Essa membrana deve regular o fluxo de certos íons durante a fertilização e deve ser capaz de se fundir com a membrana plasmática do espermatozóide.

CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 127 Vesícula germinal Corpos polares Pronúcleo feminino Oócito primário jovem Os vermes anelídeos Dinophilus e Sacocirrrus O verme poliqueta Histriobdella O platelminto Otomesostoma O onicóforo Peripatopsis Oócito primário totalmente crescido O nematelminto Ascaris O mesozoário Dicyema A esponja Grantia O verme poliqueta Myzostoma O verme concha Nereis O molusco Spisula O verme equiuróide Urechis Cães e raposas Primeira metáfase Segunda metáfase Meiose completa O verme nemerteano Cerebratulus O verme poliqueta Chaetopterus O molusco Dentalium O verme central Pectinaria Muitos insetos Estrela-do-mar O anfioxo Branchiostoma Anfíbios Mamíferos (maioria) Peixes Cnidários (e.6 A superfície do óvulo do ouriço-do-mar. Um grânulo cortical aparece diretamente abaixo da membrana plasmática do óvulo. 1979.19). Essas estruturas Estágios de maturação do óvulo no momento da entrada do espermatozóide em diferentes animais. que estão estreitamente cobertas pelo envoltório vitelínico. Microfilamentos são necessários para a divisão celular. Schroeder. 1965. (B) Microfotografia eletrônica de transmissão de um ovo não-fertilizado.g. mostrando microvilosidades e a membrana plasmática. dentro desse córtex estão os grânulos corticais (veja Figuras 4.6. Ainda. veja também a Figura 4..4 e 4. que ajudam a entrada do espermatozóide para dentro da célula (veja Figura 4. (A) Micrografia eletrônica de varredura de um óvulo antes da fertilização. cortesisa de T. anêmonas) Ouriços-do-mar Figura 4. A membrana plasmática está exposta onde o envoltório vitelínico foi retirado.) .6). e são também usados para estender a superfície do óvulo para o interior das microvilosidades. E. (Segundo Austin. (de Schroeder.5 para formar longos fios de actina conhecidos como microfilamentos.) Microvilosidades Envoltório vitelínico (A) (B) Grânulo cortical Figura 4.

portanto. Partículas de carbono coloidal (tinta Nanquim) são excluídas pela matriz de hialuronidase.128 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Cumulus Óvulo Zona pelúcida (A) (B) Figura 4. e as proteínas hialinas e adesivas envolvem o embrião precoce providenciando apoio aos blastômeros do estágio de clivagem. glicoproteínas adesivas e proteína hialina. Yoshida et al. mas é principalmente usada para atrair ou ativar o espermatozóide.7 Óvulos de hamster imediatamente antes da fecundação. os grânulos corticais também contêm mucopolissacarídeos. (Cortesia de R. sendo organelas derivadas do Golgi contendo enzimas proteolíticas. Yanagimachi. Esses organismos enfrentam dois problemas: 1) Como podem espermatozóides e óvulos se encontrarem quando em concentrações tão diluídas. Muitos tipos de óvulos têm uma geléia no exterior do seu envoltório vitelínico (Figura 4. Miller demonstrou que os óvulos do cnidário Orthopyxis caliculata não somente secretam um fator quimiotático mas também regulam o período de sua liberação. está encaixado na zona pelúcida. Essa rede de glicoproteínas pode ter numerosas funções. moluscos. produzida durante a meiose. As enzimas e os mucopolissacarídeos atuam na prevenção da entrada de outros espermatozóides no óvulo após a entrada do primeiro. equinodermos e urocordados (Miller. Esse ambiente pode ser tão pequeno quanto uma poça de maré ou tão grande como o oceano.000 grânulos corticais. (B) Em menor aumento. esse ambiente é compartilhado com outras espécies que podem liberar suas células sexuais no mesmo período. Oócitos em desenvolvimento. ou óvulo. 1985. O óvulo. por sua vez. Essa.) ligadas à membrana são homólogas à vesícula acrossômica do espermatozóide. é uma célula especializada para receber o espermatozóide iniciando o desenvolvimento. (A) O ovo do hamster. enquanto cada espermatozóide contém uma vesícula acrossômica. está envolvida por células do cumulus. e 2) que mecanismo inibe o espermatozóide da estrelado-mar tentar fertilizar os óvulos do ouriço-do-mar? Dois mecanismos principais evoluíram para resolver essas dificuldades: atração e ativação espécie-específica do espermatozóide. incluindo cnidários. Em 1978. Além disso.4). Além das enzimas digestivas. Atração do Espermatozóide A atração espécie-específica do espermatozóide (um tipo de quimiotaxia) foi documentada em numerosas espécies. Reconhecimento do óvulo e do espermatozóide: Ação à distância Muitos organismos marinhos liberam seus gametas para o ambiente. cada óvulo do ouriço-do-mar contém aproximadamente 15. Uma célula do corpo polar. também está dentro da zona pelúcida. em . 1993).. um oócito de camundongo é mostrado em relação ao cumulus. No entanto.

esses oócitos não controlam somente o tipo de espermatozóide que atraem. 40 e 90 segundos após a injeção. mesmo em concentração muito baixa (Figura 4. foram fixados sobre lâminas microscópicas. Os mecanismos de quimiotaxia são diferentes em outras espécies (veja Metz. A posição da micropipeta está indicada em (A). Uma dessas moléculas quimiotáticas. é colocada em uma lâmina de microscópio. Vacquier. Resact é específico para A. mais espermatozóide é recrutado para dentro do crescente agrupamento. Isso aumenta a concentração de GMP cíclico do óvulo (Shimomura et al. (de Ward et al. Quando ela liga o resact ao lado externo da célula. resact causa uma mudança conformacional que ativa a atividade de guanidil ciclase no lado citoplasmático. e espermatozóides foram adicionados a uma certa distância dos óvulos.9. cortesia de V. punctulata liga resact a receptores na sua membrana celular (Ramarao e Garbers. mostrando espermatozóide nadando em círculos estreitos antes da adição de resact.) . Quando uma gota de água do mar. Miller encontrou que quando o espermatozóide era adicionado a oócitos que ainda não haviam completado sua segunda divisão meiótica.8 vários estágios de amadurecimento. 1985. punctulata e não atrai espermatozóide de outras espécies. Assim. 1986). 1985).8). Na maioria dos invertebrados marinhos. pela geléia que envolve o óvulo. Colwin e Colwin.. 1985.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 129 (A) (B) (C) (D) Figura 4. O receptor para resact é uma proteína transmembrana. A reação acrossômica pode ser iniciada pela geléia do óvulo solubilizada. (B-D) Exposições semelhantes de 1 segundo mostrando a migração do espermatozóide para o centro do gradiente de resact 20. Ward e Kopf. Um nanolitro de uma solução 10-nM de resact é injetado em uma gota de 20ml de suspensão de espermatozóide. após o término da segunda divisão meiótica e os óvulos estarem prontos para ser fertilizados. Esses peptídios (mais de 70 foram isolados de diferentes espécies de ouriços-do-mar) causam aumentos dramáticos e imediatos da motilidade espermática e do consumo de oxigênio (Hardy et al. 1963). Resact também age como um peptídio ativador de espermatozóide. 1978.. Também pode ser ativada artificialmente pelo aumento da concentração de cálcio na água do mar. Ativação Espermática: A Reação Acrossômica no Ouriço-do-Mar Uma segunda interação entre espermatozóide e óvulo envolve a ativação do espermatozóide pela geléia do óvulo. em segundos o esperma migra para a região da injeção e ali se congrega. Espermatozóide de A. o espermatozóide geralmente nada em círculos de aproximadamente 50 µm de diâmetro. 1993). (A) Uma fotografia de 1 segundo. um peptídio de 14 aminoácidos chamado resact foi isolado da geléia do óvulo do ouriço-do-mar Arbacia punctulata (Ward et al. D. Bentley et al... 1994). ou mesmo em certas espécies.. que parece ativar a ATPase da dineína estimulando a agitação da cauda no espermatozóide (Cook e Babcock. Quimiotaxia do espermatozóide em Arbacia. mas também o momento em que o atraem. Resact difunde facilmente na água do mar e tem um profundo efeito quando adicionado a uma suspensão de espermatozóide de Arbacia. contendo espermatozóide de Arbacia. pelo contato com o próprio óvulo. essa reação acrossômica tem dois componentes: a fusão da vesícula acrossômica com a membrana plasmática do espermatozóide (uma exocitose que resulta na liberação dos componentes da vesícula acrossômica) e a extensão do processo acrossômico (Figura 4. 1993). À medida que o resact continua a difundir-se. Se uma quantidade mínima de resact for introduzida na gota. Porém. o espermatozóide migrava em sua direção. não havia atração de espermatozóide pelos óvulos. 1986) e pode nadar através de um gradiente crescente de concentração desse composto até alcançar o óvulo.

Schackmann e Shapiro. (D) Enquanto as moléculas de actina se agregam para produzir microfilamentos. Essa protrusão se origina da polimerização de moléculas globulares de actina em filamentos de actina (Tilney et al. 1981. a semelhança entre a exocitose da vesícula acrossômica e a exocitose da vesícula sináptica pode ser bastante profunda. Fotografias reais da reação acrossômica no espermatozóide do ouriço-do-mar são mostradas em seguida.10). Estudos recentes de reações acrossômicas em ouriços-do-mar e mamíferos (Florman et al. da membrana acrossômica com a membrana plasmática adjacente do espermatozóide (Figuras 4. Levine et al. 1992. 1992) sugerem que quando os receptores para os ligantes ativadores do espermatozóide ligam essas moléculas. 1970. o espermatozóide de S.9. 1985). A segunda parte da reação acrossômica envolve a extensão do processo acrossômico (veja Figura 4..b). a geléia do óvulo pode prover reconhecimento espécieespecífico em algumas espécies. Franklin.9).9 e 4. punctulata) (Summers e Hylander. 1994 a. Lennarz. A exocitose da vesícula acrossômica é causada por uma fusão.) Em ouriços-do-mar. A reação acrossômica é considerada ser iniciada por um oligossacarídeo ligado a uma proteína na geléia do óvulo que permite a entrada de cálcio na cabeça do espermatozóide (SeGall e Lennarz. purpuratus também pode ser ativado pela geléia de Lytechinus variegatus (mas não de A. 1967. causam a despolarização da membrana que poderia abrir canais de cálcio voltagem-dependentes de maneira reminescente à transmissão sináptica. 1975). há uma fusão mediada pelo cálcio entre a vesícula secretória e a membrana celular. o processo acrossômico se estende para fora. A seqüência desses eventos está esquematizada na Figura 4. . As proteínas que atracam os grânulos corticais à membrana celular também parecem ser homólogas àquelas usadas na ponta do axônio (Bi et al. A exposição do espermatozóide do ouriço-do-mar à geléia do óvulo também ocasiona a rápida utilização de ATP e um aumento de 50% da respiração mitocondrial.9 Reação acrossômica em espermatozóide de equinoderma. Os fatores da geléia do óvulo que iniciam a reação acrossômica em ouriços-do-mar são muitas vezes muito específicos. González-Martínez et al. Os espermatozóides dos ouriços-do-mar Arbacia punctulata e Strongylocentrotus drobachiensis reagem somente com a geléia de seus próprios óvulos. L.. 1979. 1978). A energia gerada é usada primordialmente para motilidade flagelar (Tombes e Shapiro. * Tais reações exocitóticas podem ser vistas na liberação de insulina das células pancreáticas e na liberação de neurotransmissores de terminais sinápticos. (Segundo Summers e Hylander. 1995).. fotografias por cortesia de G. No entanto. Keller e Vacquier. J. (A-C) A porção da membrana acrossômica diretamente abaixo da membrana do espermatozóide funde-se com essa liberando o conteúdo da vesícula acrossômica.130 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Membrana acrossômica Enzimas acrossômicas Membrana do espermatozóide Actina globular Bindina Microfilamentos de actina Núcleos Figura 4. o contato com a geléia do óvulo causa a exocitose da vesícula acrossômica e a liberação de enzimas digestoras de proteínas que podem digerir um caminho através da geléia de revestimento até a superfície do óvulo (Dan. mas não em outras. Decker e W. Essa exocitose permite que a vesícula acrossômica libere seu conteúdo na cabeça do espermatozóide*.. mediada pelo cálcio. 1974.. Portanto. Realmente. Em todos os casos. 1978).

vacas e seres humanos dentro de 30 minutos após a deposição.) Informações adicionais & Especulações Ação à Distância: Gametas de Mamíferos MUITO DIFÍCIL estudar as interações que podem estar ocorrendo entre gametas de mamíferos antes do contato espermatozóide-óvulo.000 espermatozóides chegam perto do óvulo. ainda não conhecemos os componentes dos vários ambientes naturais encontrados pelo espermatozóide dos mamíferos em sua viajem ao encontro do óvulo. Como menos de 1 em 10. mas existem quatro conjuntos de alteraçõess moleculares que podem ser importantes. não atingindo assim o óvulo (Austin. hamsters. 1952).. somente 200 atingem a região ampolar do oviduto. Meizel. Translocação e Capacitação O trato reprodutivo de mamíferos femininos exerce um papel muito ativo no processo de fertilização. Um motivo óbvio para isso é que a fertilização ocorre dentro dos ovidutos femininos. a capacitação e as reações de hiperativação que parecem ser necessárias em algumas espécies para ligá-lo ao óvulo. Dos 280 x 106 espermatozóides humanos normalmente ejaculados para o interior da vagina. um período “demasiadamente curto para ser atingido até mesmo pelo espermatozóide mais olím- pico. a membrana da célula espermática . Há muita controvérsia em relação ao deslocamento do espermatozóide mamífero até o oviduto. 1976) e pode ser mimetizado in vitro pela incubação de espermatozóide em meios de cultura de tecidos (contendo íons de cálcio. Espermatozóide mamífero recém-ejaculado é incapaz de sofrer a reação acrossômica sem ter residido por algum tempo no trato reprodutivo feminino (Chang. 1970. cobaia. contendo espermatozóides em diferentes estágios de amadurecimento. é difícil analisar aquelas molé- É culas que permitem aos espermatozóides nadar em direção ao óvulo e serem ativados. se confiar somente no poder de seus flagelos” (Storey. A membrana acrossômica pode ser vista formando vesículas. 1951. (A) Micrografia de transmissão eletrônica de um espermatozóide de hamster passando pela reação acrossômica. 1960. (A de Meizel. Corselli e Talbot. Primeiro. bicarbonato e soroalbumina) ou em fluido dos ovidutos. 1994). Embora seja relativamente fácil mimetizar as condições rodeando a fertilização do ouriço-do-mar (usando água do mar natural ou artificial). onde ocorre a fecundação (Ralt et al. 1987). cortesia de S. e a possibilidade que o óvulo possa estar atraindo o espermatozóide por quimiotaxia. Os espermatozóides que não foram capacitados são “segurados” na matriz cumular. 1995). uma vez no oviduto encontre o ovo. (B) Diagrama interpretativo de micrografias eletrônicas mostrando a fusão de membranas acrossômica e celular na cabeça do espermatozóide. O espermatozóide é encontrado no oviduto de camundongos. 1991). As alterações moleculares que explicam a capacitação ainda são desconhecidas (veja Yanigamachi.10 Reação acrossômica em espermatozóide de hamster. a motilidade espermática provavelmente é um fator de menor importância para entrar no oviduto. Um segundo motivo para essa dificuldade é que a população de espermatozóide ejaculada para o interior da fêmea é provavelmente muito heterogênea. Enquanto a motilidade espermática é necessária para que o espermatozóide do camundongo. 1948. segundo Yanagimachi e Noda. Austin.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 131 Membrana celular do espermatozóide Membrana acrossômica Fusão entre a membrana celular do espermatozóide e a membrana acrossômica adjacente Núcleo Centríolo Figura 4. Esse requisito para capacitação varia de espécie para espécie (Gwatkin. É mais provável que o espermatozóide seja transportado para o oviduto por meio da atividade muscular do útero. B.

1985. mas se aí ficam por um período demasiadamente longo. e duas proteínas encontradas tanto no soro como no trato reprodutivo feminino (albumina e proteína 1 de transferência lipídica). Esses fatores podem influenciar a motilidade espermática assim como a capacitação. fatores solúveis no oviduto também podem prover o componente direcional do movimento do espermatozóide. Feito isso. de 30. Isso significa que o espermatozóide fertilizador poderia demorar até seis dias para fazer a jornada. 1987). Deve-se notar que “o prêmio da corrida não vai sempre para o mais rápido”. porém com uma melhor probabilidade de sucesso do que aquele que chegou dias antes. passando a migrar ao encontro da fonte de fluido folicular. observaram que parte do espermatozóide mudou sua direção de movimentação.. durante a qual pode ter sucesso na fertilização do óvulo. Em quarto lugar. Suarez e colaboradores (1991) mostraram que enquanto essas reações não são conducentes a viagens em fluidos de baixa viscosidade. O espermatozóide pode também ter diferentes prazos de sobrevivência. isso pode permitir que algum espermatozóide chegue mais tarde. Em 1977. ficam “hiperativados”. Embora algum espermatozóide possa alcançar a região ampolar do oviduto (onde ocorre a fertilização) dentro de meia hora após a relação sexual. É possível que o trato reprodutivo feminino estimule a adenilciclase do espermatozóide a produzir mais cAMP e que esse ative a proteína quinase que inicia a cascata de fosforilação. 1989). A concentração de colesterol no espermatozóide é diminuída durante a capacitação do espermatozóide em várias espécies (Davis.500Da. Zeng et al. 1989a. o potencial da membrana do espermatozóide é dramaticamente reduzido (de cerca de – 30 para –50 mV. A microinjeção de outras soluções não teve esse efeito. e que é dada ao espermatozóide uma janela de competência relativamente breve. Essa proteína é capaz de se . 1995). Lopez et al. cobaias e algumas variedades de camundongos) passam do útero para os ovidutos. Eisenbach (1995) propôs a hipótese pela qual a capacitação é um acontecimento transitório. o processo acrossômico do espermatozóide faz contato com o envoltório vitelínico do óvulo (Figura 4. Por exemplo. 1995a. Em terceiro lugar. ainda é incerto se esses eventos são independentes um do outro e até que ponto cada um deles produz capacitação do espermatozóide. certas proteínas ou carboidratos na superfície do espermaozóide são perdidos durante a capacitação (Poirier e Jackson. adquirem competência. Wilson e Oliphant. 1992).. mudando sua composição de lipídios. o fluido demonstrasse habilidade quimiotática (P < 0. o óvulo só era fertilizável se. terminando no dia da ovulação. certas proteínas são fosforiladas por um caminho cAMP-dependente. Visconti et al. perdem-na. e em quase todos os casos. Quando os espermatozóides atingem a ampola. 1981). que é necessária tanto para a aquisição de competência como para a fosforilação de tirosino-quinases. Porém. A proteína acrossômica mediando esse reconhecimento é chamada bindina. o óvulo humano secrete um fator quimiotático somente quando estiver capacitado para a fertilização. parecem ser muito adequadas para o movimento linear do espermatozóide no fluido viscoso que poderá encontrar no oviduto. terminando na fosforilação e ativação das proteínas envolvidas na ligação do espermatozóide à zona pelúcida e mediando a exocitose da vesícula acrossômica (Leyton e Saling. o folículo ovariano no qual o óvulo se desenvolve) pode estar secretando substâncias quimiotáticas que poderiam atrair o espermatozóide em direção ao óvulo durante os últimos estágios da migração (veja Hunter.11). Esses estudos não eliminam a possibilidade de que o efeito fosse devido a uma estimulação geral do movimento ou do metabolismo do espermatozóide. mais provavelmente.0001). Em segundo lugar. regionalmente específicos. que tal como certos óvulos de invertebrados. quando os espermatozóides de certos mamíferos (especialmente hamsters. e somente se.. É possível que essas entidades perdidas durante a capacitação estivessem bloqueando locais de reconhecimento para as proteínas que se ligam à zona pelúcida. Ravnik et al. Um importante passo do reconhecimento espécie-específico ocorre nesse ponto. Reconhecimento do óvulo e espermatozóide: Contato de gametas Reconhecimento Espécie-Específico em Ouriços-do-Mar Uma vez que o espermatozóide do ouriço-do-mar tiver penetrado na geléia do óvulo. foram verificadas remover colesterol do espermatozóide humano (Langlais et al. do acrossomo de Strongylocentrotus purpuratus. 1981. Vacquier e colaboradores isolaram essa proteína insolúvel. dependendo da sua localização dentro do trato reprodutivo. essas investigações revelaram uma correlação fascinante: o fluido de somente a metade dos folículos testados mostrou um efeito quimiotático. os autores microinjetaram uma gota do fluido folicular em uma gota maior da suspensão de espermatozóides. portanto.132 PARTE II Padrões de Desenvolvimento pode se alterar. 1988. É possível.. No entanto. aquele espermatozóide pode ter poucas chances de fertilizar o óvulo.b). O AMP cíclico pode induzir artificialmente a competência através da proteína quinase cAMP-dependente (PKA). Realizando um experimento semelhante aquele descrito anteriormente com ouriços-do-mar. Ralt e colaboradores (1991) testaram essa hipótese usando fluido de folículos humanos cujos óvulos estavam sendo usados para fertilização in vitro. Especulou-se que o óvulo (ou.. Hiperativação e Quimiotaxia As diferentes regiões do trato reprodutivo feminino podem secretar fatores diferentes. Wilcox e colaboradores (1995) acharam que quase todas os engravidamentos humanos resultam de relacionamento sexual durante um período de seis dias. passando a nadar com maior velocidade e gerando maior força. Além de aumentar a atividade do espermatozóide.

) Figura 4. sua interação com óvulos é relativamente espécie-específica (Glabe e Vacquier. a bindina isolada dos acrossomos de S.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 133 Figura 4.25 ml de suspensão a 2% (volume/ volume) de óvulos. 1977.11 Contato do processo acrossômico do espermatozóide do ouriço-do-mar com uma microvilosidade do óvulo. Ainda mais. Esse achado implica na existência de (A) BINDINA DO ESPERMATOZÓIDE S.13). Glabe e Lennarz. Após 2-5 min de agitação branda. 1979. Estudos bioquímicos mostraram que as bindinas de espécies proximamente relacionadas de ouriço-do-mar são mesmo diferentes. os recipientes foram fotografados.) S. mas não aqueles de Arbacia puctulata. fransciscanus (B) Aglutinação espécie-específica por bindina de óvulos desgeleificados . (A baseado em fotografias de Glabe e Vacquier. purpuratus (Figura 4. B de Glabe e Lennarz. cortesia dos autores. As partículas de bindina estavam invariavelmente nos lugares onde dois óvulos se encontravam. (A) aglutinação promovida pela adição de 212 µg de bindina em um recipiente plástico contendo 0. purpuratus ligados entre si por partículas de bindina de S. Cada bindina somente se ligou a seus próprios óvulos. 1977. 1979). (B) Fotomicrografia de fluorescência de óvulos de S.12. Collins e D.12 ligar a óvulos desgeleificados de S. Epel. Usando técnicas imunológicas. fransciscanus Sem aglutinação Aglutinação . purpuratus marcadas por fluorescência. Moy e Vacquier (1979) demonstraram que a bindina está especificamente localizada no processo acrossômico. Purpurata aglutina seus próprios óvulos desgeleificados. 1977. purpuratus OVOS DESGELEIFICADOS Partículas de bindina Aglutinação Sem aglutinação Óvulos S. purpuratus S. cortesia de F. 1977). (de Epel. Vacquier e Moy. D. exatamente onde deve estar para o reconhecimento espermatozóide-óvulo (Figura 4.

) (B) . (A) a técnica de localização imunoquímica coloca um anticorpo de coelho nos lugares onde a bindina está exposta. Peroxidase catalisa a formação de um precipitado escuro de diaminobenzidina (DAB) e água oxigenada. Dessa maneira. (B e C de Moy e Vacquier.13 Localização de bindina no processo acrossômico. Quando a bindina estava presente. 1979.14 Receptores de bindina no óvulo. Lennarz. cortesia de V. L. Glabe. Esses anticorpos de porco haviam sido ligados covalentemente à enzima peroxidase. Perez e W.14 A. Os anticorpos do coelho foram produzidos contra a proteína bindina. 1993. O precipitado só se forma onde há bindina. (C) Localização de bindina no processo acrossômico na junção do espermatozóide com o óvulo. moléculas de peroxidase foram colocadas em todos os lugares onde havia bindina. o espermatozóide foi tratado com anticorpos de porco capazes de ligar-se a anticorpos de coelho. Mesmo (A) Figura Figura 4. (B) Localização de bindina no processo acrossômico após a reação acrossômica (33. a ligação do espermatozóide não se dá sobre a superfície inteira do óvulo. Tais receptores também foram sugeridos pelos experimentos de Vacquier e Payne (1973). (A) Micrografia eletrônica de varredura do espermatozóide do ouriço-do-mar ligado ao envoltório vitelínico de um óvulo. D.200x).134 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) DAB + H2O2 Precipitado denso Anti-bindina de coelho (B) Precipitado DAB Imunoglobulina porcina anti-coelho conjugada com a enzima peroxidase (C) Membrana vitelínica do óvulo Acrossomo Núcleo Processo acrossômico Bindina Espermatozóide Figura 4. (A cortesia de C. B de Foltz et al. os anticorpos do coelho permaneciam ligados ao espermatozóide. Vacquier. que saturaram óvulos de ouriço-do-mar com espermatozóide. e esses anticorpos foram incubados com espermatozóide que tinha sofrido a reação acrossômica. Como pode ser visto na Figura 4.. Depois de todo anticorpo não-ligado ser removido por lavagem. J. purpuratus a partículas de polistireno que foram cobertas com a proteína purificada do receptor de bindina.) receptores espécie-específicos de bindina no envoltório vitelínico. (B) ligação do espermatozóide de S.

e tem dois papéis importantes durante a fertilização: liga o espermatozóide. Assim. cortesia dos autores. purpuratus é misturado com o receptor de bindina de envoltórios vitelínicos de S. B de Bleil e Wassarman. purpuratus. Rossignol et al. Figura 4. e a ligação do espermatozóide do camundongo à zona dessa espécie pode ser inibida pela incubação prévia de espermatozóide com glicoproteínas da zona. As outras duas proteínas da zona. purpuratus. Florman e Storey.html] Ligação de Gametas e Reconhecimento em Mamíferos ZP3: A PROTEÍNA LIGANTE DA ZONA PELÚCIDA DO CAMUNDONGO. O receptor isolado de S. O espermatozóide do camundongo pode. Esses receptores de bindina se agregam em complexos. [fert4. (B) Ligação de ZP3 marcada radioativamente a espermatozóide capacitado do camundongo. reconhecimento espécieespecífico dos gametas do ouriço-do-mar ocorrem ao nível da atração. porém não absolutamente.. Essa matriz de glicoproteínas é sintetizada e secretada pelo oócito em crescimento.15 Ligação do espermatozóide à zona pelúcida.14B). espécie-específica (especificidade por espécie não deveria ser um grande problema quando a fertilização ocorre internamente). ativação e adesão do espermatozóide à superficie do óvulo. que é o competidor ativo nesse ensaio de inibição. 1985. 1988) isolaram da zona pelúcida do camundongo uma glicoproteína ZP3. e centenas deles são provavelmente necessários para amarrar o espermatozóide no óvulo (Figura 4. 1986. 1978. 1986. Um grande complexo de glicoproteínas dos envoltórios vitelínicos de óvulos de ouriço-do-mar foi isolado e mostrou ligar bindina radioativa de maneira espécie-específica (Glabe e Vacquier.15). Cherr et al. e inicia a reação acrossômica após essa ligação (Saling et al. ZP1 e ZP2. 1979. Isto é. indicando haver um número limitante de locais ligantes de espermatozóide. de 83-kDa. (A segundo Bleil e Wassarman... não irá interferir com a fertilização de outros ouriços-do-mar relacionados. Bleil e Wassarman (1980.) Ligação do espermatozóide (%) ZP3 sem carboidratos (A) Equivalentes da zona pelúcida por µl (B) . não puderam competir pela ligação do espermatozóide (Figura 4. o espermatozóide se liga a ele e não irá fertilizar os óvulos. 1984).. A zona pelúcida tem nos mamíferos um papel análogo aquele do envoltório vitelínico nos invertebrados. 1993). porém. 1986). parece haver espaço no óvulo para mais cabeças de espermatozóide. A ligação de espermatozóide à zona é relativamente. Ainda mais. ZP3 é a proteína específica na zona pelúcida à qual se liga o espermatozóide do camundongo. se espermatozóide de S. e Florman e Wassarman. A região ligante de bindina se estende para o espaço extracelular e provavelmente se torna um componente do envoltório vitelínico. dessa forma. Essa glicoproteína é também capaz de competir com óvulos pelo espermatozóide da mesma espécie. Esse receptor de bindina é uma glicoproteína transmembrana com quase 1300 aminoácidos (Foltz et al. A importância da porção carboidrato de ZP3 é também. (A) ensaio de inibição mostrando a diminuição específica da ligação do espermatozóide do camundongo às zonas pelúcidas quando espermatozóide e zonas são incubados com aumentos crescentes da porção carboidrato da glicoproteína ZP3.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 135 a níveis saturantes de espermatozóide (aproximadamente 1500). ZP3 radiativamente marcada ligou-se às cabeças do espermatozóide do camundongo que tinha acrossomos intactos. Assim. ZP3 também inicia a reação acrossômica após os espermatozóides terem se ligado a ela. 1980. 1982. indicada por essa figura. concentrar suas enzimas proteolíticas diretamente no ponto de fixação à zona pelúcida.

1984.. Esses pesquisadores posteriormente isolaram essa proteína. A PROTEÍNA LIGANTE DE GALACTOSE 56-KDA (SP56). 1985. a atividade ligante de espermatozóide é perdida. Os detalhes ainda terão que ser elucidados. Parece que cada uma delas tem papéis específicos. Florman e Wassarman. Como é a zona capaz de ligar e conservar esses espermatozóides contorcedores? Parece que ZP3 pode ligar-se a pelo menos três proteínas adesivas na membrana do espermatozóide. Bleil e Wassarman (1980) mostraram que um dos carboidratos críticos da glicoproteína ZP3 é o grupo galactose terminal. 1996. 1987. e milhares desses sítios podem ser necessários para prevenir que essas duas células se separem. Na realidade. (Segundo Snell e White. Essa ligação induz a reação acrossômica através da ativação do fluxo de cálcio. O espermatozóide do camun- dongo não “fura” para chegar ao interior da zona.. 1988). e quais as suas respectivas funções (veja Figura 4. Essas três proteínas são: a proteína ligante de galactose. a galactosil-transferase e a quinase do receptor da zona.136 PARTE II Padrões de Desenvolvimento O mecanismo molecular pelo qual a zona pelúcida e o espermatozóide do mamífero se reconhecem mutuamente está sendo estudado. Há evidência da ligação de três proteínas espermáticas – a galactosiltransferase da superfície. Se essa galactose terminal for removida ou modificada quimicamente. A hipótese corrente sobre a ligação dos gametas de mamíferos postula um conjunto de proteínas do espermatozóide capazes de reconhecer regiões específicas de carboidratos na zona ZP3 do óvulo (Florman et al. 1989). ligando Zona pelúcida Óvulo Espermatozóide ZP3 (proteína ligante de espermatozóide) na Zona ZP3 Proteínas candidatas a ligação à zona no acrossomo N-acetil glicosamina Galactose Membrana celular do espermatozóide GALACTOSILTRANSFERASE Ligação cruzada ativa proteínas G Ativação de síntese de IP3 na membrana acrossômica SP 56 (proteína periférica da membrana) P95 Ativação de tirosinoquinase Regulação de canais iônicos ou síntese de IP3 Figura 4. Saling. A proteína ZP3 da zona pelúcida liga espermatozóide. Uma proteína crítica ligante da zona do espermatozóide parece ser a proteína que especificamente se liga aos resíduos de galactose de ZP3. PROTEÍNAS DE ADESÃO ESPERMATOZÓIDE-ZONA.16 Liberação de Ca++ Reação acrossômica Ligação de espermatozóide à zona pelúcida do camundongo: alguns possíveis participantes.16: Snell e White. A remoção desses grupos de carboidratos ligados por treonina ou serina suprime a habilidade de ligar o espermatozóide. sp56 e P95 – à ZP3. Há uma controvérsia significativa sobre a questão de se todas as três proteínas no espermatozóide são necessárias para ligação à zona.) . Wassarman. mas um tanto sobrepostos na adesão do espermatozóide e na reação acrossômica. os espermatozóides se aproximam paralelamente ao plano da superfície da zona e aí são ativamente fixados (Baltz et al. 1996).

Lopez et al. Os embriões bicelulares (aqui marcados por asteriscos) são controles internos mostrando não ocorrer ligação. A pista 4 mostra o controle quando sp56 purificada é feita migrar no gel. as enzimas (no espermatozóide) ficam ligadas a seus substratos (na zona).. 1985. cortesia de J. e sondando para a presença de sp56 com anticorpo marcado. transferindo o gel. 1990). A pista 1 é o resultado da lise de ovos não-fertilizados. 1995. membranas de espermatozóide de camundongo irão transferir um açúcar de UDP-galactose especificamente para ZP3 (Miller et al. (C ) Na presença de sp56. porém um peptídio de 56kDa. No entanto. o espermatozóide foi impedido de se ligar à zona. bloqueando a ligação espermatozóide-óvulo (Figura 4.17. Bookbinder et al. Bleil. exatamente como qualquer enzima se ligaria a um substrato. (3) adição de anticorpos que bloqueiam a atividade da galactosiltransferase. que migra em 40 kDa). Assim. com seu sítio ativo apontando para fora. (B) Espermatozóide ligando-se normalmente a ovos não-fertilizados de camundongo (aproximadamente 76 espermatozóides por óvulo). A proteína sp56 liga-se à zona pelúcida de ovos não-fertilizados (porém não dos fertilizados). 1992). 1988). No laboratório de Shur foi demonstrado que esse receptor para a zona é uma enzima que reconhece o açúcar N-acetilglicosamina na ZP3 (Shur e Hall. mas não se ligou a partículas recobertas com ZP2 em experimento semelhante. A maioria das proteínas passou pela coluna.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 137 Figura 4. glicosiltransferase. Não se vê sp56.. está embebida na membrana plasmática do espermatozóide. A agregação dessas galactosiltransferases ocasiona a ativação de uma proteína G que pode ser importante na iniciação da reação acrossômica (Gong et al... (O anticorpo reconhece a forma não-reduzida de sp56. A pista 3 mostra os resultados negativos obtidos quando sp56 foi adicionada a embriões bicelulares. Se essa hipótese estiver correta. ligou-se às partículas recobertas com ZP3.. (de Bookbinder et al. Miller et al. ela não pode catalisar a reação porque o segundo reagente está faltando. não há resíduos de UDP-galactose no trato reprodutivo feminino. sugerindo fortemente ser um receptor de espermatozóide ligante à entidade terminal de galactose na glicoproteína ZP3.) ser importante para ligação espermatozóides-zona é a enzima da membrana celular do espermatozóide.17 ZP3 à uma coluna de afinidade.D. poderíamos esperar que a ligação óvulo-espermatozóide seria inibida ou pela inibição da enzima. fazendo migrar as proteínas extraídas em um gel. a galactosiltransferase da superfície do espermatozóide parece reconhecer um grupo carboidrato na proteína ZP3 da zona pelúcida do camundongo. Essa proteína foi encontrada exposta na membrana espermática. 1982a. Shur e Neely. A Segunda proteína do espermatozóide que parece Sp56 purificada liga-se à zona pelúcida e inibe a ligação de espermatozóide a óvulos de camundongo. 1995). Isso é exatamente o que Shur e colaboradores acharam ser o caso. Além disso. passando em seguida. as proteínas isoladas da membrana de espermatozóides de camundongo (Bleil e Wassarman. (A) Ligação de sp56 à zona pelúcida de ovos não-fertilizados. 1995). Embora a enzima possa se ligar aos resíduos de proteínas da zona. indicando que sp56 se liga aos óvulos. A função enzimática dessa enzima de 60-kDa seria a de catalisar a adição de um açúcar galactose (de UDP-galactose) para uma cadeia de carboidrato terminando em um açúcar N-acetilglicosamina (veja Capítulo 3). e (4) colocação de um excesso de galactosiltransferase no meio (a enzima em excesso iria ligar-se à zona e inibir o espermatozóide de se ligar) (Lopez et al. Essa enzima. UDP-galactose. A ligação espermatozóide-zona foi bloqueada por: (1) adição de UDPgalactose. 1985. (2) remoção de resíduos de N-acetilglicosamina de ZP3. por essa coluna. Portanto. 1992). A pista 2 mostra o resultado positivo obtido quando o ovo não-fertilizado é pré-incubado com sp56. . diretamentre acima do acrossomo.b... ligava-se a resíduos de galactose. GALCTOSILTRANSFERASE. Nacetilglicosamina:galactosiltransferase. ou pela adição do segundo reagente.

100% desses animais tornaram-se estéreis por vários meses (Primakoffet al. 1995). cujo acrossomo já reagiu. O espermatozóide humano tem uma proteína semelhante. ainda assim. Uma vez que o espermatozóide capacitado ligou-se à zona pelúcida. Parece que os espermatozóides com acrossomo que reagiram. 1987. No entanto. Além disso.html] LIGAÇÃO SECUNDÁRIA DO ESPERMATOZÓIDE À ZONA PELÚCIDA. [fert5. por lise. Durante a reação acrossômica. parece que uma ligação secundária à zona é conseguida por proteínas na membrana acrossômica interna que se ligam especificamente a ZP2 (Bleil et al. Na cobaia. Quando essa proteína da membrana acrossômica interna foi injetada em cobaias macho ou fêmea. mas irão inibir a fixação do espermatozóide que já tenha reagido. enquanto o sítio intracelular tem atividade enzimática de tirosina quinase (Leyton et al. 1989. O anti-soro de cobaias esterilizadas por injeções de PH-20 não só se ligou especificamente a essa proteína. INDUÇÃO DA REAÇÃO ACROSSÔMICA EM MAMÍFEROS POR ZP3. os grânulos corticais do ovo liberam seu conteúdo. Além disso. Esse tipo de ligação abre os canais de cálcio. No espermatozóide porcino.. 1989). 1988). O efeito ZP1 ZP2 ZP3 Resíduos de carboidratos Figura 4. Isso implica que a proteína de 95-kDa é uma tirosina quinase de receptor... e a ZP3 humana estimula a atividade da quinase. Leyton e Saling. a parte anterior da membrana plasmática do espermatozóide é solta (veja Figura 4. 1994. É ali que estão localizadas as proteínas ligantes de ZP3 e. anticorpos contra a proteína ZP2 não irão impedir a ligação do espermatozóide com acrossomo intacto à zona.. formando uma esteira de malhas. 1988).10).) . Não é conhecido quais das proteínas do espermatozóide do camundongo se ligam à ZP2. Enquanto espermatozóide com acrossomo intacto não irá se ligar à ZP2 glicoproteína. como ocorre a reação acrossômica nos mamíferos? A reação é induzida pela porção protéica de ZP3 (Endo et al. É possível que a proacrosina se ligue à zona. há muito tempo conhecida por estar envolvida na digestão da zona pelúcida. Em camundongos. Esses filamentos estão ocasionalmente ligados por ZP1. Proacrosina torna-se a protease acrosina. A estrutura da zona consiste de unidades repetitivas de ZP3 e ZP2. e que pode iniciar a reação acrossômica através da fosforilação das suas proteínas alvo (veja Capítulo 3).18 Diagrama da estrutura fibrilar da zona pelúcida do camundongo. 1992b). O mecanismo pelo qual age o ZP3 e a subseqüente exocitose do acrossomo permanece controversa. o espermatozóide deve permanecer ligado à zona para abrir. 1992). ligação secundária à zona é considerada ser mediada pela proteína PH-20. O soro sangüíneo dessas cobaias estéreis tinha uma concentração extremamente alta de anticorpos para PH-20. Filamentos principais da zona pelúcida são compostos por dímeros repetitivos das proteínas ZP2 e ZP3. ligação secundária à zona parece ser mediada por proacrosina. mas pode envolver a trajetória IP3 (Florman. 1988). peptídios sintéticos que mimetizam o domínio extracelular (que liga ZP3) dessa proteína. proacrosina é também uma proteína ligante da fucose que mantém a conexão entre espermatozóide que reagiu com acrosina e a zona pelúcida (Jones et al. Isso inibe outros espermatozóides.1989a). (Segundo Wassarman. Uma terceira proteína espermática que se liga à zona pelúcida do camundongo parece ser uma proteína transmembrana de 95-kDa com dois sítios funcionais. ocasionalmente ainda ligadas por ZP1 (Figura 4. de mover-se mais para perto do óvulo.. Suarez e Dai. sugerindo possível uso como contraceptivo (Burks et al. 1995). um caminho através dela. Essa atividade é estimulada quando a proteína liga ZP3. Uma das proteínas liberadas é a protease que especificamente altera ZP2 (Moller e Wassarman. O sítio extracelular liga especificamente ZP3. sendo depois convertida na enzima ativa que digere localmente a zona pelúcida.18). aumentando a concentração do íon no espermatozóide (Leyton e Saling. como também bloqueou a adesão espermatozóide-zona in vitro. o espermatozóide cujo acrossomo reagiu o fará.138 PARTE II Padrões de Desenvolvimento RECEPTOR DE QUINASE DA ZONA (ZRK). inibem a ligação do espermatozóide à zona pelúcida humana. e ZP3 parece atuar perfazendo ligação cruzada com seus receptores na membrana espermática.. Após a entrada de espermatozóide de camundongo no óvulo. transferem sua ligação com ZP3 para as moléculas adjacentes de ZP2.

1980.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 139 contraceptivo perdurou por vários meses. 1960. Essa lise é seguida pela fusão da membrana espermática com a membrana do óvulo. cortesia de G. (A-C de Schatten e Mazia. 1980). D cortesia de F. O análogo humano da proteína PH-20 não é ainda conhecido. Schatten e Schatten. J. Schatten. (D) Micrografia de transmissão ao microscópio eletrônico da internalização do espermatozóide através do cone de fertilização. (B) Formação do cone de fertilização. Ainda assim. Os animais foram temporariamente esterilizados por esses anticorpos..19 Varredura ao microscópio eletrônico da entrada do espermatozóide em óvulo de ouriço-do-mar. Epel. esses experimentos mostram que o princípio da contracepção imunológica está bem fundamentado. (C) Internalização do espermatozóide no óvulo. Fusão de gametas e a prevenção da polispermia Fusão entre as membranas do óvulo e do espermatozóide O reconhecimento do espermatozóide pelo envoltório vitelínico ou zona é seguido pela lise da porção do envoltório ou zona na região da cabeça do espermatozóide (Colwin e Colwin. (A) Contato da cabeça do espermatozóide com microvilosidades do óvulo através do processo acrossômico.19. 1983). As proteínas da zona pelúcida humana e suas funções ainda não foram estabelecidas tão claramente como no camundongo. A superfície do óvulo está coberta de pequenas microvilosidades. A entrada do espermatozóide no óvulo do ouriço-do-mar está ilustrada na Figura 4. após os quais a fertilidade foi restabelecida. porém. A homologia entre óvulo e espermatozóide é novamente (A) (B) Figura 4. a fusão espermatozóide-óvulo parece causar a polimerização da actina e a extensão de várias microvilosidades para formar o cone de fertilização (Summers et al. 1976. 1975. Longo. certos antígenos do espermatozóide apresentam um padrão semelhante de localização no espermatozóide.) (C) (D) .

todas as regiões do óvulo são capazes de se fundir com o espermatozóide. provindo do espermatozóide. existem regiões especializadas na membrana para o reconhecimento e fusão com o espermatozóide (Vacquier. Proteínas como a HA do vírus da influenza e a proteína F do vírus Sendai promovem a fusão celular. que é alargada pela polimerização da actina. tal como as proteínas fusogênicas virais. como na maioria dos animais estudados. no qual cada cromossomo está representado não duas. a bindina contém uma longa região de aminoácidos hidrofóbicos perto do terminal amino. Theodor Boveri demonstrou em 1902 que tais células ou morreriam ou se desenvolveriam anormalmente (Figura 4. Blobel et al. No ouriço-do-mar. restaurando o número de cromossomos apropriado para a espécie. que fora tão necessária para conseguir a penetração. sendo possível que a bindina também seja uma dessas proteínas. na qual somente um espermatozóide penetra o óvulo. A mais comum é a de impedir a entrada de mais de um espermatozóide no óvulo. Na monospermia normal. 1992. a capacidade de fusão da membrana do óvulo. centríolo e flagelo podem penetrar no ovo. Yanagimachi e Noda (1970) mostraram que processo semelhante ocorre na fusão de gametas de mamíferos (Figura 4. No ouriço-do-mar. mediar a união das duas membranas (Almeida et al. a lisina que dissolve o envoltório vitelínico também demonstrou ter atividade fusogênica (Hong e Vacquier. podese encontrar material do espermatozóide na membrana do óvulo (Gundersen et al. mas três vezes. Como não há mecanismos para assegurar que cada uma das quatro células receba o número e o tipo apropriado de cromossomos. Algumas células receberiam cópias extra de certos cromossomos e outras células não os teriam. tal como o processo acrossômico. Glabe (1985) mostrou que a bindina do ouriço-do-mar promove a fusão de vesículas fosfolipídicas e que. freqüentemente mediado por proteínas “fusogênicas” específicas. O óvulo do ouriço-do-mar tem dois mecanismos que evitam a polispermia: uma reação rápida.. 1986). 1979). 1995). um núcleo haplóide do espermatozóide e um do óvulo se combinam para formar o núcleo diplóide do ovo fertilizado (zigoto).. Prevenção da Polispermia Assim que um espermatozóide tiver penetrado o óvulo. mitocôndrias. em vez de um fuso mitótico bipolar separar os cromossomos em duas células. se dividirá para formar os dois pólos do fuso mitótico durante a clivagem.20). A entrada de múltiplos espermatozóides – polispermia – conduz à conseqüências desastrosas na maioria dos organismos. como o centríolo se divide para formar os dois pólos do aparelho mitótico. Evidência atual sugere que a fertilina do camundongo liga-se à integrina α6β1 da membrana assumindo-se que a região hidrofóbica da fertilina pode. A fusão é um processo ativo.140 PARTE II Padrões de Desenvolvimento demonstrada. pode prover um núcleo haplóide e um centríolo para o óvulo. causada pela exocitose dos grânulos corticais. Em abalones. e uma reação mais lenta.html] As espécies desenvolveram maneiras de prevenir a união de mais de dois núcleos haplóides. além de uma seqüência que sugere ligação com uma integrina da membrana do óvulo.21). esses serão distribuídos de maneira desigual. Pior ainda. Após a junção. em seguida. As proteínas fertilinas da membrana do espermatozóide dos mamíferos são essenciais para fusão espermatozóide-óvulo (Primakoff et al.. porque o cone de fertilização transitório. parece se prolongar pela polimerização da actina. aqui.. efetivada por uma mudança elétrica na membrana plasmática do óvulo.. O núcleo e a cauda do espermatozóide passam pela ponte citoplasmática. torna-se um risco. [fert6. a fertilização por dois espermatozóides resulta em um núcleo triplóide. Myles et al. 1994). . os cromossomos triplóides se dividiriam em quatro células. qualquer espermatozóide que penetra o óvulo. O centríolo. No ouriço-do-mar. o núcleo. A fertilina do camundongo tem regiões hidrofóbicas semelhantes às das proteínas fusogênicas virais. em várias outras espécies. 1970). 1987. Quando as membranas se fundem.

O bloqueio rápido à polispermia. 1994. que constantemente inibe a entrada de sódio no . é conseguido pela mudança do potencial elétrico da membrana do óvulo. A água do mar tem uma alta concentração do íon sódio.) O BLOQUEIO RÁPIDO DA POLISPERMIA. do espermatozóide fundindo em paralelo a membrana do plasma do óvulo. O ponto “calvo” (sem microvilosidades) é o local abandonado pelo corpo polar. uma diferença especialmente pronunciada para os íons de sódio e potássio. ao passo que o citoplasma do óvulo tem relativamente pouco sódio. (Segundo Yanagimachi e Noda. Yanagimachi.20 Entrada de espermatozóide no óvulo do hamster dourado. Yanagimachi. a concentração iônica do óvulo difere muito daquela do ambiente. Essa condição é mantida pela membrana celular. A membrana celular do óvulo é notável não somente por sua habilidade de se fundir com a membrana espermática. mas também por sua capacidade de resistir a uma ulterior fusão imediatamente após a entrada de um espermatozóide (Just. O oposto acontece com os íons potássio. (C ) Micrografia eletrônica de transmissão mostrando a cabeça do espermatozóide atravessando a zona. fotografias cortesia de R. 1970. (D) Micrografia eletrônica de transmissão. (B) Vista próxima da ligação espermatozóide-zona. Essa provê uma barreira seletiva entre o citoplasma e o ambiente exterior. (E) Diagrama da fusão do acrossomo do espermatozóide e membranas plasmáticas com as microvilosidades do óvulo. 1919).CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 141 (A) (B) (C) Zona (E) Membrana acrossômica interna Núcleo Segmento equatorial do acrossomo Figura 4. (A) Micrografia eletrônica de varredura do ato da fusão.

Um pequeno influxo de íons de sódio no óvulo é permitido. 1907. Jaffe e seus colaboradores mostraram que a polispermia podia ser induzida quando óvulos foram supridos artificialmente com uma corrente elétrica que mantinha negativo o seu potencial de membrana. Quando tais óvulos são expostos a essa proteína. morte do embrião tros) têm um segundo mecanismo para assegurar que múltiplos espermatozóides não penetrem no citoplasma do óvulo (Just.) Fusão pronuclear (B) 1a clivagem (C) (D) (E) (F) oócito e impede o escoamento de íons de potássio para o ambiente. 1991) forneceram o que poderá ser uma pista importante para a compreensão desse processo. Óvulos do ouriço-do-mar (e muitos ou- Células em desintegração. Se os íons de sódio não forem suficientes para ocasionar um deslocamento positivo do potencial de membrana. causando a morte prematura do embrião (F). provavelmente. Embora o espermatozóide possa se fundir com membranas tendo um potencial de –70 mV. 1976). 1983). Não é conhecido como a ligação ou a entrada do espermatozóide sinaliza a abertura dos canais de sódio.21 Pronúcleos do oócito Desenvolvimento aberrante de um óvulo de ouriço-do-mar fecundado por dois espermatozóides. a fertilização podia ser inteiramente prevenida conservando tal potencial positivo (Jaffe. O BLOQUEIO LENTO DA POLISPERMIA.22B-D). ocorre a polispermia (Gould-Somero et al. (A) Fusão de três núcleos haplóides. regulada pela carga elétrica transmembrana (Iwao e Jaffe. Quando inserimos um eletrodo no óvulo e colocamos um outro fora do oócito. o potencial de membrana do óvulo do ouriço-do-mar somente permanece positivo por cerca de um minuto. Gould e Stephano (1987. a mudança da velocidade do influxo de sódio e do potencial de membrana resultante são muito parecidos com aqueles produzidos pelo espermatozóide vivo. [fert7. porém. 1980). 1980). e usualmente expresso como –70 mV porque o interior da célula está carregado negativamente em relação ao exterior. e divisão dos dois centríolos espermáticos para formar quatro pólos mitóticos. 1989). Não é conhecido como diferenças no potencial de membrana atuam sobre o espermatozóide bloqueando a segunda fecundação. Os autores isolaram do espermatozóide de Urechis (um verme equiuróide marinho) uma proteína cromossômica capaz de abrir canais de sódio de óvulos de Urechis. o potencial da membrana muda para um nível positivo (Longo et al. O bloqueio rápido é transitório.html] Dentro de 1-3 segundos após a ligação do primeiro espermatozóide.22 A). (B. O bloqueio rápido da polispermia podia também ser evitado baixando-se a concentração do sódio da água (Figura 4. 1979. (E) Quatro células contendo números e tipos diferentes de cromossomos são formadas.142 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Oócito Pronúcleos do espermatozóide Centrossomo do espermatozóide Figura 4. mas provavelmente não na maioria dos mamíferos (Jaffe e Cross. Um bloqueio elétrico à polispermia também ocorre em rãs (Dross e Elinson. cada um contendo 18 cromossomos. Muito provavelmente.. não pode se fundir com membranas com um potencial de repouso positivo. trazendo a diferença de potencial para +20 mV (Figura 4. Carroll e Epel (1975) demonstraram que a . 1919). o espermatozóide conduz um componente (possivelmente uma proteína fusogênica carregada positivamente). parece ser causada pela ligação do espermatozóide ao óvulo. (D) Na anáfase da primeira divisão. C) Os 54 cromossomos se distribuem aleatoriamente nos quatro fusos. Jaffe. sendo a inserção desse componente na membrana do óvulo. podemos medir a constante diferença potencial da membrana plasmática do óvulo. Reciprocamente.. (Segundo Boveri. Esse potencial de repouso da membrana é geralmente cerca de 70 mV. 1986). Essa curta mudança de potencial não é suficiente para prevenir a polispermia de maneira permanente. os cromossomos duplicados são arrastados para os quatro pólos. A abertura dos canais de sódio no óvulo.

Com a entrada do espermatozóide. Diretamente abaixo da membrana do óvulo do ouriço-do-mar existem 15. a diferença de potencial através da membrana celular do óvulo é de aproximadamente –70 mV. (B) Ovos controle desenvolvendo-se em Na+ 490 mM. Em mamíferos. que fornece apoio para os blastômeros durante a clivagem. Outras proteínas.23 e 4. secionando o receptor de bindina e todo espermatozóide a ele ligado (Vacquier et al. (D) Tabela mostrando a elevação da polispermia com o decréscimo da concentração do íon sódio.) [Na+] (mM) Porcentagem de ovos polispérmicos (B) (C) (D) polispermia ainda pode ocorrer se os espermatozóides ligados ao envoltório vitelínico não forem removidos de alguma maneira. Uma terceira proteína. Como mostra a Figura 4.000 grânulos corticais.. 1973. o envoltório vitelínico se expande e passa a ser chamado de envoltório de fertilização (Figuras 4. Jaffe. A. 1991). Mozingo e Chandler. Essas enzimas dissolvem os postos vitelínicos que conectam as proteínas do envoltório vitelínico à membrana celular. produto dos grânulos corticais. Enzimas liberadas modificam os receptores de espermatozóide da . As primeiras são proteases. À medida que esse envoltório se forma. Finalmente. mucopolissacarídeos liberados dos grânulos. A célula estende microvilosidades alongadas cujas extremidades se ligam a essa camada hialina. porém. fotografias cortesia de L. cada um com 1 um de diâmetro (veja Figura 4. 1977. (A) antes da adição do espermatozóide. um bloqueio mecânico mais lento da polispermia que se torna ativo cerca de 1 minuto após a primeira ligação bem sucedida espermatozóide-óvulo. dessa forma. a reação granular não cria um envoltório de fertilização. (de Jaffe. produzem um gradiente osmótico que permite a entrada da água no espaço entre a membrana celular e o envoltório e. Há várias proteínas associadas com esse processo de exocitose de grânulos corticais. 1982). O processo se inicia cerca de 20 segundos após a fixação do espermatozóide e se completa ao fim do primeiro minuto da fertilização. os espermatozóides são liberados. 1980. o envoltório de fertilização começa a se formar no local da entrada do espermatozóide e continua sua expansão ao redor do óvulo.23. o potencial se desloca na direção positiva. Os ovos de Lytechinus foram fotografados durante a primeira clivagem. liberando seu conteúdo para o espaço entre a membrana e a esteira fibrosa das proteínas do envoltório vitelínico. 1978). uma quarta proteína granular. Essa remoção é conseguida pela reação dos grânulos corticais. forma uma capa em volta do óvulo (Hylander e Summers.22 Adição de espermatozóide (A) Segundos Potencial de membrana de óvulos de ouriço-do-mar antes e após a fertilização.6B). De 1 a 3 segundos após o espermatozóide fertilizante ter entrado em contato com o óvulo.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 143 Figura 4. enrijece o envoltório de fertilização através de ligações cruzadas entre resíduos de tirosina em proteínas adjacentes (Foerder e Shapiro. Glabe e Vacquier. esses grânulos se fundem com a membrana plasmática do óvulo. (C) Polispermia em ovos fertilizados em Na+ 120 mM (colina foi substituída por sódio). a hialina.24). uma peroxidase. o efeito é o mesmo.

O meca- nismo da reação dos grânulos corticais é semelhante aquele da reação acrossômica. iniciado no ponto de entrada do espermatozóide. ou de corantes como fura-2. começando no ponto de entrada do . ZP2 é cortada pelas proteases granulares perdendo também sua habilidade de ligar espermatozóide (Moller e Wassarman. A liberação de cálcio armazenado na região intracelular. Essa modificação é chamada reação da zona. Florman e Wassarman (1985). tanto ZP3 como ZP2 são modificadas. 1989). um envoltório de fertilização se forma em volta do óvulo. propuseram que os grânulos corticais do óvulo do camundongo contêm uma enzima que corta os resíduos terminais de açúcares de ZP3. 1993) demonstraram que após a fertilização. Após a fertilização. Espermatozóide foi adicionado a óvulos de ouriço-do-mar. Esses grânulos corticais contêm N-acetilglicosaminidases capazes de clivar N-acetilglicosamina de cadeias de carboidrato de ZP3. (D) O envoltório de fertilização está completo. as membranas corticais se fundem com aquelas do ovo.) (C) (D) zona pelúcida de maneira que esses não mais podem ligar-se a espermatozóide (Bleil e Wassarman. 1973. (A) Dez segundos após a adição de espermatozóide. (B. uma onda de exocitose se propaga ao redor do corte até o lado oposto do ovo. o resíduo de N-acetilglicosamina é removido. (de Vacquier e Payne. A Prancha 12 mostra a notável onda de liberação de cálcio que se propaga através do óvulo do ouriço-do-mar. e a suspensão foi fixada em formaldeído para evitar futuras reações. ZP3 não serve como substrato para a ligação de galactosiltransferase.23 (A) (B) Formação do envoltório de fertilização e remoção do excesso de espermatozóide. Esses corantes emitem luz quando ligam íons livres de cálcio. cortesia de V. Durante essa reação. Os óvulos são injetados com o corante e fecundados. CÁLCIO COMO O INICIADOR DA REAÇÃO GRANULAR CORTICAL . Assim. causando exocitose de seu conteúdo (veja Figura 4. Miller e colaboradores (1992. com isso liberando espermatozóide ligado à zona e evitando a fixação de mais espermatozóide.24). pode ser monitorada visualmente pelo uso de corantes luminescentes (isolados da água-viva luminescente) como a aequorina ativado pelo cálcio. Vacquier. Nessas concentrações. a concentração intracelular de cálcio do ovo aumenta muito.C) 25 e 35 segundos após a inseminação. e o excesso de espermatozóide é removido. 1980). esses foram vistos rodeando o óvulo.144 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. Após a fusão dos grânulos corticais ao redor do ponto de entrada do espermatozóide. D. o espermatozóide não pode mais iniciar ou manter sua ligação à zona pelúcida e é rapidamente descartado.

B-E de Chandler e Heuser. a liberação de cálcio pode ser vista começando em dois pontos separados da superfície celular (Hafner et al. O mecanismo dessa onda será discutido logo adiante (veja Informações adicionais & Especulações. 1979.. 1965. A colocação de . Como documentado pelas fotografias. causando a entrada de água e tumefação do espaço entre o envoltório vitelínico e a membrana celular. E) Micrografias eletrônicas de transmissão e varredura da mesma região de um ovo recém-fertilizado. cortesia de D.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 145 Membrana plasmática (i) do óvulo Microvilosidade Envoltório vitelínico Figura 4. em 30 segundos no ovo do ouriço-do-mar. 1977.. (A segundo Austin. 1988). Outras enzimas liberadas dos grânulos corticais endurecem o envoltório vitelínico (agora o envoltório de fertilização) e liberam espermatozóide a ele ligado. (B. liberam proteases que cortam as proteínas que ligam o envoltório vitelínico à membrana celular. permitindo a esses cátions atravessar barreiras antes impermeáveis. (D.) Microfilamentos Hialina (D) Espermatozóide é liberado (iv) Envoltório de fertilização Camada hialina (A) Membrana celular (E) espermatozóide um feixe de luz atravessa a célula (Steinhardt et al. os íons livres de cálcio são re-seqüestrados pouco após sua liberação.. 1988). A droga A23187 é um ionóforo que transporta íons de cálcio através de membranas. os íons de cálcio não se difundem simplesmente através do óvulo a partir do ponto da entrada do espermatozóide. a grosso modo.24 Grânulo cortical (ii) Espermatozóide supranumerário no envoltório vitelínico (B) Enzimas proteolíticas e mucopolissacarídeos são liberados (iii) (C) Exocitose de grânulos corticais. Hafner et al. Ao contrário.. (A) Diagrama esquemático mostrando os eventos levando à formação do envoltório de fertilização e a camada hialina. Vários experimentos demonstraram que íons de cálcio são responsáveis diretos pela propagação da reação cortical e que são armazenados dentro do próprio óvulo. E. a liberação de cálcio inicia-se de um lado da célula e termina do outro. Mucopolissacarídeos liberados pelos grânulos formam um gradiente osmótico. Gilkey et al. mostrando a elevação do envoltório de fertilização e os pontos nos quais os grânulos corticais fundiram com a membrana plasmática do ovo (flechas em D). À medida que os grânulos corticais sofrem exocitose. Chandler. página 147). A total liberação de íons de cálcio é completada. Quando dois espermatozóides entram no citoplasma do óvulo. 1978.C) Micrografias eletrônicas de transmissão e de varredura do córtex de um ovo não fertilizado de ouriço-do-mar.

Gardiner e Grey.25 Retículo endoplasmático rodeando grânulo cortical no óvulo de ouriço-do-mar. 1985. 1983. esse retículo é pronunciado no córtex e rodeia os grânulos (Figura 4. o retículo endoplasmático cortical fica 10 vezes mais abundante durante o amadurecimento do óvulo e desaparece localmente dentro de um minuto após a ocorrência da onda de exocitose em qualquer região do córtex.. Cálcio livre é capaz de liberar cálcio seqüestrado de seus locais de armazenamento. Estudos posteriores (Hollinger e Schuetz. Jaffe e Gould. J. 1954). 1985. 1986). causando assim uma onda libertadora do íon cálcio e exocitose granular cortical. répteis e salamandras. Portanto. (A de Luttmer e Longo. Fulton e Whittingham. 1985). Nos óvulos ricos em gema de certas aves. camundongo e rã. ao retículo sarcoplasmático do músculo esquelético ou cardíaco. Hamaguchi e Hiramoto. Coelhos. a polispermia é minimizada pelo pequeno número de espermatozóides que atingem o local da fecundação (Braden e Austin. Luttmer e Longo. Jaffe (1983) compara esse retículo endoplasmático seqüestrador de cálcio. Longo. cujos óvulos sofrem uma reação granular cortical. 1974. somente um núcleo haplóide de espermatozóide pode fundir-se com o núcleo haplóide do óvulo. leva à reação granular cortical e à elevação do envoltório de fertilização. Na rã Xenopus. Variações em estratégias preventivas da polispermia existem em toda a natureza. Qualquer que seja o mecanismo. (A) O retículo foi corado com ósmio-iodeto de zinco para permitir a visualização por micrografia de transmissão eletrônica. Os íons de cálcio internos são armazenados no retículo endoplasmático do óvulo (Eisen e Reynolds. a liberação de cálcio é autopropagada. Uma vez iniciada.25. 1991). 1976. B de McPherson et al. vários espermatozóides realmente penetram o citoplasma do óvulo. mesmo na ausência de íons de cálcio na água do mar. e ninguém iria disputar o seu grau de sucesso. Figura 4. Nos mamíferos. Elinson. O bloqueio à polispermia em hamsters parece ser controlado somente pela liberação de sítios que ligam o espermatozóide na zona pelúcida (Miyazaki e Igusa. todos menos um são induzidos a se desintegrar no citoplasma após a fusão do pronúcleo do óvulo com um dos pronúcleos do espermatozóide (Ginzburg. 1985). certos mamíferos têm defesas para a polispermia sobre as quais pouco sabemos. A23187 provoca a liberação de íons de cálcio já seqüestrados em organelas dentro do óvulo (Chambers et al. 1985. Finalmente. 1992.146 PARTE II Padrões de Desenvolvimento ovos não-fertilizados de ouriço-do-mar em água do mar contendo A23187. cortesia de F. Os anticorpos mostram esses canais no retículo endoplasmático cortical.. 1974).) (A) (B) . (B) Retrato de um óvulo inteiro corado por anticorpos fluorescentes para os canais de liberação de cálcio. Luttmer. O grânulo é visto rodeado pelo retículo. 1988) mostraram que o íon de cálcio inicia reações granulares corticais quando injetado em ovos de ouriço-domar. No ouriço-do-mar e na rã. De uma maneira desconhecida. no entanto. Kline. 1981. cortesia de S. se apoiam num bloqueio da polispermia a nível da membrana. 1978. 1981. Steinhardt e Epel. Terasaki e Sardet.

capazes de ativar um conjunto de enzimas chamadas de fosfolipase C. 1990).. 1991). e quando injetaram ativadores da proteína G nesses óvulos. que uma proteína G pode estar envolvida na regulação de íons seqüestrados de cálcio. 1989. a ligação do espermatozóide a um receptor na membrana celular do óvulo pode mudar a sua conformação de modo a ativar a proteína G e iniciar a cascata (Figura 4. os íons de cálcio podem difundir diretamente. O outro caminho é o do receptor da tirosinoquinase em cascata. recrutamento de mRNA e recomeço do ciclo celular. ocasionando uma liberação local de cálcio (Ferris et al.html] Parece. e esse pode continuar a onda. 1986). Os efeitos mediados por IP3 podem ser abortados pela pré-injeção de agentes quelantes de cálcio no óvulo (Turner et al. A proteína que faz a troca Na + /H+. [fert8. Nishizuka. O primeiro é capaz de abrir canais de cálcio.. ligando-se a mais receptores e assim por diante. O resultado disso é a elevação de cálcio e do pH intracelulares. 1986. Em primeiro lugar. 1985). portanto. Eles levantaram a hipótese que se essa proteína mediar a fertilização por ser ativada por um receptor ligante de espermatozóide. os grânulos corticais se fundem com a membrana celular na presença de concentrações altas de cálcio. Essa onda de íons de cálcio é propagada por toda célula.. 1992.. A etapa regulatória chave é a ativação da fosfolipase C. Conforme apresentado no Capítulo 3. Como em ouriço-domar IP3 também parece mediar a liberação de cálcio de sítios no retículo endoplasmático (Lechleiter e Clapham. começando no ponto da entrada do espermatozóide. que produz esses dois compostos. IP 3 é também capaz de liberar íons de cálcio em óvulos de vertebrados. IP3 injetado pode liberar íons cálcio seqüestrados no óvulo e muitos outros tipos de células (Swann e Whitaker. Shen e Burgart. impede todos os aspectos da ativação do óvulo pelo espermatozóide incluindo exocitose granular.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 147 Informações adicionais & Especulações A Ativação do Metabolismo dos Gametas S e a liberação do íon cálcio é necessária para ativação do oócito. causaram exocitose granular na ausência de espermatozóide (Turner et al. que também é usado na proliferação e diferenciação celular.33 e 3.5. Existem várias maneiras pelas quais isso pode acontecer. 1993). o aumento na concentração de IP 3 intracelular é visto ocorrer dentro de 10 segundos após a fecundação de ovos do ouriço-do-mar (Ciapa e Whitaker. respondem com uma onda de exocitose que segue os íons de cálcio. 1995). 1989. 1986. 1992). 1986). Uma vez liberados. e na exocitose de grânulos corticais. Essa cataliza a hidrólise de fosfatidilinositol 4. Assim. e o bloqueio do seu receptor em óvulos de hamster impede a liberação de cálcio no ato da fertilização. também necessita de íons cálcio para sua atividade. Esse receptor ativa a proteína G (veja Figuras 3. 1984. A ligação de íons de cálcio a esses receptores libera mais cálcio.5 trifosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). largamente conhecido como liberadora de íons de cálcio na contração muscular. O bloqueio da PKC em óvulos de ouriços-do-mar inibe a alcalinização do citosol observada durante a fertilização normal (Shen e Buck. Jaffe e seus colaboradores encontraram a proteína G em óvulos de ouriço-do-mar e rã. 1995). que é transferida do citosol para a membrana plasmática do ovo pouco após a fecundação. Esses receptores da superfície . trifosfato (IP3) é o evento primário para a liberação de íons cálcio do seu local de armazenamento intracelular. então a mesma proteína G poderia ser ativada por um neurotransmissor se o ovo contiver um receptor para neurotransmissor capaz de ativar a proteína G. Terasaki e Sardet. 1991). 1986. confirmando que IP3 estimula a liberação de cálcio armazenado. é considerado ativar a proteína quinase C (PKC) da membrana. O IP3 formado no local da entrada do espermatozóide é considerado ligar-se a esses receptores de IP3 no retículo endoplasmático. Como se pronunciou um investigador (Berridge. Berridge.5-bifosfato (PIP2) em dois segundos mensageiros: inositol 1. como o espermatozóide motiva essa liberação? Realmente não se sabe. 1992. Ayabe et al. Xu e colaboradores (1994) mostraram que o bloqueio da mediação por IP3 da saída de cálcio.. e pode ser responsável pela ativação da proteína que troca íons de sódio por íons de hidrogênio (Swann e Whitaker. tanto DAG como IP 3 estão envolvidos nas ativação do óvulo. DAG. Tal ativação foi inibida por quelantes de cálcio.. crescimento celular. No interior da membrana plasmática esse receptor é ligado à proteína trimérica G. Mohri e colaboradores (1995) mostraram que o cálcio liberado por IP3 é necessário e suficiente para liberação de cálcio. O outro segundo mensageiro. Eles injetaram mRNA para o receptor de serotonina ou de acetilcolina em óvulos de rã. Olds et al. Canais de cálcio respondendo ao IP3 foram encontrados no retículo endoplasmático do óvulo. secreção hormonal. Kline et al.. DAG estimula a troca de prótons que permite o efluxo de íons de hidrogê- nio das células. A questão então é: o que inicia a produção de IP3? Há dois caminhos que parecem estimular a liberação de cálcio: aquele do receptor ligado à proteína G. levando à sua dissociação em subunidades. 1991).. Busa et al.35).4. Dados recentes sugerem que produção do inositol 1.. percepção sensorial e liberação de neurotransmissores (Berridge.4. 1986.26A). como o EGTA. Furuichi et al. ou facilitar a liberação de mais íons de cálcio de receptores sensíveis ao cálcio localizados no retículo endoplasmático (McPherson et al.. A libertação de íons cálcio e a reação dos grânulos corticais rapidamente seguem a formação ou injeção de IP3 (Whitaker e Irvine. 1993). 1986. 1993): “Exatamente como o espermatozóide dispara o processo explosivo da liberação do cálcio no óvulo. o primeiro caminho se inicia pela ligação de um ligante extracelular (como a acetilcolina ou a serotonina) à uma proteína receptora transmembrana. ainda permanece algo misterioso”. conforme demonstrado por Kline e colaboradores (1988. Miyazaki et al.

. (A) Trajetória do fosfatidilinositol mediado pela G-proteína. Figura 4. Yim et al. Evidências recentes (Moore et al. (C) Trajetória da tirosinoquinase citoplasmática. Quando o mRNA continha um ponto de mutação que impedia Mecanismos possíveis da ativação do óvulo.26 PDGF) foi injetado em oócitos de estrela-do-mar. 1994) demonstram que a ativação do receptor da tirosinoquinase também produz IP3 e ativa a onda de cálcio e a reação granular cortical (Figura 4. esses apresentaram aumento de cálcio intracelular livre. 1994. (E) Trajetórias de ativadores solúveis.148 PARTE II Padrões de Desenvolvimento celular foram sintetizados e foram detectados na membrana celular do óvulo. após a maturação dos oócitos. exocitose de grânulos corticais e síntese de DNA. (B) Trajetória do receptor da tirosinoquinase (RTK). Entretanto. a cascata ligada à proteína-G não é o único caminho capaz de gerar IP3 (veja Capítulo 3).. Experimentos semelhantes mostraram que quando neurotransmissores ativam o caminho da proteína G–IP3 em oócitos de camundongo. PDGF foi adicionado à água banhando os óvulos. 1992. Moore et al. Shilling et al. Quando. o receptor PDGF foi sintetizado e incorporado nas membranas celulares desse organismo. 1994. (D) Trajetória na qual a G proteína ou tirosinoquinase ativadas na membrana espermática ativam trajetórias no óvulo.26b). Quando o mRNA para o receptor dessa quinase (o receptor para o fator de crescimento derivado das plaquetas. Alguns se desenvolveram em larvas. 1993).. são induzidos os eventos da fertilização (Williams et al.. Os óvulos puderam ser “fertilizados” por serotonina e acetilcolina e foi observado a reação cortical.. CAMINHOS ANTERIORES À FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (A) Espermatozóide (B) (C) Fosfolipase C (PLC) Receptor G-proteína Receptor de Tirosinoquinase Receptor de IP3 Tirosinoquinase Retículo endoplasmático APÓS A FUSÃO DO ESPERMATOZÓIDE (D) Fator solúvel do óvulo Fatores solúveis do Espermatozóide G-proteína Receptor de IP3 Retículo endoplasmático .

O espermatozóide desse macho somente estimula o desenvolvimento do ovo.26 E). rãs. Eles sugerem que os componentes ativadores do óvulo se localizam na membrana ou no citoplasma do espermatozóide. nenhuma dessas reações ocorreu (Shilling et al. Em deuterostomatas. Esses eventos acontecem no citoplasma e ocorrem sem o envolvimento dos núcleos. 5 segundos após ligar a bindina. aciona um conjunto de eventos metabólicos pré-programados. reativada pelo espermatozóide. resultando na onda de cálcio varrendo o óvulo (Jaffe. No entanto. recrutamento de mRNA e retomada do ciclo celular) não são observados. É até mesmo possível que por ocasião da fusão das membranas. . criar IP3 e induzir o fluxo de cálcio no óvulo. não contribui com material genético (Uzzell. assim. *Em certas salamandras. Não é conhecido qual o papel que essa proteína pode ter na fisiologia da ativação do óvulo. 1994). iniciado pela liberação intracelular de íons de cálcio. (No cenário apresentado na Fi- gura 4. fica fosforilado em um dos seus resíduos tirosina citoplasmáticos (Abassi e Foltz.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 149 o receptor interagir com a fosfolipase C. a bindina meramente liga o óvulo ou. tanto o caminho ligado ao receptor proteína-G como aquele do receptor da tirosinoquinase. Terasaki e Sardet. as proteínas G da membrana espermática ou as tirosinoquinases (ativadas pela geléia do óvulo para iniciar a reação acrossômica) ativem a cascata polifosfoinositídica para liberação de cálcio do óvulo. A ativação de todos os óvulos parece depender do aumento da concentração de íons livres de cálcio dentro do óvulo. não pode se desenvolver sozinho. e o bloqueio lento. A microinjeção dessa proteína em óvulos de camundongo pode iniciar liberação de cálcio. como lesmas e vermes. As respostas do óvulo ao espermatozóide podem ser divididas em “precoces” que ocorrem em poucos segundos após a reação cortical e “tardias” que acontecem vários minutos após o inicio da fertilização (Tabela 4.) Ainda outra possibilidade é que o agente ativo na liberação de cálcio ligado venha do citosol do espermatozóide. Para detalhes desse complexo mecanismo de procriação veja Bogart et al.26 C. O receptor da bindina não oferece pistas para explicar como ocorre essa ativação.26 D. Respostas precoces O contato entre o espermatozóide do ouriço-do-mar ativa dois principais bloqueios à polispermia: o bloqueio rápido. jeffersonianum).. mas à fusão das membranas do óvulo e do espermatozóide. tais como: peixes. pode interagir com a tirosinoquinase plasmática tal como aqueles que medeiam a liberação de cálcio durante a ativação de células T (Figura 4. iniciado pelo influxo de sódio na célula. motive a fosforilação de proteínas necessárias em fases mais avançadas do desenvolvimento. os outros parâmetros da ativação do óvulo (exocitose dos grânulos. Essa ativação é apenas o estímulo. 1991). 1993). Outra possibilidade é que a ativação do caminho do IP3 não é devida à ligação do espermatozóide e óvulo. 1989. ouriços-do-mar e mamíferos. Esse ovo. a ativação é acompanhada pela liberação de íons de cálcio do retículo endoplasmático. a salamandra prateada copula com o macho da salamandra Jefferson (A. essa função desenvolvimental da fertilização está totalmente divorciada da função genética. Em protostomatas. por não ter semelhante em outras proteínas transmembrana. porém. 1983. ela tem um papel igualmente importante na iniciação de processos que iniciam o desenvolvimento.. Isso sugere que o receptor de bindina ligado. Cada uma produz um ovo com um número não-reduzido de cromossomos. porém. Parrington e colaboradores (1996) isolaram uma proteína de 33-kDA. 1964). parecem ser capazes de ativar essa fosfolipase.1). talvez. ao menos parte do cálcio geralmente entra no óvulo vindo de fora. Mc Culloch e Chambers (1992) obtiveram evidência eletrofisiológica que a ativação dos óvulos do ouriço-do-mar não ocorre até depois da junção do espermatozóide com o óvulo. 1994). Ativação do metabolismo do óvulo Embora a fertilização seja freqüentemente descrita como mero meio de junção de dois núcleos haplóides. chamada oscilina. Hall et al..* O óvulo do ouriço-do-mar maduro é uma célula metabolicamente lenta. A salamandra prateada (Ambystoma platineum) é uma espécie híbrida que consiste somente de fêmeas. Assim. localizada no escasso citoplasma da cabeça do espermatozóide (Figura 4.

Essa ativação acontece na ausência total de íons de cálcio na água do mar. Por último. A elevação do envoltório de fertilização. 1995). pois NADP+ (mas não o NAD+) pode ser utilizado como coenzima para biossíntese lipídica. a Tempos aproximados baseados em dados de S. 1988). purpuratus (15-17oC).. 1995. Essa mudança pode ter importantes conseqüências para o metabolismo lipídico. punctulata (18-20oC) e L. Mohri et al. nem reinício da divisão celular (Kline. 1989). óvulos podem ser ativados artificialmente na ausência de espermatozóide por procedimentos que liberam cálcio livre no oócito. assim os tempos apresentados referem-se à essa espécie.1 Evento Eventos da fertilização do ouriço-do-mar aproximado Tempo aproximado após a inseminaçãoa Ligação espermatozóide-óvulo Elevação do potencial de fertilização (bloqueio rápido da polispermia) Fusão das membranas espermatozóide-óvulo Primeira detecção de aumento de cálcio Exocitose das vesículas corticais (bloqueio lento da polispermia) Ativação da NAD quinase Aumento de NADH e NADPH Aumento do consumo de O2 Entrada do espermatozóide Efluxo de ácido Aumento de pH (permanece alto) Descondensação da cromatina do espermatozóide Migração do núcleo do espermatozóide para o centro do óvulo Migração do núcleo do óvulo para o núcleo do espermatozóide Ativação da síntese protéica Ativação do transporte de aminoácidos Iniciação da síntese de DNA Mitose Primeira clivagem O segundos dentro de 1 sec dentro de 6 sec 6 sec 15-60 sec começa em 1 min começa em 1 min começa em 1 min 1-2 min 1-5 min 1. Uma delas é a ativação da enzima NAD+ quinase. que converte o NAD+ em NADP+ (Epel et al. o aumento do pH intracelular. Assim. o NADPH ajuda na regeneração da glutationa e de ovotiois (ovothiols) que podem ser cruciais para remoção de radicais livres que poderiam de outra maneira prejudicar o DNA do ovo e do embrião precoce (Mead e Epel. Se o quelante de cálcio EGTA for injetado no óvulo do ouriço-do-mar. Essa liberação de cálcio é essencial para a ativação do desenvolvimento do embrião. o surto de utilização de oxigênio e o aumento da síntese de proteína e DNA são todos gerados com sua seqüência própria.150 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Tabela 4. Steinhardt e Epel (1974) acharam que quantidades micromolares do ionóforo A23187 induzem no óvulo a maioria das respostas características de um ovo fertilizado normalmente. não ocorre exocitose dos grânulos corticais. o desenvolvimento cessa antes da primeira mitose porque os ovos ainda são haplóides e desprovidos do centríolo espermático necessário para a divisão. mudança do potencial da fertilização. pictus (16-18oC). A . Reciprocamente. . Outro efeito dessa mudança se refere ao consumo de oxigênio. Essa liberação de cálcio ativa uma série de reações metabólicas (Figura 4. Na maioria desses casos. variegatus (22-24oC). descondensação do espermatozóide. L. Um surto de redução de oxigênio é visto ocorrer durante a fertilização.5 min 2-12 min 2-12 min 5-10 min começa em 5-10 min começa em 5-10 min 20-40 min 60-80 min 85.95 min Principais fontes: Whitaker e Steinhardt. 1985. 1981). A enzima responsável por essa redução do oxigênio (para água oxigenada) também é dependente de NADPH (Heinecke e Shapiro. e muito desse “surto respiratório” é usado para cruzamento ligado da membrana de fertilização. a mudança de NAD+ em NADP+ pode ser importante na construção de novas membranas exigidas durante a clivagem. A contagem de tempo para os eventos dentro do primeiro minuto é melhor conhecida para Lytechinius variegatus.27)..

< [H+] ajam em conjunto para fornecer o espectro completo dos eventos da fertilização. Reciprocamente. Em seu lugar. Similarmente no camundongo. e movimentos citoplasmáticos de material morfogenético Figura 4. 1978). agentes que bloqueiam o aumento do pH inibem eventos da fertilização tardia como a síntese de DNA e proteína. os movimentos dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide são prevenidos. Quando ovos recém-fertilizados são colocados em soluções contendo baixas concentrações de íons de sódio e amiloride (uma droga que inibe a troca Na+/H+)... 1985). não há elevação do pH após a fertilização. o pH intracelular também aumenta. (Segundo Epel. tubulinas. 1980).28). A.2. As respostas tardias da fertilização produzidas por essas alterações iônicas. actinas e fatores morfogenéticos que são utilizados durante o desenvolvimento precoce. a síntese protéica falha. e a divisão celular não ocorre (Dube et al. O aumento do pH intracelular começa com o segundo influxo de íons de sódio. O surto de síntese de proteína ocorre vários minutos após a entrada do espermatozóide e não depende da síntese de novo RNA mensageiro (Figura 4.. 1980. 1980 e L. ocasionando enormes mudanças na fisiologia do ovo (Shen e Steinhardt. Jaffe. Whitaker e Steinhardt. replicação de DNA. comunicação pessoal. No óvulo muito menor do camundongo. incluem a ativação da síntese de DNA e da proteína. Esses RNAs incluem aqueles que codificam proteínas como histonas. Acredita-se que essas duas condições iônicas (> [Ca2+].) Aumento do pH intracelular Respostas tardias Pouco tempo após o aumento dos níveis de íons cálcio. a síntese de proteína nova utiliza mRNAs já presentes no citoplasma do oócito (muito mais sobre isso será mencionado no Capítulo 12). não há um aumento dramático na síntese protéica imediatamente em seguida à fertilização. *Novamente. 1982). incluindo a síntese de proteínas e de DNA (Winkler et al. Tal surto de síntese protéica pode ser induzido pelo aumento artificial do pH citoplasmático por íons amônio (Winkler et al. .8 a 7. a variação espécie-para-espécie está à solta.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 151 Influxo de Na+ Alteração do potencial da membrana Bloqueio rápido da polispermia Ativação da NAD+ quinase Ligação e/ou fusão de espermatozóide à membrana celular do óvulo Conversão de NAD+ em NADP+ Bloqueio lento da polispermia Formação da camada hialina Produção de IP3 Ativação de fosfolipase C Liberação de Ca2+ Exocitose de grânulos corticais Estimulação de proteína G ou de tirosinoquinase? Produção de diacil-glicerol Ativação de proteíno-quinase C Estimulação de síntese protéica.27 Troca Na+/H+ Modelo de um possível mecanismo de ativação do óvulo do ouriço-do-mar. causando uma troca 1:1 entre íons de sódio da água do mar e os íons hidrogênio do óvulo*. Essa perda de hidrogênio faz o pH elevar-se de 6.

(A segundo Gross et al. Após a fusão das membranas do espermatozóide e do óvulo. a síntese protéica ocorre sem nova transcrição dos núcleos do zigoto ou embrião. Giles et al. Uma vez dentro do óvulo. assim.. Assim. e isso representa tradução de mensagens recém-transcritas (e. são trocadas por proteínas derivadas do citoplasma do óvulo. (B) Aumento na porcentagem de ribossomos recrutados para polissomos durante as primeiras horas do desenvolvimento do ouriço-do-mar. 1993). a descondensação parece ser iniciada pela fosforilação de duas . embora cada gameta contribua para o zigoto com um genoma haplóide. a compacta cromatina do espermatozóide ao citoplasma do óvulo (Longo e Kunkle.000 mitocôndrias são derivadas do espermatozóide (Gyllensten et al. o pronúcleo masculino sofre uma dramática transformação. um inibidor da transcrição. O envoltório pronuclear forma vesículas com pequenos pacotes.28 Surto de síntese protéica na fertilização emprega mRNA armazenado no citoplasma do oócito. 1991). inativa.) Incorporação de valina[14C] na proteína/mg proteína (cpm x 10-3) água do mar normal Água do mar tratada por actinomicina Horas após a fertilização Porcentagem de ribossomos em polissomos Tempo de desenvolvimento (horas) Fusão do material genético Em ouriços-do-mar. A mitocôndria e o flagelo se desintegram dentro do óvulo. portanto. 1971. em quase todos os animais estudados (o camundongo sendo a principal exceção). O núcleo do óvulo sendo haplóide é chamado de pronúcleo feminino. o núcleo do espermatozóide penetra o óvulo perpendicularmente à superficie do óvulo. As proteínas que prendem a cromatina no seu estado condensado. Em ouriços-do-mar. Reciprocamente. o genoma mitocondrial é transmitido principalmente pelo parente materno. se tanto.152 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 4. com isso. o núcleo do espermatozóide e seu centríolo se separam das mitocôndrias e do flagelo. mitocôndrias derivadas do espermatozóide são encontradas em organismos em desenvolvimento ou em adultos (Dawid e Blackler. 1980). 1964. especialmente durante o primeiro ciclo celular. (A) Síntese protéica em óvulos do ouriço-do-mar Arbacia punctulata fertilizada na presença ou ausência de actinomicina D. Dentro do citoplasma do óvulo. o centrossomo necessário para a produção do fuso mitótico das divisões subseqüentes é derivado do centríolo espermático (Sluder et al. Essa troca permite a descondensação da cromatina do espermatozóide. 1989. Em camundongos estima-se que 1 em cada 10.. poucas... Um segundo surto de síntese protéica ocorre durante os estágios medianos de blástula. 1972. o núcleo do espermatozóide descondensa para formar o pronúcleo masculino. expondo. não é visto em embriões crescendo em actinomicina). Durante as primeiras horas. B segundo Humphreys. 1978).

Em seguida. essas proteínas nucleares estão firmemente compactadas através de ligações dissulfeto. J. 1986)..CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 153 (A) (B) Pronúcleo do óvulo Ponte internuclear Tempo (seg) Pronúcleo do espermatozóide Figura 4. 1980. (B) Fusão de pronúcleos no ovo do ouriço-do-mar. Porter e Vacquier. O espermatozóide do mamífero entra quase tangencialmente à superfície do óvulo em vez de aproximá-la perpendicularmente. Esses microtúbulos se estendem através de todo o óvulo. Esse afrouxamento é considerado facilitar a substituição das histonas espermatozóide-específicas por outras histonas que haviam sido estocadas no citoplasma do oócito (Poccia et al.html] Depois que o espermatozóide do ouriço-do-mar entra no citoplasma do óvulo. [fert9.29 histonas espermatozóide-específicas. 1877). . O núcleo do espermatozóide mamífero também se parte quando sua cromatina descondensa. e trazem os dois pronúcleos um para perto do outro (Hamaguchi e Hiramoto. estendendo seus próprios microtúbulos e integrando-os com os microtúbulos do óvulo formando um áster*. O pronúcleo do espermatozóide está rodeado por microtúbulos do seu áster. a glutationa reduz essas ligações de dissulfeto. Em mamíferos. Mais recentemente. com sua ligação ao DNA (Garbers et al. comparado com menos de uma hora no ouriço-do-mar.19). Esse processo começa quando o espermatozóide entra em contato com uma glicoproteína na geléia do óvulo que eleva o nível da atividade proteinoquinase cAMP-dependente. contatam o pronúcleo feminino. e funde com numerosas microvilosidades (veja Figura 4. Uma vez descondensado. Kvist et Eventos nucleares na fertilização do ouriçodo-mar. desse modo. 1985). o centríolo espermático age como um centro organizador de microtúbulos. chamou-o de “sol dentro do ovo”. e considerou-o feliz indicação de uma fertilização bem-sucedida (Hertwig. B cortesia de F. Simerly e colaboradores (1994) descobriram que certos tipos de infertilidade em homens eram devidos a defeitos na capacidade do centrossoma formar esses ásteres microtubulares.. 1981). o DNA pode iniciar a transcrição e a replicação. O DNA do núcleo espermático é ligado por proteínas básicas chamadas protaminas.) Essas quinases fosforilam vários resíduos básicos das histonas espermatozóideespecíficas interferindo. Uma vez no óvulo. A fusão forma o núcleo zigótico diplóide (Figura 4. (A) Migração dos pronúcleos do óvulo e do espermatozóide em um ovo de Clypeaster japonicus. cortesia dos autores. (A de Hamaguchi e Hiramoto. (Tais proteino-quinases cAMP-dependentes foram mencionadas no Capítulo 1. A iniciação da síntese de DNA pode ocorrer no estágio pronuclear (durante a migração) ou depois da formação do núcleo zigótico. permitindo o desdobramento da cromatina do espermatozóide (Calvin e Bedford. que se ligam fortemente ao DNA. 1980. o processo da migração pronuclear dura aproximadamente 12 horas. Essa deficiência causa a falência da migração pronuclear e a interrupção do desenvolvimento. 1981. 1980.20). 1971. Longo.) *Quando Oskar Hertwig observou esse arranjo radial de ásteres de espermatozóide no seu recém-fertilizado ovo de ouriço-do-mar. sendo depois reconstruído por vesículas coalescentes. Green e Poccia. o pronúcleo masculino gira 180o fazendo com que o centríolo fique entre o pronúcleo do espermatozóide e o pronúcleo do óvulo. 1983. Bestor e Schatten.

30B). Em vez de formar um embrião. 1980). o ovo se transforma numa massa de células placentosímiles. um núcleo zigótico verdadeiro em mamíferos é visto primeiro não no zigoto. O pronúcleo masculino dos mamíferos aumenta enquanto o núcleo do oócito completa sua segunda divisão meiótica (Figura 4. Os óvulos de muitos invertebrados e de alguns vertebrados são capazes de se desenvolver normalmente na ausência do espermatozóide se o óvulo for ativado artificialmente. todo o genoma é derivado do espermatozóide (Jacobs et al. estudos recentes mostram que em mamíferos o genoma derivado do óvulo pode ser funcionalmente diferente e ter papel complementar durante certos estágios do desenvolvimento. produz . O centrossomo que acompanha o pronúcleo masculino produz seus ásteres (principalmente a partir de proteínas armazenadas no oócito) e contata o pronúcleo feminino. Aqui vemos uma situação em que as células sobrevivem. no entanto. se dividem e têm um número normal de cromossomos. em lugar de produzir um núcleo zigótico comum (como acontece na fertilização do ouriço-do-mar). A colocação de oócitos de camundongo em um meio de cultura que artificialmente ativa o oócito. Então. a contribuição do espermatozóide para o desenvolvimento parece dispensável. A habilidade de desenvolver um embrião sem contribuição espermática é chamada partenogênese (do grego. Assim. ao mesmo tempo suprimindo a formação do segundo corpo polar. (A) Entrada de espermatozóide na célula e tumefação do pronúcleo do espermatozóide.30 A). os cromossomos do espermatozóide se duplicam restaurando seu número diplóide. No entanto. Bavister. (de Bavister. Entulho no espaço perivitelínico são os corpos polares em degeneração.) al. 1981). não apresentam a partenogênese. mas no estágio bicelular (Figura 4. 1980. (B) Aposição dos pronúcleos do espermatozóide e do óvulo. Evidência para a não-equivalência dos pronúcleos mamíferos vem também de tentativas de conseguir que óvulos se desenvolvam na ausência de espermatozóide.. A primeira evidência dessa não-equivalência veio de estudos de um tumor humano chamado mola hidatidiforme. (C ) Estágio bicelular mostrando duas células de tamanhos iguais com núcleos bem definidos. significando “nascimento virgem”).. 1980. D. Não há desenvolvimento normal quando o genoma inteiro vem do parente masculino. Assim.154 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Figura 4.30 C). [fert10. Um dos princípios fundamentais da genética Mendeliana é que os genes derivados do espermatozóide são funcionalmente equivalentes aqueles derivados do óvulo. porém. cortesia de B. No entanto. Após penetrar no óvulo.html] Informações adicionais & Especulações A Não-Equivalência dos Pronúcleos de Mamíferos G ERALMENTE ASSUME-SE que machos e fêmeas portam genomas haplóides equivalentes. A maioria dessas molas se desenvolve de um espermatozóide haplóide ferti- lizando um óvulo no qual o pronúcleo feminino está ausente. Nessas situações. apresentam um desenvolvimento anormal. cada pronúcleo migra ao encontro do outro. replicando seu DNA ao longo do trajeto. Esses tumores parecem tecido placentário. No encontro. a cromatina condensa-se para formar cromossomos que se orientam num fuso mitótico comum.. Ohama et al. Os mamíferos.30 Movimento pronuclear em hamster. os dois envoltórios nucleares se desintegram (Figura 4.

irá se desenvolver até o tamanho normal (já que o alelo derivado maternalmente não é expresso). Embora ocorra a clivagem embrionária. ao passo que alguns ovos controle (contendo um pronúcleo masculino e um feminino de zigotos diferentes) que sofreram tal transplante se desenvolvem normalmente (Tabela 4. o fator de crescimento insulina-símile II (IGF-II) promove o crescimento de órgãos embrionários e fetais. 1983. se um camundongo herda um alelo mutante IGF-II de sua mãe. 1991). os embriões bimaternos ou bipaternos cessam o desenvolvimento ao mesmo tempo que camundongos partenogenéticos. .31). 1984). o gene paterno para o receptor é mal transcrito. 339 328 348 0 0 18 se desenvolvem até o nascimento. o desenvolvimento não continua e no dia 10 ou 11 (metade do tempo da gestação). Assim. incluindo corações latejantes. Além de serem menores e em deterioração. 1986. Nem no homem nem no camundongo o desenvolvimento pode ser completado com cromossomos derivados somente do óvulo. A hipótese que pronúcleos masculinos e femininos são diferentes. Porém. cortesia dos autores. A razão para essas mortes embrionárias é que em algumas células somente o alelo de certos genes derivado da mãe é ativo. Portanto.31 (A) Embriões controle e (B) partenogenéticos (dois pronúcleos femininos) de camundongos no 11 o dia de gestação. O padrão oposto de expressão alélica se encontra para um dos receptores de IGF-II. (de Surani e Barton. enquanto o alelo materno é ativo (Barlow et al. Como certos genes importantes para o desenvolvimento somente são ativos quando provindos do espermatozóide e outros tais genes só são ativos quando vêm do óvulo. também ganha apoio de experimentos de transplante pronuclear (Surani e Barton. Pronúcleos recém-fertilizados de machos ou fêmeas podem ser removidos e adicionados a outros ovos recém-fertilizados. Essas células se dividem para formar embriões com medula espinhal. Ainda mais. esqueleto e órgãos. Os camundongos estavam se desenvolvendo na mesma fêmea.. nenhum desse tipos de ovos Tabela 4. Surani et al.) Por exemplo. Aqui estamos tratando de exceções a essa regra Mendeliana. (Na maioria dos genes. nos mamíferos existem importantes diferenças funcionais entre eles. o alelo de IGF-II derivado paternalmente é ativo em todo o embrião. o camundongo terá crescimento prejudicado (DeChiara et al. As diferenças entre os alelos ativos e inativos são consideradas ser causadas por modificações do DNA que ocorrem de maneira diferente nos núcleos do óvulo e do espermatozóide (serão discutidos posteriormente no Capítulo 11).2 Experimentos de transplantes pronucleares Classe de zigotos reconstruídos Operação Número de transplantes bem-sucedidos Número de sobrevivente Bimaternal Bipaternal Controles Fonte: McGrath e Solter. se o mesmo alelo mutante for herdado do pai. observam-se profundas diferenças entre os embriões normais e os partenogenéticos. Aqui. ao passo que o alelo derivado maternalmente é em geral inativo (exceto em algumas células neurais)..) las somente o alelo de genes derivado paternalmente é funcional. tanto pronúcleos maternos como paternos são necessários para o desenvolvimento completo dos mamíferos. (Os dois pronúcleos podem ser diferenciados nesse estágio. McGrath e Solter. naturalmente.20). 1991). porém. 1983.) Assim. porque o feminino fica debaixo dos corpos polares.. músculos. os alelos derivados do macho e da fêmea são equivalentes e são ativados no mesmo grau em cada célula. esses deteriorando e ficando grosseiramente desorganizados (Figura 4.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 155 ovos diplóides de camundongo cuja herança deriva somente do óvulo (Kaufman et al. embora os dois pronúcleos sejam equivalentes em muitos animais. enquanto em outras célu- Figura 4. Em embriões de camundongos. 1984. os embriões partenogenéticos também tinham placentas muito menores. 1977).. podem ser construídos zigotos com dois pronúcleos masculinos ou dois femininos.

(C) À medida que o pronúcleo do espermatozóide migra para o pólo animal em direção ao pronúcleo do óvulo. Em algumas rãs (como Rana). 1980. O movimento dessas regiões citoplasmáticas depende de microtúbulos que são gerados pelo centríolo e por uma onda de íons de cálcio que contraem o citoplasma do pólo animal (Sawada e Schatten. (B) Após a entrada do espermatozóide. um único espermatozóide pode entrar em qualquer lugar do hemisfério animal. citoplasma cortical amarelo rodeia citoplasma cinzento. localizado perto do equador. Esses rearranjos do citoplasma do oócito são muitas vezes cruciais para a diferenciação nas etapas seguintes do desenvolvimento. 1987. 1948). que se estende do pólo vegetal ao equador (Figura 4. o óvulo é radialmente simétrico em torno do eixo animal-vegetal. dessa maneira.32 Rearranjo citoplasmático no óvulo do tunicado Styela partita. O ovo não-fertilizado desse animal está apresentado na Figura 4. O arranjo espacial correto desses determinantes é crucial para o desenvolvimento adequado. ao longo do futuro lado posterior do embrião. esse rearranjo na orientação pode ser visualizado pela presença de grânulos pigmentados citoplasmáticos. Originalmente. em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (Manes e Elinson. o citoplasma interno claro e o cortical amarelo migram para o hemisfério vegetal (inferior) do óvulo. (A) Antes da fertilização. Durante a meiose. Na rã. Como veremos nos capítulos 13 e 14. uma região do óvulo que antes estava coberta pelo citoplasma cortical escuro do hemisfério animal fica agora exposta (Figura 4. Essa região tem sido referida como o crescente cinzento (Roux. o citoplasma cortical (externo) se desloca cerca de 30° relativos ao citoplasma interno. o citoplasma cortical amarelo e o citoplasma claro derivado da degradação do núcleo do oócito escorrem vegetativamente em direção ao espermatozóide. 1986). Um exemplo é o óvulo do tunicado Styela partita (Conklin. quando o faz. no lado oposto do ponto de entrada do espermatozóide. o crescente cinzento demarca a região onde se iniciará a gastrulação em embriões de anfíbios. as inclusões lipídicas migram com ele. porém. Quando o pronúcleo masculino migra do pólo vegetal para o equador da célula. o citoplasma do óvulo freqüentemente contém determinantes morfogenéticos que ficam segregados em células específicas durante a clivagem. Após a entrada do espermatozóide. Esse citoplasma subjacente.) Pólo animal Citoplasma Cortical amarelo Núcleo do oócito Material do núcleo do oócito Gema cinzenta Citoplasma claro (A) Cório Pólo vegetal (B) Pronúcleo do Citoplasma espermatozóide amarelo (C) Pronúcleo do espermatozóide Citoplasma amarelo (D) Crescente amarelo Material da gema . trazendo o citoplasma amarelo para a área onde mais tarde células musculares irão se formar na larva tunicada. Esse determinantes. 1905. Roegiers et al. em última análise. por isso. conduzem à ativação ou repressão de genes específicos conferindo. Essa migração forma um crescente amarelo.. certas propriedades às células que os incorporam. (Segundo Conklin. Figura 4. respectivamente.33). Em algumas espécies. Speksnijder et al. 1905). Vincent et al. tem aparência cinzenta. os citoplasmas amarelo e claro os acompanham. 1995). Um citoplasma cinzento central está envolvido por uma camada cortical contendo inclusões lipídicas amarelas.32A. 1989.. tipo gema. contém grânulos pigmentados difusos e. (D) A posição final dos citoplasmas amarelo e claro. Dentro de 5 minutos após a entrada do espermatozóide. Movimento citoplasmático também é visto em óvulos de anfíbios. marcam os locais onde as células dão origem ao mesênquima e aos músculos.156 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Rearranjo do citoplasma do óvulo A fertilização pode iniciar deslocamentos radicais nos materiais citoplasmáticos do óvulo. a desintegração nuclear libera uma substância clara que se acumula no hemisfério animal (superior) do óvulo.32B). Como veremos em capítulos subseqüentes. 1990. altera o padrão citoplasmático do óvulo.. Ancel e Vintenberger.

os pontos de Azul Nilo puderam ser vistos rodar de 30° em relação às manchas da lectina fluorescente (Figura 4. O motor para esses movimentos citoplasmáticos em ovos de anfíbios parece ser um conjunto de microtúbulos paralelos que ficam entre os citoplasmas interno e cortical do hemisfério vegetal. (Segundo Gerhart et al. fornecida pela ATPase cinesina. fazendo com que cresçam para o interior da região vegetal do ovo. Houliston e Elinson (1991a) acharam que esses rastros eram formados por microtúbulos derivados do espermatozóide e do óvulo. A força motriz para a rotação é possivelmente. esses microtúbulos se desviam do ponto de entrada do espermatozóide. Os rastros dos microtúbulos são primeiramente vistos imediatamente antes do começo da rotação.. não inclusos. Essa ATPase está localizada nos microtúbulos vegetais e nas membranas do retículo endoplasmático cortical (Houliston e Elinson. e desaparecem quando esse movimento cessa (Figura 4. (A) Corte transversal esquemático de um ovo na metade do primeiro ciclo de clivagem. com isso parando as rotações citoplasmáticas. subcortical. em direção ao pólo vegetal. nas quais não se vê um crescente cinzento. O movimento do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno causa profunda movimentação nesse último. Danilchik e Denegre 1991) marcaram plaquetas da gema .33 Reorganização do citoplasma no ovo recém-fertilizado da rã.) Em rãs como Xenopus. Tratamento do ovo com colchicina ou radiação ultravioleta interrompe a formação desses microtúbulos. A posição descentralizada do centríolo espermático quando esse inicia a polimerização microtubular. Ao atingir o córtex vegetal. 1989. O espermatozóide entrou por um lado e seu núcleo está migrando para o interior. proporciona direção à rotação. Esse movimento foi demonstrado por Vincent e seus colaboradores (1986). Tal como a dineína e a miosina. a cinesina pode fixar-se às fibras e produzir energia pela hidrólise de ATP. Usando anticorpos ligantes desses microtúbulos.CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 157 (A) Ponto de entrada do espermatozóide (B) Crescente cinzento Córtex Citoplasma interno Zona de deslizamento Figura 4. O córtex está representado como o de Rana. 1991b).34). Elinson e Rowning.35. O ovo tem simetria radial em torno do seu eixo animal-vegetal. podemos assim mesmo. a superfície do ovo é considerada girar enquanto o citoplasma subcortical. tornado pesado pelas plaquetas de gema. observar a rotação do citoplasma cortical em relação à camada interna. o citoplasma cortical gira cerca de 30 o em relação ao citoplasma interno. e que o centríolo espermático direciona sua polimerização. Quando o ovo foi mantido em sua posição por inclusão em gelatina. Esses investigadores imprimiram uma grade hexagonal de corante (Azul Nilo) sobre o citoplasma abaixo do córtex enquanto aplicavam outro tipo de corante (uma lectina ligada à fluoresceína) à superfície do ovo. permanece estabilizado por gravidade. (B) Quando está aproximadamente em 80% de seu caminho na primeira clivagem. Em ovos normais. com um hemisfério animal altamente pigmentado e um hemisfério vegetal transparente. 1988). na direção da rotação citoplasmática. Essa rotação é importante porque a gastrulação irá começar na região oposta ao ponto de entrada do espermatozóide onde ocorre o maior deslocamento do citoplasma.

fotografias cortesia de J. é distintamente diferente daquele do provável lado ventral. Como veremos nos Capítulos 6 e 15. (D) Sumário desses movimentos na região vegetal (inferior) do ovo. para o futuro lado dorsal (posterior) do embrião (Prancha 7). os microtúbulos paralelos que permitem esses rearranjos parecem estender-se ao longo do futuro eixo dorso-ventral (Klag e Ubbels. a massa do citoplasma central do ovo flui do presumível lado ventral (abdome).) com Azul Nilo e observaram seu movimento por microscopia fluorescente (o corante ligado emite fluorescência vermelha). O ovo foi embebido em gelatina. Gerhart et al. os pontos do citoplasma subcortical mudaram de aproximadamente 30 o em relação à superfície externa imobilizada do ovo. O local no ovo designando a futura superfície dorsal do embrião está marcado com um D. O que havia sido um embrião radialmente simétrico. C.158 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Figura 4. Realmente. Ao fim da primeira divisão. é agora um embrião bilateralmente simétrico. (de Vincent et al. O ponto de entrada do espermatozóide está marcado com um S. (B. 1975. dependendo do estágio de meiose em que . O mecanismo iniciador da clivagem provavelmente difere entre espécies. esses movimentos citoplasmáticos iniciam uma cascata de eventos que determina o eixo dorso-ventral da rã. o citoplasma presumivelmente do lado dorsal do embrião. Gerhart. 1986.C) Com o progredir do primeiro ciclo. (A) Um ovo recentemente fertilizado foi marcado com uma grade hexagonal de corante Azul Nilo (que cora os lípidios nas plaquetas de gema). 1983). e as posições originais de alguns dos pontos marcados na superfície celular com fluoresceína (círculos em A). Durante a parte intermediária do primeiro ciclo celular. Preparação para a Clivagem O aumento dos níveis de íons livres de cálcio intracelular também inicia a movimentação de aparelhagem para a divisão celular..34 Rotação do citoplasma subcortical relativa ao citoplasma de superfície da célula..

1952. a primeira clivagem secciona o ovo em imagens duplicadas em um espelho. D. Nature 170: 326. J.html]. 164: 430-443. Fert.. Biol. R. The “capacitation” of mammalian sperm. os pronúcleos se encontram. Tyrosine phosphorylation of the sperm receptor at fertilization. K. Uma vez degradada a ciclina. L. 1994. R. P. E.html#fert13] LITERATURA CITADA Abassi. and ten others. A. Science 193: 3173-19. 1: 310-311. J. [other. 1991). Cell Sci. Asai. cortesia de R. C. A ciclina mantém as células em metáfase. B. Elinson. os microtúbulos despolimerizam. [fert11. 1981. 1948. Desse estágio em diante. e a sua degradação permite às células voltarem para interfase. Austin. Dev. Afzelius. Amos. No entanto. J. Biol. A human syndrome caused by immotile cilia.] 31: 1-182. Fr. Austin. Capacitation and the release of hyaluronidase. and Vintenberger. Y. mas tende a ser especificada pelo ponto de entrada do espermatozóide e a subseqüente rotação do citoplasma do ovo. Assim. 1996. os íons de cálcio também parecem iniciar a degradação da ciclina (Watanabe et al. o crescente cinzento é seccionado pelo sulco da primeira clivagem em ovos de anfíbios. Portanto. Além de suas outras atividades. 7: 311-320. Elinson.) (A) (C) ocorre a fecundação. Cell 81: 1095-1104. 1985). A coordenação do plano de clivagem e dos rearranjos citoplasmáticos é provavelmente mediada pelos microtúbulos do áster do espermatozóide (Manes et al. o DNA está se replicando e novas proteínas estão sendo sintetizadas. 1976. Functional and molecular diversity of dynein heavy chains. os ciclos de divisão celular podem se reiniciar. Recherches sur le determinisme de la symmetrie bilatérale dans l’oeuf des amphibiens. Belg. cada divisão em um lado do sulco de clivagem tem uma imagem em espelho do lado oposto. A clivagem tem uma relação especial com essas regiões citoplasmáticas. 1960. ao longo do futuro eixo dorso-ventral.. .CAPÍTULO 4 Fertilização: Iniciando um novo organismo 159 Figura 4. Ancel. em todas as espécies estudadas. Semin. and Klug. Arrangement of subunits in flagellar microtubules. (B) Antes da rotação citoplasmática (cerca de metade do ciclo) nenhum arranjo pode ser visto. [Suppl. C. o citoplasma se rearranja. Reprod. 1995.35 (B) Arranjo paralelo de microtúbulos se estendem ao longo do hemisfério vegetal. O palco está preparado para o desenvolvimento de um organismo multicelular. C. 1988. and Foltz. Cell Dev. Gerhart et al. 1978.. (A) Arranjo paralelo de microtúbulos vistos na segunda parte do primeiro ciclo celular por anticorpos fluorescente à tubulina. Em embriões tunicados. Almeida. perto do fim do primeiro ciclo celular . A. (de Elinson e Rowning. De maneira semelhante. 1974. Mouse egg integrin a α P β functions as a sperm receptor. a posição da primeira clivagem não é aleatória. A. A. Bull. P. Biol. R. A. (C) No término da rotação do citoplasma. 14: 523-549. o ritmo das divisões celulares é regulado pela síntese e degradação de ciclina.

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.

o volume citoplasmático não aumenta. enquanto a clivagem dos núcleos ocorre numa razão tão rápida nunca vista antes (nem mesmo em células de tumor). Isso difere da maioria dos casos de proliferação de células. a diminuição da razão entre os volumes citoplasmático e nuclear é crucial na N OTÁVEL COMO SÓ ELA É. em estágio de clivagem. O genoma zigótico transmitido por mitose para todas as outras células. B. (1968) mento. Uma conseqüência dessa divisão rápida é a razão do volume citoplasmático/nuclear se tornar cada vez menor assim que a clivagem progride. Um ovo de rã. WILSON. Também em muitas espécies. Poucos. do qual existe um período de crescimento celular entre as mitoses: a célula se expande para quase o dobro de seu volume. A Figura 5. Ela ilustra uma evidente descontinuidade entre clivagem e gastrulação. em oitavos.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 167 Clivagem: Criando multicelularidade 5 Para nossa limitada inteligência. e em apenas 12 horas forma algo em torno de 50. uma série de divisões mitóticas pelo qual o enorme volume do citoplasma do ovo é dividido em numerosas pequenas células nucleadas.000 células em apenas 43 horas. pode ser dividido em 37.1 mostra o logaritmo de números celulares em um embrião de rã representado graficamente em função do tempo de desenvolvimento (Sze. por exemplo. abriga uma opinião muito diferente. é acompanhada pela abolição do período de crescimento entre as divisões. daí se divide. A mitose na Drosophila. manifestadamente. não importa o seu tamanho. o embrião pode dividir-se apropriadamente até mesmo quando produtos químicos são usados para inibir a transcrição. Na maioria das espécies (mamíferos sendo a principal exceção) a velocidade da divisão celular e a colocação dos blastômeros um em relação ao outro estão completamente sob controle das proteínas e dos mRNAs armazenados no oócito pela mãe. não há aumento do volume embrionário durante a clivagem. em seguida em quartos. A célula. isso começa por um processo chamado clivagem.000 células. 1953). com o seu novo potencial genético e com sua nova disposição do citoplasma. (1923) Deve-se mostrar o máximo respeito por tudo que cresce exponencialmente. se alguns. Em todas as espécies de animais conhecidas. no entanto. Essas células em estado de clivagem são chamadas de blastômeros. e assim por diante. Durante a clivagem embrionária. Em muitos tipos de embriões. mRNAs são produzidos mais tarde durante a clivagem. Esse crescimento produz um aumento total de células enquanto mantém uma razão relativamente constante entre volume nuclear e volume citoplasmático. pode parecer simples dividir um núcleo em partes iguais. inicia agora a produção de um novo organismo multicelular. sem o aumento do seu volume. GARRETT HARDIN. a fertilização é o passo inicial do desenvolvi- 167 . E. Essa divisão do citoplasma do ovo. O primeiro ovo é dividido ao meio. o enorme volume do citoplasma zigótico é dividido cada vez mais em células menores. O zigoto. Esse aumento em número de células pode ser apreciado comparando a clivagem com outras fases do desenvolvimento. não funciona em embriões com clivagem precoce. Antes. ocorre a cada dez minutos por mais de duas horas.

aves Maioria dos artrópodos Meroblástica (clivagem incompleta) Mesolécito (moderadamente telolécito) Telolécito (vitelo denso.1 Log10 do número de células por embrião Formação de novas células durante o desenvolvimento precoce da rã Rana pipiens. porque o tempo dessa transição pode ser mudado experimentalmente alterando na célula a razão da cromatina para o citoplasma (Newport and Kirschner. Por exemplo. É sabido que algo no ovo está sendo titulado pela recém-produzida cromatina. 1953. O padrão da clivagem embrionária de uma dada espécie é determinado por dois parâmetros principais: (1) a quantidade e a distribuição de proteína do vitelo dentro do citoplasma e (2) aqueles fatores no citoplasma do ovo que influenciam no ângulo do fuso mitótico e na determinação do tempo de sua formação.1 Classsificação dos tipos de clivagem Padrão de clivagem Holoblástica (clivagem completa) Posição do vitelo Isolécito (oligolécito) (vitelo escasso. concentrado em uma extremidade do ovo) Centrolécito (vitelo concentrado no centro do ovo) . nematelmintos.168 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5.b). os blastômeros tornam-se móveis e os genes nucleares começam a ser transcritos.) Clivagem Gastrulação Horas a 150C regulagem do tempo da ativação de certos genes. A essa altura. distribuído por igual) Simetria de clivagem Radial Espiral Bilateral Rotacional Radial Bilateral Discoidal Superficial Animais representativos Equinodermos. a transcrição de novas mensagens só é ativada após 12 divisões. Quando um pólo do ovo é relativamente livre de vitelo. peixes. (Segundo Sze. a concentração de vitelo no Tabela 5. ainda que a clivagem comece logo após a fertilização e termine assim que o embrião atinja um novo equilíbrio entre o núcleo e o citoplasma. anelídeos. A quantidade e distribuição de vitelo determina onde a clivagem pode ocorrer e o tamanho relativo dos blastômeros. Amphioxus Maioria dos moluscos. O pólo rico em vitelo é chamado de pólo vegetal. na rã Xenopus laevis. a divisão celular ocorre nesse pólo de uma forma mais rápida do que a do pólo oposto. PADRÕES DE CLIVAGEM EMBRIONÁRIA Clivagem é um processo muito bem coordenado e é regulado pelas leis genéticas. a razão da clivagem diminui. platelmintos Ascídios Mamíferos Anfíbios Moluscos cefalópodos Répteis. 1982a.

quatro tipos principais de clivagem podem ser observados: holoblástica radial. O vitelo deve ser o suficiente para nutrir esses animais. mas continuam perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. como em zigotos de insetos. como nos ovos das aves. Os dois sulcos da clivagem aparecem simultaneamente em ambos blastômeros e também passam pelos dois pólos. Na ausência de grandes quantidades de vitelo. Em zigotos com relativamente pouco vitelo (ovos isolécitos e mesolécitos) a clivagem é holoblástica. Embriões de mamíferos. Essa clivagem é conhecida como meridional porque passa pelos dois pólos como um meridiano no globo.) No entanto. o primeiro sulco da clivagem passa diretamente através dos pólos animal e vegetal. adotam uma outra estratégia: a placenta. Para esse fim. holoblástica bilateral e clivagem holoblástica rotacional. A terceira divisão é equatorial: as hastes mitóticas de cada blastômero estão agora em posição . Dessa maneira. Esse órgão fornece alimento e oxigênio para o embrião durante sua longa gestação. A holotúria. como os ouriços-do-mar. ao mesmo tempo. respectivamente. Clivagem meroblástica pode ser discoidal. Os ovos não necessitam ser colocados na água porque o estágio de girino foi eliminado. eles provém seus ovos com quantidades enormes de concentração de vitelo (Lutz. ou superficial. como veremos adiante.1 fornece a classificação dos tipos de clivagem e mostra a influência do vitelo no padrão e na simetria da clivagem. Synapta A clivagem padrão da holotúria. as primeiras duas divisões são. Ao contrário. répteis e aves. normalmente formam o estágio larval muito rapidamente. dependendo onde o depósito de vitelo estiver localizado.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 169 pólo animal é relativamente baixa. nos quais muito pouco vitelo está presente. meridional e perpendicular uma com a outra. que também não possuem uma grande quantidade de vitelo. Após a união dos pronúcleos. Synapta digita. Existem também padrões herdados de divisões celulares que são adicionados às restrições do vitelo. de um lado (telolécito) ou no centro do citoplasma (centrolécito). No geral. Zigotos contendo grande acúmulo de proteína vitelínica sofrem clivagem meroblástica. significando que o sulco da clivagem se extende por todo o ovo. Esse estágio larval pode se alimentar por si só.2. o vitelo é somente um fator influenciando o padrão de clivagem em uma espécie. A maior parte do seu volume celular é vitelo. A correlação entre grandes concentrações de vitelo e a falta do estado larval é conhecida em algumas espécies de rãs. Esse tipo de clivagem é característico de equinodermos e do protocordato Amphioxus. Algumas rãs tropicais. peixes. 1947). sendo que eles se desenvolvem sem um estágio larval ou placentário. é ilustrada na Figura 5. O vitelo é uma extraordinária adaptação que permite ao embrião se desenvolver na ausência de uma fonte externa de alimentação. Animais desenvolvidos sem grandes concentrações de vitelo. (Isso será discutido mais adiante no Capítulo 19. No outro extremo estão os ovos dos insetos. O núcleo do zigoto é freqüentemente deslocado em direção ao pólo animal. Nesse tipo de clivagem os sulcos têm orientação paralela e perpendicular ao eixo animalvegetal do ovo. O sulco da clivagem não chega a penetrar na porção de vitelo do citoplasma. criando duas células filhas do mesmo tamanho. A Tabela 5. assim como de rãs e salamandras. holoblástica espiral. o desenvolvimento continua com a larva nadando livre. o eixo da primeira haste mitótica é formado perpendicularmente ao eixo animal-vegetal do ovo. onde somente uma porção do citoplasma é clivado. o vitelo inibe a clivagem. se torna a primeira diferenciação do embrião mamífero separando as células que irão formar a placenta. Os sulcos da segunda clivagem estão no ângulo reto dos sulcos da primeira clivagem. tais como as Eleutherodactylus e a Arthroleptella não passam pelo estágio de girino. Isso pode ser prontamente observado em ovos isolécitos. Clivagem holoblástica radial Clivagem holoblástica radial é a forma mais simples de clivagem de se entender.

os blastômeros se movem. As quatro células da camada animal se dividem meridionalmente em oito blastômeros..128 e 256 células. separando os dois pólos um do outro (Figura 5. ambas são meridionais e perpendiculares em relação a outra. 1982. no entanto. 1993). cada qual com o mesmo volume. Sucessivas divisões produzem embriões de 64. Os embriões resultantes consistem de blastômeros dispostos em fileiras horizontais ao longo de uma cavidade central. Summers et al. no entanto. e quatro pequenas. . os eventos são bem diferentes. e o sulco resultante da clivagem separa os dois pólos um do outro. Os macrômeros se dividem meridionalmente. Cada blastômero na metade animal do embrião está agora diretamente acima do blastômero da metade vegetal. levando à formação de uma blástula oca. para criar uma esfera oca composta de uma única camada de células. os micrômeros (Figura 5. Esse tipo de simetria é característico de uma esfera ou cilindro e é chamada de simetria radial. Os micrômeros também se dividem. Dessa maneira. produzindo duas fileiras de 8 células cada. Essa esfera oca é chamada de blástula. enquanto a quinta divisão é equatorial. a terceira clivagem é equatorial. A qualquer momento durante a clivagem da Synapta. Synapta tem clivagem holoblástica radial.) Plano de clivagem meridional Plano de clivagem equatorial Pólo vegetal Metade Animal Pólo animal Metade Vegetal Blástula oca (aberta por corte) Pólo vegetal paralela ao eixo animal-vegetal. conforme mostrado no corte (último painel). A primeira e a segunda clivagem são similares as da Synapta. (Segundo Saunders. um embrião seccionado através de qualquer meridiano produz a imagem refletida de duas metades.170 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. com divisões meridionais alternando com divisões equatoriais. produzindo um pequeno grupo abaixo da camada maior. Ouriço-do-Mar Ouriço -do-Mar O ouriço-do-mar também apresenta clivagem holoblástica radial. os macrômeros. Na quarta clivagem.3). uns em direção aos outros. produzindo uma blástula com 128 células.2 Pólo animal Clivagem holoblástica no equinodermo Synapta digita. mas com algumas importantes modificações. Todos os sulcos de clivagem da sexta divisão são equatoriais. a sétima clivagem é meridional. Em ambos os pólos do embrião.4. e a cavidade central é referida como blastocele. Essas células são chamadas mesômeros. sofre uma clivagem equatorial desigual para produzir no pólo vegetal quatro células grandes. uma se equilibrando em cima da outra. formando uma camada de oito células abaixo de an2. A quarta divisão é meridional novamente. dividindo o embrião em oito blastômeros iguais. A camada vegetal. os oito mesômeros se dividem para formar duas camadas “animais”. Assim que a célula com 16 embriões clivar. produzindo quatro fileiras de 8 células cada. an1 e an2. Similarmente.

ou colocando-os em água do mar hipotônica. (A) Planos de clivagem nas primeiras três divisões e formação de camadas particulares de células nas divisões 3-6. visão de cima para baixo do pólo animal. cortesia de S.) Metade vegetal (B) Micrômeros Macrômeros (C) (D) Em 1939. (de Inoué. os macrômeros centrais e dos micrômeros vegetais em ângulo para o centro. ainda ocorreria no tempo apropriado. colocados assimetricamente. (B) O estágio de 2 células. a clivagem desigual (quarta) que forma os micrômeros. mostrado sem a membrana de fertilização para permitir a visualização dos mesômeros do pólo animal. Figura 5. 1982. (Fotografia cortesia de G. (C) O estágio de 4 células. Inoué.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 171 (A) Pólo animal Figura 5. a segunda e terceira clivagens. Watchmaker. (A) A localização e orientação do fuso mitótico na parte baixa das células vegetais são visualizadas com luz polarizada no embrião vivo.4 (A) (B) Formação de micrômeros durante a quarta divisão de embriões de ouriços-do-mar. Os pólos vegetais dos embriões são visualizados por baixo. (B-D) Fotomicrografias de embriões vivos do ouriço-do-mar Lytechinus pictus. (B) A clivagem através desses fusos. Hörstadius concluiu que existem três fatores que determinam a clivagem em um embrião de 8 células: (1) existem mudanças progressivas no citoplasma. produziu micrômeros e macrômeros. sacudindo os ovos. Sendo assim. Ele demonstrou que se inibisse a primeira. (D) O estágio de 32 células. Sven Hörstadius realizou um experimento simples demonstrando que o controle do tempo e colocação de cada clivagem de ouriço-do-mar é independente de clivagens preexistentes.3 Pólo vegetal Mesômeros Metade animal an 1 an 2 derivados derivados veg1 veg2 Clivagem no ouriço-do-mar.) .

todas as células são do mesmo tamanho. Wolpert e Gustafson (1961) e Wolpert e Mercer (1963) propuseram que a pressão da blastocele não é necessária para se conseguir esse efeito. e (3) deve haver algum mecanismo pelo qual o material formador de micrômeros seja ativado no tempo correto (Hörstadius.) algum tempo após a fertilização. C de Dan-Sohkawa e Fujisawa. Nessa altura. o estágio de blástula começa na fase de 128 células. Essa pressão também alinha o longo eixo de cada célula para que a divisão nunca seja para dentro da blastocele. No desenvolvimento do ouriço-do-mar. Em um trabalho recente (Ettensohn e Ingersoll. Certamente. a blástula permanece como uma camada unicelular grossa. Dando prosseguimento a sua divisão. (C) Junções apertadas (flecha) formando– se entre células de uma blástula de equinodermo com 1024 células. Durante esse tempo. Nesse estágio. Essa expansão cria a blástula ao invés do contrário. Eles mostraram que enquanto permanecessem fortemente atracadas na camada hialina. a camada celular é expandida e se afina.5A. a camada hialina é vital para expansão da blastocele. 1988). (B) Com a contínua divisão. 1980. mostrando uma camada única de células arredondadas rodeando uma grande blastocele. seu fluido torna-se espesso. e se a adesão de células da camada hialina é inibida por anticorpos para a hialina.5C). Dan (1960) conjeturou que o motivo maior dessa expansão é o influxo de água na cavidade da blastocele. 1992) concluíram que é provável que ambos . as células não têm alternativa a não ser a de se expandir. Toda a célula está em contato com o fluido proteináceo da blastocele e com a camada hialina dentro do envoltório de fertilização.1973). (A e B segundo Giudice. Isso criaria uma expansão adicional fazendo com que a população fosse orientada somente para um plano. então a expansão da blastocele cessa (Adelson e Humphreys. Já que o blastômero secreta proteína na blastocele. os contatos entre as células são estreitados. Esse fluido absorve grandes quantidades de água por osmose. 1973. (2) deve haver material formador de micrômero no citoplasma vegetal. os micrômeros tendo diminuída sua divisão celular e clivando menos freqüentemente. Duas teorias surgiram para explicar a concomitante proliferação de células e formação da blastocele.172 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Cílio Blastocele (A) Blástula jovem (B) Blástula mais velha com placa vegetal achatada e tufo ciliar (C) Figura 5. Essas junções unem as células frouxamente conectadas num tecido epitelial onde a blastocele é isolada do ambiente externo (Figura 5. exercendo pressão nos blastômeros para se expandirem.5 Blástulas de ouriço-do-mar. que direcionam os fusos formados para uma certa direção.B). as células formam uma esfera oca circundando a blastocele central (Figura 5. (A) Esquema de um corte controle através de uma blástula precoce de ouriço-do-mar. Durante esse período. as células da blástula tardia mostram diferenças de forma à medida que as células da placa vegetal se alongam. cortesia dos autores. Eles enfatizaram o papel de adesividade das células entre si e a camada hialina. Dan-Sohkawa a Fujisawa (1980) analisaram esse método em embriões de estrela-do-mar e mostraram que o fechamento da cavidade esférica é contemporânea com a formação de junções apertadas entre os blastômeros.

e outra de macrômeros. (D-H) No final. designados por números romanos. é um impedimento à clivagem.8B mostra que enquanto o sulco da primeira clivagem ainda está tentando clivar o vitelo citoplasmático do hemisfério vegetal. desse modo.) (A) (B) (C) (D) Figura 5. o hemisfério vegetal contém blastômeros mais longos e mais escassos que os da metade animal. Sendo assim. (C) A terceira divisão é deslocada em direção ao pólo animal. as células da parte animal do embrião sintetizam e secretam uma enzima de eclosão que lhes permite digerir a membrana fertilizante (Lepage et al. a adesão à camada hialina parece ser o fator mais importante.6 Células ciliadas da blástula. causando a rotação da blástula dentro do envoltório de fertilização. A Figura 5. Durante a clivagem precoce. Humphreys.7 Crescente Cinzento (E) (F) (G) (H) Blastocele Clivagem de um ovo de rã. (Segundo Carlson.) . Embriões anfíbios contendo de 16 a 64 células são freqüentemente chamados mórulas (do Latim “amora”. esse sulco da clivagem em ovos anfíbios é muito mais próximo do pólo animal. 1981. no entanto. A células da blástula desenvolvem cílios em sua superfície externa (Figura 5. Na salamandra axolotle. 1992). Assim que a clivagem progride. Figura 5.6). da qual sua forma é vagamente reminiscente). No entanto. 1977). Logo após. Esse vitelo. Podemos notar as dobras nos sulcos da clivagem e a diferença entre os sulcos nos hemisférios animal e vegetal. que é concentrado no hemisfério vegetal. A Figura 5.8C). (Cortesia de W. a região animal se torna abarrotada com numerosas células pequenas. J.03mm/min ao se aproximar do pólo vegetal (Hara.7). Sulcos de clivagem. e é também meridional. No estágio de 128 células a blastocele se torna aparente e o embrião é considerado uma blástula. a pressão osmótica também parece exercer o seu papel. o embrião se torna uma blástula eclodida livre para nadar. Ele divide o embrião de rã em quatro blastômeros animais pequenos (micrômeros) e quatro grandes blastômeros (macrômeros) na região vegetal.02-0. O ovo do anfíbio. o sulco da clivagem se estende através do hemisfério animal a uma velocidade próxima de 1mm/min. B) O vitelo vegetal impede a clivagem fazendo com que a segunda divisão comece na região animal do ovo. Essa clivagem holoblástica desigual estabelece duas regiões embrionárias principais: uma de divisão rápida de micrômeros. O sulco da clivagem seciona o crescente cinzento e depois diminui para menos de 0. como era de se esperar.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 173 mecanismos expandem a blastocele. estão enumerados por ordem de aparecimento. por causa do vitelo vegetalmente colocado. Cada célula desenvolve um único cílio. enquanto a região vegetal contém uma pequena quantidade de grandes macrômeros carregados de vitelo (ver Figura 5.8A é uma varredura no microscópio eletrônico. a primeira divisão começa no pólo animal e vagarosamente se estende até a região vegetal (Figura 5. A terceira clivagem. Essa clivagem está em ângulos retos em relação à primeira.7). como na clivagem do equinodermo. mais lenta (Figura 5. (A. a segunda clivagem já começou próxima ao pólo animal. contém muito mais vitelo. Anfíbios Clivagem na maioria dos embriões de rãs e salamandras é radialmente simétrica e holoblástica. é equatorial. enquanto que em estágios mais tardios.. próxima ao pólo animal. antes da primeira divisão ter dividido o citoplasma vegetal. mostrando a primeira clivagem em um ovo de rã.

a EP-caderina não é produzida e a adesão entre os blastômeros é dramaticamente reduzida (Heasman et al. Kalt (1971) demonstrou que na rã Xenopus laevis o primeiro sulco da clivagem se alarga no hemisfério animal para criar uma pequena cavidade intercelular que é isolada do ambiente externo por junções intercelulares muito apertadas (Figura 5. Essa cavidade se expande durante clivagens subseqüentes para se tornar uma blastocele. Figura 5.) (B) (C) Na realidade. R. numerosas células com moléculas de adesão mantêm as células juntas. B e C cortesia de L. Enquanto essas células estão dividindo-se. Como o tecido mesodérmico é normalmente formado dessas células animais. 1971. parece plausível que células vegetais influenciam células adjacentes para se diferenciar em tecidos mesodérmicos. e (2) previne células que estão abaixo interagir prematuramente com as células de cima.. 1976. (A) Primeira clivagem. essas células animais se tornaram mesoderma ao invés de ectoderma. Isso resulta na obliteração da blastocele (Figura 5. A blastocele provavelmente presta duas principais funções no embrião das rãs: (1) é uma cavidade que permite migração celular durante a gastrulação. cortesia de M. Biedler.9).174 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 5. mostrando a discrepância de tamanho entre as células animais e vegetais aparecendo após a terceira divisão.8 Pregas Sulco de clivagem Micrografias ao microscópio eletrônico da clivagem de um ovo de rã. Uma das mais importantes dessas moléculas é a EPcaderina. (de Kalt.9 Formação da blastocele num ovo de rã. (C) Quarta clivagem (16 células). que são adjacentes aos precursores do endoderma. cortesia dos autores. a formação da blastocele foi traçada desde o primeiro sulco de clivagem. a blastocele aparece para prevenir o contato do endoderma com células destinadas para dar origem à pele e aos nervos. O mRNA para essa proteína é fornecido no citoplasma do oócito. (B) embrião de oito células mostrando uma pequena blastocele (flecha) na junção de três planos de clivagem. e se essa mensagem é destruída (injetando no oócito oligonucleotídeos antisense complementares para esse mRNA). que posteriormente se desenvolve na blastocele.10). Kalt. (A de Beams e Kessel.) (A) (B) . Sendo assim. Quando Nieuwkoop (1973) tirou células do topo da blastocele de um embrião de salamandra aquática e colocou-as junto a células do vitelo vegetal na base da blastocele. (A) Primeiro plano de clivagem mostrando uma pequena fenda. 1994). (B) Segunda clivagem (4 células).

elas assumem o empacotamento com a orientação termodinamicamente mais estável. 1927. Figura 5. Heasman.11 Diagrama mostrando o arranjo de quatro e oito bolhas de sabão num prato ligeiramente côncavo.13 retratam a clivagem de embriões de moluscos. as partes superiores do eixo mitótico parecem alternar entre o sentido horário e o anti-horário. uma característica que permite serem individualmente identificados. 1994. cortesia de J. tornando possível saber o destino de cada célula da blástula.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 175 (A) (B) Figura 5. Terceiro.12 e 5. os blastômeros são de tamanhos diferentes (D sendo o maior). Quando os destinos das células individuais em embriões de anelídeos. prevenindo a expressão da EPcaderina. produzindo o primeiro quarteto de micrômeros. produzindo quatro grandes macrômeros (marcados A. B. cada macrômero origina um pequeno micrômero no seu pólo animal. As Figuras 5. de preferência. formando a disposição “espiral” de blastômeros filhos.) . exceto cefalópodos.10 Depleção de EP-caderina mRNA no oócito de Xenopus. parecido com o de bolhas de sabão adjacentes (Figura 5. Em cada sucessiva clivagem. uma disposição indicando uma espiral dextra (oposta à sinistra).11). Na terceira clivagem. vermes nemertinos e todos os moluscos. Na realidade. O arranjo termodinâmico maximiza o contato e é muito reminiscente daquele de embriões que se clivam em espiral. foram idênticos (Wilson. Em muitas espécies. 1898). mas (B) não pelos controles. As duas primeiras clivagens são quase meridionais. platelmintos turbelários e moluscos foram comparados.. embriões de clivagem espiral normalmente realizam menos divisões antes de começar a gastrulação. criando um relacionamento espiral característico da clivagem. a clivagem se dá em ângulos oblíquos. C e D se comportam similarmente. resultando na perda de adesão entre os blastômeros e na obliteração da blastocele. Primeiro. Cada quarteto sucessivo de micrômeros é deslocado para a direita ou para a esquerda de seu macrômero irmão. A blastocele é obliterada em embriões depletados de EP-caderina. platelmintos turbelários. C e D). fotografia. Segundo. os micrômeros estão à direita do seu macrômero (olhando para o pólo animal). as mesmas células foram vistas no mesmo lugar e o seus destinos. de uma maneira geral. Na maioria das espécies. Observando o embrião pelo pólo animal. Oligonucleotídeos antisense complementares à mensagem da EP-caderina foram injetados no embrião unicelular. Na quarta clivagem. (Segundo Morgan. as células se tocam entre si em mais lugares do que em embriões clivados radialmente. As blástulas então produzidas não têm blastocele e são chamadas de estereoblástulas.) Clivagem holoblástica espiral Clivagem espiral é característica de vermes anelídeos. macrômero 1A e micrômero 1a. Isso faz com que micrômeros alternados se formem obliquamente para a esquerda e para a direita do seu macrômero. o macrômero A dará origem a duas células filhas. os ovos não se dividem em paralelo ou em orientações perpendiculares ao eixo animal-vegetal do ovo. Difere da clivagem radial em muitas maneiras. (de Heasman et al. As células B.

enquanto outros têm sua abertura para à esquerda.) . 1986. ocasionalmente. O blastômero D é maior que os outros. cortesia dos autores. esquematizados nos estágios precoces. (B) Metade da quarta clivagem. A clivagem é dextra. Exemplificando. PB é o corpo polar. Todavia. o macrômero 1A se divide para formar o macrômero 2A e o micrômero 2a. (de Craig e Morrill. como por exemplo o 1a2. Figura 5. permitindo a identificação de cada célula.176 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Vista do pólo animal (B) Vista lateral Figura 5. se dividem para produzir células tais como as 1a21 e 1a22. e micrômeros. 1a1 e 1a2. as células derivadas do blastômero A estão coloridas. em espécies em que a espiral abre para a direita. Crampton (1984) analisou os embriões desses caracóis aberrantes e observou que sua clivagem precoce difere da normal.13 Clivagem espiral do caracol Ilyanassa. dividem as células desigualmente e em ângulo aos eixos vertical e horizontal. serão encontrados alguns indivíduos com a abertura espiral para a esquerda. Isso foi descoberto analisando mutações da espiral do caracol. (A) estágio de 8 células. A orientação da clivagem plana para a esquerda ou para a direita é controlada por fatores citoplasmáticos dentro do oócito. e o micrômero 1a se divide para formar mais dois micrômeros. ainda são encontrados mutantes. Mais clivagens irão produzir blastômeros 3A e 3a a partir do macrômero 2A. a rotação da espiral é a mesma para todos os membros de uma determinada espécie. os macrômeros já se dividiram em células grandes e pequenas orientadas espiralmente. Alguns caracóis têm sua espiral aberta à direita da concha. Os fusos mitóticos. Em B. Normalmente.12 Clivagem em espiral do molusco Trochus vista do pólo animal (A) e de um lado (B).

1923. Caramujo fêmea do tipo dd pode produzir somente herdeiros de espiral sinistra. No caracol Limnaea peregra a maioria dos indivíduos são espiralados para a direita. Os caracóis sinistrogiros e dextrogiros se desenvolvem como imagens espelhares uma da outra. a direção da clivagem não é determinada pelo genótipo do caracol em desenvolvimento. mas pelo genótipo da mãe do caramujo. Boycott et al.14. mesmo quando o genótipo dos herdeiros é Dd. Na Figura 5.. Raros mutantes. Esses cruzamentos produzem o seguinte quadro: . Um indivíduo Dd irá se espiralar tanto para a direita quanto para a esquerda dependendo do genoma de sua mãe. foram encontrados e acasalados com caracóis tipo-selvagem. A origem do enrolamento para direita e para a esquerda do caracol pode ser reconhecida pela orientação do fuso mitótico na segunda clivagem. Geralmente. Esses acasalamentos mostraram que existe um alelo D “dextrogiro” que é dominante em relação ao alelo d “sinistrogiro”. os dois caracóis são formados com seus corpos em lados diferentes da abertura da espiral. graças a uma orientação diferente do aparelho mitótico nos caracóis com enrolamento sinistrogiro.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 177 (A) Enrolamento sinistrogiro (B) Enrolamento dextrogiro Figura 5. A direção da abertura na espiral da concha do caracol é controlada por um único par de genes (Sturtevant.14 Olhando do pólo animal de caracóis enrolados para a direita e para a esquerda. (Segundo Morgan. exibindo abertura esquerda. No entanto. Todas as subseqüentes divisões em embriões de espiral para a esquerda são imagens espelhares daqueles embriões com espirais dextras. 1927. podemos notar que a posição do blastômero 4d (o qual é muito importante. já que sua progênie irá formar os órgãos mesodérmicos) é diferente nos dois tipos de espirais dos embriões.14).) A orientação das células após a segunda clivagem estava diferente (Figura 5. 1930).

Informações adicionais & Especulações Adaptação pela modificação da clivagem embrionária E VOLUÇÃO é causada pela alteração hereditária do desenvolvimento embrionário. pequenas moléculas são capazes de difundirem-se entre os macrômeros 3D e os micrômeros centrais. É o genótipo do ovário. incluindo uma glân- dula capaz de produzir uma concha maciça. uma pequena quantidade de citoplasma proveniente de caracóis com espirais dextras. Essas ostras. ou todos os macrômeros são iguais em tamanho.178 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Os fatores genéticos envolvidos no enrolamento do caracol são trazidos ao embrião no citoplasma do oócito.15 Formação de larvas de gloquídia pela modificação da clivagem em espiral. resolveram esse problema efetuando duas modificações no seu desenvolvimento. No entanto. Após formação do embrião de 8 células (A). Às vezes.) (A) (B) (C) (D) . Unio e seus aparentados vivem em locais de água corrente. Essas larvas (chamadas gloquídias) assemelham-se a pequenas armadilhas para urso. *Não se preocupe. Ao contrário da maioria das ostras. no qual o fenótipo se desenvolve. 1979). o macrômero 3D se estende para dentro entrando em contato com os micrômeros do pólo animal. A primeira altera a clivagem embrionária. é causada pela alteração do padrão típico da clivagem espiral na família unionídeo das ostras. 1983. a determinação de que a célula que originará a célula precursora mesodérmica será alcançada entre a quinta e a sexta clivagem. Nos moluscos de blastômeros de igual tamanho no estágio de quatro células*. Isso confirma a observação que mães do tipo selvagem estavam colocando um fator em seus ovos que estava ausente ou defeituoso nas mães dd. a célula 4d produzida pelos macrômeros 3D não produz mesoderma (van den Biggelaar e Guerrier. a disposição do fuso mitótico motiva a maioria do citoplasma D penetrar no blastômero 2d (B). para finalmente originar a grande concha “armadilha de urso” da larva (D). de Laat e colegas (1980) demonstraram que na hora do contato (e não antes). Na típica clivagem dos moluscos. porque os adul- tos são sedentários e as larvas que nadam livremente seriam sempre carregadas correnteza abaixo. Essa célula se divide para produzir a maior parte das estruturas larvais.html] Outra descoberta emocionante com relação a clivagem dos moluscos está na comunicação entre os blastômeros. Citoplasmas de caracóis com espiral esquerda não afetaram os embriões com a espiral direita. que determina em que direção a clivagem vai ocorrer. Quando Freeman e Lundelius (1982) injetaram no ovo de mães dd. Uma dessas modificações. Injetando corantes de baixo peso molecular. os embriões resultantes apresentaram espirais para a direita. descoberta por Frank Lillie em 1898. a divisão desse Unio é tal que o blastômero 2d fica com a maior parte do citoplasma (Figura 5. somos capazes de identificar uma modificação da embriogênese que impediu o organismo de sobreviver diferentemente em ambientes hostis.15). (Segundo Raff e Kaufman. no entanto. [cleave1. ou o blastômero 2D é a maior célula no estágio embrionário. possuem pêlos sensíveis que permitem as válvulas da concha fecharem-se abruptamente quando tocadas pelas guelFigura 5. As correntes criam um problema para a dispersão das larvas. Imagens ao microscópio eletrônico mostram que nesse momento. Esse blastômero grande 2d se divide (C). aparecem junções de fenda na superfície dessas células. daremos no Capítulo 16 mais informações sobre embriões de moluscos com blastômeros de tamanhos desiguais. Nessa altura. Sem esse contato.

mas ao contrário da primeira divisão. Durante a clivagem.16 Peixe falso sobre o molusco unionídeo lampsilis ventricosa. Clivagem Holoblástica Bilateral Clivagem holoblástica bilateral é encontrada primariamente nos ascídios (tunicados). O “peixe” visto na Figura 5. O “peixe” é. (As regiões do citoplasma destinadas a formar determinados órgãos estão marcadas em A e são codificadas por cor em todo o diagrama. D) Vistas de embriões mais tardios do pólo vegetal. a forma da bolsa de criação (marsúpio) e as ondulações do manto Figura 5. Elas “pegam uma carona” com o peixe até estarem prontas para cair e.17 mostra a clivagem padrão de um tunicado. mostrando os destinos das várias regiões citoplasmáticas. tal como a Lampsilis ventricosa. o tipo de citoplasma que a célula recebe determina seu destino. A Figura 5. Em algumas espécies.16 Simetria bilateral em um ovo de tunicado. Outras espécies. separando o embrião do que será o seu futuro lado direito e esquerdo. Cada divisão sucessiva orienta-se em relação a esse plano de simetria. Dessa maneira. cortesia de J. mas sim a bolsa de criação e o manto abaixo dela. Muitos moluscos desenvolvem um manto fino e saliente em volta da concha circundando a bolsa de criação. a modificação de padrões de comportamentos já existentes permitiram moluscos unionídeos sobreviver em ambientes hostis. na verdade. mostrando os blastômeros e os destinos das várias células. No estágio de 32 células. (B) embrião de oito células. daqui em diante. essas se tornam fracionadas em células diferentes. uma pequena blastocele se forma e começa a gastrulação. Células recebendo citoplasmas claros se tornam ectoderma. as diferenças no tamanho e na forma destacam a simetria bilateral desses embriões. transformarse em moluscos adultos. como a primeira divisão. aquelas contendo citoplasma amarelo se transformam em células mesodérmicas. aumentaram as chances de suas larvas encontrarem um peixe realizando outra modificação no seu desenvolvimento (Welsh. (C. Em alguns unionídeos. Durante as três próximas divisões. 1969). Para tornar a ilusão mais completa. certos tunicados (incluindo S. o molusco despeja as gloquídias da bolsa de criação. Pode ser visualizado como duas metades de 4 células. e o meio embrião formado de um lado da primeira clivagem é a imagem espelhar do meio embrião do outro lado. O fenômeno mais admirável nesse tipo de clivagem é que o primeiro plano de clivagem estabelece o único plano de simetria no embrião. Welsh. cada divisão no lado direito do embrião tem uma divisão espelhar do lado esquerdo. através de metamorfose. a bolsa da cria e o manto do molusco. não passa através do centro do ovo. 1981. H. desenvolveram uma mancha preta em forma de olho (ocelo) de um lado e uma nadadeira do outro. ela cria duas grandes células anteriores (blastômeros A e D) e duas pequenas células posteriores (blastômeros B e C). (A) Ovo não-clivado. (Fotografia. as células Figura 5. Além do mais. Styela partita. A segunda clivagem é meridional. as gloquídias são liberadas da bolsa de criação da fêmea e meramente aguardam um peixe passar. Como foi mencionado no capítulo 4.) (D) (A (B) (C) Ectoderma Ectoderma neural Músculo Mesênquima Pólo vegetal Notocorda Endoderma Pólo vegetal Vista do pólo vegetal . Quando o peixe que estiver ao alcance for atraído. podem se espalhar correnteza acima. Cada lado tem agora um blastômero grande e um pequeno.16 não é um peixe real.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 179 ras ou barbatanas dos peixes que por ali estiverem passando. Dessa maneira.) (Segundo Balinsky.) imitam o comportamento e a forma de pequenos peixes nadando. partita) contêm regiões citoplasmáticas coloridas. Em vez disso.

A fertilização ocorre na ampola do oviduto. O oócito dos mamíferos é liberado pelo ovário e varrido pelas fímbrias até o oviduto (Figura 5. menos de 10 ovos são ovulados por uma fêmea em um determinado tempo. tornando difícil seu manuseio experimental. Mais adiante. A clivagem nos mamíferos está entre as mais lentas do reino animal – de 12 a 24 horas de separação.18). Só recentemente foi possível a duplicação de algumas dessas condições internas e observar o desenvolvimento in vitro. na Estágio de 2 células Útero Primeira clivagem Zona pelúcida Figura 5. Normalmente. de modo que as células formadoras do mesoderma são confinadas aos dois blastômeros vegetais posteriores. praticamente invisível. e a primeira clivagem começa um dia depois. Os ovos de mamíferos estão entre os menores do reino animal. a primeira clivagem ocorre durante essa jornada. o desenvolvimento dos embriões dos mamíferos se completa dentro de outro organismo ao invés de um ambiente externo.18 Desenvolvimento de um embrião humano desde a fertilização até a implantação. A primeira é relativa a lentidão das divisões. O destino de cada célula do embrião precoce de Styela tem sido acompanhado e será discutido em detalhe no Capítulo 13. região próxima ao ovário. Enquanto isso. (Segundo TuchmannDuplessis et al. já que a clivagem nos mamíferos é completamente diferente de outros padrões de divisão celular embrionária.. O ovo “eclode” da zona quando alcança o útero. enquanto o provável tubo neural e cordomesoderma serão formados pelas duas células anteriores. assim. por exemplo. tem somente 100 µm de diâmetro.180 PARTE II Padrões de Desenvolvimento que incorporam inclusões ardósia se tornam endoderma e as células cinza claro. valeu a pena esperar o conhecimento da clivagem de mamíferos. e é provável que a zona evite a adesão das células em clivagem de se colarem ao oviduto. e as células do cordomesoderma são restritas as duas células vegetais anteriores. Clivagem holoblástica rotacional Não é surpresa alguma que o estudo da clivagem em mamíferos tenha-se tornado um desafio. A segunda diferença fundamental é a singular orientação dos blastômeros dos mamíferos um em relação ao outro. Com todas essas dificuldades. os cílios no oviduto empurram o embrião em direção ao útero. sendo seu volume menor de um milésimo do ovo de Xenopus. Existem várias características da clivagem dos mamíferos que as distinguem de outros tipos de clivagem. A compactação em embriões humanos ocorre no dia 4.) Oviduto Mórula Blastocisto Ovário Estágio precoce da implantação Fertilização Ovulação . Esses plasmas coloridos estão localizados bilateralmente em volta do plano de simetria e. tornando difícil a obtenção de material para estudos bioquímicos. A segunda clivagem motiva o provável mesoderma se posicionar nas duas células posteriores. a terceira divisão irá repartir essas regiões citoplasmáticas. E como uma barreira final. 1972. A meiose é então completada. Também. quando ele está no estágio de 10 células. O zigoto humano. zigotos de mamíferos não são produzidos em números comparáveis aos embriões do ouriço-do-mar ou de rãs. eles serão divididos pelo sulco da primeira clivagem em metades direita e esquerda do embrião. em lugar de viajar para o útero. A primeira clivagem é uma divisão meridional normal. o tubo neural e a notocorda. no entanto.

no entanto. 1982. 1975. Nematóides também têm uma forma rotacional de clivagem. [cleave2. atravessando o estágio de 8 células.) . 1967. Prather 1989).20. 1975). mas freqüentemente contêm números ímpares de células. (F) Blastocisto.19). Mulnard. Também. formam um arranjo solto com espaço suficiente entre eles. sendo o responsável pela produção de proteína necessária para a clivagem. (A) estágio de 2 células. porém. Esse tipo de clivagem é chamada de clivagem rotacional (Gulyas.20 (D) (E) (F) Clivagem de um único embrião de camundongo in vitro. A terceira principal diferença entre a clivagem nos mamíferos e a da maioria dos outros embriões é marcada pela falta de sincronização das divisões precoces. embriões de mamíferos não aumentam por igual do estágio de 2 para 4 e para 8 células. No camundongo e na cabra. Dessa maneira.19 Comparação da clivagem precoce (A) em equinodermos (clivagem radial) e (B) em mamíferos (clivagem rotacional). cortesia de J.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 181 Plano de clivagem II Plano de clivagem I Plano de clivagem IIA Plano de clivagem I Figura 5. Como mostra a Figura 5. (de Mulnard. (B) estágio de 4 células. (C) início do estágio de 8 células. (Segundo Gulyas. G. Seguindo a terceira clivagem. os blastômeros passam (A) (B) (C ) Figura 5. a mudança do controle maternal para o zigótico ocorre no estágio de duas células (Piko e Clegg. diferente dos outros genomas animais. Os blastômeros de mamíferos não se dividem ao mesmo tempo. Detalhes sobre a clivagem dos nematóides serão fornecidos no Capítulo 13. não formam a estrutura blastocística característica dos mamíferos. (E) Mórula.) Plano de clivagem IIB (A) EQUINODERMO (Ouriço-do-mar) (B) MAMÍFERO (Coelho) segunda clivagem um dos dois blastômeros se divide meridionalmente e o outro se divide equatorialmente (Figura 5. o genoma mamífero é ativado durante a clivagem precoce. blastômeros mamíferos.html] Compactação Talvez a diferença mais crucial entre a clivagem de mamífero e todos os outros tipos envolva o fenômeno da compactação. (D) Estágio de 8 células compactado.

Essas células não aparentam ser somente diferentes das células do trofoblasto.. Essa estrutura é chamada blastocisto e é outro marco da clivagem de mamíferos. . Esse grupo de células não produz estruturas embrionárias. A maior parte dos descendentes das células externas se tornam células do trofoblasto (trofectoderma). Fleming. permitindo pequenas moléculas e íons passarem entre elas. desse modo. fazendo com que a mãe não rejeite o embrião como faria com um órgão transplantado.23). nenhuma delas contribuindo para células do outro grupo (Dyce et al.22 e 5. Essas células geram a massa celular interna que dará origem ao embrião. formando uma bola compacta de células (Figuras 5.) por uma mudança espetacular em seu comportamento. se amontoam. Dessa forma.20C. mas também sintetizam proteínas diferentes nesse estágio do desenvolvimento precoce. Durante o estágio de 64 células. Ao invés disso. formam o tecido do cório.D e 5. selando o interior da esfera (Figura 5. De repente.21 Micrografia ao microscópio eletrônico de embriões de camundongos de 8 células. 5.1972). Esse pacote é estabilizado por junções apertadas que se formam entre as células. Inicialmente. 1987. Elas são necessárias para implantar células do embrião na parede uterina (Figura 5. (Cortesia de C. 1987). maximizando seu contato com outros blastômeros. a mórula não tem uma cavidade interna.182 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 5. No entanto. a distinção entre os blastômeros do trofoblasto e da massa celular interna representa o primeiro evento diferenciado no desenvolvimento dos mamíferos. Essa mórula consiste de um pequeno grupo de células internas rodeadas por um grupo maior de células externas (Barlow et al. Fleming.20. suplementada por células divididas do trofoblasto durante a transição para o estágio de 32 células (Pedersen et al. Ziomek.. O embrião do camundongo é derivado dos descendentes das células internas do estágio de 16 células.21). As células do embrião compactado se dividem para produzir uma mórula de 16 células. durante um processo chamado cavitação.23).22). alantóide e âmnio. 1986. 1987). As células no interior da esfera formam junções com espaços. a massa celular interna (aproximadamente 13 células) e as células do trofoblasto se tornam camadas de células separadas. a parte embrionária da placenta. O cório permite ao feto conseguir oxigênio e nutrientes da mãe. células do trofoblasto não são capazes de produzir células do próprio embrião. acompanhada da bolsa com vitelo.. No entanto. Também secreta hormônios para que o útero da mãe retenha o feto e produza reguladores de resposta imune. (A) nãocompactados e (B) compactados. A massa celular interna fica posicionada de um lado do anel de células do trofoblasto (veja Figuras 5. a célula do trofoblasto secreta um fluido para dentro da mórula para criar a blastocele.

K+ . Apical: microvilosidades. Basolateral: desmossomos. (Figuras à direita segundo Fleming. Basal: Na+. Basal: lisossomos. vesículas lipídicas. Apical: transportadores e canais Microvilosidades Massa celular interna (ICM) Blastocele Trofoblasto E-caderinaDesmossomos Direção da corrente iônica Na+.ATPase Junções de fendas Proteínas da membrana apical Desmossomos Lisossomos secundários Golgi Filamentos de citoqueratina Microtúbulos e actina citoplasmática Junções apertadas (ZO-1) (ZO-1) + cingulina Actina cortical Microvilosidades Mitocôndrias . correntes iônicas. (A. junções de fendas. laminina. Basolateral: adesão de E-caderina. (D) blastocisto de 32 células.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 183 (A) Estágio precoce de 8 células: não-polar. 1992.22 Compactação e formação do blastocisto de camundongo. ZO-1. K+ . cingulina.) (B) Compacto de 8 células: polar. microtúbulos Apical Junções apertadas Lateral Basal (C) 16 células: Adesão basolateral intensificada. O lado direito detalha as mudanças associadas com o amadurecimento do trofoblasto.B) embrião de 8 células. porém com efeitos de contato local Figura 5. Microtúbulos acetilados. endossomos.ATPase. actina cortical. O lado esquerdo representa o organismo inteiro ou sua visão em corte. mitocôndria. (C) mórula de 16 células. Golgi Junções apertadas entre células exteriores Junções de fendas entre células interiores (D) 32 células: transporte vetorial de fluido. actina citoplasmática.

Esses resultados sugerem que a ativação da proteína quinase C pode iniciar a compactação mudando a localização da E-caderina. Johnson et al. Chester Reather. E-caderina (tam- (A) (B) Figura 5. cada um dos oito blastômeros interage com os seus vizinhos para sofrer polarização da membrana. ocorre compactação prematura. não-polar. Componentes diferentes da superfície das células migram para regiões diferentes da célula (veja Figura 5. 1986. com a ocorrência da compactação.. A polarização da membrana é influenciada por interações célula a célula porque acontece somente quando a célula está em contato. marcando certas moléculas da superfície celular com corantes fluorescentes. (A de Fleming et al. que reconhece a classe das glicoproteínas. 1980).) bém conhecida como uvomorulina). essas moléculas são encontradas predominantemente nos pólos mais distantes do centro do agregado (Figura 5. (A de Rugh. E finalmente. sintetizada no estágio de 2 células é distribuída uniformemente por toda a membrana celular. Uma dessas marcações.) (A) (B) Informações adicionais & Especulações A Superfície da Célula e o Mecanismo de Compactação C OMPACTAÇÃO CRIA AS circunstâncias que trazem á tona a primeira diferenciação no desenvolvimento de mamíferos: a separação do trofoblasto da massa celular interna.24 Polarização de componentes da membrana em blastômeros de camundongo durante o estágio de 8 células. Peyrieras et al. Se um blastômero for separado do resto do embrião perde sua polarização.23 Implantação de blastocistos de mamíferos no útero. (A) Distribuição homogênea. extendidas . de componentes da membrana marcados com concanavalina A fluorescente no estágio de 4 células. 1990). na metade do estágio de 8 células. (A) Blastocistos de camundongo entrando no útero. Fotografias cortesia dos autores.24A).25. Se embriões de 4 células de camundongo forem colocados em um meio contendo drogas que ativam a proteína quinase C. desses componentes no estágio de 8 células. a membrana celular pode também ser modificada durante a compactação. Quando isso ocorre.. Isso pode ser observado. Ziomek e Johnson. No entanto. Experimentos recentes mostraram que a via do fosfatidilinositol também pode ser importante para inicializar a compactação. B cortesia da Carnegie Institution of Washington. A porção de carboidrato dessa glicoproteína pode ser essencial para o seu funcionamento. 1967.. Uma dessas moléculas.22.. por meio de reorganização do citoesqueleto. a E-caderina se torna restrita aqueles sítios da membrana celular que estão em contato com os blastômeros adjacentes.. com um outro blastômero. essas glicoproteínas são aleatoriamente distribuídas por toda a membrana (Figura 5. No entanto. fotógrafo. sendo a tunicamicina (droga que inibe a glicosilação das proteínas) também é capaz de prevenir a compactação.184 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. No primeiro estágio da compactação. (B) Implantação inicial do blastocisto no útero de um macaco Rhesus. Anticorpos para essa molécula causam a descompactação da mórula (Figura 5. 1983. Similarmente diacilglicerídeos podem momentaneamente provocar a compactação de embriões de 4 células. B de Levy et al. polar. As microvilosidades. no mínimo. Como isso é feito? Existe uma crescente evidência que a compactação é realizada por intermédio de eventos que ocorrem na superfície das células dos blastômeros adjacentes. 1986. Proteínas específicas da superfície celular cumprem o seu papel na compactação. 1986). (B) Distribuição heterogênea. a E-caderina acumula-se especificamente nas junções entre os blastômeros (Winkel et al.24B). mostra que no estágio de 4 células. uma glicoproteína adesiva de 120-kDa.

aparecem na superfície de células adjacentes. dilatando a blastocele (veja Figura 5.) Formação da massa celular interna O processo crucial para o precoce desenvolvimento dos mamíferos é a criação da massa celular interna distinta do trofoblasto. Dessa maneira. enquanto que as células do lado de dentro formariam o embrião (Tarkowski e Wróblewska. (B) Proliferação sem compactação ocorrendo na presença de anticorpos contra a E-caderina. Essa acumulação de íons de sódio permite que a água entre por osmose. as proteínas bombeiam sódio para a cavidade central.22. Ziomek. o blastocisto se expande dentro da zona pelúcida (a matriz extracelular do óvulo foi essencial para a ligação do espermatozóide durante a fertilização).. (A) Compactação normal ocorrendo em ausência do anti-soro. Pelúcida Fuga da Zona Pelúcida Enquanto o embrião está se movendo através do oviduto.1990). 1982. e essas células se dividem de tal modo que elas estão soltas dentro dos blastômeros agregados (Graham e Kelly. Marcando os vários blastômeros. dessa maneira. morfologia ou potência de qualquer um dos blastômeros. . Até o estágio de 8 células. não existem diferenças óbvias na bioquímica. rumo ao útero. Borland. As membranas celulares das células trofectodérmicas contêm uma bomba para o sódio (a Na+/K+-ATPase) de frente para a blastocele. Durante esse período. O achatamento dos blastômeros um contra o outro pode. 1983).25 Prevenção da compactação por anti-soro contra a glicoproteína da superfície celular. No entanto. unindo uma célula à outra. Sutherland et al. existem evidências crescentes de que a compactação é causada por mudanças na arquitetura da superfície celular dos blastômeros. é chamada de ectópica ou * As células internas mostraram virem mais freqüentemente da primeira célula a se dividir no estágio de 2 células. (Fotografias cortesia de C. é essencial que a zona pelúcida previna o blastocisto de aderir às paredes do oviduto. não está totalmente certo como esses eventos se relacionam um com o outro. Essas microvilosidades podem ser os sítios onde a E-caderina está funcionando para mediar adesão intercelular. Essa célula normalmente produz o primeiro par de blastômeros a alcançar o estágio de 8 células. Portanto. Como a célula é direcionada para um ou outro desses caminhos? Como a célula é informada que dará origem a uma porção do mamífero adulto ou que dará origem a um singular tecido de sustentação que será descartado no nascimento? As observações de embriões vivos sugerem que essa importante decisão está meramente no fato de a célula estar no lugar certo na hora certa. 1977..1967. a opção da célula transformar-se em trofoblasto ou embrião depende se essa célula era externa ou interna após a compactação. muitos investigadores descobriram que as células que estavam do lado de fora formariam o trofoblasto. Sutherland e Calarco-Gillam. promotora da adesão. portanto. 1977). Quando tal aderência acontece em humanos. ter acontecido em virtude do encolhimento do blastômero através da despolimerização da actina (Pratt et al.*Hillman e colegas (1972) mostraram que quando cada blastômero de um embrião de camundongo de 4 células é colocado na superfície externa de uma massa de blastômeros agregados. E-caderina. (A) (B) Figura 5. as células externas transplantadas somente darão origem ao tecido trofoblasto. 1984). a compactação forma células internas ou externas com propriedades muito diferentes. Wiley.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 185 por actino-filamentos. ou como são coordenados e integrados na cadeia de eventos que causa a compactação. No entanto.

indicando que a separação ocorreu antes da formação do tecido trofoblasto. Uma vez fora. cortesia de E. Isso acontece em aproximadamente dois terços dos casos de gêmeos humanos idênticos. após a formação do trofoblasto. Gardiner e Rossant (1976) também mostraram que se as células da massa celular interna (mas não células do trofoblasto) são injetadas no blastocisto. Se a separação do embrião acontecesse após a formação do cório. Camun- . 1996). às vezes. O restante dos gêmeos idênticos compartilham do mesmo cório. no nono dia. ácido hialurônico e receptores heparan sulfato. localizada na membrana celular lisa a matriz fibrilar da zona pelúcida (Perona e Wassarman. gêmeos idênticos são formados de um único embrião cujas células.27B). menos o trofoblasto). o blastocisto pode fazer contato direto com o útero. Uma vez que a massa celular interna (ICM) se separou do trofoblasto. protegendo-o da dessecação e movimentos bruscos (veja Capítulo 6). a partir de células que normalmente iriam produzir somente uma porção.. o âmnio. como pluriblasto (Johnson e Selwood. no entanto. fibronectina.. a estripsina. de alguma forma. o embrião humano já completou a construção de uma outra camada extra-embrio- nária. o trofoblasto secreta outro conjunto de proteases.html] A habilidade de produzir um embrião completo. Uma pequena porcentagem de gêmeos idênticos nascem com um único cório e âmnio (Figura 5.27C). Gêmeos fraternos são o resultado de dois eventos separados de fertilização. [cleave4. quando Seidel destruiu uma célula de um embrião de coelho e demonstrou que a célula remanescente poderia produzir o embrião por inteiro.26). também contribuem para um novo embrião. fibronectina e laminina.27A). a massa celular interna tem sido referida. Gêmeos idênticos são provavelmente produzidos pela separação de blastômeros precoces ou mesmo pela separação da massa celular interna em duas regiões no mesmo blastocisto. (Fotografia de Mark et al. Uma vez na célula epitelial uterina. no quinto dia. e seus respectivos destinos serão determinados por interações entre os seus descendentes. Esse tecido forma a bolsa amniótica (ou bolsa de água). e tais recémnascidos correm o risco de serem gêmeos ligados (“Siameses”). Informações adicionais & Especulações Gêmeos e células embrionárias precursoras A S CÉLULAS PRECOCES do embrião podem substituir uma à outra e compensar uma célula ausente. Essa condição é especialmente grave.. Isso significa que a divisão do embrião aconteceu após o nono dia. ao passo que. Cerca de 33 % dos gêmeos idênticos têm dois córios completos e separados. 1976. ele deve “livrar-se” da zona pelúcida para que possa aderir à parede uterina. [cleave3. 1985. sugerindo que a separação ocorreu dentro da massa celular interna. Essas enzimas digestoras de proteínas digerem a matriz extracelular do tecido uterino. Lacy. Uma protease semelhante à tripsina. Já que seus blastômeros podem gerar qualquer tipo de célula no corpo. No nono dia.186 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figure 5. Regulação é também vista na habilidade que dois ou mais embriões precoces têm para formar um camundongo quimérico ao invés de gêmeos. 1986. impedindo o blastocisto de cobrir a si mesmo com a parede uterina (Strikland et al.26 Blastocisto de camundongo eclodindo da zona pelúcida. 1983). os embriões resultantes deveriam ter um cório e dois âmnios (Figura 5. Isso foi primeiramente demonstrado em 1952. envolvendo o embrião com fluido amniótico. 1989). Brenner et al. dissociam uma da outra.html] Casos de gêmeos idênticos ocorrem em aproximadamente 25% dos nascimentos humanos. eles sintetizam o proteoglicano heparan sulfato dramaticamente no momento anterior à implantação (veja Carson etal. laminina. O blastocisto do camundongo se livra da zona pelúcida perfurando um pequeno buraco e se espremendo através dele enquanto se expande (Figura 5. cada célula pode originar todos os tipos de células do embrião. as células da ICM constituem um “grupo de equivalência” onde cada célula da ICM tem a mesma potência (nesse caso. Yamazaki e Kato. estromelisina e ativador de plasminogênio. incluindo colagenase. porque a implantação do embrião no oviduto pode causar uma hemorragia com perigo de morte. Gêmeos humanos são classificados em dois grandes grupos: gêmeos monozigóticos (um ovo ou idênticos) e gêmeos dizigóticos (dois ovos ou fraternos). O epitélio uterino “agarra” o blastocisto em uma matriz extracelular contendo colágeno. trigêmeos ou um monstro de múltiplas cabeças..1989). é chamada de regulação e é discutida no Capítulo 15.) gravidez tubária. no quinto dia (Figura 5. mas antes da formação do âmnio. Quando o embrião alcança o útero. As células do trofoblasto contêm os elementos que irão se juntar ao colágeno uterino.

eles mostraram que cada um dos três embriões deram origem a precursores dos gametas. Existe até evidência que embriões humanos podem formar quimeras (de la Chappelle et al. Essa hipótese tem sido confirmada. Esses indivíduos têm dois tipos de células diferentes (XX e XY) dentro do mesmo corpo. e terá importantes conseqüências no estudo do desenvolvimento dos mamíferos. e um único cório. os descendentes quiméricos têm algumas células de cada embrião. cada blastômero da massa celular interna deve ser capaz de produzir qualquer célula do corpo. Markert e Petters (1978) mostraram que embriões precoces de 8-células podem se unir para formar uma mórula compactada comum (Figura 5. . Quando blastômeros de linhagem preta e branca são agregados o resultado é normalmente um camundongo malhado (Figura 5. que estavam se desenvolvendo ao mesmo tempo.. porém.1979).27 Diagrama mostrando a relação entre a formação de gêmeos monozigóticos humanos e as membranas extra-embrionárias. Além disso. (B) A cisão ocorre após a formação da trofectoderma.) dongos quiméricos são o resultado de duas ou mais clivagens precoces (normalmente 4. A explicação mais simples para tal fenômeno é que esses indivíduos resultaram da agregação de dois embriões.ou 8-células) de embriões que foram agregados artificialmente para formar um embrião composto.. permanecem indiferentes e continuam a se dividir em cultura (Evans e Kaufman. Mayr et al. então dois gêmeos fraternos se fundem para criar um único indivíduo composto. (A) A cisão ocorre antes da formação da trofectoderma. um macho e outro fêmea. De acordo com nossas observações sobre formação de gêmeos e camundongos quiméricos. Esses blastocistos preparados são implantados no útero da mãe adotiva. Isso é prontamente observado quando os blastômeros agregados vêm de uma linhagem que difere na cor da pelugem. a ninhada era um de cada cor. de modo que cada gêmeo tem o seu próprio cório e âmnio. (Segundo Langman. Quando as massas celulares internas são isoladas e crescem sob certas condições. Quando um quimérico (preto/marrom/branco) fêmea de camundongo acasalava com um macho de pelugem de cor branca (recessivo). Quando nascem.29) e que o camundongo resultante pode ter a cor da pelugem de três linhagens diferentes (prancha 21). (C) Cisão após a formação do âmnio conduz a gêmeos em um saco amniótico. cada uma com o seu conjunto de características genéticas. antes da formação do âmnio.1974. Como é mostrado na Figura 5. 1981. as zonas pelúcidas de dois embriões geneticamente diferentes são removidas e os embriões são unidos para formar um blastocisto em comum.28B). Se essa explicação estiver correta. compartilhando um cório.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 187 Embrião Saco vitelínico Âmnio 2 Córios (A) 2 Âmnios Massa celular interna 1 Cório (B) Embrião bicelular Blastocele 2 Âmnios 1 Cório (C) 1 Âmnio Cório Figura 5.28A. porém. resultando em gêmeos que têm sacos amnióticos individuais.

Markert. 1978. Quando essas células ES são injetadas nos blastocistos de um outro gene de camundongo. concentrações de vitelo cumprem um papel importante na clivagem celular. O embrião resultante tem células vindas de ambos tecidos. 1981). essas células podem ser alteradas na placa de Petri. Como foi mostrado no capítulo 2. ou genes existentes podem ser mutados. (A) Procedimento experimental para a produção de camundongos quiméricos. Na clivagem . elas podem integrar a sua massa celular interna hospedeira.29 Agregação e compactação de três embriões de camundongo. Genes clonados podem ser inseridos dentro de seu núcleo. Mintz. Em parte alguma isso está tão aparente como nos tipos de clivagem meroblástica. que é implantado no útero de uma mãe de criação. no estágio de 8 células. hospedeiro e doador. (Fotografia cortesia de B. Essas células são chamadas de células-tronco embrionárias (células ES). exceto em uma pequena porção do citoplasma do ovo. O camundongo quimérico resultante é mostrado na Prancha 21. As células formam um blastocisto composto.) (A) Blastocisto Blastocistos implantados na mãe de criação 1981. Células de três diferentes embriões (A) são agregadas para formar uma mórula (B) que sofre compactação para formar um blastocisto único (C). (de Markert e Petters. Essa técnica se tornou extremamente importante para determinar a função dos genes durante o desenvolvimento de mamífero.28 Pronase Zona pelúcida Blastômeros Produção de camundongos quiméricos. para formar um única mórula compactada. as grandes concentrações de vitelo proíbem a clivagem no seu todo.) Clivagem Meroblástica Como já foi mencionado anteriormente.188 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 5. Martin. (B) (B) (C ) Figura 5. (B) Um camundongo adulto quimérico mostrando contribuições dos embriões pigmentados (pretos) e não-pigmentados (brancos). Embriões de camundongos geneticamente distintos (aqui aqueles com diferentes cores do pêlo) no início do estágio de 8 células são isolados dos ovidutos dos camundongos e reunidos após remoção de suas zonas pelúcidas por ação de enzimas proteolíticas. Aqui. cortesia de C.

Num primeiro instante.30 Clivagem discoidal em um ovo de galinha. permitindo que a clivagem ocorra somente no blastodisco.000 células. Entre elas está a blastocele. na realidade. Essas células serão acrescidas por aquelas células hipoblásticas (hyp) que migraram anteriormente da foice de Koller para formar a camada inferior (hipoblástica). Dessa maneira. A massa do oócito é Sulcos de clivagem tomada pelo vitelo.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 189 discoidal. e pode ser criado para que mutantes possam ser protegidos e propagados. AVES. Langeland e Kimmel. uma região de citoplasma ativo de aproximadamente 2-3mm de diâmetro no pólo animal do ovo. são facilmente mantidos.. Daí por diante. Clivagem discoidal Clivagem discoidal é uma característica de aves.. peixes e répteis. essa camada celular está incompleta. O anel periférico das células blastodérmicas que não são descartadas constituem a zona opaca. Esses peixes têm grandes crias. Essa seção sagital próxima à margem posterior. Entre o blastoderma e o vitelo existe um espaço chamado cavidade subgerminal. Ademais. Observações da clivagem de ovos de peixe através de micrografia ao microscópio eletrônico Blastoderma Figura 5. 1997). Figura 5. Os ovos de peixes com muito vitelo desenvolvem-se similarmente aos das aves. Eyal-Giladi.31 Formação de um embrião do pinto com duas camadas. têm embrião transparente que se desenvolve fora da mãe (uma característica importante para a microscopia). cortesia de H. Essas células permanecem ligadas com junções apertadas (Bellairs et al.31). o vitelo centralizado permite a clivagem somente na borda periférica do ovo. o peixe zebra. Eyal-Giladi.30 mostra a clivagem de um ovo de ave. a divisão celular é limitada a um pequeno disco de citoplasma sem vitelo no topo de um monte formado por vitelo. PEIXES. clivagens equatoriais e verticais dividem o blastoderma em um tecido de cinco a seis camadas celulares. Algumas dessas células são delaminadas em cavidades subgerminais para formar uma segunda camada (Figura 5. vista do pólo animal. 1991). Porque essas clivagens não se estendem para o vitelo citoplasmático. procriam o ano inteiro. 1996. Os sulcos de clivagem não penetram no vitelo. 1992. A Figura 5. o embrião já tenha formado a maior parte de seus tecidos e órgãos primordiais. criado quando uma célula blastodérmica absorve fluido da albumina (“branco do ovo”) e secreta-o entre si e o vitelo (New. (Sc é a cavidade subgerminal. apresentando como característica a forma semelhante ao girino (veja Granato e Nüsslein-Volhard. contínuas nas suas bases. já que as células permanecem contínuas ao vitelo subjacente. logo após a galinha ter botado o ovo. gwm é a margem da parede germinal). eles se desenvolvem rapidamente. e outras clivagens se seguem para criar um blastoderma de camada única. com a divisão celular ocorrendo somente no blastodisco do pólo animal. 1956). as células mais profundas do centro do blastoderma são descartadas para criar uma zona pelúcida unicelular (as células descartadas parecem morrer).1975. Na clivagem superficial. Detalharemos a formação do hipoblasto no próximo capítulo. Danio rerio. para que 24 horas após a fertilização. as células da clivagem precoce são. O primeiro sulco de clivagem aparece centralizado no blastodisco. o blastoderma já contém 60. e é produzido um blastoderma formado por uma única camada de células. mostra uma camada superior consistindo de um epiblasto central que irá entrar nas células da foice de Koller (ks) e na zona marginal posterior (mz). Quando uma galinha se considera pronta para botar um ovo. esse contém duas camadas de células: a superior epiblasto e a inferior hipoblasto. Nesse estágio. se tornou o organismo favorito para quem deseja estudar o desenvolvimento dos vertebrados.) . Nos últimos anos. (de Eyal-Giladi et al. Certas células do epiblasto caem (delaminam) da camada superior para formar ilhas de polinvaginação (pi) com 5 a 20 células cada.

33A. Neste ponto. com periodicidade de aproximadamente 15 minutos cada.32).33A). o blastoderma envolve a célula do vitelo. BD significa a região do blastodisco. A YSL é formada no nono ou décimo ciclo. duas populações de células podem ser distinguidas. A primeira é a camada de vitelo sincicial (YSL).) (E) (F) de varredura mostram. Essas são as células mais superficiais do . 1976. pode ser detectado o início da transição da blástula intermediária: começa a transcrição do gene zigótico. ficando à frente da margem do blastoderma. Inicialmente. parte do vitelo sincicial se moverá para baixo do blastoderma. para formar a YSL externa (Figura 5. quando as células da parte vegetal do blastoderma se fundem com a célula do vitelo adjacente. para formar a YSL interna e parte dos núcleos se moverá vegetalmente. (de Beams e Kessel. Em (A). todas as células mantêm conexões abertas umas com as outras e com a célula de vitelo subjacente para que células de tamanho moderado (17-kDa) passem livremente de um blastômero ao outro (Kimmel e Law.B). A função da YSL ainda não foi esclarecida. 1993).32 Clivagem discoidal em um peixe-zebra. criando uma região celular acima do vitelo denso. A segunda população celular distinguida na transição da blástula intermediária é a camada envolvente (EVL. 1985). veja Figura 5. Começando por volta da décima divisão. Como nos embriões de anfíbios e de ouriços-do-mar. Essas divisões são rápidas. cortesia dos autores. formando um monte celular situado no pólo animal de uma grande célula de vitelo. Isso produz um anel de núcleos com essa parte do citoplasma da célula do vitelo localizado bem embaixo do blastoderma.190 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Figura 5. divisões com clivagens precoce seguem um padrão altamente reprodutível de clivagem meridional e equatorial. As primeiras 12 divisões ocorrem sincronicamente. a natureza incompleta da clivagem discoidal (Figura 5. de uma bela maneira. Expandindo vegetalmente. desaceleração das divisões celulares e o movimento celular é evidente (Kane e Kimmel.

1996. permitindo que um mapa do destino possa ser traçado (Figura 5.. A EVL finalmente forma a periderme. Lee et al. Helde et al. 1993. 1993. qualquer célula pode dar origem a uma variedade imprevisível de descendentes de tecido (Kimmel e Warga. cortesia do autor. determinando em seguida.. . células profundas estão rodeadas pelo EVL. Nesse período. (B) Estágio tardio de blástula. e a EVL é uma cobertura epitelial fina composta apenas de uma camada de células. 1994).. (C) Mapa do destino das células profundas depois que a mistura de células cessou. O destino da célula blastodérmica parece ser fixado pouco antes do começo da gastrulação. quais órgãos as células carregadas de corante geraram. olho Epiderme Crista neural Ventral Somito do músculo Prônefron Intestino Cérebro Medula espinhal Mesoderma Cabeça Dorsal Notocorda Sangue Nadadeiras Coração Músculo Ectoderma Faringe Fígado Margem do blastoderma Célula do vitelo Endoderma A blástula do peixe–zebra. Microtúbulos se estendem através do citoplasma vitelínico e da região externa do YSL. A vista lateral é mostrada. células em regiões específicas do embrião originam certos tecidos de uma maneira altamente previsível. O mapa é gerado injetando células com corante de alto peso molecular. B de Trinkaus. 1987. 1994). (A) antes da gastrulação. Entre a EVL externa e a YSL interna estão as células profundas. e não todos os destinos dos órgãos estão identificados (para clareza). Esse comportamento pode ser observado em algumas das primeiras células a terem seu destino estabelecido .) Pólo vegetal blastoderma. uma proteção extra-embrionária cobrindo o que se pensa ser descartado mais tarde durante o desenvolvimento. das quais surgirá o embrião propriamente dito. 1990). Os núcleos dessas células são derivados de células da margem do blastoderma. Os destinos das células blastodérmicas precoces não estão determinados. que liberou seus núcleos para o citoplasma vitelínico.33C. O processo pelo qual a célula contribui para o tecido envolve uma narrativa progressiva de possíveis destinos para o desenvolvimento de uma determinada célula. Kimmel et al.as células precursoras do coração (Stainer et al.33 (C) Pólo animal Nariz.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 191 (A) Blastoderma Camada envolvente (EVL) Células profundas (B) YSL interna Núcleos sinciciais do vitelo YSL externa Microtúbulos Célula do vitelo Figura 5.. Além do mais. A superfície animal do vitelo é achatada e contém os núcleos do YSL. (A e C segundo Langeland e Kimmel. e os estudos de linhagem celular (onde um corante fluorescente não difusível é injetado em uma das células e os descendentes daquela célula podem ser seguidos) mostram que existe muita mistura de células durante a clivagem. mostrando a YSL.

35 Células individuais que margeiam na metade do caminho as futuras superfícies dorsal e ventral de um embrião em estágio de meia clivagem.34A. células da blástula intermediária podem contribuir para a progênie de ambos. os descendentes de qualquer célula podem povoar somente o miocárdio ou o endocárdio. embora com uma velocidade diminuída. Na Drosophila.192 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. átrio e ventrículo do coração. a progênie da célula está restrita a formar parte do coração. já que a duração de cada ciclo de divisão depende.B). embora o blastoderma celular se forme 3 horas mais tarde. O núcleo do zigoto sofre várias divisões mitóticas dentro da parte central do ovo. em parte. podem dar origem às células que povoam ambos. Núcleos (enérgides) Enérgides migram para a periferia Células polares Blastoderma celular Células polares . seus descendentes irão popular uma câmara somente. Os tempos são representativos.. A clivagem de um ovo de inseto é mostrada na Figura 5. onde as mitoses continuam. Por exemplo. a meio caminho entre os pólos dorsal e ventral.) Ventral Dorsal Célula do vitelo Saco vitelínico Figura 5. Um dos detalhes fascinantes desse tipo de clivagem é que as células não se formam até que os núcleos tenham se dividido. O em- Clivagem superficial em embrião de Drosophila. Nesse estágio. as células marcadas formam descendentes que podem popular tanto a aurícula como o ventrículo. Células polares (que formarão as células germinativas) são vistas no estágio de 512 núcleos. (Segundo Stainier et al. 1993. da temperatura em que o ovo está sendo incubado. O numeral acima de cada embrião corresponde ao número de minutos decorrido após a deposição do ovo.34 (A) (B) Mapa do destino das células profundas da blástula do peixe-zebra. 256 núcleos são produzidos por uma série de divisões nucleares durando. Clivagem Superficial A maior parte dos ovos dos insetos passa por clivagem superficial. onde uma grande quantidade de vitelo centralizada confina a clivagem para a borda citoplasmática do ovo. 8 minutos cada. Se a célula estiver perto da margem. os descendentes de uma célula somente serão capazes de povoar subcompartimentos específicos de tecido. Mais tarde ainda. Se a injeção em tais células for feita em um estágio mais tardio da blástula. Depois o núcleo migra para a periferia do ovo. Injeção de um único blastômero na blástula precoce (estágio de 256-512 células) com rodamino-dextrano. o numeral abaixo de cada embrião indica o número de núcleos presentes. em média. o endocárdio e o miocárdio (Figura 5. Um pouco mais tarde.35.

1993. a criação do blastoderma celular envolve uma interação delicada entre microtúbulos e microfilamentos.. Essas células dão origem às células germinativas dos adultos. 1971. Nenhuma membrana celular existe a não ser a do próprio ovo. Isso forma o blastoderma celular. um dos primeiros eventos do desenvolvimento dos insetos é a separação das futuras células germinativas do resto do embrião. cada núcleo fica cercado por microtúbulos e Superfície do ovo Fuso mitótico Sulco de clivagem Áster Núcleo Canal do sulco Microtúbulos Figura 5. (Segundo Fullilove e Jacobson. 1994). Na Drosophila. a membrana do oócito dobra-se para dentro. e o complexo de actino-membranas começa a apertar o que será o terminal basal da célula (Schejter e Wieschaus. isso não significa que o citoplasma seja uniforme. A primeira fase da celularização do blastoderma é caracterizada pela invaginação das membranas celulares e sua rede de actina subjacente nas regiões entre o núcleo. a segunda fase da celularização ocorre.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 193 brião é chamado agora de blastoderma sincicial. Quando o núcleo alcança a periferia durante o décimo ciclo da clivagem. Aqueles núcleos migrando para o pólo posterior do ovo logo ficam envolvidos pelas novas membranas celulares para formar o pólo de células do embrião. Após as células polares terem sido formadas. Esse processo é inibido por drogas que bloqueiam os microtúbulos. Dessa maneira. separando cada núcleo somático para uma única célula (Figura 5. Karr e Alberts (1986) mostraram que cada núcleo dentro do blastoderma sincicial está contido dentro de seu próprio pequeno território de proteínas citoesqueléticas.36). [cleave5. Foe et al. Após as membranas e sua actina terem passado o nível do núcleo.) .36 Membrana vitelínica Alongamento nuclear e celularização do blastoderma de Drosophila. entre os núcleos. essa camada é composta por aproximadamente 6000 células e é formada 4 horas após a fertilização. Aqui a velocidade da invaginação aumenta. conseqüentemente. com todas as células arranjadas como uma cobertura de camada única envolvendo o núcleo do ovo. Como qualquer outra formação celular. significando que todas clivagens nucleares estão contidas em um único citoplasma.html] Embora os núcleos se dividam originalmente dentro de um citoplasma em comum.

Tais transições também são vistas nos embriões de inúmeros vertebrados e de filos invertebrados. o ciclo 13. Domínios do citoesqueleto podem ser vistos em volta de cada núcleo. O controle dessa desaceleração mitótica (em embriões de Xenopus.194 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Prófase 12 Núcleos Microfilamentos Microtúbulos Figura 5. Daqui para frente. Esses investigadores descobriram que enquanto embriões do tipo selvagem formam sua camada celular imediatamente após a décima terceira divisão. A desaceleração da divisão celular da Drosophila e o aumento concomitante na transcrição do RNA é freqüentemente referido como transição da blástula intermediária (midblastula transition). os embriões haplóides seguem um padrão similar aos embriões do tipo selvagem. L. (B) Microfilamentos foram identificados usando anticorpo fluorescente para actina. Edgard e seus colegas compararam o desenvolvimento inicial de embriões de Drosophila do tipo selvagem com os do mutante haplóide. em um determinado ciclo. Um embrião de Drosophila entrando na prófase da décima-segunda divisão mitótica.37 Localização do citoesqueleto em volta de núcleos no blastoderma sincicial de Drosophila.e. corresponde aos ciclos 12 ao 15 em embriões haplóides.. cortesias de T. fazendo com que os núcleos se dividam em um volume menor. após 13 divisões). 1986). com defasagem de uma divisão celular. um embrião haplóide no oitavo ciclo celular tem a mesma quantidade de cromatina quanto um embrião do tipo selvagem no sétimo ciclo. (de Karr e Alberts. A divisão final do blastoderma. e o ciclo 14 é assincrônico. 1982a. a décima quarta. A Figura 5. Enquanto os ciclos de 1 a 10 duram 8 minutos cada. Karr. A transcrição desses núcleos (que começa por volta do décimo primeiro ciclo) é muito intensificada. em relação a do tipo selvagem. . antes da celularização. o tempo necessário para completar cada uma das próximas quatro divisões se torna gradualmente maior. 1989). sinalizando o fim do período de clivagem. Quando essa ligação foi realizada. Se essa defasagem fosse devida ao fato dos mutantes haplóides terem uma razão de cromatina para o citoplasma de metade. foi secionado e corado triplamente.) microfilamentos. (A) Os núcleos foram localizados por um corante que se liga ao DNA. em comparação com os do tipo selvagem. Dessa maneira. Alguns grupos de células completam esse ciclo em 75 minutos. Além do mais. enquanto outro grupo leva 175 minutos (Foe. estrela-do-mar e Drosophila) aparenta sofrer efeito da razão da cromatina para o citoplasma (Newport e Kirshner. o último ciclo no blastoderma sincicial. O núcleo e suas ilhas citoplasmáticas associadas são chamados enérgides. porém. a duração dos ciclos 11 a 14 em embriões do tipo selvagem. Após o núcleo alcançar a periferia. (C) Microtúbulos foram reconhecidos por um anticorpo fluorescente para tubulina. o padrão mitótico do embrião foi acelerado. O embrião de Drosophila forma células no ciclo 14 (i. Edgard et al. os embriões haplóides passaram por uma divisão extra. 1986. ouriço-do-mar. Os embriões haplóides de Drosophila têm a metade da cromatina a cada divisão celular. então seria possível acelerar a celularização amarrando (ligando) algum citoplasma.37 mostra o núcleo e seu microfilamento essencial e os domínios do microtúbulo na prófase da décima segunda divisão mitótica. leva 25 minutos para se completar.

Em 1941. 1986. não sendo surpreendente encontrar uma grande variabilidade no seu desenvolvimento. a poligerme em crescimento fica suspensa no hospedeiro.. (B) Larvas precoces de um gênero relacionado. Drosophila e Xenopus. 1986a. 195 Informações adicionais & Especulações Exceções. o mesmo acontece com o ovo do parasita. 1987). Com o desenvolvimento do ovo hospedeiro (normalmente de uma mariposa). 1982a. Cruz. No entanto.b). O desenvolvimento da vespa parasita Copidosomopsis tanytmemus difere marcadamente daquele da Drosophila canônica. Kimelman et al. freqüentemente reflete quais animais são mais acessíveis para o estudo e mais facilmente domesticados para o laboratório. e uma explosão de transcrições ocorre em Drosophila (Edgard et al. atacam a larva de Trathala dentro do mesmo hospedeiro. embora haja mais de 800. Em ambos. Cruz.38A. O desenvolvimento de anfíbios é geralmente representado pelo Xenopus laevis.) Mórula de 4 dias Ovo (A) Poligerme precoce Esôfago Corpo gorduroso do hospedeiro Poligerme (B) Poligerme em expansão . a iniciação da transcrição pode ser induzida prematuramente aumentando artificialmente a duração do ciclo celular. Pelo contrário. A fotografia é de um hospedeiro recémaberto. que isso não reflete necessariamente as condições do mundo natural. a fêmea C. Em duas semanas. o maior compêndio do desenvolvimento de insetos (Embriologia dos insetos e Miriápodes. ao invés de diferenciar o eixo do corpo.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade é alcançada quando existe um núcleo para cada 61 µm3 de citoplasma. a transição da blástula intermediária é induzida precocemente em Xenopus. enquanto o ovo do hospedeiro começa o seu desenvolvimento no padrão superficial usual. Johannsen e Butt) sequer mencionava essa espécie em seu índice. B de Cruz. as células do embrião parasita dividem-se repetidamente para se tornar uma massa de células não diferenciadas chamadas poligerme. Insetos são um excepcionalmente bemsucedido e espalhado subfilo.38 Olho/cabeça da lagarta hospedeira Desenvolvimento de vespas parasitárias (Encyrtidae). 1986a). Similarmente. o ovo da vespa divide holoblasticamente. Como muitas outras espécies parasitárias. Em Xenopus. Quando cicloheximida (um inibidor da síntese protéica) atrasa a divisão celular. permanecendo frouxamente atada ao cérebro e traquéia larvais (Figura 5. 1981. Generalizações. A Drosophila ganhou proeminência somente depois que se fez necessário relacionar fenômenos embriológicos com genes particulares. a maior parte dos biologistas do desen- volvimento conhecem apenas o desenvolvimento de uma espécie: Drosophila melanogaster. Ademais. tanytmemus deposita seu ovo den- tro do ovo de uma outra espécie.000 espécies de insetos conhecidas. uma desaceleração similar na taxa mitótica é observada após a décima segunda divisão celular. nossas discussões de desenvolvimento animal são freqüentemente dificultadas por certos organismos em particular. Pentalitomastix. Experimentos de ligação sugerem que o tempo de duração da transição dessa blástula intermediária também é função da razão volumes cromatina/ citoplasma (Newport e Kirschner. Aqui também. cortesia de Y. Figura 5. (A segundo Cruz. e Clivagem Parasítica da Vespa O QUE CONSIDERAMOS “normal” e o que marginalizamos como “exceções”. (A) Clivagem holoblástica do ovo de Copidosomopsis tanytmenus produz uma poligerme de células não-diferenciadas.. as divisões daqui para frente se tornam assincrônicas. Não é necessário dizer. e o camundongo e o homem são os únicos mamíferos cujos desenvolvimentos são usualmente estudados.

1986b. começa a se alimentar vorazmente dos órgãos da larva hospedeira. temos o intervalo da pré-replicação (G1). a divisão celular pode ser muito simples. Após o período da síntese. 1964). Drosophila adiciona G2 durante o ciclo 14 e G1 durante o ciclo 17. Blastômeros precoces de ouriço-do-mar não têm G1 replicando o seu DNA durante a última parte (telófase) da mitose prévia (Hinegardner et al. 1981. a criação parasita já se alimentou dos músculos do hospedeiro.. Se os núcleos de células divididas forem transplantados para esses oócitos.39A). temos o intervalo pré-mitótico (G2). I MECANISMO DE CLIVAGEM Regulando o ciclo da clivagem O ciclo celular das células somáticas é funcionalmente dividido em quatro estágios (Figura 5. provocam a abertura e a saída do hospedeiro. cujos ovos formam quádruplos idênticos. gordura corporal. as larvas precoces são formas predatórias que eliminam possíveis competidores (Cruz.38B). Cada um desses grupos se torna um embrião! A vespa poliembrionária Copidosoma floridanum produz até 2000 indivíduos de um único ovo fertilizado (Grbic et al. morrendo assim que as larvas normais se formam. literalmente por comer o seu corpo. em uma cena recordando o filme Alien. os novos adultos perfuram o tegumento do hospedeiro e. Newport e Kirschner.. Os núcleos de Xenopus e Drosophila eliminaram as fases G1 e G2 durante a clivagem precoce. Um grupo menor. Oócitos normais de Xenopus. A progressão dessas fases é regulada por fatores de crescimento. Enquanto elas vivem. (Poliembrionia é característica de certos grupos de insetos e certas espécies de mamíferos. Quando oócitos normais são estimulados por progesterona. Essa habilidade que um ovo tem para se transformar em uma massa de células. São essencialmente um conjunto de mandíbulas móveis. desencorajando generalizações precipitadas sobre um completo subfilo de organismos. No entanto. cordões nervoso e hemolinfa. 1982a).. 1992). Xenopus divide-se sincronicamente em um ciclo celular bifásico: S para M e M para S (Figura 5. Essas larvas não se reproduzem. se tornam larvas precoces (Figura 5. que se desenvolvem em uma semana. Laskey et al. tais como o tatu de nove bandas.196 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Com o crescimento. Elas não só se desenvolvem precocemente. glândulas de seda. deve também nos encorajar a apreciar a plasticidade da natureza. Se o núcleo de células não divididas (como neurônios) são colocados no citoplasma de oócitos tratados com progesterona. Após outros 5 ou 6 dias. Em 40 dias. São incapazes de se dividirem. vão até o embrião hospedeiro matando as larvas parasitas de outros indivíduos (de espécies diferentes e de outros clones da mesma espécie). A habilidade de um inseto se formar de um embrião por clivagem holoblástica. no entanto. acham um novo hospedeiro para depositar os seus ovos e morrem logo em seguida. que rotineiramente forma numerosos embriões. 1996). e o hospedeiro é um pouco mais do que um saco de pele segurando cerca de 70 larvas pupantes de vespa. gônadas. no entanto. de cerca de 10 porcento do número total de embriões. também param a divisão. também iniciam a divisão e param . em seguida acontecendo a síntese do DNA (S). além de sua utilidade de provocar noções de desconforto no que se refere a ordem natural e natureza da “individualidade”. Em outras palavras. fazendo-o questionar o conceito de uma divindade benigna conhecida por todos. seguido pela mitose. Tal ciclo de vida incomodava Charles Darwin. a larva normal emerge da sua primeira mudança de pele. Após a mitose (M). Esses adultos freqüentemente co- pulam (a maioria das vezes sobre o corpo do hospedeiro morto). Grbic and Strand. Macrocentrus grandii é uma vespa poliembrionária que parasita a broca Européia do milho. são detidos na primeira prófase meiótica. algum tempo após a décima segunda clivagem. 1977. as vespas parasitas podem ter conseqüências econômicas importantes. Os fatores que regulam esse ciclo bifásico estão localizados no citoplasma. a poligerme se divide em dúzias (às vezes milhares. Com a morte das larvas precoces (e suas presas).39B. como têm muito pouca estrutura e não sofrem metamorfose. é chamada de poliembrionia. retomam sua divisão meiótica e param na metáfase da segunda meiose. intestinos. Em 1860 ele escreveu ao biologista americano Asa Gray: “Eu não consigo me convencer de que o benevolente e onipotente Deus tenha planejado e criado a Ichneumonidae com a expressa intenção delas se alimentarem dentro dos corpos vivos de lagartas”.) A maior parte desses embriões de vespa parasita se desenvolvem em larvas normais que levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver. (Embriões de Xenopus adicionam essas fases ao ciclo celular. dependendo da espécie) de discretos grupos de células. quando aumentam.) Nas primeiras 12 divisões. Em blastômeros de clivagem precoce.

Seus envoltórios nucleares se partem e suas cromatinas condensam-se em cromossomos. o MPF existe em estado inativo. Newport e Kirschner (1984) demonstraram que a replicação do DNA (S) e mitose (M) são dirigidas somente pelo ganho ou perda de atividade do MPF. Harland e Laskey. Esse mesmo fator continua realizando o seu papel após a fertilização. Masui e Markert. (A) Ciclo celular de uma célula somática típica. 1968). mesmo na ausência de núcleos ou centríolos. S e M.) na metáfase (Gurdon. responsáveis para progressão através do ciclo celular. Essa ciclicidade também é observada em blastômeros anucleados. incubando-as com um inibidor de síntese protéica. 1980.39 Ciclos celulares de células somáticas e blastômeros precoces. Gerhart e colegas (1984) mostraram que o MPF sofre mudanças cíclicas nos níveis de atividade nas células mitóticas. Após uma hora. sua replicação sofre o controle desse ciclo (Hara et al. são mostradas no seu ponto de regulação do ciclo celular. A atividade do MPF de blastômeros precoces de rãs é maior durante M e não detectável durante S.. As células em clivagem pode ficar presas na fase S. Células que estão se diferenciando são geralmente “removidas” do ciclo celular e estão numa fase G1 estendida chamada G0. O fator induzido por progesterona que permite o núcleo do oócito retomar suas divisões é uma fosfoproteína de duas subunidades chamada de fator de promoção da maturação (MPF. As ciclinas e suas respectivas quinases. Quando o MPF é microinjetado nessas células. o MPF é degradado e os cromossomos retornam à fase S. Dessa maneira. 1995. elas entram em M. mesmo na ausência de síntese protéica. (B) Ciclo celular bifásico mais simples dos blastômeros precoces de anfíbios. .CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 197 (A) Ciclina B (B) Ciclina D Ciclina A Ciclina E Ciclina A Figura 5. regulando o ciclo bifásico dos blastômeros precoces de Xenopus. Se fragmentos clonados de DNA são injetados nesses embriões anucleados. A Mitose (M) é seguida por uma condição de “interfase”. também conhecida como fator promotor da mitose.. S (síntese) e G2. a capacidade de divisão celular é regulada pelo citoplasma. O citoplasma de oócitos estimulados com progesterona ainda passam por contrações corticais periódicas (característica da divisão). 1980. (A segundo Nigg. 1969. Karsentiket al. 1971). tendo somente dois estados. Durante essa fase S. Esse último período é subdividido em fases G1. Fator promotor de maturação Alguns dos fatores que governam a síntese do DNA e a divisão celular foram identificados. O MPF foi primeiro descoberto como o principal fator responsável pela retomada das divisões celulares meióticas no ovo ovulado de rã (Smith e Ecker.1984).

MPF funciona adicionando grupos fosfatos às proteínas específicas. Gautier et al. Outro alvo é o envoltório nuclear. A pequena subunidade de MPF tem sido notavelmente conservada através da evolução e é quase idêntica àquela da fosfoproteína indutora de mitose. Quando essa proteína é fosforilada. pode fosforilar uma variedade de proteínas. 1987). Um terceiro alvo parece ser a RNA polimerase (Cisek e Corden. e nos próximos 15 minutos. o gene humano que codifica a proteína correspondente à pequena subunidade do MPF de Xenopus pode ser inserido no genoma da levedura e causar divisão nos mutantes de levedura deficientes em cdc2 (Lee e Nurse. Pré-MPF acumula mas não é ativado até que a fosfatase cordão cliva os fosfatos T-14 e Y-15 da cdc2 quinase..40 O desenvolvimento da regulação do ciclo celular na embriogênese de Drosophila.. o envoltório se despolimerizou e está se desfazendo (Miake-Lye e Kirschner.) Regulado zigoticamente Regulado maternalmente Ciclina maternal e proteínas de cordão presentes MPF ativo Proteína Ciclina Ciclina Ciclina Proteína maternal de cordão presente Ciclina Ciclina mRNA Ciclina Degradação Pré-MPF Ciclina Síntese de ciclina (zigótica) Desfosforilação cdc 25/cordão fosfatase (zigótica) MPF ativo Ciclina Síntese de ciclina MPF ativo Ciclina Degradação da ciclina Mitose Quinase ativa de proteínas maternas (limita substrato) Ciclo Divisões nucleares Mitose Ciclo dirigido pela tradução de nova ciclina de mRNA materno Mitose Ciclo dirigido pela cdc25/fosfatase de cordão Mitose . sintetizada pelo gene cdc2 da levedura (Dunphy et al. Arion et al. Além disso. A inibição dessa miosina durante os estágios iniciais da mitose. e a fosforilação da RNA polimerase pode ser a responsável pela inibição da transcrição durante a mitose. ela se torna inativa e incapaz de funcionar como uma ATPase dirigindo os filamentos de actina envolvidos na divisão celular (Satterwhite et al. Portanto. A proteína p34 pode existir em formas fosforiladas e desfosforilada. 1994.. durante os primeiros sete ciclos celulares. quando ativada. e deve ser sintetizado de genes nucleares. À medida que a ciclina é degradada.. A fosforilação dessa proteína pode levar à condensação cromossômica. 1988). 1989). 1990). 1988. Um quarto alvo da quinase parece ser a subunidade reguladora de miosina citoplasmática. Ward e Kirschner. que se liga ao DNA. Um desses alvos é a histona H1. 1992). A MPF quinase purificada já foi mostrada fosforilar esses envoltórios nucleares de proteínas. Dessa forma. (A) Ciclina e proteína cdc25 (cordão) são abundantes antes da fertilização. 1988). 1990. CDK) MPF tem uma subunidade grande e outra pequena. as três proteínas principais (as lâminas) do envoltório nuclear se tornam hiperfosforiladas. De fato. o mRNA materno para ciclina desapareceu. sua síntese (de mRNA estocado no citoplasma) torna-se limitante no ciclo 8. (Segundo Edgar et al. pode prevenir divisões da célula até depois dos cromossomos terem-se separado. a degradação das proteínas do cordão comanda nova síntese a partir do núcleo. e realizar sua despolimerização in vitro (Peter et al. A forma ativa parece ser fosforilada Figura 5. Quinze minutos após a adição do MPF.. A pequena subunidade de MPF é uma proteína quinase que. 1985. No ciclo 14. p34. O mecanismo que relaciona a atividade do MPF com o término da síntese de DNA e a iniciação da citocinese estão sendo investigados.198 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações MPF e Seus Reguladores A pequena subunidade do MPF: A cdc2 Quinase (QuinaseCiclina-dependente. a atividade da MPF quinase permanece constante e as divisões celulares prosseguem tão rapidamente quanto funcionam as enzimas e os substratos..

Em Drosophila.41 Correlação da expressão do gene string (cordão) com a divisão celular em embriões de Drosophila. Ambas condições são importantes para a atividade da quinase (Gould e Nurse. Na ovulação. 1989. 1988. se o núcleo não transcrever seu próprio cordão mRNA. Esse gene foi clonado. o MPF ativo permanece em níveis altos. durante o pró- ximo ciclo. acumulando durante a fase S e sendo degradada durante a mitose (Evans et al. Essa degradação e a necessidade de re-sintetizar essa proteína explicariam a mudança de controle citoplasmático para controle nuclear da divisão como visto no ciclo 14.40).. Isso é conseguido pelo aparecimento da fosfatase cdc25 (Edgar e O’Farrell. pensou-se que qualquer regulador da proteína da levedura teria contrapartida no embrião animal. Na Drosophila. a fosfatase cdc25 (produto do gene string. Solomon et al. o complexo pré-MPF armazenado no ovo é desfosforilado em T14 e Y-15 pelo recém-traduzido cordão (cdc25) da proteína. um embrião de estágio tardio 14 é corado com uma seqüência nucleotídica radioativa que especificamente reconhece e liga o mRNA cordão (visto aqui como pontos brancos na auto-radiografia). 1989.. A proteína ciclina B combina com a quinase cdc2 do MPF para criar o comple- xo MPF. Gautier et al. e a seqüência de sua proteína codificada foi considerada muito semelhante às proteínas ciclina B encontradas em numerosos animais (Goebl e Byers. Uma comparação da microfotografia de fluorescência com a auto-radiografia obtida da ligação da sonda radioativa mostra que somente aquelas células capazes de se dividirem. 1993).CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 199 em treonina-161 (T-161) e desfosforilada em tirosina-15 (Y-15).41). Um dos principais reguladores da proteína MPF de levedura é o produto do gene cdc13. Essa fosfatase (que tem sido encontrada em inúmeros organismos) é ela própria regulada pelo desenvolvimento. Dessa maneira. de cordão) é inicialmente sintetizada pelo mRNA armazenado no oócito durante os 13 primeiros ciclos celulares. o cordão mRNA materno é degradado. Lee et al. 1983. 1986). A Fosfatase cdc25: Iniciadora de Mitose A mitose se inicia com uma abrupta desfosforilação de todas essas subunidades MPF quinase na posição 15.) (B) (C) . uma proteína 56-kDa chamada p56cdc13. 1989. as células não se dividirão. Edgard et al. (A) Nesse exemplo. 1992). 1988). potencialmente funcional. A. No entanto. A síntese da ciclina do mRNA armazenado no oócito armazenado se torna o passo limitante para a mitose. a célula não entrará em mitose (Minshull et al. como é regulado o MPF? Desde que a clivagem de Xenopus parecia ser regulada por uma proteína similar àquela que regula a divisão celular da levedura. e se sua transformação em proteínas é seletivamente inibida. cortesia de B. As proteínas ciclina B em células em estágio de clivagem mostram um comportamento periódico. Durante os ciclos 8-13. 1991. quando fosforilada nessas posições a quinase permanece inativa. enquanto aquelas que não são capazes de se juntar a esse ciclo. Ciclinas são freqüentemente codificadas pelo mRNA armazenado no citoplasma do oócito. A degradação do cordão da oócito-proteína leva à parada do ciclo celular na interfase do ciclo 14. Durante os primeiros sete ciclos nucleares. (C) Anticorpos para a proteína ciclina A mostram que ela é degradada após a mitose e não é vista nas regiões que contêm a proteína de cordão. Edgard e O’Farrel (1989) mostraram que aquelas células que se dividem estão sintetizando a sua própria fosfatase cdc25.. A fosforilação no T-161 é necessária para a atividade do MPF. existe uma maturação desenvolvimental da regulação da quinase MPF ativa (veja Figura 5. A maior subunidade do MPF: Ciclina Então. mas fosforilações nos T-14 e Y-15 a inibem. (de Edgar e O’Farrell. Edgar. (A) Figura 5.. (B) Um embrião ligeiramente mais velho é corado com anticorpos fluorescentes para tubulina para mostrar os microtúbulos dos fusos mitóticos. e o núcleo divide-se tão rapidamente quanto as enzimas sintetizadoras de DNA permitem.. 1994). a acumulação gradual do MPF é convertida em uma breve explosão de atividade quinase que inicia a mitose. Dessa forma.40. sintetizam mRNA string.. Jessus e Beach.. A ciclina permite a subunidade quinase cdc2 tornar-se fosforilada nos resíduos treonina-14 (T14). levando a flutuações periódicas de atividade MPF-quinase. 1989). Solomon. Swenson et al. O suprimento de moléculas MPF potencialmente funcionais (pré-MPF) acumula durante o período tardio de S. a ciclina começa a ser degradada na metáfase. tirosina-15 (Y15) e treonina-161 (Figura 5. 1992. porém. não realizarão a divisão (Figura 5.

6 cumprem um papel crucial no desenvolvimento. por fim. as células retidas sofrem uma nova rodada de síntese de DNA (Knoblich et al. Outras ciclinas e quinases ciclinadependentes MPF é o primeiro membro descoberto de uma família de proteínas diméricas que têm estruturas muito similares. MPF permanece ativo. seríamos muito maiores do que agora. e se desenvolve um tumor. o crescimento das células continua sem controle externo. Em diversos tipos de células. 1996. O sinal normal de maturação é o hormônio progesterona. e a mitose pára. Certamente.html] começo da mitose.200 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Grandes concentrações de pré-MPF se acumulam. que estimula a ovulação dos oócitos e o início da meiose. O oócito maduro da rã cessa a divisão celular produzindo uma proteína chamada fator citostático (CSF). que continuam a produzir DNA na ausência de divisão celular. a ciclina B cessa seu funcionamento. expressam a proteína Dacapo. durante o desenvolvimento do oócito da rã. e Pontos de Controle para Divisão Celular: DNA e Fusos O ciclo celular exige uma excepcional intricada coreografia da citocinese. 1994). levando à deficiência dessa proteína no ciclo 17. as ciclinoenzimas D/cdk4. 1994). e as células do intestino. que quando dependente do MPF é chamada cdk1. Ainda pior. Enquanto MPF (ciclina B/cdk1) é crítica para a entrada na mitose (M). quando a proteína de cordão se torna limitante no ciclo 14. A regulamentação do desenvolvimento dessa proteína é uma fase crítica no desenvolvimento da Drosophila. imagine se a divisão da cartilagem não fosse coordenada com a divisão da pele e dos vasos sangüíneos. Aí começam a diferenciar-se. A fase G1 é adicionada ao ciclo 17 quando ciclina E se torna o fator limitante para a replicação do DNA.. fazendo com que a mitose não comece até que o DNA tenha começado a replicarse. um inibidor de ciclina E/cdk2 (Lane et al.. Nesses casos. a maioria das células param no G1 desse ciclo. inativação de CSF Estímulo para amadurecimento (progesterona ou MPF) Alta Atividade de MPF Baixa CSF estabiliza MPF Oócito Imaturo Meiose I Meiose II Oócito maduro Primeira clivagem Segunda clivagem . 1996). Fator Citostático A síntese e a degradação do MPF leva a ciclagem das células. Dessa forma. de Nooij et al.. e parece agir bloqueando a degradação da ciclina (veja o Capítulo 22). fosforilando certos fatores de transcrição que regulam as transcrições das proteínas necessárias para a replicação do DNA (Duronio e O’Farrell. Em células maduras de vertebrados.. As mitoses para as divisões 14. a ciclina E é derivada dos genes zigóticos.42). Em embriões precoces. Essa proteína é derivada de transcrição nuclear ao final de cada período G2. Essa proteína contém os produtos dos genes c-mos e cdk-2. A regulação das ciclinas é uma função crítica no desenvolvimento. regulam as ciclinas que controlam a passagem através dos ciclos das células. 1994). seus mRNA sendo fornecidos pelo oócito e traduzidos através de todos os primeiros 15 ciclos de divisão. que mantém o oócito preso na metáfase da segunda divisão meiótica (Figura 5. aumento de Ca2+ livre.39). Madine et al. quando a ciclina se torna ativa sem regulação externa ou quando ciclinas se tornam estimuladas por proteínas mutantes. Também parece haver retroalimentação entre a cromatina replicante e as quinases ciclina-dependentes. Embriões de Drosophila adicionam um estágio G2 antes da mitose. Os papéis de algumas dessas quinases foram determinados (como mostra a Figura 5. não entrando no período de síntese do DNA. Por exemplo. aparentemente. [cleave6.. Nesse conjunto. e somente uma rodada de replicação é normalmente permitida durante a divisão celular (Chong et al. montagem de fusos e metabolismo celular. controlam a dicotomia entre a divisão e a diferenciação celular. 1995). Se os fusos são formados incorretamente. Pensa-se que a ciclina E controla a síntese do DNA.42 Níveis do fator promotor de amadurecimento (MPF) durante o desenvolvimento precoce da rã Xenopus laevis. Primeiro. (Segundo Murray e Kirschner. Uma vez que a ciclina não é degradada. imagine que essa desregulação ocorresse em somente uma de nossas pernas. imagine as células da cartilagem de nossas pernas sofrendo mais uma divisão celular. mas a própria montagem do fuso é necessária para o funcionamento apropriado da ciclina B (Minshull et al. 15 e 16 são iniciadas somente quando essa pré-MPF é desfosforilada nas posições T14 e Y-15 pela proteína cordão.. Pelo menos outras sete quinases ciclina-dependentes estão envolvidas em células maduras de vertebrados. e mais de uma dúzia de ciclinas foram identificadas. Pior. A mitose passou do controle citoplasmático para o nuclear. ciclinas e quinases ciclina-dependentes são alvos e causadores da regulação. 1989. Cada uma dessas proteínas contém uma ciclina e uma quinase ciclina-dependente. a fibra do fuso mitótico não pode formar até a ciclina B/cdk1 sinalizar o Figura 5. No entanto. (As exceções são as células precursoras dos nervos que continuam a proliferar. se a degradação da ciclina for prevenida.) Se ciclina E é induzida ectopicamente. Segundo. As moléculas que mediam essas trocas estão agora sendo estudadas. 1995. 1989). quando as células saem normalmente do ciclo para começar a se diferenciarem. replicação de DNA. Entre essas enzimas.) Entrada de espermatozóide. permitindo a ocorrência de síntese do DNA. uma das mais críticas é a ciclina E/cdk2. A regulação desses eventos é coordenada através de hormônios e fatores de crescimento que. O sistema ciclinaquinase parece coordenar esses eventos. Isso é o que acontece. ciclina E/cdk2 é crítica para a habilidade da célula entrar na fase S. ciclina E e cdk2 estão sempre presentes. A mensagem para ciclina é degradada durante o ciclo 16. o MPF permanece ativo e a célula é travada na metáfase (Murray et al..

um dos efeitos da liberação de íons de cálcio na fertilização é de iniciar a degradação da ciclina e permitir que a célula comece a replicação do DNA. O mecanismo citoesquelético da mitose Clivagem na verdade é o resultado de dois processos coordenados. Outra maneira de induzir esse estado é tratar os embriões com a droga citocalasina B. a citocinese pára. portanto. A liberação de íons de cálcio durante a fertilização ativa a protease que especificamente inativa o CSF (Watanabe et al. se interrompido. 1987). com seus microtúbulos compostos de tubulina (o mesmo tipo de proteína componente do flagelo do espermatozóide). Sob o microscópio eletrônico. às vezes. Embora a cariocinese e a citocinese sejam normalmente coordenadas. Em seguida. . 1991). O relacionamento e coordenação entre os dois sistemas durante a clivagem é representado na Figura 5. Whittaker. 1991). Esse aperto dos anéis de microfilamentos cria o sulco da clivagem. O primeiro desses processos cíclicos é a cariocinese.1µm para o centro do ovo. O sulco da clivagem finalmente seciona o plano da mitose criando. 1902. nocodazol tornou-se a principal droga usada para inibir processos mediados por microtúbulos (veja Hardin.43B). que inibe a formação e a organização de microfilamentos no anel contrátil. Quando o CSF é degradado. O fuso mitótico e o anel contrátil estão perpendiculares um com o outro. separadas por condições naturais ou experimentais. O segundo processo é a citocinese. mesmo quando a clivagem é bloqueada (Lillie. Nos ovos dos insetos. elas são. os sinais da fertilização que ativam a proteína quinase C estão estabelecendo condições de interfase: descondensação da cromatina e reforma do envoltório nuclear (Bement e Capco. cujo agente mecânico é o fuso mitótico. a divisão da célula. a divisão mitótica do núcleo.2 apresenta uma comparação desses sistemas de divisão. o anel de microfilamentos pode ser visto formando uma banda cortical distinta de 8-10 µm de espessura (Figura 5. que por sua vez é baseada nos ritmos cíclicos da síntese e degradação da ciclina. e o fuso é interno ao anel contrátil. a cariocinese ocorre diversas vezes antes da citocinese. Enquanto os íons de cálcio estão ocupados desligando a mitose. Dessa maneira. o núcleo continua a se dividir e expressar proteínas reguladoras do desenvolvimento. enquanto a clivagem continua.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 201 o oócito permanece na metáfase. É responsável por exercer a força que separa o zigoto em blastômeros. Os microfilamentos de actina são encontrados no córtex do ovo ao invés do citoplasma central. Em alguns momentos. e a célula pode retornar à fase S. Tabela 5. A Tabela 5. a ciclina pode então ser degradada. onde o ovo do ouriço-do-mar é mostrado passando pela primeira clivagem. 1979). interrompendo a clivagem sem parar a cariocinese (Schroeder.2 Cariocinese e citocinese Principal composição protéica Microtúbulos de tubulina Microfilamentos de actina Principal droga disruptora Colchicina. os ritmos da divisão celular são controlados pela atividade do MPF.43A.. Schroeder (1973) propôs um modelo de clivagem em que o anel contrátil parte o ovo como um “fecho de bolsa” apertando o ovo. dois blastômeros geneticamente equivalentes. assim. Esse anel contrátil existe somente durante a clivagem e se estende por 0. 1972). nocodazola Citocalasina B Processo Cariocinese Citocinese Agente mecânico Fuso mitótico Anel contrátil Localização Citoplasma central Citoplasma cortical a Como foi verificado que a colchicina inibe independentemente várias funções da membrana. O agente mecânico da citocinese é o anel contrátil de microfilamentos feitos de actina (o mesmo tipo de proteína que alonga os microvilos do óvulo e o processo acrossômico do espermatozóide). incluindo a osmorregulação e o transporte de íons e nucleosídeos.

Esses ásteres (Figura 5. Dessa maneira... 1927) fizeram observações semelhantes com embriões de ouriço- . 1991). Driesch e Morgan (revisto por Morgan.43C) são “raios” microtubulares que se estendem dos pólos do fuso mitótico para a periferia da célula.202 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 5. (A) Diagrama da telófase da primeira clivagem. Pflüger (1884) descobriu que quando um zigoto de rãs é levemente comprimido entre duas placas de vidro. (B de Bonder et al. al.20). Pesquisas in vitro sugerem que a replicação do DNA pode controlar a fosforilação da subunidade quinase cdc2 do MPF e que essa fosforilação pode controlar a habilidade da actina de se contrair (Smythe e Newport. O número e o local desses sulcos de clivagem parecem ser controlados pelos ásteres dos microtúbulos. (C) marcação fluorescente da tubulina mostra os ásteres microtubulares de um ovo de ouriço-do-mar durante a telófase da primeira clivagem. Clivagem normal ocorre somente se um par de ásteres está presente (Wilson. é como a citocinese e a cariocinese são coordenadas entre si. essas observações podem não ser consistentes com as observações feitas em células embrionárias precoces (Ferrell et al. e ovos polispérmicos (obtendo centríolos de cada espermatozóide) formam sulcos de clivagem múltiplos no mesmo ovo (veja Figura 4. 1901). 1987.43 (A) Microfilamentos (anel contrátil) (B) Papel dos microtúbulos e microfilamentos na divisão celular. se os centríolos migram ao pólo posterior. mesmo na ausência de núcleo. Em estudos mais recentes. 1988.. enquanto o citoplasma está sendo apertado pela contração dos microfilamentos. Raff e Glover (1989) mostraram que no embrião de Drosophila. Os cromossomos estão sendo arrastados para os centríolos por microtúbulos.) Centríolo Cromossomo (C) Microtúbulos Um dos mais intrigantes problemas não resolvidos da clivagem embrionária. O segundo tipo de evidência ligando os ásteres com a formação do sulco de clivagem vem de experimentos nos quais a direção de clivagem é mudada pela colocação do ovo sob pressão. parece que os ásteres são elementos sine qua non da clivagem. 1992). C de White et. Ambos. Marcação fluorescente dos microfilamentos de actina mostra o anel contrátil no sulco da primeira clivagem (flecha) de um ovo de ouriço-do-mar na telófase. eles podem formar células polares. as direções das primeiras três clivagens são todas perpendiculares ao plano das placas. No entanto. (B) Localização de microfilamentos da actina no sulco de clivagem.

Na próxima divisão (C. suas interações causam a formação de um sulco de clivagem.D). A membrana da parte onde o sulco termina é derivada de uma superfície externa preexistente do ovo. a membrana da superfície externa do embrião e a membrana da borda principal do sulco de clivagem são altamente marcadas (mostrando serem as regiões originais da membrana). pode-se alterar a direção do sulco de clivagem.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 203 Zigotos (A) (B) Sulco de clivagem normal (C) Sulco extra de clivagem extra (D) Bola de vidro deslocando o aparelho mitótico Ásteres Interrupção do sulco de clivagem Fuso Figura 5. na borda do sulco. com a mudança do local do fuso mitótico. apesar de não haver fuso mitótico que o atravessa. a nova membrana é branca. uma bola de vidro foi usada para deslocar os ásteres do centro da célula em direção à periferia. Durante a primeira clivagem. a membrana do sulco é um mosaico de diferentes partes. mas um terceiro sulco aparece entre os dois ásteres no topo da ferradura (Figura 5. Em ambos os casos.) A formação de novas membranas Nossa última consideração sobre clivagem embrionária envolve a formação de novas membranas celulares. em forma de ferradura. O sulco de clivagem resultante se estende somente enquanto a bola não aparece do outro lado.44C). cria-se um novo sulco de clivagem.45B). A borda do . Criação de um novo sulco de clivagem pelo deslocamento dos ásteres. Entre elas há uma grande região desprovida de rótulo radioativo (Figura 5. Byers e Armstrong especulam que o domínio da membrana intensamente marcada. Byers e Armstrong (1986) radiorotularam componentes de membrana de ovos de Xenopus recém-fertilizados e seguiram a redistribuição dessas moléculas através da clivagem. Rappaport.44.45A mostra o primeiro sulco da clivagem de um zigoto pigmentado de rã. cria-se uma célula com forma de ferradura. Embriões de anfíbios fornecem evidências que novos componentes da membrana estão sendo sintetizados durante a clivagem precoce. Dessa maneira. mas a maior parte da membrana do sulco é derivada de regiões que são inacessíveis aos marcadores de superfície. Isso demonstra claramente que se os dois ásteres estiverem próximos um do outro. por auto-radiografia. Dessa maneira. Na Figura 5. Na próxima divisão. deslocando os fusos mitóticos para os lados das células. Serão essas membranas recém-sintetizadas ou são meras extensões da membrana celular do oócito? A resposta é que provavelmente ambos mecanismos contribuem para as membranas celulares internas. Ao passo que a membrana original tem uma região cortical pigmentada associada a ela.44 do-mar. (A. 1961. dois aparelhos de fuso se formam entre quatro ásteres. marcada. cortesia de R. Rappaport (1961) estendeu esse tipo de experimento. é formada uma célula binucleada.B) Pela interrupção de um sulco de clivagem com uma bola de vidro. contém as membranas âncoras para o anel subjacente de microfilamentos corticais. A Figura 5. Essa nova membrana tem também propriedades de condutividade elétrica diferentes daquelas da membrana original. mesmo na ausência de um fuso mitótico entre eles. o plano da terceira clivagem (que é normalmente paralelo ao equador do oócito) foi deslocado em 90o. Dessa maneira. Novamente nós observamos que a divisão celular pode ocorrer sem divisão nuclear enquanto os ásteres estiverem presentes. (de Rappaport. mas são gerados três sulco de clivagem! Cada braço da ferradura tem o seu próprio fuso mitótico e sulcos de clivagem como esperado.

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Dev. and Kirschner. Cytoplasmic determinants of tissue differentiation in the ascidian egg. Ziomek. Sutherland. The yolk syncytial layer of Fundulus: Its origin and history and its significance for early embryogenesis.CAPÍTULO 5 Clivagem: Criando multicelularidade 207 Peter. Biol. Dev. K. Smythe. M. E. Lytechinus variegatus. Rugh. NatI. Farrell. T. Satterwhite. J. and Nuccitelli. Amos. Ziomek. L. 1993. 1979. K. Cell 61: 561-577. Wilson. The Mouse. 1972. Morrill. Strickland. Experiments in cytology. Exp. Cavitation in the mouse preimplantation embryo: Na/K ATPase and the origin of nascent blastocoel fluid. Jr. 1979. L. J. total poly(A). Pratt. 122: 577-601. D. Nuclear transfer in mammals and amphibia. J. E. Bottleneck acts as a regulator of the microfilament network governing cellularization. M. III.. L. Dev. Dev. . and Wróblewska. J. M. 249: 347-349. Booher. A. and Haegel. R. Determining its brief existence. 1980. R. C. Ges. Seidel. E. W.. 1961. 1983. 13: 353-395. 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.

dramaticamente. o casamento ou a morte. • Ingresso de células. e migrações celulares em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. envolve os seguintes tipos de movimentos: • Epibolia. e é estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. Ainda. reorganizam as células da blástula. LEWIS WOLPERT (1986) G ASTRULAÇÃO é o processo pelo qual movimentos altamente integrados de células e tecidos.. Assim. • Invaginação. ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso são distribuídas na superfície externa. Não ousaríamos sequer conceber as coisas que são meros detalhes da existência. geralmente. Durante a gastrulação. A blástula consiste de numerosas células. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de células ectodérmicas) que se espalham como uma unidade e não individualmente. devemos levar em conta as seguintes questões (Trinkaus. para envolver as camadas mais profundas do embrião. CONAN DOYLE (1891) Não é o nascimento. as três camadas germinativas – ectoderma externo. mas é a gastrulação que é verdadeiramente a parte mais importante de nossa vida. o palco está montado para as interações desses tecidos recémposicionados. de maneira semelhante à cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfície de uma bola de borracha macia. a vida é infinitamente mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. A separação de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. A internação ou movimento de interiorizarão de uma camada externa em expansão. A gastrulação.. As células que formarão os órgãos endodérmicos e mesodérmicos são trazidas para dentro do embrião. de modo a se espalhar na superfície interna das células externas remanescentes. 1984a): • Qual é a unidade da atividade migratória? É a migração dependente do movimento de células individuais.. propriedades migratórias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmáticos que 209 . Os movimentos da gastrulação envolvem o embrião inteiro. Ao considerarmos gastrulação em diferentes tipos de embrião. O dobrar para dentro de uma região de células. relativamente poucos mecanismos estão envolvidos.Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 6 Meu querido amigo. A migração de células individuais da camada superficial para o interior do embrião. • Involução. essas células recebem novas posições e novos vizinhos. ou são as células parte de uma camada migrante? Por mais extraordinário que possa parecer. A. endoderma interno e mesoderma intersticial – são produzidas inicialmente durante a gastrulação. • Delaminação. cujas posições foram estabelecidas durante a clivagem. Mesmo que o padrão de gastrulação seja extremamente variado em todo o reino animal..

Gastrulação em ouriço-do-mar A blástula do ouriço-do-mar consiste de uma única camada de mais ou menos 1000 células. conseqüências de mudanças nas propriedades da superfície celular. • A expansão ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrínsecos próprios. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposição contínua para seguir os movimentos microscópicos das células mesenquimatosas dentro da blastocele.30 horas da madrugada com uma xícara de café. examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que está se passando”. F. tais como adesividade ao substrato ou a outras células? Considerando essas questões.1 e 6. aves e mamíferos*. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulação. Essas células apresentam movimentos de vibração em suas superfícies internas. Essas células são chamadas de mesênquima primário e são derivadas dos micrômeros. As células então se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6. No *A discussão da gastrulação de Drosophila será transferida para o Capítulo 14. e os cílios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Gastrulação é (como diz Wolpert na citação no começo deste capítulo) a época mais importante da sua vida. partenogeneticamente. característica dos ouriços-do-mar. Logo após a eclosão da blástula da membrana de fecundação. estão as células involutivas puxando as células epibolizantes para baixo em sua direção. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulação. Assim. o citoplasma claro externo migrou para baixo em direção à região vegetativa. a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das células que formam a região migratória. Vale a pena examiná-la criticamente e apreciá-la vagarosamente. de uma maneira muito parecida à epibolia das células do hemisfério animal durante o desenvolvimento normal. durante a gastrulação. Ray Keller (comunicação pessoal) “Estudantes NÃO deveriam ler esse material apressadamente. quando ela ocorre no contexto da formação do eixo. O citoplasma do zigoto se separou em regiões definidas. ou são os dois movimentos independentes? • Existe uma expansão ativa do tecido total. Ainda mais. Ingresso do Mesênquima Primário FUNÇÃO DAS CÉLULAS PRIMÁRIAS DO MESÊNQUIMA. Por exemplo. .2. passivamente? • São as mudanças na forma e na motilidade celular.2 mostram o destino das várias regiões do zigoto enquanto ele se desenvolve através da clivagem e da gastrulação na larva pluteus. observaremos os vários padrões de gastrulação encontrados em equinodermos. ao contrário uma cena típica é aquela em que um pobre coitado está debruçado sobre este texto às 2. estendendo e contraindo longos e finos processos (30x5 µm) chamados filopódios. O destino de cada camada pode ser visto através de seus movimentos durante a gastrulação. 9 horas). 9-10 horas). óvulos do anelídeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. um aglomerado de pequenas células começa a se modificar. As 64 ou mais células mesenquimatosas primárias do ouriço-do-mar são as descendentes dos quatro blastômeros que se formaram pela quarta clivagem assimétrica. anfíbios. o seu hemisfério vegetal começa a se espessar e achatar (Figura 6. Lillie (1902) conseguiu ativar. R.2. Essas células derivadas de diferentes regiões do zigoto têm tamanhos e propriedades diferentes.210 PARTE II Padrões de Desenvolvimento são independentes da celularização. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausência de células. No centro dessa placa vegetativa achatada. peixes. ou é a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular. As Figuras 6. ou às forças extrínsecas que a estendem ou a distorcem? É essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vários movimentos celulares da gastrulação são integrados.

N cortesia de G. (Cortesia de J.1 Desenvolvimento normal do ouriço-do-mar.) (Vista ventral) (N) Boca Bastonetes esqueléticos Ânus 9 hs. (L.5 hs. (I) Blástula com mesênquima primário. (K) Larva em estágio prismático.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 211 Animal (A) (B) (C) Mesômeros (D) (E) (F) (G) Macrômeros Vegetal Tufo ciliar (I) Mesênquima secundário Mesênquima primário Endoderma invaginante Micrômetros veg1 veg2 (K) Estomodeu (boca) Envoltório ectodérmico Bastonetes esqueléticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (L) (Vista lateral) (H) (J) (M) Figura 6.) . 9. 1939. O tempo mostra a duração do desenvolvimento a 25oC. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ouriço-do-mar. 10.M) Larva pluteus.5 hs. 17 hs. Watchmaker. (A-F) Clivagem até o estágio de 60 células (omitindo o estágio de 2-células). 13 hs. Seqüência completa da gastrulação em Lytechinus variegatus.2 15 hs. (H) Blástula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. Figura 6. 18 hs. (J) Gástrula com mesênquima secundário. 10 hs. 11. (A-M segundo Hörstadius. (G) Blástula precoce com cílios.5 hs. 13. Os destinos do citoplasma zigótico podem ser seguidos pelas variações no sombreamento.5 hs. 12 hs. Morrill. seguindo o destino das camadas celulares da blástula. 11 hs.

Entretanto. o padrão de ligação dos micrômeros muda na gastrulação. (D) Colocação das células mesenquimatosas primárias na larva precoce de Lytechinus variegatus. um padrão similar de ligação.. Cadeia dorsal (D) Cadeia ventral Espícula Os eventos que se dão no citoplasma e na superfície celular são fundamentais para o ingresso e a migração das células mesenquimatosas primárias. Fink e McClay confirmaram as especulações de Gustafson e Wolpert. em relação à camada hialina. (A) Células mesenquimatosas primárias da gástrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espícula de carbonato de cálcio. medindo as forças de adesão dos blastômeros de ouriço-do-mar. 1990. cortesia dos autores. (C) Anel de células mesenquimatosas em volta do arquêntero (intestino primitivo). Na sua lateral. Originalmente todas as células da blástula estão ligadas pela sua superfície externa à camada hialina e sua superfície interna ligada à lâmina basal secretada pelas células (veja Capítulo 3).3). Em 1985. as células mesenquimatosas primárias se fundem em cordões sinciciais. originalmente. onde considera-se que sua aderência seja maior. essas células tornam-se localizadas dentro da provável região ventrolateral da blastocele. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrômeros e mesômeros. (A e D de Ettensohn. IMPORTÂNCIA DA LÂMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE.3 Formação dos cordões sinciciais por células mesenquimatosas do ouriço-do-mar. ativamente produzindo e quebrando conexões filopódicas com a parede da blastocele. As células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da superfície da blastocele e são envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrômeros se dá através de modificações de sua adesão a outras células e às matrizes extracelulares que os rodeiam. Aqui. respectivamente) se ligam fortemente entre si e à camada hialina.) (C) Agregados Ventrolaterais começo. que formarão o eixo das espículas de carbonato de cálcio do esqueleto larval (Figura 6. 1992) sugerem que a migração inicial das células mesenquimatosas primárias é dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele.1). 1985. Finalmente. à lâmina basal e a outras células. B e C de Morrill e Santos. A metade animal e todo o arquêntero foram removidos. Os micrômeros da blástula mostram. mas aderem fracamente à lâmina basal (Tabela 6. (B) microfotografia eletrônica de varredura de espículas formadas pela fusão das células mesenquimatosas primárias para formar os cordões sinciciais. Estudos mais recentes (Cherr et al. ao longo da superfície interna da blastocele.212 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 6. . todas as fotografias. as células parecem se movimentar ao acaso.4). cada célula tem outra célula como vizinha.

enquanto que sua afinidade aos componentes da lâmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. (de Cherr et al.0 x 10-7 Fonte: Segundo Fink e McClay. 1992.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 213 (A) (B) Figure 6. (B. as precursoras do mesênquima primário perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original). 1985. a Células testadas foram colocadas em placas contendo hialino. .1 Afinidades de células mesenquimatosas e não-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Força de deslocamento (em dinas) Tipo celular Micrômeros em estágio de 16 células Células mesenquimatosas em estágio migratório Ectoderma e endoderma gastrular Hialino Monocamadas de células gastrulares 6.8 x 10-5 1.2 x 10-7 5.. lâmina basal extracelular.8 x 10-7 1.4 Fotografias ao estéreo-microscópio eletrônico de varredura de células mesenquimatosas primárias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele.5 x 10-5 5. Cherr. atraídos pela lâmina basal.0 x 10-5 Lâmina basal 5. Essa mudança na afinidade faz com que os micrômeros percam suas ligações com a camada hialina externa e com as células circundantes e. (A) Células mesenquimatosas primárias enredadas na matriz extracelular da gástrula precoce de Strongylus centrotus. ou monocamadas celulares.5). cortesia de G. A força de deslocamento é calculada pela força centrífuga necessária para remover as células teste do substrato.0 x 10-5 4. As placas foram invertidas e centrifugadas a várias forças para deslocar as células. As modificações na afinidade celular foram Tabela 6. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e estão intimamente associadas com as células mesenquimatosas primárias.8 x 10-5 1.C) migração de células mesenquimatosas em estágio de gástrula.2 x 10-7 5.) (C) Enquanto outras células mantêm sua forte ligação à camada hialina e às células vizinhas. migram para o interior da blastocele (Figura 6.

Karp e Solursh. B. 1984). Em dois sítios perto do futuro lado ventral da larva. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alterações nas interações adesivas nas presumidas células mesenquimatosas primárias (cor). 1985. 1985. As células mesenquimatosas primárias se organizam em forma de anel em uma posição específica ao longo do eixo animal-vegetal. Uma é a fibronectina. as células mesenquimatosas entram na blastocele. Karp e Solursh.3). as células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele.) (F) correlacionadas com modificações nas moléculas da superfície celular que ocorreram durante esse período (Wessel e McClay. a afinidade dos micrômeros por essa molécula específica aumenta dramaticamente. Cherr et al. Três proteínas parecem ser importantes nessa migração. é encontrada nas matrizes extracelulares das células da blastocele e é expressa somente durante a gastrulação. Lane e Solursh. Morrill e D. 1996). 1987). ele não podia entender o porquê. esses sinais de orientação não são suficientes. Porém. Na época. uma vez dentro da blastocele. Além disso. uma grande glicoproteína (400-kDa). 1974.6. mas não continuam a migrar* (Figura 6. 1985).. Se um micrômero marcado de outro embrião é injetado na blastocele em gastrulação de um embrião de ouriço-do-mar. Essas células perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastômeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lâmina basal... 1991). Como mostra a Figura 6. que é um componente comum das lâminas basais. Fink e McClay mostraram que durante a gastrulação. ECM18. ao longo do eixo animal-vegetal. Flaherty.214 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lâmina basal Células Mesenquimatosas primárias (A) Camada hialina Cílios (B) (C) (D) (E) Figure 6. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migração mesenquimatosa primária quanto a invaginação secundária do endoderma (Berg et al. pode estar guiando as células em sua migração. (F cortesia de J. Curt Herbst (1904) observou que embriões de ouriço-do-mar não gastrulavam adequadamente quando colocados em água do mar que não continha íons sulfato.4. 1992). A orientação das fibrilas.. Anstrom et al. Sugiyama. (F) Montagem de micrografia eletrônica de varredura mostrando o ingresso de células primárias de Lytechinus variegatus. A terceira proteína. Se a síntese (ou sulfatação) desses proteoglicanos é inibida. incluindo aquela da blastocele do ouriço-do-mar (Wessel et al. ele migra para o local correto *Em um dos primeiros experimentos em embriologia química.5 Ingresso de células mesenquimatosas primárias. extendendo seus filopódios a sua frente (Galileo e Morrill. 1972. pois os micrômeros “sabem” quando parar seu movimento e formar espículas perto do equador da blastocele. Blastômeros não-mesenquimatosos retêm suas originais afinidades pelo hialino e células vicinais. . muitas dessas células mesenquimatosas primárias se agrupam para iniciar a formação de espículas (Figura 6. O segundo grupo de moléculas consiste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfície das células mesenquimatosas ingressantes (veja Capítulo 3. há uma alta concentração de material da lâmina extracelular ao redor das células mesenquimatosas primárias ingressantes (Galileo e Morrill. 1985).

se todas as células mesenquimatosas do hospedeiro são removidas antes da injeção de células mesenquimatosas mais velhas. assim como um filopódio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma..6 Efeito da privação de sulfato no movimento do mesênquima primário do ouriço-do-mar Lytechinus.) e contribui para a formação das espículas embrionárias (Prancha 35). 1939. Primeiro estágio da invaginação do arquêntero Enquanto se forma o anel de células mesenquimatosas primárias no pólo vegetal da blastocele. fotografia cortesia de D. 1995). são considerados como sensores do ambiente. da mesma maneira que os filopódios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Considera-se que essa informação posicional é fornecida pelas futuras células ectodérmicas e suas lâminas basais (von Übisch.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 215 (A) (B) Figura 6.. Somente células mesenquimatosas primárias (e não outros tipos de células ou partículas de látex) são capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay. Harkey e Whiteley. (B) Gástrula anormal formada quando embriões são cultivados em água do mar livre de sulfato. Miller e colegas (1995) observaram a existência de filopódios extremamente delgados (0. 1980). essas repetirão os estágios iniciais de sua migração. 1990). (de Miller et al. esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6. a partir do ectoderma (Malinda et al.3 µm de diâmetro) no mesênquima esqueletogênico (skeletonogenic). McClay.7 Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopódio longo e fino estendendo-se de uma célula mesenquimatosa primária até a parede ectodérmica da gástrula. (de Karp e Solursh. 1974.) . (A) Gástrula normal. Além disso. normalmente (Ettensohn. Essas extensões delgadas podem ser responsáveis pela captação de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal. 1995. 1986). Esses filopódios contêm actina e não são considerados como locomotores. mudanças importantes estão ocorrendo nas células que permanecem na Figura 6. cortesia de M. migrarão como as células mais jovens e serão incorporadas normalmente no mesênquima do hospedeiro. Em lugar disso. formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto. Os filopódios mesenquimatosos estendem-se através da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das células ectodérmicas. elas atrasarão sua diferenciação. Solursh. Se células mesenquimatosas primárias de embriões mais velhos são injetadas em gástrulas mais jovens.7).

Verifica-se. tipo rede. O proteoglicano absorve água e entumece a lâmina interna.216 PARTE II Padrões de Desenvolvimento placa vegetativa.8A). Figura 6. 1982. portanto. Essa molécula higroscópica (absorvente de água) incha a lâmina interna mas não a externa.. (A) Invaginação da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrônica de varredura da superfície externa da gástrula precoce. causando tumefação . composta de proteínas fibropelinas* (Hall e Vacquier. No estágio de blástula. Essas células permanecem ligadas umas às outras e à camada hialina do ovo. 10. As células da placa vegetal (e somente essas células) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lâmina interna da camada hialina.5-11. Um pouco mais tarde. formada primariamente de proteína hialina. B.8 Invaginação da placa vegetal. (C) Os grânulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lâmina interna da camada hialina. Morrill e C segundo Lane et al. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.2. diretamente abaixo delas. a invaginação cessa. sobre a superfície do embrião. também. cortesia de J. (A de Morrill e Santos. O blastóporo está claramente visível. Quais forças atuam para invaginar essas células? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento é semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetálica. (B) a camada hialina consiste de lâminas internas e externas.C). 1993. na verdade. 1985. 1991). enquanto a lâmina externa.) (B) (C) Células da placa vegetal empurradas para cima Blastocele interior Células de placa vegetal Camada hialina Lâmina interna Lâmina externa Microvilosidades Vesículas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) CSPG secretado para a lâmina interna absorve água. que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou até a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6. repentinamente. a placa vegetal se achata ainda mais. uma *Fibropelinas são armazenadas em grânulos secretores dentro dos oócitos. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltório hialino e do epitélio a ele ligado. (A) Figura 6. A camada hialina é.5 horas. Bisgrove et al. ao qual está fixado.8B. e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesênquima. A região invaginada é chamada de arquêntero (intestino primitivo) e sua abertura no pólo vegetal chamada de blastóporo.. formada de duas lâminas: uma externa. Então. São secretadas desses grânulos após a liberação da proteína hialina pela exocitose granular cortical. não entumece. as fibropelinas já formaram um envoltório. Microvilosidades da placa vegetal estendem-se através da camada hialina e seu citoplasma contém vesículas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). e uma interna.

(A) Células mesenquimatosas estendendo filopódios da ponta do arquêntero. Durante essa fase. Esse fenômeno. (Segundo Hardin. 1990. Essa última fase é iniciada pela tensão propiciada pelas células mesenquimatosas secundárias.9 blastóporo Rearranjo celular durante a extensão do arquêntero em embriões de ouriço-do-mar. Em pelo menos algumas espécies de ouriço-do-mar. o arquêntero se estende dramaticamente. ao mesmo tempo. Mais tardiamente na gastrulação. Hardin e Cheng. as células do arquêntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn.) segunda força resultante dos movimentos das células epiteliais adjacentes à placa vegetal. (B) Cabos de filopódios conectando a parede da blastocele à ponta do arquêntero. Nessa espécie. 12 horas. o arquêntero tem uma circunferência constituída de somente 6 a 8 células. 13 horas. mas não são formadas novas células (veja Figura 6. onde células se intercalam para estreitar o tecido e. 1985. ocorre um terceiro estágio no alongamento do arquêntero. que se formam na ponta do arquêntero e lá permanecem (veja Figura 6. Os filopódios se estendem dessas células através do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfície interna da Figura 6. algumas vezes triplicando seu comprimento. o largo e curto intestino rudimentar é transformado em um tubo longo e delgado. Clones marcados fluorescentemente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. o arquêntero precoce tem 20 a 30 células ao redor de sua circunferência. começa a segunda fase da formação do arquêntero. Para produzir essa extensão. 1986). levá-lo adiante é chamado extensão convergente.10).10 (A) (B) Estágio de gástrula intermediária do ouriçodo-mar Lytechinus pictus. pode facilitar essa invaginação puxando para dentro a camada envergada (Burke et al.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 217 Gastrulação precoce Gastrulação tardia Figura 6. mostrando extensões de filopódios do mesênquima secundário estendendo-se da ponta do arquêntero até a parede da blastocele. No processo de extensão. Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero A invaginação das células vegetais ocorre em três estágios discretos. A tensão nos cabos pode ser avaliada pela tração exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixação.2.2. Ettensohn.9).. (Fotografias cortesia de C. Figura 6. 1991).) . Após uma breve pausa. Figura 6.

Esse movimento não é devido a um arrastão ativo dos blastômeros. Mas. Pelo contrário. se achatam contra essa região e puxam o arquêntero em direção a ela. Gastrulação em peixes A transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celular Durante o décimo ciclo de clivagem do peixe-zebra. Somente quando os filopódios encontraram o “alvo” é que cessaram os movimentos. Parece então. Onde o arquêntero contata a parede se formará. As células mesenquimatosas secundárias têm. o blastóporo marca a posição do ânus. que é reconhecida pelas células mesenquimatosas secundárias e que posiciona o arquêntero na região onde se formará a boca. 1981). ou existe um alvo específico no hemisfério animal que precisa estar presente para que a ligação ocorra? Existe alguma região da parede da blastocele que é predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um “alvo” específico para os filopódios do hemisfério animal. em seguida. e como conseqüência o arquêntero só pode se alongar aproximadamente em dois terços do seu comprimento total. uma boca que se fundirá a ele formando um tubo digestivo contínuo. como células migratórias livres. Com a gástrula contraída de modo a impedir que os filopódios jamais atingissem a área “alvo”. de modo que o contato com a região se tornou mais eficiente. as células secundárias mesenquimatosas continuaram sua exploração até que finalmente se afastaram do arquêntero e encontraram o tecido alvo. onde proliferam para formar os órgãos mesodérmicos (veja Figura 6. Quando o topo do arquêntero encontra a parede da blastocele nessa região. então. Como discutido no Capítulo 5. 1993). um papel essencial em elevar o arquêntero até a parede da blastocele durante a última fase da invaginação.5 horas). finalmente. Os filopódios das células mesenquimatosas secundárias se estendem. Parece que alguma coisa na cromatina está “removendo por titulação” alguma substância (até agora desconhecida) do citoplasma. quando os filopódios atingem uma região específica da parede. como é característico para os deuterostomatas. A camada envolvente (EVL) está . Essa transição da blástula intermediária (MBT) também é evidente em rãs e em Drosophila. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele. Peixes haplóides entram na MBT um ciclo mais tarde. que existe uma região alvo destinada a se transformar na região ventral da larva. O primeiro movimento celular é a epibolia das células blastodérmicas sobre o vitelo. tocam a parede da blastocele ao acaso e. a MBT parece ser regulada pela relação entre cromatina e citoplasma. as divisões celulares perdem sua sincronia. Hardin (1988) removeu as células mesenquimatosas secundárias com um laser. Na fase inicial. Schroeder. Mais tarde. se retraem. 1990). as células se movem sobre a superfície do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6.218 PARTE II Padrões de Desenvolvimento parede da blastocele (Dan e Okazaki. eles permanecem ligados naquele local. os filopódios continuaram a se estenderem e a se contraírem ao tocar a parede daquela região. Entretanto. 13. o alongamento continuou. as células blastodérmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as células mais superficiais (Warga e Kimmel. embora em velocidade menor do que nos controles. peixes tetraplóides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel. 1956. Assim. novos genes são expressos e as células se tornam móveis. arrastando o arquêntero para cima.2. o movimento é propiciado pela expansão autônoma da camada sincicial do vitelo (YSL) “dentro” do citoplasma do hemisfério animal. em seguida. podem os filopódios mesenquimatosos secundários se ligar a qualquer parte da parede da blastocele. as células mesenquimatosas secundárias se dispersam no interior da blastocele. Os filopódios se ligam à parede nas junções entre as células do blastoderma e. que difere de outras regiões. Quando algumas células mesenquimatosas secundárias foram deixadas. se contraem.11).

por involução de células na margem do blastoderma em epibolização ou por delaminação de células do epiblasto. entre o ectoderma e o endoderma. Quando isso é feito. as células blastodérmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expansão ao redor da célula do vitelo (Trinkaus.11 Movimentos celulares durante a gastrulação do teleósteo Danio rerio.) Célula do vitelo Núcleo do vitelo Pólo vegetal (B) ESCUDO (6. (C) Detalhe da região marginal. 1992). e Langeland e Kimmel. e radiação ou drogas que . 1995. (Segundo Driever. (E) Término da gastrulação.3 HS) Região do tronco fortemente ligada à YSL e é arrastada junto com ela. A expansão de YSL tem como base uma rede de microtúbulos em sua estrutura. As células mais profundas do blastoderma enchem o espaço entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. neuroectoderma Pólo vegetal Mesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) Coto caudal Posterior Pólo animal 1 SOMITO (10.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 219 (A) 30% DE EPIBOLIA (4. o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo. 1997. (B) Formação do hipoblasto. 1984b.0 HS.) (C) Pólo animal Ingresso celular Epiblasto Hipoblasto Escudo Hipoblasto Camada envolvente Epiblasto Dorsal Células em involução Células em nãoinvolução Sinais indutores mesodérmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grânulo do vitelo Ventral Sinal indutor mesodérmico Pólo Vegetal (D) Pólo animal Mesoderma dorsal Camada envolvente (E) Anterior Pólo animal Região cefálica Camada envolvente Somito #1 Ventral Dorsal Ventral Dorsal Mesoderma Ectoderma.7 HS) Camada envolvente Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Pólo animal Figura 6. (D) Com 90 porcento de epibolia. Isso pode ser demonstrado cortando a ligação entre YSL e EVL. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa.

(A) Vista dorsal de movimentos de convergência e extensão durante a gastrulação do peixe-zebra. 1992. o hipoblasto. Assim. (de Langeland e Kimmel. 1996). Outros laboratórios alegam que essas células hipoblásticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus. (B. 1994). pois ele pode organizar um eixo embrionário secundário quando transplantado a um embrião hospedeiro (Oppenheimer. A epibolia estende o blastoderma sobre o vitelo. (É possível que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espécies diferentes.12 Convergência Involução Epibolia Célula do vitelo Convergência e extensão no peixe-zebra.11). e uma camada interna. Solnica-krezel e Driever. 1993. Esse escudo é funcionalmente equivalente ao lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. Esse espessamento é chamado de anel germinativo. elas também estão involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direção (A) Pólo animal Extensão Escudo embrionário Figura 6. epiblasto e hipoblasto. 1936.12). Ho. Formação das camadas germinais Depois que as células blastodérmicas cobrem aproximadamente a metade da célula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. convergência e extensão trazem células do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionário.) (B) (C) (D) (E) . para formar um espessamento localizado. o escudo embrionário (Figura 6. a intercalação estende o cordomesoderma em direção ao pólo animal. (D. 1995). A involução começa na futura porção dorsal do embrião. um gene que é expresso pelas células da notocorda. veja discussão de gastrulação em anfíbios). as células profundas de ambos. Dentro do escudo.220 PARTE II Padrões de Desenvolvimento impedem a polimerização de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan.) Uma vez formado o anel. Experimentos com marcação de células indicam que o lado mais delgado marca o sítio da futura superfície dorsal do embrião (Schmidt e CamposOrtega.E) Extensão convergente de células mesodérmicais adaxiais (marcadas pela sua expressão de gene snail para flanquear a notocorda. 1997. o epiblasto. Alguns laboratórios alegam que o hipoblasto é formado pela involução das células superficiais abaixo da margem. se intercalam no futuro lado dorsal do embrião. a involução ou o ingresso geram o hipoblasto. mas ocorre na margem inteira. enquanto as células realizam a epibolia em torno do vitelo. e é composto de uma camada superficial. Não entendemos como é produzido o hipoblasto. seguida por sua migração para o pólo animal (veja Figura 6.C) Extensão convergente do cordomesoderma é mostrada por aquelas células exprimindo o gene no tail (sem cauda). Durante a migração.

1983.12D.12B. 1929. Os movimentos pelos quais isso é conseguido podem ser visualizados pela técnica de coloração vital. A convergência e a extensão no epiblasto traz as células presuntivas do cérebro de todo o epiblasto para a linha média dorsal onde formam a quilha neural. a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento. (E) Gastrulação de anfíbios O estudo da gastrulação em anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas áreas da embriologia experimental.C). O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. Se abrirmos. os quais coram mas não danificam as células embrionárias.) Secção em plano de visão (E) (D) ao escudo embrionário (Trinkaus. finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal média do hipoblasto. então. as células adaxiais. Vogt (1929) saturou fragmentos de ágar com corante. uma blástula de Xenopus no pólo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal. Espécies diferentes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski. mesmo considerando que gastrulação de anfíbios foi estudada extensamente no século passado. (E) Embrião de tritão dissecado no plano mediano para mostrar células coradas no interior. a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus. Esses fragmentos corados de ágar foram pressionados contra a superfície da blástula e uma parte do corante foi transferida para as células contatadas (Figura 6. Nos últimos anos. o primórdio da notocorda (Figura 6. não é tão diferente daquele da rã ou outros vertebrados (como logo veremos). As células adjacentes ao cordomesoderma. são as precursoras dos somitos mesodérmicos (Figura 6. O estudo da gastrulação em anfíbios foi complicado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulação nos anfíbios. 1992). 1986).13). O mapa de destino do peixe-zebra. Lundmark.13 Coloração vital de embriões de anfíbios.E). conceitualmente. Os movimentos de cada grupo de células coradas foram acompanhados através da gastrulação. trazer para dentro aquelas áreas destinadas a formar os órgãos endodérmicos. o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrião do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel. Esse é o cordomesoderma. As células hipoblásticas do escudo embrionário convergem e se estendem anteriormente. equinodermos e peixes. (A) Método de Vogt para marcação de células específicas da superfície embrionária com corantes vitais. Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios As blástulas de anfíbios têm as mesmas tarefas que seus companheiros. (Segundo Vogt. daremos ênfase ao seu processo de gastrulação. envolver o embrião com células capazes de formar o ectoderma e colocar as células mesodérmicas no lugar apropriado entre elas. portanto. (B-D) Vistas da superfície do corante em embriões sucessivos. 1997).CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 221 (A) Vidro para segurar o embrião (B) Manchas de corante no embrião (C) Discos de ágar com corante Lábio dorsal do blastóporo Embrião Figura 6. e . ou seja. foram revisadas na década passada. como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo.

uma invaginação de células inicia a formação do arquêntero. Em Xenopus. Mapas de destino (A) de células exteriores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodérmicos são formados de células interiores. 1979) e de Keller (1975. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de injeção de corantes (Smith e Malacinski. os precursores da notocorda e do mesoderma são encontrados em ambas. Entretanto. o ponto em que se forma o lábio dorsal do blastóporo está indicado por uma flecha. enquanto as células do pólo animal sofrem epibolia e convergem no blastóporo. os precursores mesodérmicos existem somente na camada profunda. Essas células garrafa revestem o arquêntero inicial. Essas células. através do lábio dorsal do blastóporo. As próximas células involuindo para o embrião. Landstrom Løvtrup. Quando as células marginais migratórias chegam ao lábio dorsal do blastóporo.) Mesoderma lateral Blastóporo Somitos (B) INTERIOR Notocorda Blastóporo os resultados sumariados em mapas de destino. logo abaixo do equador na região do crescente cinzento (Figura 6. mas o contacto com a superfície externa é mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoço (Figura 6. enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrião. a blastocele é deslocada para o lado oposto ao lábio dorsal do blastóporo. bem como os processos de formação das células garrafa e involução continuam no blastóporo. se tornam as células faríngeas do intestino anterior. Essas células modificam sua forma dramaticamente.16). 1993). Essas células formarão a notocorda. na região equatorial (marginal) do embrião. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodérmicos estão localizados abaixo da superfície. as futuras células endodérmicas locais invaginam dando lugar à formação de um blastóporo em forma de fenda. uma “espinha dorsal” mesodérmica transitória que é essencial para o início da diferenciação do sistema nervoso. como na gastrulação do ouriço-do-mar. 1976. são as células cordomesodérmicas. A próxima fase da gastrulação envolve a involução das células da zona marginal. conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrião (Figura 6. Em urodelos (salamandras.222 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. Aqui. tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rãs sem ser o Xenopus. Lundmark. onde se encontram os hemisférios animal e vegetal. tornando-se os precursores do mesoderma da cabeça. o lábio do blastóporo se expande lateral e ventralmente. Enquanto essas primeiras células passam para o interior do embrião. o lábio do blastóporo passa a ser composto de células que involuem para dentro do embrião. as células que constituem o lábio do blastóporo estão constantemente mudando. À medida que as novas células migram para dentro do embrião. A gastrulação em embriões de rã é iniciada no futuro lado dorsal do embrião. a gastrulação na rã não começa no pólo vegetativo. Assim. As primeiras células que compõem o lábio dorsal são as células garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquêntero. Nesse ponto.15). elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfície interna das lâminas celulares externas.14). nas células da superfície e nas células marginais profundas (Purcell e Keller. 1976) mostraram que as células da blástula de Xenopus têm diferentes destinos. O corpo principal de cada célula é deslocado na direção interna do embrião. 1986). 1983. mais tarde. as células endodérmicas não são tão grandes e nem tão ricas em vitelo como os blastômeros do pólo vegetativo. Dessa forma. Enquanto isso. Nessa vista lateral. ao contrário da gastrulação em ouriço-do-mar.14 Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastóporo Endoderma abaixo do blastóporo (A) EXTERIOR Mapas do destino da blástula da rã Xenopus laevis. (Segundo Keller. O blastóporo em expansão . mas na zona marginal próxima ao equador da blástula. Estudos com corantes vitais de Løvtrup (1975.

e as células superficiais do hemisfério animal estão coloridas para permitir o seguimento de sua movimentação. A diferença de tamanho entre os blastômeros animais e vegetais está claramente aparente. 1943. AP marca a posição do pólo animal.) (C) Célulasgarrafa Blastóporo . o endoderma foi internalizado. O arquêntero se forma e desloca a blastocele.F) Perto do fim da gastrulação.16 (A) (B) Estrutura do lábio do blastóporo. As seções são cortadas através da metade do embrião. a blastocele é obliterada. (Segundo Keller. (E. Células de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lábio do blastóporo. micrografias de varredura eletrônica cortesia de C. As células do hemisfério animal migram em direção da região vegetal.) Figura 6. mostrando a extensão das células-garrafa do blastóporo. e as células migram dos lábios lateral e ventral do blastóporo para dentro do embrião. (C) Detalhe da região onde as células do hemisfério animal estão involuindo através do lábio do blastóporo.D) Gastrulação intermediária. movendo o blastóporo para região próxima do pólo vegetal.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 223 Pólo animal (AP) Arquêntero Blastocele Células superficiais Células profundas Pólo vegetal Lábio dorsal do blastóporo Blastocele deslocada (B) (C) Mesoderma Endoderma (A) Mesoderma dorsal Ectoderma Arquêntero Notocorda Mesênquima Ectoderma Notocorda Lábio lateral do blastóporo Lábio dorsal do blastóporo Lábio dorsal do blastóporo Lábio lateral do blastóporo Endoderma (D) Ectoderma Endomesoderma anterior (E) Tampo do vitelo Lábio ventral do blastóporo (F) Mesoderma ventral Figura 6. e as células mesodérmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (A) Diagrama de células de uma seção da gastrulação do embrião da salamandra. Os principais movimentos celulares estão indicados por flechas.15 Movimentos celulares durante a gastrulação da rã. que irá mudar à medida que a gastrulação prossegue. Phillips. (A segundo Holtfreter. 1986. (C. e precursores mesodérmicos involuem sob o teto da blastocele. e são posicionadas de modo que o pólo vegetal seja inclinado na direção do observador e ligeiramente para a esquerda. o embrião fica envolvido pelo ectoderma.B) Gastrulação precoce. (B) Visão de superfície de um lábio dorsal precoce do blastóporo de Xenopus. B e C. (A.

Com a formação do lábio ventral. mesodérmicas e endodérmicas. I. Os eixos dorsoventral (dorso-frente). finalmente. O óvulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direção do hemisfério animal (para cima) em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (veja Figura 4. um lábio ventral sobre o qual passam células precursoras adicionais. todos os precursores endodérmicos foram trazidos para o interior do embrião. Os eixos dorsoventral e ântero-posterior são especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundação. (A) Movimentos morfogenéticos de células migrando para o interior do blastóporo e em seguida sob a superfície. lateral e ventral. ântero-posterior e direito-esquerdo ainda não foram determinados. o hemisfério vegetal formará as células do intestino e órgãos associados (endoderma). cortesia de B. a preparação para a gastrulação já pode ser visualizada no preciso momento da fusão óvulo-espermatozóide. A gastrulação não existe como um processo independente na vida do animal.224 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) i Lábio dorsal ii iii Obturador do vitelo Lábio do blastóporo Lábio lateral iv v Lábio ventral Obturador do vitelo Figura 6. 1975. isso nada diz sobre qual parte do ovo formará a frente e qual as costas.15B-E. (B de Balinsky. Posicionando o blastóporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulação em anfíbios. podemos agora nos ocupar de cada passo em detalhe. Quando o lábio ventral completa o círculo. o ectoderma envolveu a superfície e o mesoderma foi colocado entre eles. porém. Naquele ponto. Balinsky. as camadas germinativas podem ser mapeadas no óvulo. A superfície do hemisfério animal se transformará nas células do ectoderma (pele e nervos). Esse pedaço remanescente de endoderma é chamado de rolha ou obturador do vitelo. ao redor do equador. O citoplasma interno permanece orientado em relação à gravidade devido a sua densa acumulação de vitelo.34). e as células mesodérmicas serão formadas a partir do citoplasma interno. (B) Mudanças na região ao redor do blastóporo quando se formam sucessivamente os lábios dorsal. respectivamente. No Capítulo 4 discutimos a rotação do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da rã. desenvolve lábios laterais e. Assim. Na verdade.) como um “crescente”. Números ii-v correspondem às Figuras 6. O destino geral dessas regiões pode ser previsto antes da fecundação. o endoderma torna-se progressivamente internalizado. ele também é finalmente internalizado (Figura 6.17 Epibolia do ectoderma. o blastóporo forma uma anel ao redor das grandes células endodérmicas que permanecem expostas na superfície do pólo vegetativo. .17).

. os fatores indutores da gastrulação parecem ser criados pelas interações dos citoplasmas animal e vegetal. 1981. 1981. Entretanto. a direção desse movimento é imprevisível. com o ponto de entrada do espermatozóide virado para cima. ele é importante na determinação da direção dessa rotação. Na verdade. Além disso. A discussão precedente sugere que deve ser possível ter dois sítios de iniciação de gastrulação se houver a combinação de rotação orientada pelo espermatozóide com uma rotação do ovo artificialmente induzida. a iniciar a gastrulação (Figura 6. a rotação cortical ainda se dá no tempo correto. 1981). 1987).19). Vincent et al.. Quando ovos fecundados são inclinados dessa maneira por trinta minutos. desgeleificados e colocados em Ficoll para desidratar o espaço perivitelino. mas é a rotação citoplasmática que é essencial para o futuro desenvolvimento. não há o desenvolvimento dorsal..CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 225 Essa rotação faz com que o eixo animal-vegetal da superfície do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. A direção preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozóide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecânico da relação espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. um novo estado de simetria é adquirido. onde se inicia a gastrulação. marca o futuro dorso (costas) do embrião (Gerhart et al. 1986). O citoplasma interno também se move. o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embriões iniciam a gastrulação no mesmo lado da entrada do espermatozóide (veja Figura 6.18).18 Relação entre o ponto da entrada do espermatozóide e o lábio dorsal do blastóporo em ovos de rã normais e naqueles que sofreram rotação. Enquanto que o óvulo era radialmente simétrico em relação ao eixo animal-vegetal. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotação inicial orientada pelo espermatozóide. 1981. o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugação interage com os componentes do pólo vegetal. mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente. Esses movimentos citoplasmáticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. 1981. Se um ovo artificialmente estimulado é anucleado. Kirschner e Gerhart. em ovos dispérmicos existe uma única direção de rotação. Gêmeos também podem ser produzidos em gravidade normal. provavelmente. A hipótese de Black e Gerhart (1986) é que tal produção de gêmeos é causada pela formação de duas áreas de interação: um eixo se forma onde a rotação cortical normal deu origem às interações citoplasmáticas no pólo vegetal da célula.18). A possibilidade de se obter dois lábios funcionais dos blastóporos também sugere que não há nada especial a respeito do crescente cinzento. colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozóide voltado para cima. Cooke. o lado oposto. O lado pelo qual entra o espermatozóide marca a futura superfície ventral do embrião. (De fato. 50-80 minutos após a fertilização. o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e é bilateralmente simétrico (tem lados direito e esquerdo). ativam algum componente do citoplasma vegetal. Quando se impede a rotação do ovo (por imersão em um polissacarídeo que provoca o colapso do espaço perivitelino entre o ovo e o envoltório de fertilização) ele pode sofrer uma rotação de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e não vertical e o ponto de entrada do espermatozóide voltado para cima (Gerhart et al. de modo que o citoplasma interno se movesse para o ponto de entrada do espermatozóide. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma série de experimentos de transplante que confirmaram Normal Porcentagem de embriões Girada Ângulo do lábio do blastóporo do ponto de entrada de espermatozóide Figura 6.. A direção do movimento citoplasmático determina qual lado será o dorsal e qual será o ventral. interações essas que. 1986). após remover o envoltório de fertilização (Gerhart et al. Mesmo que o espermatozóide não seja necessário para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo. Os ovos sofreram rotação. (Segundo Gerhart et al. e o embrião morre como uma massa de células ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart. se essa rotação cortical é bloqueada.) O espermatozóide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotação autônoma do citoplasma. e microscopia de fluorescência de embriões precoces mostrou que os padrões citoplasmáticos das células presuntivas dorsais são diferentes daqueles das células presuntivas ventrais (Prancha 7). Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em água normal. Dessa maneira.) . Ovos de Xenopus foram fertilizados. foram inclinados em 900. onde se observa pela primeira vez o início da gastrulação. levando ao aparecimento de larvas gêmeas ligadas (Figura 6. A entrada do espermatozóide foi marcada com corante. apareceram dois sítios de gastrulação. partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem..

que formam girinos gêmeos. então. que os rearranjos internos do citoplasma. Esse pequeno grupo de blastômeros vegetais permite a invaginação de células marginais adjacentes e a formação do eixo mesodérmico dorsal do embrião. Johannes Holtfreter (1943.19 Blastóporos gêmeos produzidos pela rotação de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do espermatozóide). O comprimento apical-basal dessas células aumenta bastante.226 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Figura 6. Figura 6. originando a forma característica de “garrafa”. no estágio de 64 células. essas células parecem ter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulação. 1944) observou que as células garrafa de gástrulas precoces de salamandra poderiam aderir às lamínulas de vidro e guiar o movimento das células ligadas a elas. de outra maneira. era capaz de induzir a formação de eixos secundários quando injetado em células vegetativas ventrais. e não no crescente cinzento. criado pelo deslocamento de material citoplasmático.20B). na superfície dorsal da blástula. em última instância. podem também induzir uma invaginação secundária e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrião normal. (A) Dois blastóporos são instruídos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozóide) e o novo. As moléculas que podem estar envolvidas na formação do sítio vegetal de iniciação da gastrulação (o “centro de Nieuwkoop”) serão discutidas no Capítulo 15.20A). situados abaixo da região do prospectivo lábio dorsal. penetra no interior do embrião.) a hipótese de que os fatores que iniciam a gastrulação originalmente estão no citoplasma profundo das células vegetativas dorsais. ligados ventralmente. esses três blastômeros. Até mais convincentes foram os experimentos . Gerhart. enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. provavelmente orientados pela entrada do espermatozóide. no estágio de 64 células. Na salamandra. no estágio de 64 células. Além disso. Nem o citoplasma cortical de células animais e nem o citoplasma profundo das células ventrais puderam induzir esses eixos. Movimentos celulares e a construção do arquêntero O INÍCIO DA GASTRULAÇÃO. são responsáveis pela distribuição assimétrica de fatores subcelulares. (Cortesia de J. das células vegetativas dorsais do embrião de Xenopus. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical. Eles demonstraram que em um embrião de Xenopus. As superfícies externas (apicais) dessas células se contraem dramaticamente. no momento da primeira clivagem. dirige o posicionamento do blastóporo acima de um conjunto de blastômeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. Essa assimetria cria uma distinção dorsoventral no ovo que. (B) Esses ovos desenvolvem dois eixos completos. Parece. não seriam capazes de iniciar a gastrulação. A gastrulação em anfíbios é iniciada quando um grupo de células endodérmicas marginais. não irradiado (Figura 6. os três blastômeros vegetais mais dorsais são capazes de induzir a formação do lábio dorsal do blastóporo e de um eixo dorsal completo em embriões hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que.

(Segundo Gimlich e Gerhart. Mais ainda. criaram uma depressão reminiscente do blastóporo precoce. Experimentos de transplante demonstrando que as células vegetativas. para uma cavidade criada pela remoção de um número semelhante de células vegetais. para região vegetal mais ventral.21 Um implante de células de anfíbios da região do lábio dorsal do blastóporo submerge para dentro de uma camada de células endodérmicas e forma um sulco do blastóporo. de outro embrião de 64 células. abaixo das regiões do futuro lábio dorsal do blastóporo.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 227 (A) Ponto de entrada do espermatozóide DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL (B) RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozóide Ponto de entrada do espermatozóide UV Sem transplante Transplante Peça embrionária ventral carente de eixo corporal Novo local de gastrulação e forma de eixo corporal Figura 6. 1984. 1944. (B) Formação de um novo local para gastrulação e eixo corporal pelo transplante das células vegetativas. (A) Salvamento de embriões irradiados pelo transplante de blastômeros do segmento mais dorsal (cor) de um embrião.20 de recombinação de Holtfreter. Quando as células da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodérmico interno. ao se aprofundarem. são responsáveis pelo início da gastrulação.) Implante Células endodérmicas Sulco no blastóporo Figura 6. nos quais células da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lábio dorsal do blastóporo) foram combinadas com o tecido endodérmico interno. Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma é uma propriedade inata das células da zona marginal dorsal. Um zigoto irradiado sem tal transplante não sofre gastrulação normal. as células precursoras do blastóporo formaram células garrafas e se aprofundaram abaixo da superfície do endoderma interno (Figura 6. no estágio de 64 células. Sendo assim. de um embrião de 64 células. (Segundo Holtfreter.) . mais dorsais.21).

configurando uma fita estreita de células achatadas. Wilson e Keller. células profundas (mesodérmicas) estão se intercalando radialmente. 1981. Esse estreitamento de várias camadas em poucas outras causa extensão na direção lábio do blastóporo. empurrar as células vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de (A) Endoderma Intercalação radial de células profundas Células marginais superficiais Célulasgarrafa Futuro mesoderma anterior Lábio dorsal do blastóporo Blastóporo Morfologia de mudanças das células profundas Células garrafa (E) Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Células garrafa re-espalhadas IMZ superficial movendo-se em direção do pólo animal Endoderma Intercalação medianolateral (F) Ectoderma Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Pólo animal Blastocele O lábio se extende lateral e vegetalmente (B) (C) (D) Células marginais profundas Células garrafa Futuro mesoderma posterior IMZ profunda Figure 6.B). (D) Ocorre intercalação radial (interdigitação) das células profundas da IMZ. olhando da superfície dorsal para baixo em direção do lábio dorsal do blastóporo. 1988) mostraram que apesar das células garrafa terem um papel na iniciação da involução da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa. 1988. O mesoderma move-se na direção ao pólo animal.228 PARTE II Padrões de Desenvolvimento A situação no embrião da rã é um pouco diferente. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. é a constrição das células que puxa a zona marginal na direção vegetativa. as células marginais profundas se achatam. Na NIMZ (zona marginal não involutiva) e parte superior da IMZ. e as células previamente superficiais formam a parede do arquêntero. (E) À medida que continua a gastrulação.22 A. arrastando as células superficiais e as células garrafa por involução. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. intercalação medianolateral das células produz tensões que arrastam a IMZ por cima do lábio. Imediatamente acima do lábio. elas não são essenciais para a continuação da gastrulação. alongando e estreitando o mesoderma axial. (F) Intercalação como em (D). Keller e seus orientados (Keller.) . (Segundo Hardin e Keller. A forma peculiar de garrafa dessas células é necessária para iniciar a gastrulação.22 Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulação precoce de Xenopus. (B) Constrição das células garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulação. R. E. Hardin e Keller. O estiramento da zona marginal permite a expansão do ectoderma em direção ao pólo vegetal e o envolvimento do embrião. a intercalação medianolateral continua. 1991. enquanto empurra as células vegetativas para dentro (Figura 6.

porque os movimentos dessas células ocorrem mesmo se essa região do embrião é isolada do resto (Keller. Portanto. A porção dorsal das células marginais não-involutivas expande-se mais rapidamente que a porção ventral. ainda que as células garrafa possam ser responsáveis pela indentação inicial. e as células sofrem elongação separadamente (Wilson e Keller. a notocorda localizada centralmente se separa do mesoderma somítico em ambos os lados. O fator principal no movimento das células para dentro do embrião parece ser a involução das células marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Essa intercalação causa uma extensão convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6. Essa intercalação estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Migração do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodérmicos. . as várias camadas de células IMZ profundas se intercalam radialmente para formar uma fina e larga camada. Mais ainda. a força motivadora para essa involução parece vir da camada profunda de células marginais.22C-E).15 e 6. O movimento das células garrafa mais profundamente dentro do embrião depende da sua ligação às células profundas subjacentes. elas involuem para dentro do embrião e iniciam um segundo tipo de intercalação. 1980. Ao mesmo tempo. a formação do blastóporo e o fechamento continuam. ao longo das superfícies internas das células profundas remanescentes (Figura 6. Keller. a intercalação radial e mediolateral da camada de células profundas parece ser responsável pelo movimento contínuo do mesoderma para dentro do embrião. Durante a gastrulação. Quando as células profundas atingem o lábio do blastóporo. a involução. 1988). Hardin e Keller. as células garrafa do Xenopus não são mais necessárias. que estão migrando ativamente. a expansão convergente também continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. No fim da gastrulação. incluindo aquelas da notocorda na sua região profunda (IMZD). Parece que essas células subsuperficiais ou células da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direção ao pólo animal.22E). 1986). formando o teto do arquêntero (Figuras 6. Essa extensão convergente do mesoderma parece ser autônoma. mas a remoção das células marginais dorsais profundas e sua substituição por células do hemisfério animal (que normalmente não sofrem involução) interrompe a formação do arquêntero. as células superficiais se espalham se dividindo e achatando. Durante o terço médio da gastrulação. 1991).CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 229 baixo dos precursores mesodérmicos posteriores e começar a migrar no teto da blastocele (Hardin e Keller. Esse processo é dirigido pela contínua intercalação mediolateral de células ao longo do eixo ântero-posterior. A IMZ contém o prospectivo teto endodérmico do arquêntero na sua camada superficial (IMZS) e as prospectivas células mesodérmicas.22F) que integra várias correntes mesodérmicas para formar um longa e estreita banda. 1988). Assim a corrente mesodérmica continua a migrar em direção ao pólo animal e a camada superposta de células superficiais (incluindo as células garrafa) são passivamente puxadas em direção ao hemisfério animal.22 (D-F) esboça o comportamento dessas células da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estágios da gastrulação em Xenopus (Keller e Schoenwolf. e que a camada superficial forma o revestimento do arquêntero unicamente porque ela está ligada às células profundas. Pouco antes de sua involução através do lábio do blastóporo. A parte anterior dessa banda migra em direção ao hemisfério animal. estreitando ainda mais a banda. o pólo animal e as células da zona marginal não-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrião. A remoção das células garrafa não afeta a involução das células profundas ou das células superficiais da zona marginal para dentro do embrião. A FORMAÇÃO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAÇÃO DE XENOPUS A Figura 6. 1981. a lâmina em expansão do mesoderma converge em direção à linha mediana do embrião. Quando as células garrafa são removidas após sua formação. 1977. após começar esses movimentos. Entretanto.

C. 1984. 1986). enquanto a blástula gastrulando normalmente foi injetada com a solução controle. ectoderma. tendo fixado à fibronectina sintética. cortesia de J. ec.23 Fibronectinas e gastrulação de anfíbio. o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz extracelular que contém fibrilas de fibronec- Figura 6. Pouco antes da gastrulação. ossos e partes de vários outros órgãos) entra através dos lábios ventral e lateral para criar o manto mesodérmico. Thiery. blastóporo. dão origem ao mesoderma dorsal axial. (B-E) Micrografias ao microscópio eletrônico de varredura de gastrulação normal (B. causando o movimento dos lábios do blastóporo em direção ao lado ventral. os rins. bl.E) Os estágios finais da gastrulação detida.230 PARTE II Padrões de Desenvolvimento assim. não conseguem reconhecer a via de migração normal forrada de fibronectina. (A) Imunofluorescência revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfície basal de prospectivas células ectodérmicas forrando o teto da blastocele do embrião da salamandra. yp. 1985. blastocele.) (A de Boucaut et al. Informações adicionais & Especulações Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica C omo é que as células involutivas são informadas para aonde ir. Boucaut e J. Enquanto essas células mesodérmicas. O endoderma é derivado das células da IMZS que formam o revestimento do teto do arquêntero e das células vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquêntero (Keller. mesoderma. obturador do vitelo. B-E de Boucaut et al. onde os precursores mesodérmicos. o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o coração.) (A) (B) (C) (D) (E) .-P.E) da salamandra. O arquêntero não se forma. (C) O obturador do vitelo ao fim da gastrulação. endoderma. parece que os precursores mesodérmicos involutivos migram em direção ao pólo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas células do teto da blastocele.. (D. en. uma vez que se encontram no interior do embrião? Na salamandra. sangue. (B) Seção durante gastrulação intermediária. (ar. entrando através do lábio dorsal do blastóporo. mes. arquêntero.. e os precursores nãoinvoluídos do mesoderma permanecem na superfície.C) e anormal (D. bc. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante à célula de fibronectina.

Em Xenopus. A matriz extracelular aderiu à placa.24A). foi então colocado sobre essa matriz.. formando uma massa celular convoluta. A importância dessas fibrilas de fibronectina é também vista em híbridos interespecíficos que se detém na gastrulação. e a flecha branca representa seu eixo blastóporo-pólo animal. as células mesodérmicas dorsais vão aderir à superfície basal do ectoderma presuntivo. e se migrassem o fariam em uma direção particular? Foi verificado que as células migraram. As fibrilas de fibronectina são necessárias para que as células mesodérmicas da cabeça se achatem e estendam largos processos (lameliformes) na direção da migração (Winklbauer et al. 1985). Delarue e colegas (1985) mostraram que certos híbridos inviáveis. A matriz extracelular contendo fibronectina. O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. entre duas espécies de sapos. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removido de outra gástrula precoce e colocado sobre a matriz com seu próprio eixo blastóporo-pólo animal.. Entretanto. Nakatsuji et al. a subunidade αv da integrina é progressivamente perdida das membranas das células do blastômero. permite a ligação das células mesodérmicas à rede de fibronectina e. mas se organiza em pequenos aglomerados fibrilares. a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos podem ocorrer. então as células ligadas a esse fragmento solúvel de peptídio. 1990). 1988. 1995). Shi e colegas (1989) removeram os tetos da blasto- cele de gástrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plástico com suas matrizes extracelulares tocando o plástico (Figura 6. Se a fibronectina fosse essencial para a migração celular. Boucaut e colaboradores injetaram grandes quantidades de um pequeno peptídio contendo essa seqüência na blastocele de embriões de salamandra. Isso é precisamente o que ocorreu (Figura 6.24B). A fibronectina das gástrulas de Xenopus não forma grades complexas. as células das DMZ não migraram ao acaso. RGD). contendo células da DMZ. fotografia cortesia dos autores. parece fornecer sinais para a direção da migração celular. o explante foi removido. Figura 6.23A. Parece então. (B) Células da DMZ do explante migraram para o pólo animal da matriz. em lugar da fibronectina real ligante de células. em direção ao pólo animal.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 231 tina (Figura 6. a extensão convergente empurra as células migratórias para cima. A linha pontilhada indica a borda original do explante. morrem durante a gastrulação porque não secretam essas fibrilas de fibronectina. Impossibilitadas de encontrar sua “estrada”. Seria possível às células desse explante migrarem na matriz. Não foram vistas células migratórias ao longo do lado de baixo do ectoderma.. Winklbauer e Keller. 1996). e particularmente seu componente fibronectina.24 (B) AP A direção da migração das células da zona marginal dorsal (DMZ) depende da orientação da matriz extracelular do teto da blastocele. (A) Explantes do teto da blastocele do blastóforo (BP) para o pólo animal (AP) foram dissecados de embriões de salamandra em estágio precoce de gastrulação e colocados em placas plásticas. A migração mesodérmica pode ser também interrompida pela microinjeção de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade β1 de integrina que funciona como parte do receptor de fibronectina (D’Arribère et al. O eixo do blastóporo ao pólo animal foi marcado e. após 2 horas. perpendicular àquele da matriz. mas não migrarão (Winklbauer e Nagel. Boucaut et al.. Células se ligam a uma certa região da proteína fibronectina que contém uma seqüência de três aminoácidos (Arg-Gly-Asp. deveriam parar. 1989. os precursores mesodérmicos permaneceram fora do embrião.23B-E). e que a migração podia ser inibida por anticorpos que impedem que a célula (A) Pólo animal reconheça a fibronectina. além disso. Um explante menor de uma gástrula precoce. Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo após a fecundação. Isso foi confirmado pela síntese química de uma “falsa” fibronectina que pode competir com a genuína da matriz extracelular. Se a fibronectina for sintetizada mas não organizada nessas fibrilas. 1984. as células mesodérmicas deveriam cessar sua involução. pouco antes e durante a gastrulação. que a síntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma começar e continuar a migração. Outros pequenos peptídios sintéticos (incluindo outros fragmentos da molécula de fibronectina) não impediram a migração... (de Shi et al. 1991). Além disso. e o tecido foi então removido. que a matriz extracelular do teto da blastocele. Em vez disso. Considera-se que as células mesodérmicas aderem à fibronectina através da αvβ1 proteína integrina (Alfandari et al. a subunidade αv é expressa na superfície das células mesodérmicas migratórias. é importante na migração das células mesodérmicas durante a gastrulação em anfíbios. Parece então. deixando sua matriz extracelular. Entretanto.) . pouco antes do início da gastrulação. com o seu próprio eixo perpendicular aquele da matriz. 1991. mas migraram em direção ao pólo animal da matriz extracelular que havia sido absorvida no plástico (Figura 6.

A camada mais superficial se expande por divisão e achatamento celular. Gastrulação no Xenopus é uma orquestração de vários eventos distintos. as células precursoras ectodérmicas epibolizam vegetalmente por divisão celular e pela integração de camadas celulares previamente independentes. se dá provavelmente pelo mesmo mecanismo. por extensão convergente. Keller. (de Keller.) . começa a formação do arquêntero. ainda que mudanças na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfério animal. O espalhamento de células nas zonas marginais dorsal e ventral.5 representam gástrulas progressivamente mais avançadas. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrônica de varredura para observar as modificações tanto nas células superficiais como nas células profundas das regiões animal e marginal. e o prospectivo cordomesoderma atrás delas. mostrando as mudanças na forma e arranjo das células. se estreita e se alonga posteriormente. Ao mesmo tempo. Durante a gastrulação precoce.25 Micrografias eletrônicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus. 1988). estágios 10-11. O resultado desses movimentos celulares é o posicionamento adequado das três camadas germinativas em preparação para sua diferenciação em órgãos do corpo. Os estágios 8 e 9 são de blástula. acoplado a uma concomitante integração de várias camadas profundas em uma só (Figura 6.25). Estudos moleculares (a serem discutidos no Capítulo 15) estão começando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as células são informadas de como começar e finalizar essas migrações Estágio Figura 6. em tempo e lugar precisamente definidos. a involução das células marginais através do lábio do blastóporo. 1980. A maior parte das células da região marginal. involuem para se juntar à corrente de células mesodérmicas dentro do embrião. O resultado dessas expansões é a epibolia das células superficiais e profundas do pólo animal e regiões marginais não involutivas sobre a superfície do embrião (Keller e Danilchik. cortesias de R. Em seguida.232 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Epibolia do ectoderma Enquanto a involução está ocorrendo no lábios do blastóporo. A primeira indicação de gastrulação envolve a invaginação local das células garrafa do endoderma na zona marginal. três rodadas de divisão celular aumentam o número de camadas de células profundas no hemisfério animal. na margem anterior do manto mesodérmico. E. na porção dorsal do embrião. migram ao longo da superfície interna do teto do blastóporo. O mecanismo principal de epibolia na gastrulação do Xenopus parece ser um aumento no número de células (através de divisão). Ao mesmo tempo. como mencionado anteriormente. os precursores ectodérmicos estão se expandindo sobre todo o embrião. Essas células involutivas. completa integração de numerosas células profundas em uma camada também ocorre.

26). e o espaço entre as camadas é uma blastocele. para formar as ilhas de polinvaginação (hipoblasto primário). para formar ilhas de células sob o epiblasto. Assim. Pouco tempo depois. à primeira vista.retém movimentos de gastrulação muito parecidos com aqueles dos embriões de aves e répteis. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impõe várias restrições aos movimentos celulares.26 e 5. A camada superior é o epiblasto. As células centrais do blastodisco das aves são separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras . Em contraste.por isso. veremos que embriões de mamíferos .33). devido a seu contato com o vitelo. o centro do blastodisco é chamado de área pelúcida. células do epiblasto se agregam na região anterior à foice de Koller para formar a linha primitiva. uma lâmina de células da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrás dele) migra em direção anterior para se juntar às ilhas de polinvaginação e formar o hipoblasto secundário (Eyal-Giladi et al. As primeiras células hipoblásticas delaminam individualmente. logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulação em aves e as gastrulações que já estudamos. Blastoderma Epiblasto Anterior Zona marginal posterior Área opaca Espaço subgerminativo Vitelo Células do hipoblasto delaminando-se do epiblasto Área pelúcida Figura 6.. O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da área opaca. ser muito diferente daquela do ouriço-do-mar ou da rã. formam a área opaca (Figura 6. as células da margem da área pelúcida parecem opacas.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 233 Gastrulação em aves Generalidades sobre gastrulação em aves A clivagem em embrião de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. Enquanto a maioria das células permanece na superfície formando o epiblasto. Realmente. Células da margem posterior (células de foice de Koller e células marginais posteriores) produzem uma população de células que migra abaixo do blastodisco e incorpora as ilhas poli-invaginadas. À medida que o hipoblasto se move no sentido anterior.26 Área opaca Área opaca Epiblasto Blastocele Células do hipoblasto migrando de células profundas da região posterior Formação do blastoderma de duas camadas do embrião da galinha.que não tem vitelo.1992). . e a gastrulação em aves parece. Essa camada inferior tornase o hipoblasto. a estrutura do blastodisco das aves não é diferente da blástula de anfíbios ou equinodermos. um arquipélago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 células (veja Figuras 6. certas células migram individualmente para a cavidade subgerminativa. FORMAÇÃO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. Além disso.

a população ingressante cria um mesênquima fracamente conectado. Assim.27B. Eyal-Giladi et al. 1986. Ou seja. Mesmo que células em uma região específica da gástrula tendam a se transformarem em tipos específicos de células. Essa linha é visível inicialmente como um espessamento de uma camada de células do epiblasto. elas ainda podem produzir diferentes tipos celulares se transplantadas a uma outra região do embrião.. Bellairs. essa se estende na direção da futura região da cabeça. Em lugar disso. as células do epiblasto começam a migrar sobre os lábios dessa e para dentro da blastocele (Figura 6. A estrutura majoritária característica da gas- trulação em aves. através da qual as células passam para a blastocele. imediatamente anterior ao crescente de Koller (Figura 6. que liga a massa do vitelo ao tubo digestivo endodérmico. Além disso. 1972). as células do hipoblasto formam porções da membrana externa. e pela migração de células da região lateral do epiblasto posterior em direção ao centro (Figura 6. células entrando no embrião de aves o fazem individualmente. O nódulo de Hensen é o equivalente funcional do lábio dorsal do blastóporo de anfíbios. Corantes vitais e transplantes de células radioativas foram úteis no mapeamento de tendências prioritárias. 1966. Todas as três camadas germinativas do embrião propriamente dito (mais uma quantidade considerável de membrana extra-embrionária) são formadas das células epiblásticas. o uso de vírus ou corantes fluorescentes permitiu aos pesquisadores acompanhar células individuais através do desenvolvimento (Schoenwolf. ela se move anteriormente e se contrai para formar a linha primitiva definitiva. a linha primitiva tem uma população celular se modificando constantemente. o hipoblasto não contribui com células para o embrião em desenvolvimento (Rosenquist. Essa linha se estende em 60-75% do comprimento da área pelúcida e marca o eixo ântero-posterior do embrião (Figura 6. pois com esses métodos se marcam grupos de células que se difundem ao prosseguir o desenvolvimento. Recentemente. se forma uma depressão na linha. contornou o problema de difusão. Vakaet.234 PARTE II Padrões de Desenvolvimento O mapa de destino para o embrião de aves é restrito ao epiblasto. existe uma significante extensão convergente enquanto a linha primitiva progride anteriormente. [gast1. o mesoderma da cabeça e a notocorda. 1991). Ao mesmo tempo. Na ponta anterior da linha primitiva há um espessamento regional de células chamado nódulo primitivo ou nódulo de Hensen.html] Tão logo se forma a linha primitiva. células passando através das porções laterais da linha primitiva dão origem à maioria dos tecidos endodérmicos e mesodérmicos (Schoenwolf et al. Como pode ser visto nessas figuras.. as células do hipoblasto secundário estão continuando a migrar da margem posterior do blastoderma. De maneira similar ao blastóporo de anfíbios. não se forma um verdadeiro arquêntero na gástrula de aves. À medida que a área espessada se estreita. e serve como um blastóporo. Enquanto as células convergem para formar a linha primitiva. Células migrando através do nódulo de Hensen passam para dentro da blastocele. Enquanto as células entram na linha primitiva. 1984. tais como células de codorna colocadas em embriões de galinha. na direção anterior. Em contraste com o mesoderma de Xenopus. especialmente o saco vitelínico e o pedúnculo. FORMAÇÃO DA LINHA PRIMITIVA. répteis e mamíferos é a linha primitiva. 1992). através do qual as células migratórias passam para a blastocele. na região posterior do embrião. A elongação . Esse espessamento é causado pelo ingresso de células mesodérmicas do epiblasto para dentro da blastocele.27A). a fenda primitiva é análoga ao blastóporo de anfíbios. migram anteriormente formando o intestino anterior.28).27C-E). Transplantar células marcadas geneticamente. 1992). o qual migra como lâminas de células para a blastocele. Mapas de destino de epiblasto de galinha estão representados na Figura 6. Esses mapas integram vários tipos de mapeamento. Essa depressão é chamada fenda primitiva.27. mas ainda assim marcava aglomerados relativamente grandes de células. Em lugar de formar uma lâmina de células fortemente organizadas. O centro desse nódulo contém uma depressão em forma de funil (algumas vezes chamada cova primitiva).

As células hipoblásticas estão confinadas a uma região na porção anterior da área pelúcida. O movimento precoce das células epiblásticas HNK-1+ é mostrado por flechas. O blastoderma é visto em (A) 3-4 horas. é similar àquela vista nos anfíbios. essas células migram anteriormente e finalmente deslocam as células do hipoblasto na porção anterior do embrião. 1975.27 Nódulo de Hensen Sulco primitivo (G) Borda anterior do mesoderma Ectoderma da dobra cefálica Dobra neural Somito Notocorda (H) Dobra cefálica Intestino anterior Movimentos celulares da linha primitiva do embrião de galinha. não forma estruturas . (D) 10-12 horas e (E) 1516 horas. MIGRAÇÃO ATRAVÉS DA LINHA PRIMITIVA: FORMAÇÃO DO ENDODERMA E MESODERMA. novamente. Essa região. (F-H) A formação da notocorda e somitos mesodérmicos à medida que a linha primitiva regride é mostrada em (F) 19-22 horas.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 235 (A) Anterior (B) Área opaca (I) Ectoderma Endoderma Mesoderma Axial Paraxial (vértebras. As primeiras células a migrarem através da linha primitiva são aquelas destinadas a se transformarem no intestino anterior.) Nódulo de Hensen Placa segmental Linha primitiva da linha primitiva parece ser coincidente com a migração em direção anterior dessas células do hipoblasto secundário. e Balinsky. (Adaptado de várias fontes. especialmente Spratt. Essa situação. e as células precursoras endodérmicas ingressam mais rapidamente que as células precursoras mesodérmicas. (B) 5-6 horas. 1985. (I-K) Mapas do destino do epiblasto em dois estágios da gastrulação. o crescente germinativo. (G) 23-24 horas e (H) no estágio de quatro somitos. (A-E) Visão dorsal da formação e alongamento da linha primitiva. Extensão convergente é mostrada na linha mediana. 1946. Uma vez dentro da blastocele. musculatura) Placa lateral (incluindo o coração) Extra-embrionária Área pelúcida Área de engrossamento do blastoderma Área opaca Área pelúcida Posterior (C) (D) (J) Linha primitiva tomando forma (E) Nódulo de Hensen Área pelúcida Área opaca Anterior Processo cefálico (F) (K) Figura 6. rins. (C) 7-8 horas. I-K segundo Vakaet.

empurrando para cima a região medianoanterior do hipoblasto. porém. Essas células de movimento profundo dão origem a todos os órgãos endodérmicos do embrião. deslocando as células hipoblásticas para os lados. Essa camada origina as porções mesodérmicas do embrião e das membranas extra-embrionárias. mas contém os precursores das células germinativas. essas células se separam em duas correntes. (A de Solursh e Revel. A segunda corrente migratória se espalha através da blastocele como uma camada frouxa. Uma corrente se move mais profundamente e encontra o hipoblasto em sua região mediana. mais ou menos a meio caminho entre o hipoblasto e o epiblasto. as células hipoblásticas finalmente se separam para formar uma camada abaixo daquela do endoderma e contribuem para o saco vitelínico. (B) Estereograma de um embrião gastrulante de galinha. Essas células permanecem entre o endoderma e o epiblasto para formar as células do mesoderma da cabeça e do cordomesoderma (notocorda) (veja Psychoyos e Stern. estendendo seus terminais apicais para transformarem em células garrafa. as células continuam a migrar para dentro. mostrando a relação da linha primitiva. 1975. através da porção lateral da linha primitiva. das células migratórias e das duas camadas originais do blastoderma. que mais tarde migram através dos vasos sangüíneos até as gônadas. a maior parte das células presuntivas endodérmicas estão no interior do embrião. 1978. Solursh. . assim como a maioria das membranas extra-embrionárias (o hipoblasto forma o restante). 1996).29). Essas células de ingresso precoce se moveram todas anteriormente.28 (A) Migração de células endodérmicas e mesodérmicas através da linha primitiva. a fim de formar o processo cefálico (Figura 6. A camada inferior se transforma em um mosaico de células hipoblásticas e endodérmicas. cortesia de M. apesar das células presuntivas mesodérmicas continuarem a migrar para o interior por um tempo mais longo.) (B) Nódulo de Hensen Linha primitiva Epiblasto Blastocele Hipoblasto Endoderma Células migratórias (mesênquima) embrionárias. Após 22 horas de incubação. B segundo Balinsky. Enquanto isso. (A) Micrografia eletrônica de varredura mostra células epiblásticas passando para a blastocele. Quando entram na blastocele. As próximas células que entram na blastocele através do nódulo de Hensen (e o primeiro quarto anterior da linha primitiva) também se movem anteriormente.236 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. mas não se movem tão ventralmente como as células presuntivas endodérmicas do intestino anterior.

Ainda mais. (C) Estágio de quatro somitos (27 horas). Ela deixa em seu lugar o eixo dorsal do embrião e o processo cefálico.29 Agora começa uma nova fase da gastrulação. formando a região anal. células ectodérmicas migraram para fora do blastodisco para envolver o vitelo por epibolia.) Alongamento da notocorda . que dura 4 dias para ser completada e envolve a produção contínua de novo Gastrulação do embrião de galinha de aproximadamente 24 até perto de 28 horas. 1947. enquanto a notocorda anterior empurra para cima o processo cefálico que estava embaixo. O enclausuramento do vitelo (novamente reminiscente da epibolia do ectoderma de anfíbios) é uma tarefa de Hércules. a linha primitiva regrediu até a porção caudal do embrião. os precursores ectodérmicos proliferavam para se tornar a única população de células remanescente na camada superior. a ponta anterior estará mais avançada no seu desenvolvimento (podese dizer que teve uma “vantagem” inicial) do que a porção posterior. os embriões de aves (e mamíferos) exibem um distinto gradiente de maturidade de desenvolvimento ântero-posterior. O tempo representa as horas decorridas após atingir o comprimento máximo em aproximadamente 18 horas. células da porção anterior já estão começando a formar órgãos. Enquanto células das porções posteriores do embrião estão gastrulando. para uma posição mais posterior (veja Figura 6. O processo cefálico (notocorda anterior) pode ser visto estendendo-se a partir do nódulo de Hensen. o epiblasto é composto inteiramente de células ectodérmicas presuntivas. Linask. (A) A linha primitiva totalmente estendida (24 horas). E segundo Spratt. Enquanto as células presuntivas do mesoderma e do endoderma se moviam para dentro. Finalmente. a porção remanescente (posterior) da notocorda é estabelecida.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 237 Endoderma faríngeo Processo cefálico (notocorda anterior) Ilhas de sangue Dobra cefálica Intestino anterior Sulco neural Nódulo de Hensen Linha primitiva Área pelúcida Somito Linha primitiva Área opaca (A) (B) (C) Linha de referência Regr es da li s ã o p r i m nha itiva Borda posterior da área pelúcida Horas (D) (E) Figura 6. deixando a notocorda em seu rastro. (E) Regressão da linha primitiva. Anteriormente vê-se o endoderma faríngeo. (D) Após 28 horas.29). Pelos próximos dias. Enquanto continua o ingresso do mesoderma. o nódulo regride para sua posição mais posterior. Vários pontos da linha foram acompanhados após atingir seu comprimento máximo. movendo o nódulo de Hensen de uma posição próxima do centro da área pelúcida. Ao mesmo tempo que o nódulo avança posteriormente. (B) Estágio de dois somitos (25 horas). A linha primitiva está regredindo. Como uma conseqüência desse processo de gastrulação em duas etapas. Nesse ponto. a linha primitiva começa a regredir. (Fotografias cortesia de K.

e aquele frente ao espaço subgerminativo se torna o ventral. o ectoderma envolveu o vitelo. 1971). se o blastoderma é separado em partes. forme hipoblastos próprios.5). A conversão de um blastoderma radialmente simétrico em uma estrutura simétrica bilateral é determinada pela gravidade. a região onde começa a formação do hipoblasto. Entretanto.238 PARTE II Padrões de Desenvolvimento material celular e a migração das células ectodérmicas presuntivas ao longo da superfície inferior do envoltório vitelínico. Khaner e Eyal-Giladi (1989) verificaram que na transposição da zona marginal posterior para uma área marginal lateral (Figura 6. Portanto. Azar e Eyal-Giladi. Assim. 1981) consideravam que o hipoblasto induzia à formação da linha primitiva e a contemplava com uma polaridade ânteroposterior. como também impedem que outras regiões marginais induzam seus hipoblastos. Mecanismos de gastrulação em aves O PAPEL DO HIPOBLASTO E A FORMAÇÃO DOS EIXOS EMBRIONÁRIOS. evitarão que qualquer célula. se uma região posterior é reciprocamente transposta com uma região lateral (Figura 6. O lado frente à albumina se torna o dorsal. a parte onde começa a gastrulação (Kochav e Eyal-Giladi. Isso cria dois lados para as células: um lado frente à albumina negativa e básica. As células posteriores formarão o hipoblasto e. com menos atividade. Essas células marginais posteriores não só contribuem com as células indutoras do hipoblasto. O controle desse campo parece residir na zona marginal posterior. O blastoderma do embrião de galinha age como um sistema único integrado para formar um único embrião. mas um pouco deslocado para o lado. 1932.30B). produzem uma barreira entre a albumina básica (pH 9. e mostrou que o epiblasto inicia a formação da linha primitiva e mantém sua polaridade independentemente da orientação do hipoblasto. Esse eixo é estabelecido quando as células em clivagem do blastoderma. cada parte vai formar seu próprio embrião (Spratt e Haas. abaixo do disco. A porção mais alta do blastodisco se transforma na ponta caudal (rabo) do blastoderma. ele gira a uma velocidade de 10 a 15 revoluções por hora. mas é deslocado para cima pelo vitelo mais denso. somente a margem posterior original do hospedeiro forma o hipoblasto que está subjacente à linha primitiva.5) acima do blastodisco e o espaço subgerminativo ácido (pH 6. 1960). os eixos ântero-posterior e dorsolateral são determinados antes da gastrulação. Entretanto. em diferentes estágios do desenvolvimento da galinha. Assim. 1988). Enquanto o óvulo rola oviduto abaixo.30C). . O citoplasma que deverá se tornar a camada celular está sempre girando para baixo.30A). cada uma tendo sua zona marginal. ao mesmo tempo. o rasgo posterior cicatriza e duas linhas primitivas aparecem. o endoderma substituiu o hipoblasto e o mesoderma se posicionou entre essas duas regiões. enquanto o óvulo está lentamente rolando oviduto abaixo. Khaner (1995) girou o epiblasto com relação ao hipoblasto. Similarmente. Isso pode ser revertido ou invertendo o gradiente de pH ou invertendo a diferença de potencial através da camada de células (revisão em Stern e Canning. se uma zona marginal posterior é colocada em um embrião que retém sua margem posterior original (Figura 6. e outro lado frente ao fluido do espaço subgerminativo positivo e ácido. chegando ao fim da gastrulação em aves. O eixo dorso-ventral (costa-frente) é crítico para a formação do hipoblasto e para o contínuo desenvolvimento do embrião.* *Pesquisadores anteriores (Waddington. somente se forma uma linha primitiva e ela provém da região posterior original. Água e íons de sódio são transportados da albumina através das células para dentro do espaço subgerminativo criando uma diferença de potencial de membrana de 25 mV através da camada de células (positivo no lado ventral das células). Khaner e Eyal-Giladi sugerem que as células da zona marginal formam um gradiente de atividade cujo pico está na ponta posterior. não está em cima do vitelo.

as Experimentos de Khaner e Eyal-Giladi demonstrando que a porção posterior da zona marginal (PMZ) contribui para as células indutoras da linha primitiva do hipoblasto e impedem outras regiões marginais de criarem seus próprios hipoblastos. Evidências dos estudos de Stern e Canning (1990) sugerem que o epiblasto não é um tecido homogêneo.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 239 EXPERIMENTO (A) Anterior Zona marginal Área opaca Epiblasto RESULTADOS INTERPRETAÇÃO Posterior (B) Cicatriz Linhas primitivas (C) Figura 6. Esses estudos mostram que certas células. enquanto ainda estão no epiblasto. É provável que o tecido marginal posterior secrete uma substância que atrai as células que expressam HNK-1. Pelo contrário. o embrião não formará mesoderma nem endoderma. As células expressando HNK-1 ingressam individualmente na blastocele e migram para a região posterior. Quando a linha chega ao seu comprimento quase total.) . e nenhuma célula expressando HNK-1 formará derivados ectodérmicos. como foi assumido por muito tempo. enquanto o tecido marginal anterior secreta uma molécula repelente (Jephcott e Stern. produzirão o endoderma e o mesoderma. (Segundo Khaner e Eyal-Giladi. para formar o rudimento inicial da linha primitiva. As células expressando HNK-1. Essas células HNK-1 positivas interagem com as células do epiblasto acima delas. Se as células HNK-1 são seletivamente destruídas (por anticorpos). parece haver diferenciação nas células epiblásticas mesmo antes que a formação da linha primitiva se inicie. que se juntam na margem posterior. podem ser distinguidas por uma molécula específica na superfície celular (HNK-1. 1991). citado em Stern. nãodiferenciado. Esse rudimento de linha sofre um processo de extensão convergente que o estreita e alonga.30 ACUMULAÇÃO CELULAR NA LINHA PRIMITIVA. 1989. dispersas ao acaso no epiblasto. uma forma sulfatada do ácido glucurônico).

o movimento dessas células está ligado.. Em ambiente aquoso.240 PARTE II Padrões de Desenvolvimento células HNK-1 positivas dissolvem a lâmina basal do epiblasto central para formar uma canal através da linha primitiva. 1995). Movimento dentro da blastocele amniota é feito por células individuais. Isso se estende posteriormente para o “broto da cauda” do embrião (incluindo os somitos 28-50) (Le Douarin et al. entram na blastocele. as células mesenquimatosas se aglomeram e não conseguem migrar adequadamente. não através do nódulo de Hensen). a destruição da lâmina basal e a liberação dessas células do epiblasto pode ser realizada por uma proteína de 190-kDa chamada fator de espalhamento (Stern et al. 1990).28). Na ponta anterior do canal. Na ausência de E-caderina funcional. O ácido hialurônico é capaz de manter as células separadas. Isso permite que células do epiblasto (que nunca expressaram HNK-1) sejam recrutadas para a linha que está se estendendo anteriomente e.35). as células se separam e migram lateralmente ao longo da membrana basal do epiblasto. assim. nódulo de Hensen. O fator de espalhamento é secretado somente no nódulo de Hensen. Ácido hialurônico e outros polissacarídeos facilitam a migração de células individuais (veja Capítulo 3). onde reveste a superfície das células que estão chegando. a lâmina epitelial se desmonta naquela região e as células se tornam mesênquima. FORMAÇÃO SECUNDÁRIA DA NOTOCORDA. Não existe evidência clara de que essa fibronectina é essencial para o direcionamento do movimento celular que afasta as células lateralmente da linha primitiva. mas não parecem dirigir o movimento dessas células (Fisher e Solursh. Mas. assegurando que a migração continue. em gastrulação precoce. à presença de uma rede de fibronectina na lâmina basal extracelular das células do epiblasto. são achatadas e passam a fazer parte de uma corrente de células migratórias independentes. e tem sido implicado na dissociação de células nessa região e na indução do tecido neural a partir do epiblasto. o ácido hialurônico pode ser um fator importante para manter as células mesenquimatosas dispersas durante sua migração. na vizinhança do nódulo (Streit et al. fosforila as β-cateninas que ancoram as E-caderinas à membrana celular (Hartmann et al. Além disso. como na gastrulação de anfíbios. Após o somito 17 (da galinha). 1994). novas regiões da linha primitiva podem ser induzidas. Muito estudos têm mostrado que o ácido hialurônico é importante para manter as células mesenquimatosas migratórias separadas umas das outras. Um desses complexos polissacarídeos é o ácido hialurônico. Quando se implantam resinas contendo o fator de espalhamento abaixo do epiblasto de embriões de galinha. Dentro da linha.. Polissacarídeos extracelulares podem também ter um papel importante nessa migração. Essa camada rica em fibronectina aparece na superfície inferior das células da camada de cima. uma vez liberadas da linha primitiva. 1979). 1982). Enquanto a porção anterior da notocorda é formada pelo ingresso de células através do nódulo de Hensen e a subseqüente migração anterior. O fator de espalhamento se liga a receptores tirosina quinase em células adjacentes. Fisher e Solursh (1977) mostraram que quando esse material é digerido (injetando a enzima hialuronidase na blastocele).. e não por uma camada epitelial. a notocorda posterior é formada de maneira diferente. células de aves passando pelo blastóporo sofrem uma constrição no seu terminal apical e se tornam células garrafa (Figura 6. rica em fibronectina (Duband e Thiery. um polímero linear de ácido glucurônico e N-acetilglicosamina (veja Figura 3. contribuir (junto com as células HNK-1 positivas) para os mesoderma e endoderma embrionários. Na verdade. pouco antes da formação da linha primitiva e desaparece na região da linha. Esse composto é produzido pelas células ectodérmicas e se acumula na blastocele. Portanto. mais uma vez.. provavelmente devido a sua capacidade de se expandir em água. esse polímero pode expandir em até 1000 vezes o seu volume original. 1996). a notocorda se forma pela condensação de tecido mesodérmico que ingressou através da linha primitiva (isto é. . o ácido hialurônico começa a se acumular precisamente no momento em que as primeiras células entram na blastocele. As células. e agindo através da cascata da proteína G.

(A) Quando um blastoderma de galinha é colocado no envoltório vitelínico. causou retração dos filopódios das células marginais e parou a migração do blastoderma.) . Essas observações sugerem que o envoltório vitelínico é essencial para a extensão da lâmina celular. As células marginais são inerentemente diferentes das outras células blastodérmicas. como certas células são destinadas a se tornarem células do hipoblasto. as células precursoras do ecto- derma se expandem externamente para envolver o vitelo. Identificamos muitos dos processos envolvidos na gastrulação de aves. Assim. as células marginais migram e cobrem o envoltório vitelínico com ectoderma. ou como as células são designadas aos seus respectivos destinos. mais uma vez. a superfície superior da área opaca adere fortemente à superfície inferior do envoltório vitelínico e se espalha ao longo dessa superfície interna. as bordas do blastoderma se curvam para dentro de modo que as células marginais da camada superior estão. a epibolia do ectoderma cessa. New (1959) mostrou que quando o blastoderma é colocado sobre o envoltório vitelínico de forma invertida (camada profunda em contato com o envoltório vitelínico). Se as células marginais são removidas. como no experimento discutido anteriormente. elas continuam a migrar sozinhas.31 Endoderma Presuntivo (camada profundas) (A) Ectoderma Presuntivo Envoltório Vitelínico (B) Propriedades migratórias dos precursores ectodérmicos de galinha. Em primeiro lugar. na blastocele de salamandra. New (1959) demonstrou que o blastoderma isolado se estende normalmente sobre o envoltório vitelínico isolado. Nas aves. A maioria das células blastodérmicas aderem frouxamente. Existem várias linhas de evidência indicando que as células marginais da área opaca são os agentes da epibolia ectodérmica. Durante a gastrulação. O mesmo comportamento é visto em cultura de células. a camada blastodérmica se enrola para permitir que as células da camada superficial possam aderir e migrar sobre a camada vitelínica. não sabemos ainda como se forma a cavidade subgerminativa. com os precursores em contato com a superfície vitelínica. O resultado é uma vesícula fechada. (B) Quando as camadas profundas são colocadas em contato com o envoltório vitelínico. Recentemente. Esses filopódios alongados são considerados o aparelho locomotor das células marginais. em contato com a superfície vitelínica (Figura 6. Lash e seus colaboradores (1990) expandiram esses resultados mostrando que a fibronectina está presente na superfície interna do envoltório vitelínico.31). É interessante observar que somente as células marginais (isto é. Lash e colegas aplicaram a seqüência RGD ao envoltório vitelínico enquanto as células migravam sobre ele. pois podem estender longos processos citoplasmáticos (500µm) em direção ao envoltório vitelínico. Segundo. quando as células marginais são isoladas do resto do blastoderma. Esse tratamento quebrou especificamente o contato entre as células marginais e o envoltório vitelínico. Então. Gary Figura 6. parece que as células precursoras do ectoderma são levadas junto com as células ativamente migratórias da área opaca (Schlesinger. 1958). Existe também uma relação específica entre as membranas celulares das células marginais e a superfície inferior da membrana vitelínica. as células da área opaca) se ligam firmemente à superfície vitelínica. como certas células expressam HNK-1. como a linha primitiva se estende e se retrai. enquanto suas vizinhas não o fazem. o blastoderma se espalha somente quando as margens estão se expandindo. mas não individualmente. quando o fazem. como células expressando HNK-1 migram para a margem posterior e como lá interagem com as células do epiblasto. 1959. (Segundo New.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 241 EPIBOLIA DO ECTODERMA. no qual Boucaut e colaboradores injetaram o composto sintético contendo a seqüência do sítio de ligação à fibronectina (RGD). mas ignoramos como esses processos são realizados. e Spratt (1963) demostrou que esse espalhamento não ocorre com outros substratos. Essas células estão ligadas entre si por ligações firmes e migram como uma unidade.

O embrião mamífero obtém seus nutrientes diretamente da mãe e não depende de vitelo armazenado. TECIDOS EMBRIONÁRIOS Ectoderma embrionário Epiblasto embrionário Mesoderma embrionário Epiblasto Linha primitiva Massa celular interna Ectoderma amniótico Endoderma amniótico Hipoblasto Blastocisto Endoderma extra-embrionário Envoltório vitelínico Mesoderma extra-embrionário TECIDOS EXTRA-EMBRIONÁRIOS Trofoblasto Citrofoblasto Sinciciotrofoblasto Figura 6.. Portanto. Essa evolução ensejou uma dramática reestruturação da anatomia materna (tal como a expansão do oviduto para formar o útero) como também o desenvolvimento de um órgão fetal capaz de absorver os nutrientes maternos.é derivado primariamente de células trofoblásticas embrionárias. é certo dizer que o que sabemos sobre gastrulação e neurulação em aves é consideravelmente menos do que ainda resta conhecer”. O que é surpreendente é que os movimentos de gastrulação de embriões de répteis e aves. seguindo instruções que parecem mais apropriadas a seus ancestrais. (Segundo Luckett. 1993.242 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Schoenwolf (1991) comentou: “ A despeito de tudo que foi escrito. Esse órgão fetal -a placenta. Gastrulação em mamíferos Aves e mamíferos são descendentes de espécies de répteis.) . que evoluíram como uma adaptação a ovos com vitelo. a maioria dos mamíferos evoluiu para uma admirável estratégia de desenvolvimento dentro da própria mãe. A massa celular interna nos mamíferos pode ser visualizada como assentada sobre uma bola imaginária de vitelo.32 Diagrama esquemático mostrando a derivação de tecidos de embriões humanos e do macaco rhesus. e Bianchi et al. não é surpreendente que o desenvolvimento de mamíferos se dá paralelamente ao dos répteis e aves. suplementado por células mesodérmicas derivadas da massa celular interna. 1978. Modificações para desenvolvimento dentro de outro organismo Em lugar de desenvolver-se isoladamente dentro do ovo. são mantidos mesmo na ausência de grandes quantidades de vitelo no embrião mamífero.

que não o faz. O mamífero adulto se forma das células do epiblasto embrionário. e o sinciciotrofoblasto que irá ingressar no tecido uterino. 1993. com isso.32. Uma . O trofoblasto em alguns mamíferos pode ser dividido em trofoblasto polar. Essas células se separam da massa celular interna para revestir a cavidade da blastocele onde elas originam a endoderme do saco vitelínico.33C e 6. 7 dias Revestimento uterino Capilar maternal Epitélio uterino (endométrio) Massa celular interna Blastocele Trofoblasto (B) 8 dias Sinciciotrofoblasto proliferando no tecido uterino Epiblasto Cavidade amniótica Blastocele Trofoblasto (C) 9 dias Lacunas trofoblásticas (D) 10-11 dias Cavidade amniótica Lacunas trofoblásticas (suprimento de sangue materno) Epiblasto Hipoblasto Trofoblasto Cavidade Amniótica Blastocele Sinciciotrofoblasto Formação de mesoderma extraembrionário Retículo extra-embrionário Figura 6. essas células não produzem partes do organismo neonato. que cobre a massa de células internas.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 243 (A) Blastocisto. (D) O endoderma extra-embrionário forma o saco vitelínico.33). e Larsen. (C) Ao mesmo tempo o epiblasto se divide em ectoderma amniótico (que rodeia a cavidade amniótica) e epiblasto embrionário. semelhante aquele visto em embriões de aves. O trofoblasto se divide no citotrofoblasto que forma as vilosidades. As células do epiblasto são separadas por pequenas fendas que coalescem para separar o epiblasto embrionário das outras células do epiblasto. é agora chamado de epiblasto. formando. (Segundo Gilbert. Como em embriões de aves. 1989.B) Blastocisto humano imediatamente antes da gastrulação. (A.33 Formação de tecido no embrião humano entre 7 e 12 dias. O tecido da massa celular interna remanescente. A massa celular interna delaminam células hipoblásticas que forram o trofoblasto. o envoltório vitelínico primitivo e um blastodisco de duas camadas (epiblasto e hipoblasto). as quais formam o revestimento do âmnio (Figuras 6.) As origens dos tecidos mamíferos precoces estão sumariadas na Figura 6.34). acima do hipoblasto. e o trofoblasto mural. A primeira segregação de células dentro da massa celular interna envolve a formação do hipoblasto (algumas vezes chamado endoderma primitivo) (Figura 6.

(Segundo Larsen. . o epiblasto ingressante é considerado substituir as células hipoblásticas (que contribuem ao forro do saco vitelínico). Essas células podem ser vistas como uma banda de células pequenas e ciliadas se estendendo para cima do nódulo de Hensen (Figura 6. o mesoderma e o endoderma de mamífero migram através da linha primitiva.34 (A) Sinciciotrofoblasto Mesoderma Extra-embrionário Estrutura do âmnio e movimentos celulares durante a gastrulação humana. 1974.244 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 6. O epiblasto embrionário parece conter todas as células que vão dar origem ao próprio embrião e é. Sulik et al. Enquanto penetram a linha.. Aos dias 14 e 15. as células devem se integrar no endoderma do intestino primitivo.36). (B) Os movimentos das células epiblásticas para dentro da linha primitiva e o nódulo de Hensen. o embrião foi cortado sagitalmente através da linha mediana. Kirstie Lawson e seus colegas (1991) marcaram células individuais do epiblasto com peroxidase de rabanete (horseradish) o que lhes permitiu construir um detalhado mapa de destino do epiblasto de camundongo (Figura 6. 1993). 1994). Na formação da notocorda do camundongo. portanto. Disco germinativo bilaminar Cavidade amniótica Epiblasto Sulco primitivo Saco vitelínico Hipoblasto (B) 14-15 dias Cavidade amniótica Sulco primitivo Nódulo de Hensen Epiblasto Sulco Primitivo Hipoblasto 16 dias Saco vitelínico Endoderma Mesoderma Mesoderma extra-embrionário Endoderma vez completado o revestimento do âmnio. 1993. enquanto impede a sua dessecação. Na representação superior. As células migrando através do nódulo de Hensen dão origem à notocorda. e por baixo do epiblasto estão sobrepostas na visão da superfície dorsal. ele se enche com uma secreção chamada fluido amniótico. Elas formam a notocorda convergindo mediamente e se dobrando em uma direção dorsal com afastamento do teto do intestino. que mantém as células unidas. semelhante ao epiblasto de ave. e elas migram como células individuais (Burdsal et al. enquanto no dia 16. de muitas maneiras. Como as células do epiblasto de galinha.). a representação inferior olha de cima para baixo sobre a superfície dorsal do embrião.. (A) Embrião humano e conexões uterinas após 15 dias de gestação. as células ingressantes se espalham como um leque para formar a camada mesodérmica. que serve como absorvente de choques para o embrião em desenvolvimento. de maneira diferente da formação da notocorda da galinha (Jurand. as células do epiblasto deixam de expressar E-caderina.35).

embrionário e extra-embrionário. Sulik e G. O tipo inicial de célula trofoblástica constitui uma camada chamada citotrofoblasto. 1993) que a substituição das células hipoblásticas pelos precursores endodérmicos ocorre nos dias 14-15 da gestação. clones de células dão origem a descendentes em mais de uma camada embrionária ou para ambos os derivados. cortesia de K. (A) A superfície ventral do embrião de 7. elas dão origem a uma população de células onde a divisão nuclear se dá em ausência de citocinese. 1991.35 (A) Mapa do destino do embrião do camundongo.5 dias vista pelo microscópio eletrônico de varredura. Apesar da aparência normal das células trofoblásticas iniciais no camundongo e no homem. não do trofectoderma. o epiblasto do camundongo é firmemente curvado. (B) Formação da notocorda pela dobra dorsal das pequenas células ciliadas. as linhagens não se separaram umas das outras.) .. posição similar que ocupam no epiblasto de galinha. enquanto que a migração de células formando o mesoderma não começa antes do dia 16. mas enquanto o mesoderma de galinha se forma de células posteriores ao fim da linha.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 245 Figura 6. Os endodermas parietal e visceral são derivados do hipoblasto. as células migrando entre as camadas de hipoblasto e epiblasto parecem estar envolvidas em ácido hialurônico cuja síntese se inicia durante a formação da linha primitiva (Solursh e Morriss. 6 dias após a fertilização.) (Segundo Lawson et al. no estágio de epiblasto. as células extra-embrionárias estão produzindo os tecidos distintivos dos mamíferos que permitem ao feto sobreviver dentro do útero materno. (A) O estágio do ovo cilíndrico.. Formação de membranas extra-embrionárias Enquanto o epiblasto embrionário está apresentando movimentos celulares reminiscentes daqueles vistos na gastrulação de répteis e aves.) Cone ectoplacentário do trofoblasto Cavidade amniótica Epiblasto Útero Endoderma visceral Endoderma parietal Saco vitelínico Trofoblasto Os precursores ectodérmicos estão localizados anteriormente à linha primitiva completamente estendida. 1977). Como nos embriões de aves. Assim. C. (de Sulik et al. O (B) Anterior Âmnio Ectoderma Mesoderma Endoderma Notocorda Mesoderma extra-embrionário Linha primitiva Posterior Tubo neural presuntivo Mesênquima Endoderma Notocorda presuntiva Figura 6. (O mapa do destino do camundongo foi achatado e deve ser visto como enrolado para cima com a linha primitiva nas bordas.36 Tubo neural Notocorda (A) (B) Formação da notocorda no camundongo. Notar que ao contrário dos epiblastos da galinha e humano. 1994. o mesoderma de camundongos se forma de células anteriores à linha primitiva. de modo que o sangue materno possa banhar os vasos sangüíneos fetais. enquanto que o tipo de célula multinucleada forma o sinciciotrofoblasto. flanqueadas pelas células endodérmicas maiores do intestino primitivo. O citotrofoblasto adere à parede uterina (endométrio) através de uma série de moléculas de adesão que foram discutidas no Capítulo 3. Schoewolf. (B) Mapa do destino de um epiblasto de 7 dias na gastrulação precoce. Em alguns casos. As células presuntivas da notocorda são pequenas células ciliadas na linha mediana. Considera-se (Larsen. As células citotrofoblásticas humanas também contêm enzimas proteolíticas que lhes permitem entrar no útero e remodelar os vasos sangüíneos uterinos.

entram em contato com o sinciciotrofoblasto. e seus vasos sangüíneos podem ser vistos estendendo-se para dentro das vilosidades coriônicas. Mesmo que o camundongo e o homem gastrulam e implantam da mesma maneira. mas pobre ciência: a placenta é de vaca. por fim. O órgão completamente desenvolvido. mas ainda passível de separação (como na placenta de contato no porco). O útero.html] A Figura 6. 1989). Assim.246 PARTE II Padrões de Desenvolvimento tecido do sinciciotrofoblasto parece promover a progressão do embrião para dentro do útero. é chamado cório e esse se funde com a parede uterina para formar a placenta. É muito arriscado extrapolar fenômenos de desenvolvimento de um grupo de mamíferos para outro. O embrião está deitado dentro do âmnio.. o tecido mesodérmico se estende para fora do embrião em gastrulação (veja Figura 6.) . Os vasos sangüíneos se estendendo do cório ao embrião e desse ao cório são facilmente observados. O estreito pedúnculo de conexão do mesoderma extra-embrionário que liga o embrião ao trofoblasto forma os vasos do cordão umbilical. Seu extraordinário desenho do feto humano dentro da placenta é excelente arte. Figura 6. A esfera à direita do embrião é o saco vitelínico. Esse pode estar fortemente justaposto ao tecido materno.33). F. o cório. 1991). 1993).. (Instituto Carnegie de Washington. Pouco depois. 1982). consistindo de tecido trofoblástico e mesoderma contendo vasos sangüíneos. Reather. a placenta tem uma porção materna (o endométrio uterino que é modificado durante a gravidez) e um componente fetal.37 Embrião humano e placenta após 40 dias de gestação. A atividade proteolítica cessa após a décima segunda semana de gestação (Fisher et al. Essas vilosidades contém os vasos sangüíneos e *Existem numerosos tipos de placenta.* [gast2. cortesia de C. que se junta às extensões trofoblásticas e dá origem aos vasos sangüíneos que levam nutrientes da mãe para o embrião.37 mostra as relações entre os tecidos embrionários e extra-embrionários de embrião humano de 6 semanas. Estudos recentes com embriões humanos e de macaco rhesus sugerem que o saco vitelínico (e portanto o hipoblasto) é a fonte desse mesoderma extra-embrionário (Bianchi et al. e as membranas extra-embrionárias se formam de maneira diferente nas diferentes ordens de mamíferos (veja Cruz e Pedersen. como também as vilosidades que se projetam da superfície externa do cório. Até Leonardo da Vinci errou (Renfree. por sua vez. suas estruturas extra-embrionárias são distintas. supre essa área com vasos sangüíneos que. incluindo o homem). ou tão intimamente integrado que os dois tecidos não podem ser separados sem causar dano para a mãe e para o feto em desenvolvimento (como na placenta decídua da maioria dos mamíferos. O embrião encontra-se envolvido pelo âmnio e protegido pelo cório.

Os vasos sangüíneos das vilosidades coriônicas são formados do mesoderma extra-embrionário que penetra nos pequenos montes de tecido citotrofoblástico chamados vilosidades primárias (Figura 6. A progesterona placentária é também usada pela glândula supra-renal fetal como um substrato para a produção de hormônios corticosteróides biologicamente . uma parte desse mesoderma extra-embrionário produziu vasos sangüíneos. se formam na segunda semana de gestação. apesar de não haver fusão dos sistemas circulatórios materno e fetal.39). As estruturas resultantes.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 247 Para o feto Do feto Do feto Figura 6. e o feto envia seus produtos descartáveis (principalmente dióxido de carbono e uréia) para a circulação materna. [other. A porção sinciciotrofoblástica do cório produz três hormônios essenciais para o desenvolvimento dos mamíferos. Primeiro. ele produz a gonadotrofina coriônica.38). Assim. a mãe proporciona nutrientes e oxigênio ao feto. e essas vilosidades terciárias estão aptas a trazer nutrientes e oxigênio da mãe para o embrião. 1956). as vilosidades secundárias. A progesterona é o hormônio esteróide que mantém a parede uterina espessada e cheia de vasos sangüíneos. um hormônio peptídico que é capaz de induzir outras células da placenta (e do ovário materno) a produzir progesterona. os ovários podem ser removidos depois do primeiro terço da gravidez. é também um órgão endócrino.html#gast4] O trofoblasto é necessário para a aderência e entrada do embrião nos tecidos uterinos.38 Relação entre as vilosidades coriônicas e o sangue materno no útero. Nos primatas. sem danos para o desenvolvimento do feto. Artérias umbilicais Veia umbilical Âmnio Vilosidades coriônicas Cório (porção fetal da placenta) Células trofoblásticas Porção maternal da placenta (células deciduais) Para a mãe Da mãe Veia maternal Artéria maternal permitem ao cório ampliar a área exposta ao sangue materno. Mas o cório tem uma importância até maior. porque o cório tem capacidade para produzir os esteróides necessários para manter a gestação (Zander e von Münstermann. e o cório permite troca de gases e nutrientes entre a mãe e o feto. a difusão de substâncias solúveis pode ocorrer através das vilosidades (Figura 6. Dessa maneira. No fim da terceira semana.

mas também a regulação das relações endócrinas e imunológicas entre a mãe e o feto. como ela rejeitaria um órgão daquela criança? Parece que o cório desenvolveu vários mecanismos pelos quais ele pode inibir a resposta imune contra o feto (Chaouat. Assim. Ele pode secretar proteínas solúveis que bloqueiam a produção de anticorpos.) Mesoderma extra-embrionário importantes. apesar de haver diferenças entre os movimentos na gastrulação de embriões de ouriço-do-mar. O terceiro hormônio produzido pelo cório é a somatomamotropina coriônica (freqüentemente chamada lactogênio placentário). agora. assim. Estudos recentes indicam que o cório pode ter ainda outra função. Dadas as diferentes quantidades e distribuições de vitelo.39 Desenvolvimento das vilosidades coriônicas em humanos. pronto para a formação dos primeiros órgãos. As glicoproteínas responsáveis por essa rejeição são chamadas de antígenos de histocompatibilidade principais e. formam-se capilares que irão se conectar aos ramos da artéria e veia umbilicais.. (C) dentro do mesoderma extra-embrionário. diferem de indivíduo a indivíduo. e o corpo da mãe rejeitará a pele ou órgãos de seus descendentes porque eles contêm antígenos derivados do pai. pode o feto humano permanecer 9 meses dentro do corpo da mãe? Porque a mãe não rejeita imunologicamente o seu feto. Cada grupo tem o problema de trazer as células precursoras do mesoderma e do endoderma para dentro do corpo. 1990). e pode promover a produção de certos tipos de linfócitos que impedem a resposta imune normal dentro do útero. que parece proteger o embrião de ser reconhecido pelo sistema imune da mãe (Carosella et al. aves e mamíferos.. Além disso. que é a de proteger o feto da resposta imune da mãe. Pazmany et al. . as funções da placenta incluem não só suporte físico e troca nutricional. (B) Vilosidade secundária formada quando o mesoderma extra-embrionário subjacente penetra na vilosidade primária. provavelmente. [gast3. Uma pessoa com um sistema imune normal reconhece e rejeita células estranhas dentro do seu corpo. certos mecanismos são comuns a todos. As células citotrofoblásticas também contêm uma forma de antígeno de histocompatibilidade principal. Como então. como também outras considerações ambientais. observamos uma série incrivelmente bem coordenada de movimentos celulares pelos quais os blastômeros do estágio de clivagem são rearranjados e começam a interagir com seus vizinhos. (Segundo Gilbert. (A) Vilosidade primária composta de tecido citotrofoblástico encaixado no sinciciotrofoblasto. Uma criança expressa antígenos de histocompatibilidade principais de ambos. cada tipo de organismo foi capaz de desenvolver uma maneira de conseguir esse objetivo. 1989. O palco está. Tais vilosidades secundárias juntam-se às vilosidades adjacentes para formar a casca citotrofoblástica que irá ancorar as vilosidades ao endométrio.248 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Vilosidade primária Endométrio Espaço entre vilosidades Sinciciotrofoblasto Citotrofoblasto Mesoderma extraembrionário (B) Vilosidade secundária Endométrio Casca citotrofoblástica Sinciciotrofoblasto Espaço entre vilosidades Citotrofoblasto Capilares das vilosidades (C) Vilosidade terciária Figura 6. esse fato é demonstrado pela rejeição a transplantes de pele e de órgãos de indivíduos geneticamente diferentes. Esse hormônio é responsável pelo desenvolvimento do seio materno durante a gestação. específico da placenta.html] Na gastrulação. o pai e a mãe. anfíbios. permitindo a produção de leite mais tarde. e envolver o embrião com precursores ectodérmicos. 1996. 1996).

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Development of a “primitive” sea urchin (Eucidaris tribuloides): Irregularities in the hyaline layer. Zool. M. J. and Driever. 24: 673-688.CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 251 Pazmany. C. 1985. Trinkaus. R. G. Development 121: 813-824. micromeres. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. [B] 13: 221. Jr. R. 1981. Plenum. 1977. Schoenwolf. Zool. NJ. Purcell. Schmidt. Trans. Streit A. G. J..).L. G. 1990. Philos. Reyburn. 38: 31-110. 1992. Warga. A different type of amphibian mesoderm morphogenesis in Ceratophrys ornata. 161: 141-151. 1978.. J. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. 145: 97-138.. Dev. and Canning. 26-69. B. Kinematics of gray crescent formation in Xenopus eggs. Glycosaminoglycan synthesis in rat embryos during the formation of the primary mesenchyme and neural folds. Exp. K. Wilson. and McClay. Edelman (ed. Dev. W. W. The origin of the mesoderm in an anuran. Ireland. Biol. 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o mais eminente embriologista de sua época*. von Baer estabeleceu quatro generalizações. as escamas de répteis. enquanto acordadas. Todos os vertebrados em desenvolvimento (peixes. falando de nada exceto da célula. LEWIS THOMAS (1979) E M 1828 KARL ERNST VON BAER. Somente mais tarde é que diferenças entre pernas. cuja descendência total é o cérebro humano. De seu estudo detalhado sobre o desenvolvimento da galinha e da comparação de tais embriões com embriões de outros vetebrados. além de contribuir para o progresso conceitual aqui descrito. Caracteres menos gerais são desenvolvidos a partir dos mais gerais. maravilhadas. mas somente como seu embrião precoce. No momento. Todos os embriões de vertebrados têm arcos de guelras.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 253 Início do desenvolvimento vertebrado: Neurulação e ectoderma 7 Porque a verdadeira maravilha. Eles podem ser lagartos. Enquanto peixes preservam e elaboram essas fendas tornando-as verdadeiras guelras. asas e braços se tornam evidentes. A mera existência de tal célula deveria ser uma das coisas assombrosas da Terra. os mamíferos as convertem em estruturas tais como os tubos de Eustáquio (entre o ouvido e a boca). depois quatro. se afasta mais e mais deles. que esqueci de identificar. aves e mamíferos) são muito semelhantes logo após a gastrulação. não consigo determinar o gênero ao qual pertencem. E. essa se divide em duas. 2. o desenvolvimento precoce de membros é essencialmente o mesmo em todos os vertebrados. em lugar de passar através de todos os estágios adultos de outros animais. elas se parecem às fendas viscerais de peixes embrionários e outros vertebrados embrionários. répteis. anfíbios. 1. era a floresta que se estendia a minha frente naquele momento: o sistema nervoso central. as penas das aves. Somente mais tarde no desenvolvimento que as características especiais da classe. A Figura 7. Da mesma maneira. Assim. As pessoas deveriam vagar o dia inteiro. 3. até finalmente aparecerem os caracteres mais especializados. Seu trabalho será mais discutido no Capítulo 23. em um certo estágio aparece uma única célula. Somente mais tarde se desenvolvem as escamas de peixes. As fendas viscerais em embriões de aves e mamíferos não se parecem em detalhe às fendas das guelras de peixes adultos. notocordas. ilustradas aqui com alguns exemplos de vertebrados. ou o pêlo. é este processo. espécie aparecem (veja Figura 7. RITA LEVI-MONTALCINI (1988) * K. ordem e. finalmente. von Baer descobriu a notocorda. anunciou: Eu tenho dois pequenos embriões preservados em álcool. o embrião precoce de um animal superior nunca é como um animal inferior.1). Cada embrião de uma dada espécie.1 permite-nos apreciar seu dilema e ilustra as quatro leis gerais da embriologia propostas por von Baer. As características gerais de um grande grupo de animais aparecem no embrião mais cedo do que os aspectos especializados. chamando umas às outras. medulas espinhais e rins pronéfricos. garras e unhas dos mamíferos. 253 . o ovo de mamífero e o ovo humano. Inicialmente todos os vertebrados têm o mesmo tipo de pele. se você quiser se maravilhar. pequenas aves ou mesmo mamíferos”. 4. Você inicia como uma única célula derivada da união entre um espermatozóide e um óvulo. Ao contrário. Von Baer verificou que diferentes Ainda mais atraente do que a mata virgem. depois oito e assim por diante e.

O ectoderma forma a pele e os nervos. o coração. Von Baer também reconheceu que existe um modelo comum para todo o desenvolvimento de vertebrados: as três camadas germinativas originam diferentes órgãos. Com o progresso do desenvolvimento. pensa. 1901). e coordena nossos processos corporais conscientes ou inconscientes é indubitavelmente o mais desafiante dos enigmas do desenvolvimento. o sistema urogenital e partes da maioria dos órgãos internos. este. Uma combinação de abordagens genéticas. os embriões se tornam reconhecíveis como membros de sua classe. ama. troca. A construção de um órgão que reconhece.” Assim Gregor Eichele (1992) terminou. uma rã ou uma galinha. odeia. nenhum deles passando pelos estágios dos outros. sua família e. recentemente. e o mesoderma forma o tecido conjuntivo.1 Ilustração das leis de von Baer. realmente. uma revisão de pesquisa sobre desenvolvimento do cérebro de mamíferos. sua espécie. I II III Peixe Salamandra Tartaruga Galinha Porco Boi Coelho Homem grupos de animais compartilham aspectos comuns durante o desenvolvimento embrionário precoce e que esses aspectos se tornam mais e mais característicos da espécie à medida que progride o desenvolvimento. o endoderma forma os sistemas respiratórios e digestivos. O Capítulo 9 acompanhará o desenvolvimento precoce dos órgãos endodérmicos e mesodérmicos. embriões humanos inicialmente compartilham características comuns com embriões de peixes e aves. Neste capítulo acompanharemos o desenvolvimento precoce do ectoderma. sua ordem. Embriões humanos nunca passam por estágios equivalentes a um peixe ou uma ave adultos. (de acordo com Romanes. engana a si mesmo. . e o capítulo seguinte enfocam a formação do sistema nervoso nos vertebrados. os embriões de mamíferos e outros divergem. lembra.254 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. FORMAÇÃO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Neurulação: aspectos gerais “Talvez a mais intrigante de todas as perguntas é se o cérebro é suficientemente poderoso para resolver o problema da sua própria criação. finalmente. e essa derivação dos órgãos é constante se o organismo é um peixe. as células do sangue. Mais tarde. celulares e orgânicas está fornecendo uma compreensão preliminar de como a anatomia básica do cérebro se torna ordenada. Embriões precoces de vertebrados mostram aspectos comuns ao subfilo inteiro.

formando a epiderme externa e um tubo neural interno conectados pelas células da crista neural. Em neurulação primária. HP. cortesia de R. HN. a se proliferar. O quanto essas formas de construção são usadas depende da classe de vertebrados. Neurulação primária Em vertebrados. é construído por neurulação secundária (Pasteels. o rudimento do sistema nervoso central.. 1993). o tubo neural se origina de um sólido cordão de células que se embebe no embrião e subseqüentemente se torna oco (forma uma cavidade) para formar o tubo neural (veja Schoenwolf. 1996). nódulo de Hensen. 1991b). Existem dois caminhos principais para a formação do tubo neural. o cordomesoderma estimula o ectoderma acima dele a formar o tubo neural oco. Nessa interação. é chamado neurulação. placa neural. Os eventos da neurulação primária estão no (A) Placa neural Prega neural (B) (C) Crista neural Figura 7. Nagele. a maior parte do tubo neural do girino é produzida por neurulação primária.) Epiderme Tubo neural . também). uma camada mesodérmica intermediária e um ectoderma externo. NP. Catala et al. invaginar e a se destacar da superfície formando um tubo oco. a neurulação secundária começa aproximadamente ao nível do somito 35 (Schoenwolf. mas o tubo neural caudal é derivado de neurulação secundária (Gont et al. Nievelstein et al. Em camundongo (provavelmente no homem.) (Fotomicrografias. 1937. que o recobre. (C) Formação do tubo neural vista em seções transversais do embrião de galinha na região do futuro mesencéfalo (setas em B). a gastrulação cria um embrião com uma camada endodérmica interna. as porções anteriores do tubo neural são construídas por neurulação primária. Em anfíbios. que se diferenciará em cérebro e medula espinhal.2 Neurulação em anfíbios e amniotas. como o Xenopus. Em aves. O ectoderma se dobra no ponto mais dorsal. (HF. (A) Diagrama representativo da formação do tubo neural. prega cefálica. mesencéfalo.. A interação entre o mesoderma dorsal e o ectoderma que a ele se sobrepõem é uma das interações mais importantes em todo o desenvolvimento de tetrápodes. o cordomesoderma estimula o ectoderma. 1984.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 255 O processo pelo qual o embrião forma o tubo neural. M. Cada fotografia em C corresponde à outra acima dela. As células ectodérmicas estão representadas como precursoras da crista neural (preto) ou como precursoras da epiderme (cor). (B) Fotomicrografias de neurulação em um embrião de galinha de 2 dias. e um embrião sofrendo essas transformações é chamado nêurula.. porque ela inicia a organogênese. Na neurulação secundária. a criação de tecidos e órgãos específicos. caudal ao par somito 27 (isto é. A neurulação em peixes é exclusivamente secundária. processo cefálico. tudo posterior aos membros posteriores). 1993). ao passo que o tubo neural.

mostrando em cada caso nêurulas precoce (esquerda).3 Quatro vistas da neurulação em um embrião de anfíbio. 1975. de cima para baixo.) Placa neural Prega neural (A) SEÇÃO TRANSVERSAL diagrama da Figura 7. as quais migram da região de conexão entre o tubo neural e a epiderme.2. será detalhada no Capítulo 15. (B) A mesma seqüência olhando a superfície dorsal do embrião inteiro. Durante a neurulação primária. O fenômeno de indução embrionária. (C) Seção sagital pelo plano mediano do embrião. Placa neural Notocorda Notocorda Arquêntero Mesoderma Notocorda Mesoderma Cavidade do intestino Tubo neural Cavidade do intestino Endoderma Mesoderma Epiderme Endoderma Endoderma Epiderme Epiderme Notocorda Prega neural Epiderme (B) SEÇÃO SAGITAL Arquêntero Resto da blastocele Placa neural Notocorda Prega neural Placa neural Prega neural Blastóporo Blastóporo Cavidade do intestino Tubo neural Cavidade do intestino Mesoderma Endoderma Epiderme Mesoderma Endoderma Mesoderma Epiderme Endoderma Divertículo do fígado Tubo neural Placa neural (C) VISTA DA SUPERFÍCIE DORSAL Prega neural Placa neural Prega neural Pregas neurais fundidas Blastóporo Blastóporo (D) SIMULAÇÃO COMPUTADORIZADA DA DEFORMAÇÃO DA LÂMINA DE ECTODERMA (LINHA C) . 1976. (A-C de acordo com Balinsky. D de acordo com Jacobson e Gordon. extensão e levantamento da placa neural. (D) Simulação computadorizada em três dimensões da constrição. o ectoderma original é dividido em três conjuntos de células: (1) o tubo neural posicionado internamente. média (centro) e tardia (direita). e (3) as células da crista neural. que inicia a neurulação na região dorsal do embrião. (A) Seção transversal no centro do embrião. (2) a epiderme da pele posicionada externamente. e irão gerar os neurônios periféricos e a glia. que formará o cérebro e a medula espinhal.256 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. as células pigmentadas da pele e vários outros tipos de células. Neste capítulo estamos considerando a resposta dos variados tecidos ectodérmicos.

enquanto um sulco neural. répteis. (2) a formação do assoalho da placa neural. 1995. 1971). As pregas neurais migram em direção à linha média do embrião. considera-se que o mesoderma dorsal subjacente (em colaboração com outras regiões do embrião) sinaliza às células ectodérmicas acima dela para se desenvolverem em células colunares da placa neural (Smith e Schoenwolf. A primeira indicação que uma região do ectoderma está destinada a se tornar tecido neural é uma mudança na forma celular (Figura 7. O alongamento das células ectodérmicas dorsais causa a elevação dessas regiões neurais presuntivas acima do ectoderma circundante. Essa epiderme presuntiva empurra a placa neural abaixo dela. A formação da placa neural A formação da placa neural como uma região distinta de outras células ectodérmicas será discutida em detalhe nos Capítulos 8 e 15. se movendo para o meio. 1995). (C) Nas três regiões de articulação (no ponto de articulação mediano MHP e nos dois pontos de articulação dorsolateral a -DLHP). (De acordo com Moury e Schoenwolf. (A) Formação das pregas neurais ocorre quando as células epidérmicas presuntivas se movem para dentro. Catala et al.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 257 (A) Formação das pregas neurais (B) Elevação das pregas neurais (C) Epiderme presuntiva Placa neural presuntiva Zona de transição Placa neural Notocorda Formação de cunha Formação de sulco Epiderme Notocorda Ancoragem Figura 7. A mecânica da neurulação primária A neurulação ocorre com algumas variações em diferentes regiões do corpo. puxa com ela a placa neural.4). As células ectodérmicas da linha média tornamse alongadas. Esses movimentos parecem continuar enquanto a epiderme. na direção da linha média do embrião. (B) Enquanto as células da linha média da placa neural (células da placa do assoalho) são ancoradas à notocorda.3 e 7. a qual se transformará em epiderme. Em geral. 1996): (1) a formação da placa neural. sua região do tubo neural de maneira a refletir a relação da notocorda com o ectoderma que a ela se sobrepõe. e (5) o fechamento do sulco neural para formar o tubo neural. e esse processo pode ser dividido em cinco estágios distintos. a placa neural. Até 50% do ectoderma está incluído nessa placa.3 e parece ser similar em anfíbios. aves e mamíferos (Galera. As células da porção mais dorsal do tubo neural se tornam as células da crista neural. cada um. resultando na justaposição das pregas neurais. Logo após. o tronco e a cauda formam.4 O processo de neurulação primária em embriões de rã está descrito na Figura 7. 1992. Se a epiderme ao redor da placa neural é isolada.) . 1989. enquanto as células destinadas a formar a epiderme se tornam mais achatadas. as células da placa neural presuntiva se distinguem do ectoderma circundante. criando assim. mas espacialmente e temporalmente se superpondo estágios (Schoenwolf.4). As células da placa neural e as células da epiderme possuem seus próprios movimentos intrínsecos (Moury and Schoenwolf. A cabeça. enquanto se move. Tanto as regiões da cabeça como as do tronco. as bordas da placa neural se engrossam e se movem para cima formando as pregas neurais. dividindo os futuros lados direito e esquerdo do embrião (veja Figuras 7. 1991a. discussão posterior neste capítulo). as pregas neurais são elevadas. Representação esquemática do dobramento do epitélio durante a neurulação na galinha. (4) o dobramento da placa neural para formar o sulco neural. (3) a modelagem da placa neural. as células da placa neural mudam seu comprimento e sofrem uma constrição nos seus ápices.aparece no centro da placa. em forma de -U.. Como resultado dessa indução neural.. sofrem variantes da neurulação primária. Keller et al. finalmente se fundindo para formar o tubo neural abaixo do ectoderma sobreposto.

Embriões de galinha e codorna se desenvolvem de maneira muito semelhante (especialmente no desenvolvimento precoce). Para acompanhar as células embrionárias individuais do nódulo eles usaram o sistema de quimera galinha-codorna. na codorna a heterocromatina do núcleo está concentrada ao redor dos nucléolos. tendo uma porção do seu corpo composta de células de codorna (Figura 7. Esses movimentos da placa neural e da epiderme originam as pregas neurais. o ectoderma é “torcido” e logo a epiderme presuntiva começa a recobrir a placa neural. existem alguns antígenos que são específicos para a (A) Figura 7. considerava-se que somente as células da linha média da placa neural formavam a placa do assoalho do tubo neural. e quando porções do embrião de codorna são enxertadas em uma região equivalente do embrião de galinha. Formação do assoalho da placa neural Anteriormente. Se a placa neural é isolada.que se origina em parte do nódulo de Hensen e é “inserido” no centro da placa neural. Isso cria uma grande massa que se cora intensamente e é facilmente distinta da heterocromatina difusa da galinha. (de Le Douarin et al. 1969. (Realmente. Nas quimeras. 1995). ela formará pequenas pregas neurais em cultura). Esses movimentos coordenados finalmente causarão a elevação e o dobramento do tubo neural (veja Figura 7. Le Douarin. 1995.5 Uma quimera galinha-codorna. Le Douarin. e o pinto que eclode é uma “quimera”. migram para as penas da cabeça. Moury e Schoenwolf. 1996.5. (A) Duas quimeras galinha-codorna e uma galinha controle 4 dias após a eclosão. Melanócitos de codorna. As células de galinha e codorna. originários da crista neural. Segundo. o tubo neural dorsal anterior da codorna substituiu uma região equivalente da galinha no embrião de 12-somitos. Le Douarin e Teillet. se tornariam as porções mais dorsais do tubo neural. Provavelmente é assim que se forma a região da cabeça. suas células convergem e se estendem para formar uma placa mais delgada. mas não se fundem para formar um tubo neural. entretanto. Evidência recente.. as células se integram no embrião e participam da construção dos órgãos adequados. entretanto. ao nível do enxerto.258 PARTE II Padrões de Desenvolvimento as células se movem em direção ao centro (ou seja. têm duas diferenças críticas. Ou seja. as pregas neurais. (B) Uma região do embrião contendo tanto células de codorna (com sua cromatina altamente condensada) como células de galinha (com sua cromatina mais difusa). M. O enxerto pode ser feito enquanto o embrião ainda está dentro do ovo. Esse modelo foi proposto por Catala e colaboradores (1995) baseado nos seus dados e em estudos anteriores de vários laboratórios. As partes mais periféricas. suas células mais centrais se localizariam no fundo do tubo. em direção à área onde estava a placa neural). Jacobson e Moury. sugere que o assoalho do tubo neural do tronco tem uma outra origem .4. Inicialmente. se a “região de transição” contendo os dois tecidos é isolada.) (B) Célula de galinha Célula de codorna . Primeiro. no fechamento da placa para formar o tubo neural. fotografias. cortesia de N. 1973).

b. As células MHP ficam ancoradas à notocorda. Na galinha. 1989). o nódulo de Hensen contém as células necessárias para a formação da placa do assoalho caudal e da notocorda. cortesia de N. (B) Análise do eixo quimérico (marcado com antígeno específico para a codorna) mostrando células de codorna na notocorda (flecha) e placa do assoalho (cabeças de flecha). essas células da linha mediana da placa neural são chamadas células do ponto de articulação mediano (MHP) e são derivadas da placa neural imediatamente anterior ao nódulo de Hensen e da sua linha média anterior (do nódulo de Hensen) (Schoenwolf. Esses pesquisadores removeram o nódulo de Hensen e o término caudal da notocorda em alongação de embriões de galinha com 6-somitos (1. as células provocam um estreitamento da placa neural. mas esse fenômeno já havia sido documentado em um famoso livro de embriologia. a placa neural começa a dobrar-se mesmo quando ainda está sendo modelada. na sua maioria. Tanto em anfíbios como amniotas. * A idéia de que a notocorda e a placa do assoalho são derivadas da mesma população de células é de apreciação recente. Endoderma dorsal Figura 7..12).uma ectodérmica e uma do nódulo de Hensen.7). Em aves e mamíferos.5 dias) e os substituiram com seus equivalentes de codorna. fotografia.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 259 (A) Somito 6 (B) Tubo neural Somito Nódulo de Hensen Codorna Galinha codorna e não são encontrados em células da galinha. mas a modelagem mais importante da placa é produzida pelas suas células da linha mediana que se situam diretamente acima da notocorda. mesmo quando a população celular é. (B de Catala et al. abaixo delas. A modelagem e dobramento da placa neural Forças intrínsecas à placa neural estão envolvidas na sua modelagem. as células da placa neural sofrem uma extensão convergente pela intercalação de várias camadas de células no meio de poucas camadas (Jacobson e Sater. de galinha. 1988. O dobramento da placa neural é conseqüência de forças intrínsecas e extrínsecas às suas células. se localizavam mais em direção à cauda do que o próprio nódulo. Schoenwolf e Alvarez. Daquele nível até a cauda.. o enxerto do lábio dorsal do blastóporo é mostrado como dando origem ao mesoderma dorsal (notocorda e somitos) e à placa do assoalho do tubo neural.) . 1996. Ao se tornarem mais colunares. É interessante notar que (como previsto pela regressão do nódulo. Portanto.6 A placa do assoalho do tubo neural do tronco da galinha é derivado do nódulo de Hensen. As paredes do tubo neural foram produzidas da placa neural da galinha (Figura 7. associadas com a placa neural. Os dois fenômenos permitem distinguir células individuais de codorna. elas alongam e estreitam a placa neural (veja Figura 7. M. Le Douarin. O livro Indução embrionária e desenvolvimento de Hans Spemann em 1938 tem uma ilustração do famoso experimento de enxerto de Spemann e Mangold. tanto a notocorda como a placa do assoalho foram compostas de células de codorna. (A) Esquema da operação pela qual o nódulo de um embrião de galinha de 6-somitos é substituído pelo seu correspondente de codorna.6). Catala et al. discutida no Capítulo 6) a placa do assoalho e as células da notocorda.* O tubo neural tem duas fontes distintas . 1991a. 1996). Dessa maneira.3c). As células da placa do assoalho se inserem na parte central do ectoderma dorsal e somente mais tarde é que a notocorda se separa da placa do assoalho pela formação de uma membrana basal entre elas (Figura 7. Nas páginas 144 e 146 daquele livro (e reproduzido aqui na Figura 15.

Em mamíferos.) originando uma articulação em forma de sulco na linha média dorsal. impede a constrição apical dessas células impedindo. Le Douarin. 1991a). cortesia de N.260 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Placa neural Poço do nódulo de Hensen Articulação cordoneural Figura 7. 1980. Essa transformação (modelagem como cunha) está intimamente ligada às modificações da forma celular. Em algumas espécies. antes do fechamento do tubo). As células laterais à MHP não sofrem essas mudanças (Figuras 7. enquanto que na região da medula espinhal. as dobras aderem umas às outras e as células das duas partes se reúnem. Enquanto isso. fotografia. Mas em aves. .4 B.7 O nódulo de Hensen contribui tanto para a notocorda como para a placa do assoalho neural.. um inibidor da formação de microfilamentos. 1971. Nos pontos de articulação dorsolateral.8). Esse movimento da epiderme presuntiva e a ancoragem da placa neural ao mesoderma subjacente deve ser também importante para assegurar que o tubo neural se dobre para dentro do embrião e não para fora. O ectoderma superfícial do embrião de galinha empurra na direção central do embrião.4 e 7. Essas regiões são chamadas pontos de articulação dorsolateral (DLHPs). Logo após. e estão ancoradas ao ectoderma da superfície da prega neural. enquanto citocalasina B. Essas células aumentam sua altura e adquirem a forma de cunha. Nagele e Lee. Fechamento do tubo neural O tubo neural se fecha ao se aproximarem os pares de dobras neurais na linha média dorsal. Depois da formação inicial de sulcos. Alvarez e Schoenwolf. 1972. as células nessa junção formam as células da crista neural. 1988. as células da crista neural cranial (que formam as estruturas da face e do pescoço) migram enquanto as dobras neurais estão se elevando (ou seja. 1991). 1989).C. 1987). 1996. Karfunkel.. 1973. Cada uma delas age como um eixo que dirige a rotação das células ao seu redor (Smith e Schoenwolf. Smith e Schoenwolf. 1981. entretanto. tanto microtúbulos como microfilamentos estão envolvidos nessas transformações. Essas células são induzidas pela notocorda a diminuir sua altura e adquirir a forma de cunha (van Straaten et al. A colchicina. M. as células da crista neural não migram da região dorsal até que o tubo neural tenha sido fechado naquele local. a formação de cunha (Burnside. 1992). Se pequenos pedaços da placa neural são isolados do resto do embrião (incluindo o mesoderma) eles tendem a se enrolar para fora (Schoenwolf. assim. fornecendo mais uma força motora para o dobramento da placa neural (veja Figura 7. um inibidor de polimerização de microtúbulos. as células da crista esperam até que o fechamento ocorra (Nichols. Erickson e Weston. (de Catala et al. inibe o alongamento dessas células. a placa neural se dobra ao redor dessas regiões com articulações. 1983). Seção através do nódulo de Hensen no estágio do somito-6. duas outras regiões de articulações formam sulcos próximos à conexão da placa neural ao restante do ectoderma. forças extrínsecas também estão em ação. mostrando que esse contribui para a camada superior das células embrionárias.

Tosney. (A) Sulco neural rodeado por células mesenquimatosas. A epiderme presuntiva se localiza acima do tubo. enquanto a região caudal (rabo) do embrião está ainda gastrulando.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 261 (A) (B) (C) Figura 7.) A formação do tubo neural não ocorre simultaneamente ao longo do ectoderma. As células que eram a placa neural estão agora dentro do embrião. (C) A formação do tubo neural é completada.9 detalha a neurulação em um embrião de galinha com 24 horas. A neurulação na região cefálica (cabeça) está bastante adiantada. enquanto as células epidérmicas achatadas são trazidas à linha média do embrião. A Figura 7.8 Micrografia eletrônica de varredura da formação do tubo neural no embrião de galinha. cortesia de K. ligadas à área basal do ectoderma da superfície formam as regiões de articulações dorsolaterais. (Fotografias. e o tubo neural é ladeado pelos somitos mesodérmicos e no fundo limitado pela notocorda. Essas três articulações podem ser vistas como sulcos. W. (B) Células neuroepiteliais alongadas formam um tubo. Isso pode ser melhor observado naqueles vertebrados (como aves e mamíferos) cujo eixo corporal se alonga antes da neurulação. As células MHP formam uma articulação no fundo do tubo. A regionalização do tubo neural também ocorre como resultado de mudanças na forma . enquanto as células da placa neural.

As porções cefálicas estão terminando a neurulação enquanto as porções caudais estão ainda gastrulando. As duas pontas abertas do tubo neural são chamadas neuróporo anterior e neuróporo posterior. O fechamento do tubo neural nos mamíferos.10). (de Patten. Falha no fechamento do .262 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Figura 7. 1993). 1971. 1949. Vários defeitos no tubo neural são causados pelo não fechamento em alguns segmentos (Figura 7. Na ponta cefálica (onde se formará o cérebro) a parede do tubo é larga e grossa. se inicia em vários locais ao longo do eixo ântero-posterior (Golden e Chernoff. Na parte caudal à região da cabeça. 1993.. uma série de inchaços e constrições definirão os vários compartimentos do cérebro. entretanto. Van Allen et al. Falha no fechamento na região posterior do tubo neural humano aos 27 dias (ou a ruptura subseqüente do neuróporo posterior logo em seguida) resulta na condição denominada espinha bífida. diversamente da galinha. cuja severidade depende de quanto da medula espinhal permanece aberta. o tubo neural permanece um simples tubo que se afina em direção à cauda. de acordo com Huettner.) Prega neural Notocorda Espaço subcefálico Celoma extraembrionário Prega lateral do corpo Região pericárdica do celoma Vitelo aderente ao endoderma Sulco neural Prega neural Placa neural Endoderma do intestino médio Somito Divergência das pregas neurais Sulco neural Intestino Mesoderma extraembrionário Vitelo Prega neural Placa neural Endoderma Porta intestinal anterior Somito Mesoderma intermediário Mesoderma somático Celoma Mesoderma esplâncnico Nó de Hensen Poço primitivo Ilhota sagüínea Mesoderma Linha primitiva Sulco primitivo Margem primitiva Posterior do tubo. Aqui.9 Ectoderma da cabeça Mesênquima Anterior Ectoderma do blastoderma Estereograma de um embrião de galinha de 24 horas.

As células que se tornarão o tubo neural.) tubo neural anterior resulta em uma condição letal. CDC. estão abertos ao líquido amniótico. Ambos neuróporos. (B) Vista dorsal de um embrião humano em neurulação. Pax3. Fujimori et al.. 1990. O desenvolvimento do cérebro anterior fetal cessa. (A) Seções dorsal e transversal de um embrião humano de 22 dias. Mutações da Sonic hedgehog podem impedir o fechamento do tubo neural em camundongos e no homem (Chiang et al. o cérebro anterior permanece em contato com o líquido amniótico e em seguida degenera. um dia depois. [ecto1. em vez disso..10 Neurulação em embriões humanos. 1990). e o Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos da América recomendam que todas as mulheres em idade fértil tomem 0. anencefalia.. O fechamento do tubo neural humano envolve uma complexa interação entre fatores genéticos e ambientais.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 263 (A) Prega neural Intumescência pericardíaca Placódio ótico Somitos Ectoderma da superfície Crista neural (B) Neuróporo anterior Intumescência pericardíaca (C) (D) (E) Tubo neural Somitos Borda cortada do âmnio 22 dias Sulco neural 23 dias Neuróporo posterior Normal Anencefalia Espinha bífida Figura 7. pois estão presentes em aproximadamente um em cada quinhentos nascimentos viáveis. 1992). 1989. os dois tecidos não aderem mais um ao outro. originalmente expressam E-caderina.17). *Colesterol parece ser necessário para a autoclivagem da proteína Sonic hedgehog.4mg diários de folato para reduzir o risco de defeitos do tubo neural durante a gravidez (Milunsky et al. sintetizam N-caderina e N-CAM (veja Figura 3. Czeizel e Dudas. são essenciais para a formação do tubo neural de mamíferos. ... a separação do tubo neural da epiderme presuntiva é dramaticamente impedida (Detrick et al. (C-E de acordo com Van Allen et al.* Foi estimado que aproximadamente 50% dos defeitos do tubo neural poderiam ser evitados se as mulheres grávidas tomassem suplementos de ácido fólico (vitamina B12). e a abóboda do crânio não se forma. Essas anormalidades não são raras em humanos. 1996. (D) Anencefalia devido a falta de fusão da placa neural na região 2. Essa região é clivada da molécula precursora em uma reação que requer colesterol como um cofator (Porter et al. 1996). Considera-se que essa separação é mediada pela expressão de diferentes moléculas de adesão celular. 1993. certas síndromes envolvendo falhas no fechamento do tubo neural foram relacionadas às mutações na síntese de colesterol (Kelley et al. (C) Regiões de fechamento do tubo neural postulado por evidência genética (superimposta ao corpo do recém-nascido). Como resultado.. anterior e posterior.html] O tubo neural finalmente forma um cilindro fechado que se separa do ectoderma da superfície. A região do neuróporo anterior está se fechando. Roessler et al. mas fatores da dieta como colesterol e ácido fólico parecem ser críticos. mas elas param de expressar essa proteína ao se formar o tubo e. Aqui. Se o ectoderma da superfície passar a expressar N-caderina (injetando mRNA de N-caderina em uma das células do embrião de Xenopus de duas cabeças). No homem. enquanto o neuróporo posterior permanece aberto. 1996). iniciando a neurulação. 1996). sonic hedgehog e openbrain. (E) Espinha bífida devida a falta de fusão na região 5 (ou pela falta de fechamento do neuróporo mais posterior). Defeitos de fechamento do tubo neural podem freqüentemente ser identificados durante a gravidez por vários testes físicos e químicos.. 1992. Certos genes. a porção ativa da Sonic hedgehog é sua região N-terminal..

7B. neurônios motores também serão formados. Essa proteína induz certas células do lado ventrolateral do tubo neural a expressar genes que as transformam em neurônios motores (Figura 7. 1995).Liem. Entretanto. 1996). O destino dorsal do tubo neural é determinado pelas proteínas morfogenéticas do osso. (E) Resumo das interações pela quais Sonic hedgehog promove o desenvolvimento de neurônios motores e inibe sinais de dorsalização.11D). se as células da placa do assoalho ou as células que expressam o Sonic hedgehog são transferidas para uma posição lateral. 1993. Ericson et al. ele está recebendo sinais de dois outros conjuntos de tecidos. ventralmente produzido pela Sonic hedgehog.) (E) (A) Conjunto secundário de neurônios motores Placa do assoalho ventral doada por outro embrião Sinais dorsais (D) Inibição dos sinais dorsais por Sonic hedgehog Neurônios motores Indução de neurônios motores ventrolaterais Placa do assoalho ventral Neurulação secundária A neurulação secundária envolve a formação do cordão medular e seu subseqüente esvaziamento interno formando o tubo neural. esse tipo de neurulação é geralmente identificado na formação das vértebras lombar e da cauda. Esses sinais são instruções para que o tubo neural tenha uma determinada polaridade dorsoventral. a neurulação secundária pode ser vista como continuação da gastrulação.11A. Esses genes seriam expressos normalmente ao longo do tubo neural mas são inibidos pelo sinal. Liem et al.. (B) BMP4 expresso na epiderme dorsal presuntiva durante a formação do tubo neural. Prancha 32).11B.11 (C) A modelagem dorsoventral do tubo neural. 1995.. provavelmente BMP4 e BMP7.... (de Yamada et al. Figura 7. Em ambos os casos. (A) Diferenciação de neurônios motores é vista nos neurônios ventrolaterais. Na rã e na galinha. Liem et al. O papel dessas proteínas foi confirmado por experiências in vitro nas quais tubos neurais isolados foram expostos a produtores desses sinais (Yamada et al. 1993.264 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações A modelagem dorsoventral do sistema nervoso E NQUANTO O TUBO NEURAL está sendo formado.C) e foi demonstrado que elas contrariam o efeito da Sonic hedgehog (permitindo a expressão de genes como (B) msx1 e Pax3 na porção dorsal do tubo neural). cortesia de K. (C) Expressão de BMP7 enquanto o tubo neural se fecha. além de promover a expressão de outros genes dorsalmente específicos (Figura 7. Sonic hedgehog também funciona reprimindo a expressão de genes como dorsalin. fotografias. Pax3 e msx1 da porção ventral do embrião. O tubo neural ventral parece ser modelado pela proteína Sonic hedgehog originária da notocorda e das células da placa do assoalho (veja Figura 7. Essas proteínas são expressas na epiderme dorsal presuntiva (Figura 7. as células do lábio dorsal do blastóporo continuam a crescer .

Na galinha. Exatamente como no Xenopus. e contém precursores da porção mais posterior da placa neural e a porção posterior da notocorda. a notocorda e a corda medular.. é chamada articulação cordoneural (Pasteels. A ponta da cauda é um descendente direto do lábio dorsal do blastóporo. (C) Estágio de girino precoce. (de Gont et al. Como o broto da cauda da rã.13). Catala e colaboradores (1995) mostraram que o broto de cauda precoce. (A) Involuçào da mesoderma no estágio de gástrula média. o tubo neural e seu lúmen se expandem e se contraem para formar as câmaras do cérebro e a medula espinhal.12A. e essa região contém as células que dividem-se para formar ambas. 1993. onde as células revestindo o blastóporo formam o canal neurentérico. e as células que revestem o blastóporo formam o canal neurentérico.B). mas como o cérebro humano é provavelmente a matéria mais organizada do sistema solar e o órgão mais interessante do reino animal.12C. O tubo neural se forma à medida que a corda medular produz pequenas cavidades. em um girino linear com 9mm de comprimento. A nível de tecido. O crescimento dessa região converte a gástrula aproximadamente esférica. Formação das regiões do cérebro O desenvolvimento precoce da maioria dos cérebros de vertebrados é parecido. nos concentraremos no desenvolvimento daquele que supostamente faz o Homo sábio. Como se dá na rã. parte do qual se torna o lúmen do tubo neural secundário. na ponta do lábio. que se fundem umas às outras (Figura 7. 1. funde com o ânus. já tem células com um destino determinado. o ectoderma e o mesoderma do lábio tardio do blastóporo se movem posteriormente. a população celular da parede do tubo neural se rearranja para formar as regiões funcionalmente diferentes do cérebro e da medula espinhal. as próprias células neuroepiteliais se diferenciam em numerosos tipos de neurônios e células de suporte (gliais) presentes no corpo. A parte proximal do canal neurentérico. . A região em crescimento. em lugar de involuir para o embrião (Figura 7. o lúmen do tubo neural) (Figura 7. A involução cessou e ambos.. Finalmente. 1993). Gont et al. existe uma articulação cordoneural.12 Movimentos celulares durante a neurulação secundária em Xenopus.) ventralmente.(B) Movimentos do lábio dorsal do blastóporo nos estágios de gástrula tardia/ gástrula precoce. 1937).2mm de diâmetro. no nível celular. Diferenciação do tubo neural A diferenciação do tubo neural nas várias regiões do sistema nervoso central ocorre simultaneamente de três maneiras diferentes. Enxertando pequenas regiões do broto da cauda da codorna no broto da cauda da galinha. Em nível anatômico macro. enquanto que a porção distal se torna o canal ependimário (isto é.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 265 Notocorda Blastocele Placa neural presuntiva Movimentos de extensão posterior Medula espinhal Canal ependimário Intestino Assoalho Te t o Notocorda Articulação cordoneural Parede posterior Movimentos involutivos Ectoderma (A) (B) Lábio dorsal tardio (articulação cordoneural) (C) Ânus Canal neurentérico Figura 7. essas células se movem posteriomente. essa estrutura não é uma massa não diferenciada de células. os tecidos localizados posteriomente ao neuróporo recentemente fechado são chamados de broto da cauda.

gastrointestinais e cardiovasculares. cujos neurônios dão origem aos nervos que regulam os movimentos respiratórios.14 Desenvolvimento precoce do cérebro humano. O rombencéfalo se subdividirá em um mielencéfalo posterior e um metencéfalo mais anterior.Fibras nervosas entre o cérebro e o cerebelo (somente mamíferos) .13 Formação do tubo neural secundário no embrião de galinha de 25-somitos. cérebro médio (mesencéfalo) e cérebro posterior (rombencéfalo). (B) Cordão medular pouco mais anterior no broto da cauda. (C) Formação de cavidades do tubo neural e formação da notocorda. Cerebelo Mielencéfalo Ponte . O cérebro posterior (rombencéfalo) desenvolve um modelo segmentado que especifica os lugares de onde se originam certos nervos. e o diencéfalo formará o tálamo e o hipotálamo e também a região que recebe os impulsos neurais da retina.Cheiro 3 vesículas primárias Parede Cavidade Telencéfalo Cérebro anterior (Prosencéfalo) Cérebro médio (Mesencéfalo) Diencéfalo Retina Epitálamo Tálamo Hipotálamo Mesencéfalo Cérebro médio . (de Catala et al. o tubo neural se expande em três vesículas primárias (Figura 7. O mielencéfalo vai dar origem à medula oblongata (Bulbo).Glândula pineal .) Derivados Adultos Lobos olfativos .266 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) Figura 7. As três vesículas cerebrais primárias são subdivididas enquanto o desenvolvimento continua.Coordenação de movimentos musculares complexos . Alargamentos periódicos chamados rombômeros dividem o (D) Figura 7. A direita estão os derivados em adultos. mesmo antes que a porção posterior do tubo se forme. O metencéfalo dá origem ao cerebelo. 1995. Entretanto. O cérebro anterior se subdivide no telencéfalo anterior e o diencéfalo mais caudal. cortesia de N. Nessa região anterior. O telencéfalo formará os hemisférios cerebrais.Associação Metencéfalo Cérebro posterior (Rombencéfalo) Medula espinhal Medula . M.) (B) (C) Notocorda O tubo neural precoce de mamíferos é uma estrutura reta. (A) A formação do cordão medular na ponta mais caudal do broto da cauda da galinha. Le Douarin. a porção mais anterior está sofrendo mudanças drásticas. postura e equilíbrio. 1993. a parte do cérebro responsável pela coordenação dos movimentos. dilatações secundárias -as vesículas ópticas. (D) Lumens coalescem para formar o canal central do tubo neural. lobos ópticos e tectum.Centro reflexo de atividades involuntárias .Centro de retransmissão para neurônios ópticos e auditivos .Armazenamento de memória .Temperatura.. a própria retina é uma derivação do diencéfalo.Visão . sono e regulação respiratória 5 vesículas primárias Hipocampo Cérebro . formados pelas paredes e cavidades do cérebro.14): cérebro anterior (prosencéfalo). (De acordo com Moore e Persaud.se estendem lateralmente de cada lado do cérebro anterior em desenvolvimento. fotografias. Quando se fecha a ponta posterior do tubo neural. O mesencéfalo não se subdivide e seu lúmen se tornará o aqueduto cerebral. Na verdade.Fibras nervosas entre os cérebro anterior e posterior.

dos ventrículos cerebrais. Isso foi extensivamente estudado na galinha.15. mas não com células de rombômeros adjacentes (Guthrie e Lumsden. Neurônios foram visualizados pela marcação com anticorpo para proteínas de neurofilamentos. após aumento inicial do cérebro. Lumsden e Keynes. Seria de se esperar que essa pressão do fluido fosse dissipada pela medula espinhal. r4 e r6 (Figura 7. 1984. Desmond e Field.) . rápida. produzindo uma constrição no tubo. Neurônios dos gânglios r2 formam o quinto nervo cranial (trigêmeo). 4 e 6 podem ser identificados pela alta densidade de axônios nesse estágio precoce do desenvolvimento. cortesia de A.16. 1989). Desmond. A região ocluída do tubo neural abre novamente após a expansão inicial. Desmond e Schoenwolf. normais. (D) A reabertura da oclusão. na base do cérebro (Figura 7. Na verdade.) (A) (B) (D) Figura 7. (de Lumsden e Keynes. exercida contra as paredes do tubo neural pelo fluido no seu interior. mas isso parece não acontecer. (A) Corante injetado na porção anterior do tubo neural de galinha de 3 dias.C) Seção do tubo neural da galinha na base do cérebro (B) antes da oclusão e (C) durante a oclusão. onde os primeiros neurônios aparecem nos rombômeros de número par. quando comparado com embriões controles. aqueles do r4 formam o sétimo nervo cranial (facial) e o oitavo (vestibuloacústico). 1992). [ecto2. Schoenwolf e Desmond. 1991). Se for removida a pressão do fluido na porção anterior de um tubo neural assim ocluído. enquanto as pregas neurais vão fechando a região entre o cérebro presuntivo e a medula espinhal. 1982). o tecido dorsal circundante empurra para dentro. Rombômeros 2.15 O cérebro posterior (Rombencéfalo) de um embrião de galinha de 2 dias. extensão e no fato de que isso resulta primariamente em um aumento de tamanho de cavidade e não de crescimento de tecido. enche a região do cérebro mas não passa para a região espinhal.html] A expansão do cérebro embrionário precoce é notável em sua velocidade.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 267 rombencéfalo em compartimentos menores. o cérebro da galinha aumenta a uma velocidade muito menor e contém um número menor de células. keynes. Em embriões de galinha. permite a passagem do corante da região do cérebro para a da medula espinhal. aberto para mostrar as paredes laterais. 1989. 2 4 6 Figura 7. o volume do cérebro expande 30 vezes entre os dias 3 e 5 do desenvolvimento. r2. Os rombômeros representam “territórios” separados de desenvolvimento onde células de cada rombômero podem se misturar livremente dentro dele. (Cortesia de M. (B. Essa oclusão (que também ocorre no embrião humano) efetivamente separa a região cerebral presuntiva da futura medula espinhal (Desmond. Considera-se que essa rápida expansão é causada por uma pressão fluida positiva. o nono nervo cranial (glossofaríngeo) nasce do r6.16 Oclusão do tubo neural para permitir a expansão da futura região do cérebro. Além disso. cada rombômero tem um destino de desenvolvimento diferente. 1986.

Prosencéfalo Mesencéfalo Mes/Met limite Metencéfalo Rombencéfalo Medula espinhal En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) shh (Sonic hedgehog) Figura 7. (de acordo com Bally-Cuif e Wassef.18 Estrutura neuromérica do cérebro com superposição dos hipotéticos eventos indutivos. Essa interface corresponde a uma zona limitans e é também a fonte de Sonic hedgehog. mas ela é marcada pela porção mais posterior. 1994). Se um deles não está presente. Rubenstein e Puelles. Crossley e colegas (1996) verificaram que esse tecido formador de istmo secreta FGF8. um filhote do tipo selvagem está na parte de cima. Os genes Lim1 e Otx2 são expressos por esses tecidos mesodérmicos anteriores. Shawlot e Behringer. Os limites prosoméricos coincidem com os limites de expressão de vários genes que são considerados importantes na especificação neural. (de Shawlot e Behringer. uma proteína difusível considerada indutora de modelagem durante a gastrulação e formação de membros (Figura 7. As pinas do ouvido (flechas) são as estruturas mais anteriores nesses mutantes.19A.) Figura 7. eles obtiveram duplicadas as mesmas estruturas do cérebro médio.) 1994.19B). Quando tecido da junção mesencéfalo médio e anterior é transplantado ao diencéfalo ou rombencéfalo. ele induz as células que o rodeiam a desenvolver destinos mesencefálicos (no diencéfalo) ou cerebelares (no rombencéfalo) (Figura 7. cortesia dos autores. Partículas controle embebidas em salina não mostraram essa duplicação. As regiões dos cérebros anterior e médio são definidas pelo mesoderma subjacente e pela notocorda anterior.17. A interface p2/p3 pode ser crítica na modelagem da região do cérebro anterior.18.17 Fenótipo sem cabeça de camundongo deficiente em Lim1. onde se expressa o gene Otx2. Se a junção for girada pode se dar uma “triplicação”. 1995. em relação ao rombômero 2. os detalhes da especificação do cérebro posterior e da medula espinhal pelo gene Hox serão discutidos no Capítulo 16. Dois camundongos com “knockout” de Lim1 estão na parte de baixo da figura. 1995. Somente as moléculas principais envolvidas na especificação dos cérebros anterior e médio serão aqui discutidas.268 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Informações adicionais & Especulações Determinando as regiões do cérebro anterior e cérebro médio A identidade ântero-posterior de cada vesícula do cérebro de mamíferos é especificada durante a gastrulação pelo mesoderma precordal e pela notocorda. 1994). Aqui não se verifica uma fronteira morfológica. A borda p2/p3 é considerada a fonte da proteína Sonic hedgehog. Acampora et al. Mais ainda.. 1995. As partículas . Os prosômeros p1-p3 correspondem ao diencéfalo e os prosômeros p4-p6 ao hipotálamo (ventralmente) e ao telencéfalo (dorsalmente). Bally-Cuif e Wassef. por interações a nível do ectoderma. 1995). o embrião não forma o cérebro anterior ou o médio. Essa especificação parece ser estabilizada no estágio de placa neural. A área limite mesencéfalo/metencéfalo é positiva para a expressão dos genes Fgf8 e Wnt1. Rubenstein e Puelles (1994) propuseram que o cérebro anterior é composto por seis regiões neuroméricas chamadas prosômeros. os embriões parecem normais (Figura 7. Na parte caudal. Marin e Puelles. quando transplantaram partículas contendo FGF8 para o diencéfalo ou o rombencéfalo. A maioria dos mutantes Lim1 morrem antes do nascimento. Uma das regiões críticas para o desenvolvimento do cérebro médio é a borda entre o metencéfalo/mesencéfalo que normalmente dará origem aos tecidos do istmo. pois tecidos em ambos os lados do enxerto são induzidos (Figura 7. Eles também são considerados como limitantes de respostas a certos estímulos externos. Essa região indutora mes/met parece ser controlada pelo fator de crescimento de fibroblasto 8 (FGF8).

Wnt1 e Engrailed são considerados importantes na formação do cerebelo. (B) Rotação da junção mes/met causa “triplicação” de certas estruturas. ot. P2. griseum tectale. istmo.19 (A) Mesencéfalo Diencéfalo Mes/Met limite Cérebro médio e cerebelo Tectum A região da junção mesencéfalo/metencéfalo (“mes/met”) pode agir como um indutor do desenvolvimento do cérebro médio e da expressão “engrailed” quando rodada ou transplantada a outras regiões do cérebro. ist. Wnt1 parece manter a expressão do gene Engrailed nas células precursoras cerebelares. terceiro nervo cranial ou oculomotor. (A) O transplante da junção mes/met induz a expressão do gene engrailed e das estruturas do cérebro médio e cerebelo em posições ectópicas. cerebelo. 1994. Engrailed-2 e o próprio Fgf8. quarto nervo cranial ou troclear. TS. como o tectum óptico. [ecto3..) Região expressando En Telencéfalo En (Engrailed) Wnt1 Fgf8 (Fator de crescimento do fibroblasto) Cérebro posterior (B) Diencéfalo Mesencéfalo ist/cb istmo/ cerebelo Rombencéfalo Metencéfalo Cérebro médio Rombencéfalo Cerebelo Peça invertida Indução da estrutura mesencefálica Duplicação e polarização relativa ao tecido cerebelar En mais próximo Mesencéfalo Diencéfalo Diencéfalo Mesencéfalo Eixo longo Rombencéfalo Rombencéfalo .html] Figura 7. 1996). 1990. camundongos deficientes em Wnt1 não possuem a região do cérebro médio e nem o cerebelo (McMahon e Bradley. A polaridade postulada é representada por flechas. cb. segmento talâmico dorsal. Esses três genes são normalmente expressos na região do istmo. 1990). torus semicircularis: P1. 1994. III. IV. Abreviações: gt. segmento pre-tectal. (B de acordo com Rubenstein e Puelles. permitindo a sua proliferação (Dickinson et al. Mesmo que o cerebelo não expresse genes Wnt1.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 269 com FGF8 também induziram a expressão de três genes nos tecidos circundantes Wnt1. Danielian e McMahon. Thomas e Cappecchi. tectum óptico.

1991). formado por uma única camada de células. agora. adjacente ao lúmen. da borda luminal até a borda externa. isso significa que os neurônios tiveram que migrar para sua posição cortical a partir do neuroepitélio embrionário. 1964). Isso acontece quando a célula se divide “verticalmente” em lugar de “horizontalmente”. se diferenciar na periferia do tubo neural (Fujita.20 Seção esquemática do tubo neural de um embrião de galinha. (A de acordo com Sauer. e o núcleo migra luminalmente enquanto a mitose continua (Figura 7. Figura 7. Jacobson. Tosney. Diferentes neurônios e células gliais têm seus aniversários em tempos diferentes. enquanto a outra célula filha se afasta (Chenn McConnell. A síntese de DNA (fase S) ocorre quando o núcleo está na borda externa do tubo. A diferenciação que se segue depende da posição que esses neurônios ocupam uma vez fora da região de células em divisão (Letourneau. 1968). Sauer (1935) e outros mostraram que essas células estão presentes na parede do tubo neural continuamente. Durante o desenvolvimento precoce de mamíferos. mostrando a posição do núcleo de uma célula neuroepitelial como função do ciclo celular. Células mitóticas são encontradas próximo ao centro do tubo neural. mostrando células em diferentes estágios do ciclo celular. 1995). cortesia de K. Jacbson. indicando que não estão mais participando da síntese de DNA e da mitose. Essa divisão é a ultima do neurônio e é chamada de “aniversário” do neurônio. Nesses casos. (B) Micrografia eletrônica de varredura de um tubo neural de galinha. mas como seus núcleos estão em diferentes alturas. B. recém-formado. certas células não mais incorporam esses precursores de DNA. cada uma tendo diferentes funções e conexões.20). Se células em divisão são marcadas com timidina radioativa em um único estágio de seu desenvolvimento e seus descendentes são identificados no córtex externo do cérebro adulto. Células com aniversários mais tardios. Marcação em diferentes pontos do desenvolvimento mostra que células com aniversários mais precoces migram distâncias mais curtas. a célula adjacente ao lúmen fica ligada à superfície ventricular. 100% das células do tubo neural incorporam timidina radioativa ao DNA (Fujita. 1935. 1977. Essa população de células divide-se rapidamente. migram através dessas camadas para formar as regiões superficiais do córtex. A mitose ocorre no lado luminal da camada celular. tem-se a impressão que a parede do tubo neural é composta por diversas camadas de células. Essas células neurônicas e da glia podem. Logo em seguida.) (A) Estágio do ciclo celular (B) Lúmen do tubo neural .270 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Tecido Arquitetura de Tecido no Sistema Nervoso Central Os neurônios do córtex cerebral estão organizados em camadas. O tubo neural original é composto de um neuroepitélio embrionário. 1966.

Seção de um tubo neural humano de 5 semanas. Na medula espinhal e no bulbo (linha superior). A porção dorsal recebe estímulos dos Figura 7. Células gliais cobrem muitos desses axônios da zona marginal com bainhas de mielina. contendo os corpos celulares. o epêndima é a única fonte de neurônios e células gliais. axonal. Essa nova camada é chamada zona do manto (ou intermediária) e o epitélio embrionário é agora chamado de zona ventricular (e. manto e marginal. é freqüentemente referida como massa cinzenta.21). a do manto e a marginal é mantido durante todo o desenvolvimento. a camada granular externa. No cerebelo (linha do meio) uma segunda camada mitótica. um sulco longitudinal -sulcus limitans. Assim. ambas são envolvidas por tecido conjuntivo. À medida que o tubo neural amadurece. a zona do manto. se forma na região mais remota do epêndima. Neuroblastos dessa camada migram de volta para a zona intermediária para formar as células do grânulo.aparece para dividi-lo em duas partes.21 Diferenciação das paredes do tubo neural. Essa camada se torna progressivamente mais espessa à medida que mais células do neuroepitélio embrionário são adicionadas. 1991. dorsal e ventral. contendo 3 zonas: ependimária.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 271 Placa cortical (CP) Zona intermediária (I) Medula espinhal Camada ependimária (E) Zona ventricular germinal (V) Camada granular externa (EG) Lâmina dissecans (L) Zona marginal (M) Camada granular (GL) Zona subventricular (S) Camada das células de Purkinje (P) “Camada molecular” de axônios das células granulares Cerebelo Tubo neural Camada molecular Neocórtex Córtex cerebral Massa branca Enquanto as células adjacentes ao lúmen continuam a se dividirem. dando-lhes uma aparência esbranquiçada. A massa cinzenta (manto) gradualmente adquire uma estrutura com forma de borboleta rodeada pela massa branca. os neuroblastos ou glioblastos em migração formam uma placa cortical contendo seis camadas. as células migratórias formam uma segunda camada ao redor do tubo neural original. criando portanto uma zona marginal pobre em células. Os neurônios fazem conexões entre si e emitem axônios se afastando do lúmen. e a camada marginal.) . epêndima) (Figura 7. (De acordo com Jacobson. mais tarde. No córtex cerebral (linha inferior). As células da zona do manto se diferenciam em neurônios e células gliais. como massa branca. tanto na medula espinhal como no bulbo. O esquema básico de três camadas: a ependimária.

B). separadas pelo sulcus limitans. Organização do cerebelo No encéfalo. (E) Um segmento da medula espinhal com suas raízes sensoriais (alar) e motoras (basal). Na parte interna da camada estão os neuroblastos pós-mitóticos que são os precursores dos neurônios mais importantes do córtex do cerebelo.22 Neurônio de associação Raiz dorsal Desenvolvimento da medula espinhal humana. Uma célula de Purkinje típica pode formar até 100. Para . camada embrionária externa. neuroblastos. que se espalha como um leque sobre o corpo celular em forma de bulbo. os neuroblastos proliferam. enquanto a porção ventral está envolvida na realização de várias funções motoras (Figura 7. que são os únicos neurônios que liberam impulsos para fora do córtex cerebelar. próxima ao limite externo do tubo neural. 1993. Cada um deles tem um enorme aparelho dendrítico. migram para a superfície externa do cerebelo em desenvolvimento. No limite externo da camada embrionária externa (na espessura de uma ou duas células). (A-D) O tubo neural é funcionalmente dividido nas regiões dorsal (alar. Todos os impulsos regularão a atividade da células de Purkinje. Essas células neuronais pré-granulares migram de volta para a massa branca do cerebelo em desenvolvimento para produzir células neurônicas granulares em uma região chamada camada granular interna. Cada neurônio de Purkinje também emite um axônio delgado que se comunica com outras células nos núcleos cerebelares profundos. Enquanto os condroblastos da região esclerótoma do somito formam as vértebras espinhais. do manto e marginal. servindo como uma estação de retransmissão entre as camadas externas do cerebelo e outras partes do encéfalo.22). Além disso. em divisão. incluindo os notáveis e grandes neurônios de Purkinje. as células granulares.000 sinapses com outros neurônios. o crescimento diferencial e a morte celular seletiva produzem modificações no modelo de três camadas. e o teto e o assoalho se tornam distintos. Alguns neurônios penetram a massa branca para diferenciarem-se em aglomerados de neurônios chamados núcleos.) Camada marginal Camada do manto Camada ependimária (ventricular) neurônios sensoriais. as células neurônicas precursoras. mais do que qualquer outro neurônio estudado. Cada núcleo desempenha o papel de uma unidade funcional. Enquanto isso. a camada ependimária original do cerebelo origina uma grande variedade de neurônios e células gliais. O desenvolvimento de uma organização espacial é crítico para o funcionamento correto do cerebelo. A) e ventral (basal.272 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Epiderme Região presuntiva basal Região presuntiva alar Sulcus limitans (E) Gânglio da raiz dorsal Nervo espinhal Neurônio sensorial Neurônio somático motor Figura 7. o tubo neural se diferencia nas zonas ependimária. (De acordo com Larsen. a migração celular. especialmente no cerebelo e no cérebro. formando uma nova zona embrionária.

Muitos dos mutantes cerebelares foram encontrados porque o fenótipo de tais mutantes . 1988. a célula nervosa não adere ao prolongamento da glia (Edmondson et al.23 Migração neurônica em prolongamentos gliais. 1975. fornecer conhecimentos novos sobre os mecanismos de ordenação espacial. A análise de mutações neurológicas no camundongo poderá. (C) Fotografias seqüenciais de um neurônio migrando em um prolongamento de glia cerebelar. Através do córtex.html] Figura 7. staggerer e waltzer. Hatten.pode ser facilmente reconhecido. em breve. cortesia de M. 1975). Fishell e Hatten. [ecto4. a mais importante sendo uma proteína de adesão chamada astrotactina. 1990.) (B) (A) Processo condutor do neurônio (C) Neurônio em migração Processo da célula glial . Se a astrotactina na célula nervosa é mascarada pelo seu respectivo anticorpo.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 273 que isso aconteça. (A de acordo com Rakic. envolvendo reconhecimento recíproco entre a glia e o neuroblasto (Hatten. os precursores das células granulares caminham nos longos prolongamentos da glia de Bergmann (Figura 7. A interação neuroglial consiste em uma complexa e fascinante série de eventos. 1990.. reeler. Como isso acontece? Um mecanismo considerado importante para posicionar neurônios jovens dentro de encéfalo de mamíferos em desenvolvimento é o direcionamento glial (Rakic. 1972. 1992). B de Gregory et al. (A) Diagrama com um neurônio cortical migrando em um prolongamento da célula glial. Komuro e Rakic. Rakic e Sidman. Por razões óbvias essas mutações são identificadas na língua inglesa com nomes como weaver. [ecto5. 1990).principalmente a inabilidade de manter o equilíbrio ao andar . Mais de 30 mutações conhecidas afetam o arranjo de neurônios cerebelares.. Hatten. 1991). O neurônio mantém sua adesão à célula da glia através de várias proteínas. No cerebelo.html]. A extremidade anterior do neurônio apresenta várias extensões filopódicas. 1973. C de Hatten. Ela atinge velocidades de 60 µm/hora em sua migração nos prolongamentos gliais.23. (B) Micrografia eletrônica da região onde a soma do neurônio adere ao prolongamento glial. Rakic. as células adequadas devem se diferenciar no tempo e local adequados. os neurônios parecem caminhar no “monotrilho da glia” para seu respectivo destino. 1988.

a maioria dos neurônios recém. 1974. Por exemplo. Rakic.24. Certos neuroblastos da zona do manto migram na glia através da massa branca para dar origem a uma segunda zona de neurônios.timidina Camadas corticais Massa branca Camada ventricular Dias de gestação Nascimento . A figura representa a posição desses neurônios indicados no córtex visual. verificou-se que as células mais fortemente marcadas eram aquelas que estavam na fase S do seu último ciclo de divisão. 1974). para fora da zona ventricular (ependimária) e formam a placa cortical abaixo da pia-mater do cérebro. a organização vertical é feita em camadas que interagem entre si (veja Figura 7. Segundo. Após o nascimento dos animais. neurônios da camada 4 recebem seu principal estímulo do tálamo (a região que se forma do diencéfalo). Os neurônios mais jovens estão na periferia do tubo neural (De acordo com Rakic. que é organizado de duas maneiras distintas. os seus tipos de neurônios e os conjuntos de conexões que produzem.) Injeções de [3H] . Uma única célula germinativa pode produzir neurônios (e células gliais) Figura 7. Na verdade. neurônios da camada cortical 6 do córtex visual projetam axônios para o núcleo lateral geniculado do tálamo. horizontalmente o córtex cerebral está organizado em mais de 40 regiões que regulam. ao longo dos prolongamentos da glia. Essa nova zona de manto é chamada córtex do neopáleo.274 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Organização cerebral A disposição em três zonas é também modificada no cérebro. Os neurônios subseqüentes caminham distâncias maiores para formar as camadas mais superficiais do córtex.21). de maneira análoga ao cerebelo. existe um grande número de movimentos celulares que misturam a descendência de várias células precursoras. enquanto os neurônios na camada 6 enviam sua maior produção de volta para o tálamo. os neurônios com os “aniversários” mais cedo formam a camada mais próxima do ventrículo. enquanto neurônios da camada 6 do córtex auditivo (localizado mais anteriormente que o córtex visual) projetam axônios ao núcleo médio geniculado do tálamo. Isso forma um gradiente de desenvolvimento “ao avesso” (ou “invertido”) (Figura 7. Cada camada do córtex cerebral é diferente da outra em relação às suas propriedades funcionais. Primeiro. Por exemplo. Os “aniversários” dos neurônios corticais foram determinados injetando [3H]-timidina endovenosamente nos animais em determinados tempos de gestação.24 “Gradiente invertido” na formação do córtex cerebral no macaco rhesus. Após sua mitose final. Essas células migraram para várias regiões e foram detectadas por autoradiografia de cortes microscópicos. O tempo de gestação no macaco rhesus é de 165 dias. anatomica e funcionalmente.gerados migram radialmente. Assim como no córtex cerebelar. Esse córtex se estratifica em seis camadas de corpos celulares e a forma adulta desses neurônios do neopáleo só se completa na metade da infância. processos distintos. Nem a organização vertical e nem a horizontal são especificamente clonadas.

para qual camada a célula migrará) é feita durante a divisão celular final. mas as células corticais progenitoras tardias dão origem somente a neurônios da camada superior (camada 2) (Frantz e McConnell. Enquanto mais ou menos 80% dos jovens neurônios migraram radialmente em processos gliais. (De acordo com McConnell e Kaznowski. Destino independente da célula quando transplantada após última fase S. 1996). Mas. após sua última fase S mitótica. se as células são transplantadas antes de sua divisão final (na metade da fase S). da zona ventricular para a placa cortical. os neurônios que eles formam migram para a camada 6. 1988).CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 275 (A) [3H]-timidina no dia embrionário 29 (C) (D) Migração neural do hospedeiro Migração neural do hospedeiro Camadas corticais Porcentagem de neurônios marcados com [3H]-timidina Camada intermediária Massa branca Camadas corticais [3H]-timidina no dia pós-natal 1 Camada ventricular Célula glial Destino condicionado ao hospedeiro quando transplantado na fase S. como é que a célula reconhece a camada na qual deve entrar? McConnell e Kaznowski (1991) mostraram que a determinação da identidade laminar (isto é. O’Rourke e seus colegas (1992) marcaram neurônios jovens com corante fluorescente e seguiram sua migração através do cérebro.) em qualquer das camadas corticais (Walsh e Cepko. Células transplantadas de cérebros jovens (onde elas formariam a camada 6) para cérebros mais velhos. Eles descobriram que os descendentes neurais de . Os destinos de células progenitoras mais velhas são mais determinados. aproximadamente 12% deles migraram lateralmente de uma região funcional do córtex para outra. Essas observações estão de acordo com aquelas de Walsh e Cepko (1992). Figura 7.25 Massa branca Camadas corticais Determinação de identidade laminar em cérebro de doninha. Nem todos os neurônios migram radialmente. (C) Quando os precursores precoces (vermelho) são transplantados em zonas ventriculares mais velhas. por exemplo). cujos neurônios migratórios estão formando a camada 2 após sua última divisão. mantêm seu destino e migram somente para a camada 6. Entretanto. As células cerebrais corticais progenitoras precoces têm o potencial para transformarem-se em qualquer neurônio (nas camada 2 ou 6. que infectaram células ventriculares com um retrovírus e conseguiram corar essas células e seus descendentes após o nascimento. (A) Precursores neuronais “precoces” (aniversários no dia embrionário 29) migram para a camada 6. (D) Se esses precursores são transplantados antes ou durante sua última fase S. elas não têm destino fixo e podem migrar para a camada 2 (Figura 7.25). seus neurônios migram (com os neurônios do hospedeiro) para a camada 2. Ainda não conhecemos a natureza da informação transmitida à célula ao ser fixado o seu destino. (B) Precursores neuronais “tardios” (aniversários no dia pós-natal 1) migram mais adiante para as camadas 2 e 3.1991.

raciocínio e memória. a gestação humana deveria durar 21 meses em lugar de 9. Considera-se que chegando a seu destino final..276 PARTE II Padrões de Desenvolvimento uma única célula ventricular estavam dispersos através das regiões funcionais do córtex. As delgadas extensões das células. essas células adquiriram a morfologia do estriado (Fishell. não pode se mover em resposta a um pensamento.26). Morowitz e Trefil (1992) sugeriram provocativamente que tendo a sociedade. o córtex cerebral humano não tem conexões neurônicas na 12a semana de gestação (e. 1995). a respeito do primeiro ano de vida do ser humano. característica de células neurais (o padrão do eletroencefalograma.000 outros neurônios. comparada com outros primatas. mas uma das coisas maravilhosas. 1975). Muito poucos dendritos são encontrados em neurônios corticais no nascimento. 1987). Portmann (1941. em pelo menos alguns casos. Essas células podem dar origem a precursores de neurônios e células gliais. Montagu (1962) e Gould (1977) sugeriram que durante o primeiro ano de vida. neurônios e células gliais (Turner e Cepko. O neurônio cortical. O cérebro humano continua a se desenvolver na velocidade do desenvolvimento fetal. em média. se conecta com 10. mesmo após o nascimento (Holt et al. usadas para captar impulsos elétricos são chamadas dendritos (Figura 7. somos essencialmente fetos extra-uterinos. 1982) e que. aceito que a definição de morte é a perda do padrão de EEG. Baseado em critérios morfológicos e de comportamento.000 conexões com outros neurônios. Aquelas células que permanecem como componentes integrais do revestimento do tubo neural se transformam em células ependimárias. e a desenvolver a capacidade de expressão simbólica. Existe uma grande variedade de tipos de neurônios e células gliais (como fica evidente pela comparação entre uma célula granular relativamente pequena e o enorme neurônio de Purkinje). O cérebro é bastante plástico e o desenvolvimento do córtex neopáleo humano é particularmente notável a esse respeito. Durante esse ano. e eles especulam que a inteligência humana vem da estimulação do sistema nervoso que está se formando durante aquele primeiro ano. 1945) sugeriu que. amplamente divulgado. ou soma. Quando neurônios do córtex do cérebro anterior foram transplantados para a região que formaria o corpo estriado. Portanto. é o aumento do número dessas regiões receptivas nos neurônios corticais. Esse padrão de conexões neurais (sinapses) permite ao córtex humano funcionar como o centro para o aprendizado. assim a espécie humana dá à luz após 9 meses. por exemplo. Alguns neurônios desenvolvem somente alguns dendritos. nenhuma mulher poderia dar à luz um feto de 21 meses. precisam transmitir suas mensagens por um longo caminho até a * Ao contrário do que afirma um filme antiaborto. os axônios podem se alongar por vários centímetros. Considera-se que a diferenciação dessas células precursoras é principalmente determinada pelo ambiente no qual elas entram (Rakic e Goldman.* Tipos de neurônios O cérebro humano consiste de mais de 1011 células nervosas (neurônios) associadas com mais de 1012 células gliais. ou EEG) é verificada inicialmente aos 7 meses de gestação. nem mostrar consciência ou medo). Os receptores da dor no dedo grande (hálux) do pé. enquanto outras células (como os neurônios de Purkinje) desenvolvem extensas áreas para interações celulares. Outra característica importante de um neurônio em desenvolvimento é seu axônio (às vezes chamado um neurito). talvez ela devesse aceitar a aquisição do padrão de EEG como o começo da vida humana. as células produzem moléculas adesivas específicas que as organizam e as agrupam como núcleos cerebrais (Matsunami e Takeichi. . 1995). Enquanto os dendritos são freqüentemente numerosos e não se extendem muito além do corpo da célula nervosa. a especificação de funções determinadas pelas áreas corticais ocorre após a neurogênese. bem como a produção de respostas a estímulos interpretados. cada neurônio cortical desenvolve um número suficiente de dendritos (ou superfície dendrítica) para acomodar até 100. Entretanto. uma determinada célula precursora pode formar ambos. A atividade elétrica mensurável. portanto. pois sua cabeça não passaria pelo canal do parto. nos Estados Unidos.

(De acordo com Bloom e Fawcett. em forma de cadeia. Impulsos recebidos pelos dendritos e o neurônio estimulado podem transmitir impulsos elétricos através do axônio (que podem ter 60 a 90 cm de comprimento) para o tecido alvo.26 RECEPTOR Diagrama de um neurônio motor. o suporte estrutural é . Em 1907. A bainha de mielina que promove o isolamento do axônio é formada pelas células de Schwann adjacentes. O que Harrison viu foi a emergência de axônios como projeções dos neuroblastos.27). Na virada do século vinte. Esse cone não progride em linha reta. Esse prolongamento do nervo é liderado pela ponta do axônio. chamada de cone de crescimento (Figura 7.. Forscher e Smith. Harrison isolou uma porção de um tubo neural de um girino de rã de 3mm. 1971. de modo a poder observar o que se passava nessa “gota pendente”. as microespículas de actina são destruídas. 1988). nesse estágio. mas vai “abrindo caminho” ao longo do substrato. 1975. Ele colocou esses neuroblastos em uma gota de linfa de rã sobre uma lamínula e a inverteu sobre outra lâmina com depressão. Wilhelm His (1886) e Santiago Ramón y Cajal (1890) postularam que o axônio era.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 277 Dendritos Figura 7. para formar um axônio. O cone de crescimento se move por elongação e contração de filopódios afilados. alongando a 56 µm/hora. o descobridor do nódulo embrionário. orientados paralelamente ao eixo longo do axônio (essa é uma situação similar àquela dos microfilamentos filopódicos das células mesenquimatosas secundárias em equinodermos). Hensen. na verdade. Dentro do próprio axônio. Um dos conceitos fundamentais da neurobiologia é que o axônio é uma extensão contínua do corpo da célula nervosa.) Cone do axônio Segmento inicial do axônio Chegada de impulsos via axônios de outros neurônios CONDUTOR Nó de Ranvier Impulso nervoso Célula de Schwann Bainha de mielina EFETOR Músculo esquelético medula espinhal. inibindo seu avanço ulterior (Yamada et al. acreditava que numerosas células neurais se ligavam umas às outras. chamados microespículas. Essas microespículas contêm microfilamentos. várias teorias competiam para explicar a formação de axônios. logo após o fechamento do tubo neural. admitia que o axônio se formava ao redor de fibras citoplasmáticas pré-existentes entre as células. uma projeção (apesar de extremamente grande) do corpo celular (soma). Schwann. não há uma diferenciação visível dos axônios. Tratando os neurônios com citocalasina B. Ross Harrison demonstrou a validade da teoria da projeção com um elegante experimento que foi a pedra fundamental tanto da ciência do desenvolvimento neurobiológico como da técnica de cultura de tecidos. um dos fundadores da teoria celular.

Essa membrana especializada é chamada bainha de mielina. Todas fotografias. (B) microscopia de contraste da interface diferencial e (C) microscopia de fluorescência com anticorpos fluorescentes à actina. alongamento por microtúbulos e modificações da forma apical pelos microfilamentos.. uma célula glia chamada célula de Schwann realiza essa mielinização..27 Microespículas de actina em cones de crescimento de axônios como vistos por (A) microscopia eletrônica de transmissão. debilitantes ou mortais. (No sistema nervoso periférico. No mutante trembler do camundongo. Além da função estrutural na migração de axônios. produz. os filopódios exploratórios do axônio aderem ao substrato e exercem uma força que puxa o resto da célula para frente. Como na maioria das células migratórias. paralisia e vários outros problemas de saúde. (A de Letourneau. cada filopódio faz a amostragem dos microambientes e manda sinais de volta para o corpo da célula (Davenport et al. cortesia dos autores. fazendo com que a mielinização do sistema nervoso periférico seja deficiente. Os axônios não crescerão se o cone de crescimento não conseguir avançar (Lamoureux et al. o neurônio em desenvolvimento retém as mesmas cartacterísticas que foram observadas nas regiões de articulação dorsolateral do tubo neural. B e C de Forscher e Smith. 1989). o sistema nervoso central é deficiente em mielina. as células de Schwann não conseguem produzir um determinado componente protéico da bainha de mielina. 1988). Henry e Sidman. 1964. os filopódios têm também uma função sensorial. Como veremos no Capítulo 8.28). enquanto o periférico não é afetado (Sidman et al. de onde são focalizados nos axônios.1979.) fornecido por microtúbulos. no sistema nervoso central é isolado em intervalos por processos que se originam de um tipo de célula glial chamada oligodendrócito. o axônio. Ao contrário. a saber. Explorando o ambiente à frente do cone de crescimento. jimpy. Usualmente esses impulsos vão dos dendritos à soma do nervo. Assim. então. os filopódios são as organelas fundamentais envolvidas na determinação do caminho do neurônio. 1993).278 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Microespículas (A) Cone de crescimento (B) (C) Figura 7. mas normal no sistema nervoso central. uma membrana especializada que é rica em proteína básica mielina e se espirala ao redor do axônio central (Figura 7.. Neurônios transmitem impulsos elétricos de uma região a outra.) A bainha de mielina é essencial para uma adequada função neural. Para impedir a dispersão do sinal elétrico e facilitar a sua condução. O axônio também precisa ser especializado na secreção de neurotransmissores específicos nos pequenos espaços (fendas sinápticas) que separam o axônio da superfície da célula alvo (soma. 1988. e o axônio se retrairá se for colocado em uma solução de colchicina. Um oligodendrócito se enrola ao redor do axônio em desenvolvimento. dendritos. e a desmielinização das fibras nervosas está associada à convulsões. ou o axônio de um neurônio receptor ou um . em outro mutante de camundongo.

o desenvolvimento neurônico envolve diferenciação tanto estrutural como molecular. ácido γ−aminobutírico. 1989). A ativação dessa habilidade * As induções que permitem a formação do olho serão detalhadas no Capítulo 17. Os placódios auditivos. prospectivo ectoderma da cabeça. Portanto. mais que qualquer outro do corpo.CAPÍTULO 7 Neurulação e o Ectoderma 279 Figura 7. (Fotografia cortesia de C. Nessa parte. Dinâmica do desenvolvimento ótico A história do desenvolvimento ótico começa na gastrulação. dopamina. Essa interação induz o ectoderma da cabeça à formação de lentes (cristalino) (Saha et al. no sistema nervoso central. Os placódios mais anteriores são os dois placódios olfativos que formam os gânglios dos nervos olfativos. quando o endoderma involutivo e o mesoderma interagem com o adjacente.. (A) No sistema nervoso periférico. Alguns neurônios são capazes de sintetizar e secretar acetilcolina. Os principais órgãos do sentido da cabeça se desenvolvem a partir das interações do tubo neural com uma série de espessamentos epidérmicos chamados de placódios ectodérmicos cranianos. da mesma maneira. . responsáveis pelo sentido do olfato. S.28 Célula oligodendroglial Axônio MIELINIZAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Mielinação nos sistemas nervosos central e periférico. focalizaremos o olho porque esse órgão. cujos neurônios formam o gânglio acústico que nos permite ouvir. se invaginam para formar o labirinto do ouvido interno. norepinefrina. Cada neurônio precisa ativar aqueles genes responsáveis pela produção de enzimas capazes de sintetizar seus neurotransmissores. e o cristalino deve ter uma relação precisa com a retina. octopamina. Raine. nem todas as partes do ectoderma da cabeça formam os cristalinos. a mielinaçào é realizada por prolongamentos de oligodendrócitos. (B) O mecanismo desse enrolamento leva à produção de um enorme complexo de membrana. *Mas. (C) Micrografia de um axônio envolvido pela membrana de mielina de uma célula de Schwann. as células de Schwann se enrolam ao redor do axônio. enquanto outros desenvolvem vias enzimáticas para sintetizar e secretar epinefrina. precisa se desenvolver com uma coordenação exata. Desenvolvimento do olho em vertebrados O indivíduo conhece seu ambiente pelos seus órgãos sensoriais. serotonina. ou algum outro neurotransmissor.) Nó de Ranvier Axônio MIELINIZAÇÃO NO SISTEMA NERVOSO PERIFËRICO Célula de Schwann (A) (B) Célula de Schwann Axônio (C) sítio receptor em um órgão periférico).

as vesículas ópticas não fazem contato com a superfície e a formação do olho cessa (Webster et al. micrografias A-C de Hilfer e Yang. Os axônios das células ganglionares da retina neural se encontram na base do olho e se dirigem para baixo. (A) A vesícula óptica evagina do cérebro e contata o ectoderma sobreposto.29). o placódio do cristalino causa. D. cortesia de K. R. As células da camada externa produzem pigmentos e finalmente se transformam na retina pigmentada (um dos poucos tecidos. tornando-se alongada e estreita. Coletivamente.5-mm (C) Embrião de 5-mm (D) Embrião de 7-mm Figura 7. que podem sintetizar sua própria melanina). (B. À medida que a invaginação continua. modificações na vesícula óptica que sofre uma invaginação formando um cálice óptico de parede dupla (veja Figura 7. Por exemplo. As células da camada interna proliferam rapidamente e dão origem a uma variedade de glia. interneurônios e neurônios fotorreceptores sensíveis à luz. Essas camadas incluem as células fotorreceptoras sensíveis à luz e à cor (bastonetes e cones). neurônios ganglionários. No homem. de maneira recíproca.280 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Ectoderma da cabeça Vesícula óptica primária Parede do cérebro anterior Camada pigmentada Camada neural Cristalino Vesícula do cristalino Vesícula óptica Placódio do cristalino (A) Embrião de 4-mm (B) Embrião de 4. quando essas vesículas atingem o ectoderma da cabeça. enquanto o cristalino é internalizado. Diferenciação da retina neural Como os córtices cerebral e cerebelar. Hilfer. Tosney. a retina neural se desenvolve em uma sucessão de camadas com diferentes tipos de neurônios (Figura 7. no mutante de camundongo. os corpos celulares das células ganglionárias e os interneurônios bipolares que transmitem o . eyeless. as vesículas ópticas têm início como duas protuberâncias nas paredes laterais do diencéfalo em embriões de 22 dias (Figura 7. 1984). O pedúnculo é então chamado nervo óptico. além das células da crista neural. 1964. A necessidade de um contato íntimo entre as vesículas ópticas e o ectoderma superficial é comprovada experimentalmente e em certos mutantes. essa se espessa formando o placódio do cristalino. essas constituem a retina neural..29C). Ao mesmo tempo. (Ilustrações superiores de acordo com Mann. (D) A vesícula do cristalino induz o ectoderma sobreposto a se tornar córnea.) latente na formação do cristalino e o posicionamento do cristalino em relação à retina é realizado pela vesícula óptica. Uma vez formado. a conexão entre o cálice óptico e o cérebro é reduzida. Subseqüentemente. pelo pedúnculo óptico. cortesia de S.30).29 Desenvolvimento do olho de vertebrado. as duas camadas do cálice óptico começam a se diferenciar em direções diferentes.C) O ectoderma sobreposto diferencia-se em células do cristalino enquanto as vesículas ópticas se dobram sobre si mesmas e os placódios do cristalino se tornam vesículas do cristalino. 1980. Essas protuberâncias continuam a crescer lateralmente ao tubo neural e estão ligadas ao diencéfalo por pedúnculos ópticos. (C) A vesícula óptica se torna a retina neural e pigmentada.

1987.) .31 Cristalino 4-6 semanas Remova a retina. existem numerosas células gliais de Müller que mantêm a integridade da retina. Grunwald. (de Turner e Cepko. (A. fixe e core e analise os clones Retina Epitélio pigmentado Determinação da linhagem de uma célula precursora na retina do rato. o olho é removido e a retina é corada para β-galactosidase. (A e B segundo Mann. bem como neurônios amácrinos (sem grandes axônios) e neurônios horizontais que transmitem impulsos elétricos no plano da retina. a divisão celular de uma camada embrionária e a migração e morte diferencial das células resultantes formam o padrão laminar. A coloração pode ser vista em cinco bastonetes. 1964. estriado. A formação desse tecido altamente estruturado é um dos problemas mais intensamente estudado em neurobiologia do desenvolvimento. Somente os descendentes das células infectadas deveriam ser coradas de azul. Um mês após a infecção dos ratos. da retina neural. (C) As três camadas de neurônios na retina adulta