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Protocolo de Extração de DNA de folhas

Protocolo de Extração de DNA de folhas

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Protocolo de Extração de DNA de folhas de feijoeiro (Miniprep) (Modificado de Doyle & Doyle, BRL Focus 12:13-15, 1990) 1) Pesar 200 a 300

mg de folha congelada e macerar em nitrogênio líquido, utilizando almofariz de porcelana previamente congelado, até o tecido virar pó. Transferir o pó para microtubos eppendorf (1,5ml) congelados, devidamente marcados. Procurar fazer este passo o mais rápido possível para evitar oxidação. OBS. Resfriar o tubo e a espátula em N2 líquido. 2) Adicionar 650-800µ l de tampão de extração previamente aquecido a 65oC e incubar os tubos em banho-maria a 65oC por 30-40 min. Durante a incubação, agitar suavemente os tubos a cada 10 min. 3) Retirar os tubos do banho-maria e deixar esfriar à temperatura ambiente. Centrifugar por aprox. 5 min a 14000 rpm (microcentrífuga Eppendorf) e transferir o sobrenadante para novos tubos, também marcados. 4) Adicionar ao sobrenadante 650-800µ l de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1), agitar o tubo por suaves inversões por aprox. 10 min até ficar turvo. Centrifugar como no passo 3. 5) Transferir a fase superior (aquosa) para novo tubo devidamente identificado, tendo cuidado de não transferir a interfase e a fase inferior. Utilizar, para isso, micropipeta de 200 ou de 1000µ l, com ponteiras cortadas para facililtar a operação.
6) Adicionar 650-800µ l de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) ao sobrenadante. Agitar os tubos e centrifugar como no passo 3.

7)Transferir a fase superior (aquosa) para um novo tubo e adicionar 2/3 do volume de isopropanol gelado. Inverter suavemente os tubos algumas vezes e incubá-los a -20oC por 2-3 horas ou 4oC durante a noite. 8) Centrifugar por 10 min a 14000 rpm. Um precipitado branco* deverá se formar no fundo do tubo. Remover o sobrenadante. Lavar este precipitado 1-2 vezes com etanol 70% para retirar o sal presente, e uma vez com etanol 95%. Secar o precipitado à temperatura ambiente por 15-20 minutos.
* - Obs. Ocasionalmente o pellet obtido se apresenta muito grande, viscoso e/ou escuro, o que é sinal de excesso de contaminantes. Para se obter um DNA mais limpo, pode se usar uma lavagem adicional com sal que freqüentemente auxilia na remoção de proteínas e polissacarídeos agregados. Para isso, adicione ao pellet 500µ l de uma solução 1M NaCl. Dissolva o pellet ao máximo, mesmo que para isso sejanecesário aquecer o tubo em banhomaria a 60-65oC por alguns minutos. A este ponto, o DNA estará necessariamente em solução e o que não entrar em solução consiste basicamente de contaminantes indesejáveis. Incube o tubo a 4oC por 30 a 60 minutos. Em seguida centrifugue o tubo a velocidade máxima (12 a 15000 rpm) por 10 minutos, se possível a 4oC. Neste ponto o DNA estará em solução e o material que precipitar será contaminante indesejável. Retire o sobrenadante para um novo tubo e promova a precipitação do DNA adicionando 2/3 do volume (~ 350µ l) de isopropanol e faça duas lavagens subsequentes com etanol 70%. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em

1996.ed. 10) Incubar em banho-maria a 37oC por 30 min.1% - P/ 15ml 3ml 4. 1mM EDTA.4M 20mM 100mM 1% 0. CENARGEN. Adicionar 2/3 do volume de isopropanol gelado para precipitar o DNA novamente. 2.0M PVP* sólido β -Mercaptoetanol H2O *PVP – polivinilpirrolidona . Tampão de extração: Estoque Conc. (Documento.5M Tris-HCl (pH8) 1. pH 8.15g 15µ l Completar o volume p/ 15ml CTAB 5% NaCl 5M EDTA 0.8% de agarose) e aplicar 10µ l de solução de DNA (+ 3µ l de corante tipo IV) para verificar sua qualidade.0) contendo RNAse na concentração final de 40µ g/ml.2ml 0. 13) Repetir o item 8 e ressuspender o precipitado final em 200-300µ l de TE. 220p. 20) 9) Ressuspender o precipitado em 200-300µ l de TE (10mM Tris-HCl. 14) Preparar um minigel (0. Final 1% 1. Todo o DNA deve estar ressuspenso ao final deste passo. 11) Adicionar NaCl 5M na proporção de 1:10 (NaCl : DNA ressuspenso). Brasília: EMBRAPA.5ml 0.análise genética.6ml 1. 15) Quantificar o DNA em espectro fotômetro. 12) Incubar em geladeira a 4oC durante a noite ou a -20oC por 3 horas.

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