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Tecnicas histológicas

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LABORATÓRIO DE BIOLOGIA

Prof.ª Doutora Maria Luísa Valdeira

Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa

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Programa do Laboratório de Biologia
Neste Curso de Ciências Farmacêuticas na disciplina Laboratório de Biologia procuraremos ensinar os alunos a reconhecer e aplicar os conhecimentos da Biologia Celular Animal e Vegetal aprendidos nas aulas teóricas e práticas das diversas unidades programáticas, pretendendo que os estudantes interpretem os resultados duma forma crítica para assim poderem observar e ficar com um bom conhecimento das células procariotas e eucariotas animais e vegetais. Também vale a pena referir a utilidade da aplicação de princípios quantitativos da matemática e da física aos sistemas biológicos que deles necessitem. A natureza do trabalho laboratorial deve ser definida como sendo a prática da manipulação, perícia mental e estudo das diferentes metodologias para o estudo das diferentes células através da observação e da experiência de maneira que as hipóteses possam ser construídas e avaliadas sistematicamente para serem incorporadas nos princípios gerais. Assim, devem ser explicadas ao aluno uma variedade de experiências apropriadas ao seu “background” e desenvolvimento, nas áreas da ciência da Biologia Celular e Botânica Farmacêutica que lhes foram ministradas. A metodologia a usar no decorrer destas aulas será feita de acordo com os princípios enumerados a seguir: A importância do grupo de trabalho na investigação da biologia Vantagens e inconvenientes das técnicas usadas O uso de protocolo nos ensaios Organização do trabalho laboratorial Como trabalhar num laboratório de biologia Necessidade de controlos A importância de duplicados Abordagem dos métodos de apresentação dos resultados Bibliografia e relatório

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1 – MICROSCOPIA Microscópio óptico fotónico vulgar Modo de utilização. Iluminação de Köhler. Observação da diversidade celular comparando as células procariotas (bacilos e cocos) com as eucariotas (fungos, protozoários, tecidos animais e vegetais). Interpretação das imagens em microscopia fotónica Microscópio óptico invertido Observação de cultura de células animais e interpretação das imagens. Microscópio óptico de contraste de fase Modo de utilização. Observação de células animais vivas não coradas assim como, de células vegetais destacando a epiderme da página inferior de uma folha. Interpretação das imagens nesta microscopia. Coloração vital Realização de preparações de células vivas e sua observação antes e depois da coloração com diferentes corantes vitais tais como, azul de metileno, vermelho neutro e lugol entre outos. As células não coradas serão observadas no microscópio fotónico e no de contraste de fase e as coradas no microscópio fotónico vulgar. Preparações definitivas Realização de inclusões em parafina. Obtenção de cortes no micrótomo e sua colagem em lâminas. Coloração dos cortes com v´rios corantes tais como, hematoxilina - eosina e sua montagem definitiva.

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Micrometria e Cariometria Medição de células com uma ocular micrométrica utilizando primeiro um micrómetro objectivo. Cariometria: Determinação de áreas de núcleos celulares. Microscópio de fluorescência Modo de utilização. Observação de auto-fluorescência de componentes das células vegetais. Observação de núcleos, citoplasmas e RNA com coloração de laranja da acridina. Imunocitoquímica. Estudo dos componentes do citoesqueleto. Observação de microtúbulos com anticorpos anti-tubulina marcados com fluoresceína. Observação de microfilamentos com anticorpos anti-actina marcados com rodamina. Interpretação de imagens nesta microscopia. Microscópio Digital Demonstração da utilização. Observação em campo claro, contraste de fase, fluorescência, polarização, contraste interdiferencial e confocal de células animais e vegetais. Citoquímica dos diferentes componentes químicos celulares Ácidos nucleicos DNA em cortes histológicos pela reacção de Feulgen. DNA e RNA pela coloração do verde - metil - pironina. Lípidos Lípidos totais com os corantes Sudan III, tetróxido de ósmio e Sudan Black B. Lípidos não ácidos com o corante azul de nilo em células vivas e cortes histológicos.

Complexo de Golgi segundo o método de Ramon e Cajal. as células hospedeiras. Mitocôndrias segundo o método de Régaud. segundo Alfert e Geschwind modificado por Deitch. azul de alcião e ácido periódico de Schiff (PAS) em cortes celulares e esfregaços de sangue fixados. Observação e interpretação de microfotografias de células animais. Cálcio e Ferro Cálcio com a coloração de Alizaran. Ferro com a coloração azul de Turnbull.finos contrastados. Proteínas Proteínas totais com o “fast green” ácido.MICROSCOPIA ELECTRÓNICA Microscópio Electrónico de Transmissão Observação de grelhas para o respectivo microscópio com cortes ultra. vegetais e microorganismos infectando ou não. segundo Prenant. Citoquímica de organitos celulares nas células animais Lisosssomas com marcação da fosfatase ácida segundo Gömori. Observação e interpretação de microfotografias de contrastação negativa Microscópio Electrónico de Varrimento Observação e interpretação de microfotografias de réplicas celulares . segundo Deitch Proteínas histónicas com o corante “fast green” alcalino. 2 . Peroxidases pelo método da benzidina.5 Polissacáridos Corantes: Lugol.

O sistema vacuolar Os vários tipos de vacúolos e o seu conteúdo.CÉLULA VEGETAL O estudo da célula vegetal e a sua importância em Botânica Farmacêutica. O sistema plastidial Observação de diferentes tipos de plastos em microscopia óptica: cloroplastos. R. A parede celular em microscopia óptica Composição química da parede celular primária e secundária. Aplicações ao estudo de alguns fármacos de origem vegetal e seus adulterantes. Técnicas para a sua observação. Sua aplicação à caracterização de fármacos de origem vegetal. Diferentes reacções de caracterização química dos seus principais constituintes: celulose. cromoplastos. Cultura e meios de cultura e respectiva técnica Bandas Técnicas para as Bandas G. cutina e suberina. Colheita. Realização de testes histoquímicos para a caracterização de alguns grupos de compostos do metabolismo secundário armazenados nos vacúolos: compostos fenólicos e alcalóides. . lenhina. Utilização do microscópio de fluorescência para a caracterização de conteúdos vacuolares. C e NOR Observação ao microscópio e de fotografias Estudo das leucemias 3 . como auxiliar na caracterização de fármacos de origem vegetal e na detecção de adulterantes.6 TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES CROMOSSÓMICAS Cultura celular Escolha de tecido. amiloplastos e leucoplastos.

Cortes histológicos As estruturas primárias e secundárias de raíz. Observação microscópica de figuras das fases das duas divisões meióticas em anteras de vegetais. caule e folhas em exemplares de monocotiledóneas e de dicotiledóneas. Importância da sua utilização como auxiliar na identificação de fármacos de origem vegetal e seus adulterantes. Importância destes caracteres em taxonomia e na identificação de fármacos de origem vegetal. . sua classificação e coloração. Histologia e Anatomia Vegetal. 4 – CICLO CELULAR EM CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS Estudo do ciclo celular Observação microscópica de mitoses em células animais e vegetais. Utilização de monografias da Farmacopeia Portuguesa para estudo de microcaracteres da epiderme em fármacos de origem vegetal. Observação de cortes histológicos de vários exemplares. visualização das diferentes bandas e observação dos cromossomas plumosos. através da consulta da Farmacopeia Portuguesa. Observação microscópica de cromossomas em interfase Observação microscópica dos cromossomas gigantes das glândulas salivares da Drosophila. tricomas tectores e secretores. Estudo do tecido epidérmico Observação de alguns microcaracteres a nível do tecido epidérmico: classificação de estomas e determinação do índice estomático.7 Observação de grãos de amido. Aplicações ao estudo de Fármacos de origem vegetal Observação e caracterização de alguns tecidos vegetais. Sua importância em Botânica Farmacêutica como auxiliar na caracterização de fármacos de origem vegetal e na detecção de adulterantes.

1977. J. J. (1986). Bibliografia ALLAN JONES. London. Theory and Practice of Histological BRYAN G. Techniques. e STEVENS. (1999).E. Manson Publishing. PEARSE. III. C. LUIZA. Lisboa. INFARMED. I. W. COUTURIER. Churchill Livingstone. Vol. Plant Systematics: A Phylogenetic Approach. IRL Press. São Paulo.8 Observação microscópica e fotográfica de cromossomas humanos em metafase cariotipo humano Observação microscópica e fotográfica das placas metafásicas marcadas por diferentes tipos de bandas.A laboratory hand book.I. FRANCO. B. (1980). at al. A. Nova Flora de Portugal. JUDD. A. II. (1990). PRIEST. J. MELLO. Lidel Edições Técnicas. La pratique de l analyse chromosomique. (1977). Sinauer Associates. Practical Skills in Biology. Práticas de Biologia Celular. FARMACOPEIA PORTUGUESA. Brasil. (1985).G. (1998).. Massachussets.. Publ. A. (1997) 6ª Edição. Cell Biology . M. 1983 BENCROFT. FRESHNEY. BENEDICTO.. Histochemistry: Theorical and Applied. DUTRILLAUX. (1999). (1971). Animal Cell Culture. Lisboa. United Kingdom. Inc. Lea & Febiger. A practical approach. Edgard Blucher Ltda.. Academic Press. Apoptose Observação de preparações em microscopia óptica de células com figuras de apoptose. A Colour Atlas of Plant Structure. (1998). . Longman Press.Volumes I e II: Preparative and Optical Technology e Analytical Technology. Masson..D. JEAN H. CELIS. Azevedo. Lisboa. BOWES. R. Medical Cytogenetics and Cell Culture. England. Churchill Livingstone. J. ROB REED and JONATHAN WEYERS.. Biologia Celular e Molecular. e VIDAL.

6th ed. o reconhecimento e interpretação de imagens de microscopia e análise crítica experimental. botânico e pelo zoólogo T. Atlas de Ultraestrutura Celular. O estudo e observação de culturas de células será determinante para os ensaios in vitro dos projectos científicos das ciências farmacêuticas. S. – Biology of Plants. A citoquímica de acidos nucleicos.. observação de estruturas celulares em microscopia óptica e electrónica. H. Freeman and Company / Worth Publishers. lípidos e carbohidratos assim como. Ao objectivo da Biologia Celular alia-se o da aprendizagem das técnicas de manuseio de diferentes tipos de microscópios ópticos. H. et al. R. 1999. . O estudo da célula Vegetal. New York. Âmbito A descoberta e o estudo das células feita por M.9 RAVEN. Conjuntamente. (1983). Porto Editora. metodologias utilizadas nos diferentes microscópios assim como. EVERT. Schwann reconheceram semelhanças entre células vegetais e animais e a TEORIA CELULAR foi proposta juntamente com R. & EICHHORN. Inc. F. E. SALEMA. a Histologia e Anatomia Vegetal com a Aplicação ao Estudo de Fármacos de origem Vegetal será um dos objectivos desta Licenciatura. Virchow que sugeriu que todas as células são originárias doutras células pré. (1999). R. P. a micrometria de diferentes células ao microscópio óptico e electrónico dará base para o bom estudo do novo medicamento. serão estudadas as técnicas experimentais mais importantes para o estudo das células.existentes. Schleiden. W.

em regra. Os microscópios são os aparelhos utilizados para formar essas imagens. Muitas características importantes de interesse nos sistemas biológicos são demasiado pequenas para serem vistas a olho nu. Nos anos mais recentes. só podendo portanto. O microscópio óptico usa a luz visível (radiação electromagnética com comprimento de onda compreendido entre 400 e 800 nm) . As estruturas celulares que necessitamos de estudar têm dimensões que. tem-se notado um grande desenvolvimento em microscópios.10 INSTRUMENTOS DE ANÁLISE DE ESTRUTURAS BIOLÓGICAS MICROSCOPIA A microscopia tem a maior importância no estudo das células. são invisíveis à vista desarmada. protocolos de coloração e técnicas de preparação para ajudar a esclarecer melhor a estrutura e função das células. Radiação electromagnética Os microscópios usam radiações electromagnéticas para formar imagens ampliadas dos objectos a observar. Descreveremos as capacidades e aplicações das várias técnicas de microscopia usadas para visualizar as células. 1mm (milímetro) = 1 000 µm (micrómetro) = 1 000 000 nm (nanómetro) = 10 000 000 Å (Angstrom). O olho humano só consegue formar imagens de objectos com dimensões superiores a cerca de 0.2mm. ser observadas com o microscópio. Para observar objectos mais pequenos é necessário formar deles uma imagem ampliada. corantes. as suas estruturas subcelulares e ainda as suas moléculas.

podemos ampliá-lo até 1mm. Resolução e ampliação Há um limite mínimo para a dimensão dos objectos que podem ser observados com um determinado sistema óptico. sendo de 0. e é determinada pela estrutura celular da retina.0037nm para uma voltagem de 100KV. Para conforto do observador. ou seja. permite observar objectos de dimensões inferiores a 0. A ampliação da imagem produzida pelo sistema óptico. Objectos menores que este limite não podem formar imagens. por maior que seja a ampliação utilizada. utilizando um factor de ampliação adicional de 1mm/0.2 µm = 200 µm / 0. limite esse que se denomina resolução do sistema. Para uma observação confortável. A de um microscópio óptico é de 0.2 mm (resolução do olho humano).2mm=5. Vê-se assim que a ampliação útil de um microscópio óptico não excede as 1000x Tipos de microscópio O limite de resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da radiação electromagnética usada para formar a imagem e de aberrações das lentes . Exemplo: Para que um objecto no limite de resolução do microscópio óptico se torne visível é necessário ampliá-lo: 0.2 µm = 1000 x.2mm / 0. A ampliação útil é a ampliação necessária para que a imagem do objecto se torne visível.2mm e é limitada pelo comprimento de onda da luz visível. para que atinja dimensões iguais ou superiores ao limite de resolução do olho humano. .2mm. as imagens são ampliadas até dimensões que tornam a sua observação confortável. O factor de ampliação adicional é a ampliação vazia. Por exemplo. mas apenas até ao limite de resolução do sistema óptico.11 O microscópio electrónico usa raios catódicos (feixe de electrões) cujo comprimento de onda é inversamente proporcional à voltagem de aceleração dos electrões usados no microscópio. a resolução do olho humano é de cerca de 0.

irradiando em sequência todos os pontos do objecto (varrimento ou varredura). o feixe de radiação é estático e irradia simultaneamente toda a área observável da amostra. Noutros aparelhos (microscópios de varrimento). Os raios catódicos (feixes de electrões) utilizam ++ e são usados nos microscópios electrónicos. mas é usada principalmente nos microscópios de fluorescência. do objecto e as oculares formam uma imagem virtual. A imagem virtual situa-se à distância de 25cm do olho do observador. também ampliada. atravessa a amostra e penetra na objectiva. Nos microscópios mais comuns. A objectiva forma uma imagem real. e raios-gama não foram ainda usados por falta de dispositivos que possam funcionar como lentes. e é dotado de um movimento relativamente àquela. pode-se melhorar a resolução construindo microscópios que utilizem radiações de comprimento de onda menor que o da luz visível. Os raios-X começam a poder ser usados com lentes especiais. A construção deste tipo de microscópios depende da capacidade de produzir lentes para a radiação em causa. A . Os componentes principais do microscópio óptico são: • • • • • • • Fonte luminosa: Condensador Diafragmas de campo e do condensador Platina Objectiva Tubo Oculares MICROSCÓPIO ÓPTICO FOTÓNICO VULGAR No microscópio óptico de transmissão a luz emitida pela fonte luminosa e concentrada pelas lentes condensadoras.12 Deste modo. e é a imagem que pode ser observada. ampliada. O microscópio óptico usa a luz visível como radiação electromagnética. o feixe possui dimensões muito reduzidas irradiando apenas um ponto da amostra. A radiação ultra-violeta permite algum ganho de resolução. da imagem real produzida pela objectiva.

pequenas mudanças de fase são transformadas em diferenças de amplitude (intensidade). de onda S D. diferença de fase etc. difracção. visto que fazem mudanças de fase e/ou atrasos nas radiações que atravessam essas estruturas. O condensador está provido de um diafragma em forma de anel (diafragma anular) que produz um cone oco da luz que o atravessa. O efeito de fase depende da interferência entre a imagem geométrica directa e a imagem difractada lateral. Deste modo.13 ampliação total é o produto dos factores de ampliação da objectiva e das oculares. I S+D D Comp. refracção. Se os dois grupos de raios se somam em contraste brilhante ou negativo o objecto aparecerá mais brilhante que o meio. Raios difractados S. reflexão. O microscópio de contraste de fase usa um condensador e objectivas especiais. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE Ambos os microscópios usam a propriedade de dar contraste a estruturas biológicas transparentes à luz visível. que podem ser percebidas pelo olho humano. A luz que passa o objecto é desviada em relação à que passa directamente o meio que o rodeia. A luz ilumina o objecto e o que o rodeia. Quando o contraste é positivo ou escuro os jogos de raios experimentam uma interferência substrativa sendo a imagem do objecto mais escura que o meio. que consistem na absorção de certos comprimentos de onda produzindo côr. podendo existir outros dispositivos no trajecto da luz que introduzam factores multiplicativos adicionais. O feixe luminoso que atravessa a amostra é modificado por interacções com esta. Raios directos . Estas interacções vão-se traduzir na produção de diferenças de côr ou de intensidade luminosa na imagem do objecto.

14 I S S-D Comp. de onda D Para obter os dois tipos de contrastes o microscópio é provido de objectivas com dispositivos de fase específicos: CONTRASTE BRILHANTE vidro material retardante de fase material absorvente CONTRASTE ESCURO A) vidro material absorvente B) vidro material retardante de fase Conforme os fabricantes de microscópios o contraste escuro pode ser obtido com dois dispositivos diferentes (ver Figuras A e B). Utilizando o dispositivo A. a luz directa é .

A microscopia de interferência tem por base princípios semelhantes ao microscópio de contraste de fase. Os esquemas mostram a passagem da luz através da preparação. Esta imagem tem um halo considerável em virtude dos efeitos de difracção. mas tem a vantagem de fornecer dados quantitativos. Este microscópio. enquanto que o microscópio de fase só revela variações acentuadas. as ondas de luz que passaram pelo objecto e aquelas que passaram pelo meio que o circunda. algumas das ondas de luz interferem entre si e o brilho é reduzido. Porque o atraso de fase é consequente da diferença entre o índice de refracção do meio e do objecto. Aqui. encontram-se no plano onde se forma a 1ª imagem dada pela objectiva. tem uma ranhura em forma de anel que é coberta por uma fina camada de metal que tem por fim fazer avançar os raios da luz directa de um quarto de comprimento de onda e reduzir a sua intensidade. permite a detecção de variações pequenas e contínuas de índice de refracção. Em seguida. e os dispositivos de fase.15 levada ao foco da objectiva onde está colocada a placa de fase. Os raios da luz desviada do objecto que tinham sido atrasados comparativamente à luz da fonte luminosa passam sem alteração pela placa de fase. Esta. e porque o aumento refractivo é quase o mesmo para todas as moléculas . A ocular recebe os dois conjuntos de ondas de luz para formar uma imagem altamente contrastada do objecto.

Nestas condições. a luz é dirigida do condensador à amostra num ângulo oblíquo de maneira a que nenhuma luz incidente entre nas lentes da objectiva (criando um campo escuro se nenhuma amostra estiver presente).16 biológicas. Como muitos movimentos são demasiado lentos para observar em tempo real é útil fotografar (microcinematografia) ou filmar em sistema de vídeo. Além de possibilitarem a resolução de certas . as câmaras de vídeo e a tecnologia associada do processamento de imagem têm tido maior impacto na microscopia óptica. só a luz refractada ou difractada pela amostra entra nas lentes da objectiva para formar a imagem. MICROSCOPIA DE FUNDO ESCURO No microscópio de fundo escuro. A quantificação do atraso de fase é feita usando um compensador que reduz o brilho do objecto a negro. A Figura mostra um esquema deste tipo de microscópio. interferência e de fundo escuro é que eles tornam possível a observação dos movimentos envolvidos em processos como. para detectar bactérias ou na autoradiografia. é possível avaliar a quantidade de massa seca por unidade de área do objecto. Embora o seu uso seja remoto. Ultimamente. medindo o atraso de fase. para detectar grãos de prata produzidos na emulsão fotográfica por radiação. mitose e migração celular. Uma das grandes vantagens dos microscópios de contraste de fase. pode ser empregue no futuro com sistemas analisadores de imagem. A resolução não é muito boa. mas com este método podemos observar objectos pequenos que refractam a luz incidente. É usado na microbiologia.

O feixe luminoso tem no entanto um comprimento de onda apropriado (habitualmente na região azul ou ultravioleta) para excitar substâncias fluorescentes (fluorocromios) que se encontram na amostra. entra na objectiva para formar a imagem. A fluorescência data de 1904 com Kohler e foi usada mais frequentemente com Coons que introduziu a técnica dos anticorpos fluorescentes em 1941. A luz emitida pelos fluorocrómios excitados pelo feixe luminoso. bactérias com um corante fluorescente e as examinarmos ao microscópio com luz UV.025 µm) no microscópio de interferência assistido por um computador. absorvem a energia da luz e o seu estado electrónico é mudado para um estado excitado no qual a energia de cada molécula é maior do que o seu estado normal. quer dizer. elas podem ser digitalizadas e processadas por um computador. tais como a percepção de pequenas diferenças na intensidade da luz contra um fundo brilhante. atingir o limite de resolução teórico do microscópio óptico e aumentar o contraste das imagens. Se tratarmos tecidos. Mecanismo da fluorescência Quando certas substâncias como o vidro. são fluorescentes. células. Como resultado da absorção da luz. as moléculas de fluoróforo tornam-se excitadas. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA É um microscópio de luz incidente (epi-iluminação). elas tornam-se luminosas e aparecem como corpos brilhantes num fundo escuro. resolveram de igual modo as limitações do olho humano.17 imperfeições do microscópio. Como as imagens dadas pelas câmaras de vídeo são em forma electrónica. modificam o comprimento de onda destas radiações e tornam-se luminosas. isto é. com diâmetros de dimensão inferior ao λ da luz (0. como o microscópio de reflexão. A fluorescência é um fenómeno óptico no qual a luz é absorvida por uma substância chamada fluoróforo e quase instantâneamente re-emitida com luz dum λ maior. gotas de gordura e diversos corantes são expostos às radiações UV. Um dos exemplos é a observação de microtúbulos. . Estas substâncias podem fazer parte da composição natural amostra ou ser introduzidas pelo processamento técnico como corantes. Este facto tornou possível.

a luz é meramente absorvida sem fluorescência. . podem ver-se os tipos de fluorescência e os materiais microscópio de fluorescência. a maior parte da autofluorescência é devida à presença do NADH unido a uma dehidrogenase mitocondrial.coloração simples sem p. Reac. Fluorescentes Fluorescência induzida Fluorescência do corante Imunofluorescência Fluorescência prod. No terceiro. a reacção fotoquímica induzida pela luz apagar-se-á. Químico B. No segundo. emitida em fluorescência. a fluorescência ocorre. Esta técnica não é só utilizada quando se pretende detectar substâncias em concentrações mínimas. Quando surgem mudanças de excitação ou emissão do espectro de substâncias fluorescentes devido à sua união ao substrato. a observar no Autofluorescência A autofluorescência é predominante nos tecidos vegetais. ex. Nos tecidos animais.18 A energia excedente é dissipada em calor. química seguida de coloração. mas também se usa para observações depois de tratamentos químicos.Téc. ou usada numa reacção fotoquímica. No primeiro caso. Feulgen Fluorocromia indirecta Mét. trat. No interior celular. podemos encontrá-la nas fibras do tecido conjuntivo (colagénio e elastina) e nas lipofucsinas. Enzimaticamente No Quadro. também se podem obter informações a respeito da conformação das moléculas do substrato. Tipos de fluorescência do material biológico Tipos de fluorescência Autofluorescência Locais e Técnicas Fluorescência natural de substância(s) no tecido Drogas fluorescentes Substância no tecido convertida a fluorófero A.

(laranja de acridina e quinacrina. Primeiro. A coloração do DNA com fluorcromos é importante. o mais conhecido é a Laranja de Acridina. tirosina e fenilalanina. devido aos estudos fluorimétricos. verde na sua forma ortocromática. cora o RNA. Vermelho neutro. a cor emitida pela fluorescência muda para uma de λ maior. DNA desnaturado e polissacáridos. Fluorocromia Os corantes fluorescentes são conhecidos por fluorocromos em contraste com os que são visualizados no microscópio de luz que são chamados diacromos. A maioria dos corantes amarelos. Resumindo. assim como os diacromos. As gotas lipídicas também podem ser observadas no microscópio de fluorescência. mas agora é utilizada para a quantificação do conteúdo em DNA. Muitos corantes podem ser usados como diacromos e fluorcromos: Vermelho Congo. Eosina e Fucsina Básica. principalmente. foi usada para o estudo da conformação do DNA. .19 Todas as proteínas fluorescem quando são excitadas a 250-280 nm (UV). etc. A fluorescência metacromática é devida à formação de dímeros e polímeros como resultado duma agregação das moléculas do corante. devido à presença do triptofano. e vermelho na forma metacromática. Fluorescência Metacromática Alguns fluocromos são metacromáticos. e um decréscimo na absorção máxima. estão entre eles. Com os fluorcromos metacromáticos. Brometo de etídio. cora o DNA. fluorescem com mais de uma cor. existe um correspondente aumento do espectro de emissão em direcção a grandes λ. laranja. Fluorescência induzida Algumas substâncias podem ser convertidas a fluorescentes por tratamento químico. Adicionalmente. e o brilho da fluorescência diminui. Usam-se Laranja de Acridina. reacção de Feulgen. Exº o formol reage com as ariletilaminas por reacções de condensação levando à formação de isoquinolinas e outros compostos fluorescentes. isto é. Dos corantes fluorescentes metacromáticos. a mudança da ortocromasia para metacromasia envolve um aumento no pico de excitação (absorção) em direcção a curtos comprimentos de onda. e vermelhos são de facto. fluorescentes.

respectivamente. As figuras 1 e 2 apresentam. O CH 3 CH 3 + N HO O H3 C N O CH 3 COO - COO - Fig. Pode empregar-se o isotiocianato de fluoresceína. O 1º emite luz amarela esverdeada quando é activado por luz de comprimentos de onda próprios. Nesta posição vai ser formada uma ligação covalente entre o corante e a proteína ou outra molécula. Eles são adicionados às gamaglobulinas à custa de determinados radicais e tornam fluorescente o conjugado resultante. Quando se ligam a proteínas a ligação é feita ao grupo SH ou ao NH2.20 Imunofluorescência Certos corantes fluorescentes podem utilizar-se para marcar os anticorpos do soro.1 .Fluoresceína Fig. dois corantes usados em imunoflorescência. as estruturas da fluoresceína e tetrametilrodamina. . 2 . enquanto que o 2º emite luz vermelha. Na zona sombreada é onde estão localizadas os grupos reactivos quimicamente.Tetrametilrodamina Fluorescência produzida enzimaticamente A actividade enzimática nas células (vivas ou fixadas) pode ser estudada em sistemas onde a enzima produz uma mudança de fluorescência pela acção num substracto ou co-enzima.

Por outro lado. Este material também é chamado birrefringente. porque apresenta dois índices de refracção diferentes. O microscópio de fluorescência tem grande sensibilidade tornando possível detectar pequenas quantidades de substância ou partículas de tamanhos abaixo da resolução do microscópio de luz. Se o material for isotrópico. num material anisotrópico a velocidade de propagação da luz polarizada varia. . e é negativa no caso oposto. independentemente da direcção do plano de incidência. do que no plano prependicular. A birrefringência (B) pode ser expressa quantitativamente como a diferença entre os dois índices de refracção (Ne – N0) associados com os raios de maior e menor velocidade. MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO Este método baseia-se no comportamento de certos componentes de células e tecidos. correspondentes a diferentes velocidades de transmissão. a luz polarizada propaga-se através dele com a mesma velocidade. (Omega Optical Filter Set # XF71). Photograph by Jim San Fillipo Aplicações As técnicas de fluorescência podem ser aplicadas a todas as espécies de material biológico. Podem ser visualizadas as mesmas preparações que no MO de luz e tem a vantagem de observar os corantes que absorvem na região do UV fluorescendo no visível. a birrefringência é positiva se o índice de refracção for maior ao longo do comprimento da fibra. Estas substâncias caracterizam-se por terem o mesmo índice de refracção em todas as direcções. Nas fibras biológicas. quando são observados com luz polarizada.21 Microtubules Rat aortic smooth muscle cells stained with an anti-tubulin antibody and FITC-conjugated secondary antibody (green).

tal como o microscópio de interferência. relativamente à velocidade que a luz apresenta num plano perpendicular a este. o que melhora consideravelmente o contraste e a qualidade de imagem. O aparelho é usado para observar o fundo dos frascos de cultura de células. ALINHAMENTO DOS MICROSCÓPIOS ÓPTICOS Focar a preparação e fechar o diafragma de campo ate observar um pequeno círculo. Manter o condensador nesta posição para a objectiva alinhada. que não podem ser facilmente estudados com os microscópios normais. Microscópio confocal Trata-se de um microscópio óptico que funciona em modo de varrimento. O polarizador monta-se por baixo do condensador e o analizador por cima da objectiva. sendo produzido por um laser. Centrar o círculo com os parafusos do condensador e deslocar o condensador na vertical para que os bordos do diafragma que delimitam o círculo fiquem perfeitamente focados. O microscópio de polarização. Do mesmo modo que no SEM. . Só deve ser iluminada a área a observar abrindo o diafragma até que todo o campo esteja iluminado e não mais que isso. A área iluminada pode ser ajustada abrindo ou fechando o diafragma de campo. pode ser acoplado a uma câmara de vídeo. o feixe de radiação percorre a preparação. Portanto o feixe luminoso irradia apenas um ponto da preparação.22 Na prática. em que as posições da objectiva e do condensador se encontram invertidas relativamente à platina.N0 = T/ t O microscópio de polarização difere do microscópio vulgar pela presença de dois elementos de polarização: o polarizador e o analizador. mede-se o atraso (T) que a luz sofre num plano. com o microscópio de polarização. que consistem de folhas polaróide ou de prismas de Nicol em calcite. O atraso está relacionado com a espessura do espécime (t) da seguinte maneira: B = Ne . Microscópio invertido É um microscópio óptico de transmissão.

e toda a luz proveniente do condensador entra na objectiva. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISSÃO Interpretação da imagem em microscopia electrónica de transmissão As imagens observadas com um microscópio electrónico de transmissão (TEM — Transmission Electron Microscope) são imagens de cortes de objectos tridimensionais. As condições de iluminação descritas designam-se por "iluminação de Koeller".23 O diafragma do condensador pode ser usado para regular o ângulo do cone de luz que entra na objectiva. Na interpretação destas imagens há que atender portanto a estes dois factores: 1. mas produz um fundo brilhante que impede a visualização de pequenos detalhes. Em condições ideais. e que dados sobre a sua composição química se podem recolher por maniulação dos mecanismos de contrastação. Nestas condições toda a abertura numérica da lente é aproveitada. Uma maior abertura do diafragma do condensador pode produzir maior intensidade luminosa. este cone de luz deve iluminar toda a lente frontal da objectiva e não mais do que isso. ao interagir com o feixe de electrões. . dão origem à imagem. mas permite aumentar o contraste da preparação. A imagem do diafragma do condensador pode ser monitorizada no plano focal da objectiva. O fecho do diafragma vai diminuir a abertura numérica da objectiva. reduzindo a resolução. A formação das imagens no microscópio depende de métodos de contrastação que introduzem nos cortes metais pesados que. Em que medida é que a imagem produzida pelo método de contrastação corresponde à realidade estrutural. que é directamente observável removendo a ocular e observando directamente o interior do tubo do microscópio.

As colisões dos electrões do feixe com os átomos da amostra processam-se segundo dois processos essenciais: 1) colisões dos electrões do feixe com os electrões dos átomos da amostra. durante os passos de fixação. Trata-se de uma colisão não elástica. aquele que fica fora do material a observar. O contraste Para compreender a primeira questão é necessário conhecer o mecanismo da formação do contraste no TEM. 2) colisões com os respectivos núcleos. em termos qualitativos e quantitativos. o electrão do feixe transmite parte da sua energia ao electrão do átomo da amostra e é pouco desviado da sua trjectória. A contrastação negativa (Fig. No primeiro caso. mas são desviados da sua trajectória segundo ângulos elevados. No segundo caso. O feixe de electrões. citrato de chumbo) são usados para tratamento dos cortes finos (Fig. do estudo das secçôes bidimensionais. isto é. Outros (acetato de uranilo. perto do limite de resolução do microscópio. Consequentemente. Estes electrões podem ser selectivamente removidos pela introdução de diafragmas que só deixam passar os electrões não desviados (fig). há uma maior fracção de electrões desviados e removidos do feixe.1) mostra o contraste por um corante negativo. . este efeito pode-se obter ligando químicamente à amostra compostos com metais pesados. os electrões do feixe não perdem energia. quando colidem com núcleos de átomos pesados. que podem produzir contraste por interfência com os electrões do feixe que não sofreram colisões. Este mecanismo de formação do contraste tem importância sobretudo para o detalhe mais fino.24 2. atravessa a amostra interagindo com os seus átomos. acetato de uranilo) e são usados para tratar as amostras não incluídas. gerando regiões deficientes em electrões. Estas colisões reduzem a energia dos electrões do feixe. nas regiões da amostra onde há maior concentração de átomos pesados. Que se pode inferir relativamente à estrutura do objecto tridimensional que se pretende compreender. dependente das colisões elásticas dos electrões do feixe com átomos pesados. acelerado por um potencial de várias dezenas de kilovolts (típicamente 60-80 KV em estudos de materiais biológicos). Alguns destes compostos funcionam também como fixadores (tetróxido de ósmio. Técnicas de contrastação Uma vez que o contraste que interessa obter é principalmente contraste de amplitude. 2).

Estes sinais podem ser medidos por detectores apropriados. e a interacção do feixe com a amostra gera sinais que podem ser medidos por detectores apropriados. A intensidade e/ou côr do ponto imagem são moduladas pelo sinal recolhido pelo detector. O feixe percorre sistemáticamente toda a amostra por um processo de varrimento.25 Microscopia electrónica de varrimento Enquanto que nos microscópios de transmissão convencionais o feixe irradia toda a amostra. que é essencialmente um microscópio electrónico de reflexão. Merece também referência o microscópio electrónico de varrimento-transmissão (STEM – Scanning-transmission electron microscope) que é um microscópio electrónico funcionando em modo de transmissão. de alta energia (electrões retrodifundidos). electrões retrodifundidos. A resolução deste tipo de aparelhos depende principalmente do tamanho da área do objecto irradiada pelo feixe O modo de varrimento pode ser implementado quer em microscopia de transmissão quer em microscopia de reflexão quer óptica quer electrónica. e raios-X. e são as alterações produzidas no feixe por interacção com esta que vão ser convertidas na imagem. repectivamente para electrões de baixa energia (electrões secundários). Estes sinais. etc. e o microscópio confocal. nos microscópios de varrimento o feixe irradia apenas um ponto da amostra. raios-X. são . As implementações actualmente mais importantes em biologia são o microscópio electrónico de varrimento (SEM – scanning electron microscope). que é um microscópio óptico funcionando também em modo de reflexão (fazendo uso principalmente de técnicas de imunofluorescência). SEM Funcionamento do instrumento No microscopio electrónico de varrimento o feixe de radiação é um feixe de electrões que é focado num ponto da amostra pelas lentes electromagnéticas do microscópio.A interação do feixe de electrões com a amostra gera um conjunto de sinais em que se contam electrões secundários. A imagem forma-se ponto por ponto em tubos de raios catódicos nos quais o feixe de electrões se move de um modo sincronizado com o movimento do feixe de radiação do microscópio de modo que a cada ponto do objecto corresponde um ponto da imagem.

Portanto estes instrumentos estão particularmente adaptados ao estudo das superfícies das amostras e não da estrutura interior. Os metais. Para evitar estes efeitos recorre-se à secagem por métodos de ponto crítico ou a partir de líquidos de tensão superficial muito baixa. Quando se torna necessário estudar o interior das amostras. A secagem é habitualmente o passo mais delicado. Preparação das amostras para o SEM Uma vez que interessa estudar a superfície de amostras inteiras. como dentes inteiros.26 convertidos pelo detector em correntes eléctricas de maior ou menor intensidade que vão modular a intensidade do feixe de electrões que forma a imagem no tubo de raios catódicos. Os electrões secundários são os electrões ejectados dos átomos da amostra pelas colisões não elásticas com os electrões do feixe. uma vez que no seu decurso. A intensidade da emissão depende da natureza química da amostra. Estes electrões são ejectados direccionalmente em função da topografia da amostra. os fenómenos de tensão superficial exercem forças capazes de destruír a maior parte da estrutura biológica observável. próxima da pressão atmosférica. que . Modernamente têm vindo a ser desenvolvidos microscópios electrónicos de varrimento “ambientais” nos quais a câmara que contém a amostra pode ser mantida a uma pressão elevada. apenas à interacção com a superfície da amostra. As amostras estudadas no SEM são amostras espessas. não sendo importante que o feixe de electrões seja capaz de a atravessar uma vez que os sinais recolhidos dizem respeito. os métodos de preparação têm por objectivo preservar as superfícies. Imagens produzidas pelos electrões secundários Trata-se do modo de observação mais utilizado no SEM. em regra. estas podem ser cortadas ou fracturadas de modo a expôr o interior. elas têm de ser fixadas e secas. de um modo tão fiel quanto possível. permitindo a observação de amostras não desidratadas. Como as amostras são observadas no vácuo do microscópio.

A autorradiografia. Portanto. através de sucessivas colisões elásticas com os átomos da amostra são desviados do seu trajecto o suficiente para se libertar da amostra e re-entrar no vácuo da câmara de observação (retro-difusão). A sua emissão é também direccional como a dos electrões secundários. a sua energia é muito maior que a dos electrões secundários. emitem melhor que as substâncias em que os electrões se ligam mais firmemente aos átomos. Por este motivo. caso dos compostos orgânicos. No entanto trata-se de electrões que penetram na amostra a maior profundidade e que são deflectidos mais intensamente nas regiões de maior densidade de massa (à semelhança do que se passa no mecanismo de formação de contraste do TEM). Como se trata de electrões do feixe de radiação do microscópio. Técnicas especiais de microscopia electrónica Técnicas citoquímicas para localização de polissacarídeos e ácidos nucleicos. Técnicas de imunocitoquímica. Por este motivo. Imagens produzidas pelos electrões retrodifundidos Estes electrões são os electrões do feixe que. a intensidade do sinal reflecte não apenas a topografia da amostra como a sua composição química. . o método é ideal para revelar a topografia das superfícies. Digestões enzimáticas em cortes ultrafinos para localização de proteínas e lípidos. desviados por colisões elásticas. a intensidade do sinal recolhido é maior para os pontos das superfícies viradas para o detector.27 possuem electrões mais fracamente ligados. a superfície das amostras é recoberta com finas películas metálicas. Como o detector se localiza num dos lados da câmara de observação. a criomoldagem e a coloração negativa. Os métodos citoquímicos para detecção de actividades enzimáticas.

Meios de cultura: composição e importância. caracterização e diferenciação. 5. 4. Estas células têm vantagem para alguns estudos e sobre isso falaremos.28 Fotografia de E. Cultura de tecidos é a arte de manter e crescer células vivas ou tecidos num meio artificial controlado. Biologia das células em cultura: sua origem.Curva de crescimento das células eucariotas 7. são chamados os estudos in vitro e são feitos em culturas de tecidos. Possibilidade de fazer crescer em laboratório células animais e vegetais. Breve história 2. 6. . 1. Coli num SEM CULTURA DE TECIDOS A Biologia Celular faz crescer células em condições artificiais para os seus ensaios.Tipos de células: Culturas primárias. linhas celulares e células híbridas. 3 Importância e aplicações.Diferenças entre a cultura de procariotas e eucariotas 8.

Testes de diagnóstico clínico . Os tipos de células mais utilizadas são: fibroblastos. células epiteliais. química orgânica e alimentos . são referidos outros usos em processos biológicos e químicos: . juntamente com o meio de cultura contendo os respectivos nutrientes. as interacções vírus-célula (muito importantes. embriões ou células tumurais. porque permitem melhorar e esclarecer mecanismos e factores celulares até agora desconhecidos) e as manipulações genéticas com vista ao estudo da estrutura e expressão génica. como elas crescem. em condições especiais muitas células especializadas podem ser postas .Produção de produtos farmacêuticos . Importância e aplicações Em primeiro lugar. quais as suas necessidades e como é que morrem. isto é. Embora o protocolo da cultura de células não seja tão fácil como o que diz respeito à cultura de bactérias. o crescimento viral.29 Começou a ser realizada em 1800 com o exame in vitro de orgãos e tecidos do corpo que podem ser mantidos fora do corpo. vacinas.Produção energética e fermentação . quais os factores que as estimulam ou inibem.Testes de toxicidade e diagnóstico de doenças Metodologia Depois da dispersão dum tecido nas suas células componentes. aminoácidos. Contudo. Os sistemas de cultura celular in vitro têm dado possibilidade aos investigadores de estudarem o crescimento e diferenciação celular. é importante referir o desejo dos investigadores de estudar as próprias células. assim como de células tumurais. vitaminas. estas são colocadas numa placa de Petri ou num frasco de plástico próprio ou de vidro tratado. Além destas aplicações. a modulação do ciclo celular.Ensaios para antibióticos. A possibilidade de estudar células depende da maneira como elas podem crescer e ser manipuladas em laboratório.Investigação sistemática e taxonómica . já se faz por rotina a cultura de tecidos animais e vegetais.

pois muitas das células deverão ser de origem tumural e ficarão imortais. O meio descoberto por Eagle é ainda hoje o meio base de todas as culturas de células (ver o Quadro). transfectandoas. ~ . O maior problema com as culturas de tecidos primárias é o facto de. carbohidratos. Isto significa que se as colocarmos num meio favorável elas continuarão a proliferar criando uma linha celular. Também é possível transformar células primárias em imortais. Para isso. Eagle estudou o crescimento de duas estirpes celulares: HeLa e fibroblastos de rato. vitaminas e soro de bovino. Em 1955. Eagle foi variando os componentes do meio. Harry Eagle descreveu o primeiro meio sintético que permitiu o crescimento celular. As linhas celulares são armazenadas na American Type Culture Collection. soro e extractos embrionários. Resumindo. A linha celular é clonal quer dizer. Para saber quais os nutrientes específicos para o crescimento celular. temos as culturas primárias e as linhas celulares. As culturas primárias consistem na manutenção de células normais ou tecidos que são obtidos duma fonte viva num sistema in vitro. que um largo número de células foi originado apenas de uma célula. aminoácidos.Claro que para os tecidos sobreviverem intactos devem ser seccionados finos de modo a promoverem as trocas de gás e eliminarem os resíduos.As linhas celulares podem ser obtidas depois da trituração de um tumor e observação das células que ficaram aderentes à placa de Petri. as células só se poderem dividir um número de vezes antes de ficarem quiescentes.30 em cultura levando os investigadores ao estudo das suas propriedades de diferenciação. tal como no animal normal. Os meios de cultura começaram por ser o plasma. estas células foram colocadas a crescer num meio formado por uma mistura de sais.

02 Tirosina Valina Contaminação Consiste no crescimento de microorganismos (fungos ou bactérias) indesejáveis à cultura de células.05 Fenilalanina Trionina Triptofano 0. H2O 10. então pode-se substituir parte ou a totalidade do meio por meio fresco aquecido.1 0.2 Ácido 10-3 0. 2. Depois de três dias.1 0.5 1010-4 Riboflavina 0.aminoácidos Sais (mM) Outros 100 Glucose 5 mM 5 Penicilina 0.05 Colina 10-3 KCl Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina 0.2 Tiamina 3 pantoténico CaCl2 1 -3 10 MgCl2 0.2 cavalo a 10% para todas as culturas stock .005% 10. se as células não cresceram 70-80% da confluência ( quando não existe nenhum intervalo entre elas. isto significa que as células cresceram.2 Soro de bovino ou 0. Crescimento celular Quando se começa com metade do número de células a cobrir o frasco de cultura e posteriormente se observa o frasco todo coberto.NaHCO3 0.2 Piridoxal 0. neste ponto as células deixam de crescer).NaH2PO4 . as células utilizam os nutrientes do meio e os resíduos aparecem modificando muitas vezes o pH do meio.005% 20 Vermelho fenol 0.0 Ácido fólico 3 3 L.31 Meio base de Eagle Vitaminas (mM) (mM) Arginina 0. Ao longo do tempo.05 Nicotinamida 0.1 Biotina 10-3 NaCl Cistina 0.005% 1 Estreptomicina 0.

por pouca especificidade dos métodos químicos que podem marcar várias substâncias (muitas vezes devido a impurezas dos reagentes difíceis de controlar). o componente marcado deverá desaparecer. elas proliferam até que se faça novamente a sub-cultura. Normalmente são translúcidas à luz e por essa razão não é possível ver muitos detalhes. Então. os citoquímicos. existe um número finito de passagens. com enzimas que removem selectivamente os compostos que se pretende identificar. Métodos citoquímicos e imunocitoquímicos A aplicação de compostos químicos com metais pesados pode ser feita por intermédio de reacções químicas que apresentem especificidade para componentes químicos presentes nas amostras. Para esse fim podem-se usar neste caso digestões enzimáticas. Estas reacções de que são exemplo as reacções derivadas da reacção de Feulgen para contrastação do DNA ou PAS para contrastação dos glúcidos. Consequentemente. usualmente são removidas do frasco com tripsina e colocadas num novo frasco numa concentração celular mais baixa. como glúcidos. como em todas as experiências científicas. Falaremos de técnicas para a observação dos componentes celulares e de outros. elaborar controles que garantam que a marcação observada é específica. é necessário. Devido à possibilidade de. Após o tratamento enzimático. ácidos nucleicos. . designam-se por reacções citoquímicas. de um modo específico ou preferencial. para a observação dos seus componentes químicos. a presença de componentes químicos nas amostras. Para as células primárias normais. Contudo. enquanto as imortalizadas continuam a crescer. Cada vez que se passa as células é considerado uma passagem. e permitem revelar. têm de ser empregues métodos para a coloração das células e das suas estruturas. não se devem fazer muitas passagens para não alterar a linha celular original porque com o tempo as células tendem a duplicar parte ou a totalidade dos cromossomas e consequentemente alterar os genes que exprimem. Mecanismo de coloração para a microscopia óptica vulgar A maioria das células e tecidos no seu estado natural contêm pouco pigmento para a absorção da luz. etc.32 Quando as células atingem a confluência.

Lâminas de vidro . A penetração é mais rápida.33 1. Este meio foi suplementado com 10% de soro de vitela recém nascida e 50µg/ml de gentamicina. • Retire uma lamela com monoestrato celular Vero da caixa de Petri e monte-a na lâmina e observe ao Microscópio. Pipeta Pasteur. noção de ponto isoeléctrico das proteínas. Método das colorações combinadas. Material Microscópio. Mecanismo de produção de cores: noção de grupo cromóforo e auxócromo 2. 2. • Retire a preparação do Microscópio e coloque uma gota de um corante vital num bordo da lamela para que a solução entre por capilaridade.4 Classificação dos tipos de coloração: coloração vital e pós-vital. indiferentes e metacromáticos. Células Vero. Soro fisiológico TÉCNICA • Coloque uma gota de Soro fisiológico numa lâmina limpa. Scotland). Vermelho neutro. 2. Tipos de corantes: ácidos e básicos – mecanismo de coloração.2 Inversão da coloração 2. . Papel de filtro. COLORAÇÃO VITAL EM CULTURA DE TECIDOS E CÉLULAS VIVAS As células Vero foram obtidas da American Type Culture Collection e cresceram em monocamada no meio Eagle modificada por Dulbeccu (Gibco. Este trabalho tem como objectivo observar células vivas coradas com diferentes tipos de corantes vitais. Estas células são de linha contínua fibroblástica de rim de Cercopithecus aethiops (macaco “African Green”). Coloração progressiva e regressiva.Exemplos. anfotéricos. Azul de tripano.1 Outro tipo de corantes: neutros. 2. directa e indirecta. Pinça Reagentes Azul de metileno. Lugol.3 Uso de mordentes e diferenciadores.

pelo que é importante ter em consideração o aspecto da preparação antes da coloração (exame a fresco). Cobrir com a lamela contendo o filme de corante. como os fagolisossomas. com o auxílio de papel de filtro. • Visualizar ao m. que têm um pH ácido Imagem de células Vero sem col. Este corante é também utiizado como indicador de pH: cor de laranja a pH alcalino. após alguns minutos esta solução cora as mitocôndrias de azul escuro ou verde. Dependendo do organismo e do seu estado fisiológico. extrair o líquido que sobra. específica para mitocôndrias. Coloração com Vermelho neutro: Esta solução cora ligeiramente os núcleos e outras inclusões.. o. outros organelos celulares começam também a receber o corante. Células de cultura sem coloração Verde de Janus É uma coloração vital.34 se do lado oposto aquele em que pôs a gota. . Isto dá-nos uma indicação do que ocorre a nível dos vacúolos digestivos. esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscópio. Protocolo: Retirar uma gota da suspensão celular e colocar sobre a lâmina. À medida que os organismos vão morrendo. vermelho-cereja a pH neutro e azul a pH ácido. Registar as observações.

pelo que é importante ter em consideração o aspecto da preparação antes da coloração (exame a fresco). • Observar ao mcroscópio Coloração com azul de tripano O método de exclusão do Azul de Tripano baseia-se no princípio de que células viáveis apresentam membranas intactas. TÉCNICA • Retirar uma gota da suspensão celular e colocar sobre a lâmina. células azuis correspondem a células mortas. após alguns minutos esta solução cora as mitocôndrias de azul escuro ou verde. outros organelos celulares começam também a receber o corante. Logo. Coloração com verde Janus É uma coloração vital específica para mitocôndrias. que evitam a entrada do corante. A diferença entre o número total de células e o o número de células mortas será o número de células viáveis numa dada amostra da nossa cultura Coloração com azul de metileno .enquanto que membranas metabolicamente inactivas de células mortas (não viáveis) não conseguem evitar a penetração do corante na célula. À medida que os organismos vão morrendo.35 Protocolo: Retirar uma gota da infusão e colocar sobre a lâmina. Cobrir com a lamela contendo o filme de vermelho neutro.Dependendo do organismo e do seu estado fisiológico. Registar as observações. esperar 1 a 2 minutos e observar ao microscópio. • Colocar gota do corante e esperar 1-2 minutos.

Azul de Tripano FUNDAMENTO DO PROCESSAMENTO DE CÉLULAS E TECIDOS PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ÓPTICO Existem muito poucas células suficientemente finas para serem visualizadas directamente ao microscópio (algas. a maioria dos tecidos (fígado. Vermelho neutro Co. protozoários. Preparações extemporâneas. desidratação. impregnação e corte feito em micrótomo. rim.e outras) são suficientemente espessos para permitir a passagem da luz.36 Col. exame a fresco e vital . os tecidos devem ser seccionados em fatias muito finas depois de previamente processados para impedir a danificação das células. algumas das modificações introduzidas na estrutura e composição das células. Então. Este processamento envolve vários passos: fixação. sangue e cultura de tecidos). cérebro. Estes passos serão estudados assim como.

EXAME DE PREPARAÇÕES FIXADAS Introdução Sempre que possível usam-se. . etc. Conceito e métodos. Classificação de fixadores químicos (aldeídos. materiais biológicos fixados e cortados em fatias finas (cortes). agentes oxidantes. putrefacção e fermentação. Estes são atravessados pela luz e podem ser corados para introduzir contraste e diferenciação entre as estruturas celulares.podem repetir-se as observações sempre que se deseje.37 Estudo post-mortem. Perfusão. Desidratação Diafanização Impregnação e Inclusão Microtomia: Micrótomo de Minot. . . . Método dos cortes Fixação.permite exames mais demorados.). para serem observadas. Esfregaços de bactérias e sangue. Vantagens e inconvenientes. Autólise. é o esfregaço. em conjunto com o exame a fresco. Tipos de fixação: química e física. de corrediça e de congelação. agentes desnaturantes de proteínas.podem arquivar-se documentos dos trabalhos realizados. Um dos exemplos.podem confrontar-se antigas e novas preparações. Também se usam células fixadas sem serem submetidas ao “corte”. Vantagens e inconvenientes dos diferentes tipos de fixação Qualidades dos fixadores e soluções tampão. O exame de cortes permite a conservação dessas preparações o que traz algumas vantagens: . Opacidade.

a hematoxilina. então. A eosina é um corante sintético aniónico ou ácido. as estruturas acidófilas são chamadas eosinófilas. leva-se a outra segundo um determinado ângulo a tocar o sangue e espalha-se o sangue até à outra extremidade da lâmina (ver na Figura). Depois o esfregaço está preparado para ser corado. Como se sabe todos os corantes sintéticos são derivados do benzeno. Quando a eosina é utilizada para a coloração de um tecido. A hematoxilina é um corante natural extraído do tronco da árvore: Campechium Hernatoxylin encontrada na América Central e do Sul. O extracto sofre oxidação em hemateína que é um cromogénio ácido com pequena afinidade ou especificidade. um mordente é essencial para a conversão deste corante a base podendo ligar-se fortemente aos ácidos nucleicos. Neste caso são necessárias 2 lâminas. coloca-se uma gota de água estéril contendo as bactérias e faz-se um esfregaço que seca ao ar para depois ser fixado pelo calor. Depois de se ter colocado a gota de sangue na extremidade de uma lâmina. colocando-o numa placa metálica aquecida. No caso do sangue. Esfregaço de sangue Para a execução da técnica de observação de material biológico em “corte” são realizados vários passos dos quais se destacam: A coloração com um corante aniónico ou ácido. coloca-se uma gota com uma lanceta estéril e posteriormente é feito o esfregaço.38 Esfregaços (bactérias e sangue) Por cima de uma lâmina. O sangue é seco e depois corado. a eosina e com um corante catiónico ou básico. . é uma maneira de fazer contrastes de coloração necessários para um estudo morfológico.

. A fixação consiste em mergulhar fragmentos celulares ou tecidulares em soluções químicas orgânicas ou inorgânicas. .actividade microbiana. Estas são feitas por métodos endoscópicos ou cirúrgicos (biópsias). A maioria dos fixadores são soluções que exercem a sua actividade principalmente ao nível dos complexos proteicos da célula. 2 . isto é. . tendo em conta que após a morte do ser vivo. 2 .Anestesiar o animal com éter.Colheita do material biológico A colheita deve ser feita o mais rapidamente possível. se iniciam uma série de processos destrutivos intracelulares de natureza enzimática.1. Introdução A fixação dos tecidos deve ser feita imediatamente a seguir à paragem da circulação para prevenir a decomposição postmortem.extracção de moléculas intra.Abrir o tórax. tendo a vantagem de reduzir artefactos resultantes do manuseamento dos tecidos a fixar. A fixação pode ser feita por perfusão. em certos casos. Portanto. Logo que se coloca um fragmento de tecido num fixador a morte das células não é instantânea e. que consiste em passar o fixador na corrente sanguínea do animal antes da remoção dos orgãos. 1 . Também se pode fazer colheitas com animais vivos. e tem como objectivo preservar a estrutura dos tecidos o mais possível à existente in vivo. deixando o coração a descoberto.e extracelulares. aquosas ou não. assim. podem produzir-se modificações nos tecidos em consequência da: . a fixação por injecção do líquido nos vasos do animal. é necessário escolher um fixador que mantenha a estrutura das proteínas próxima da original. que podem ou não precipitar ou coagular as proteínas. precipitando-as o menos possível.alterações osmóticas. . em que se pretende actuar mais directamente. a autólise. Técnica de perfusão Além da fixação por imersão das peças no líquido fixador emprega-se.autólise (acção enzimática).39 1 .Fixação 2.

processo precoce que resulta da acção de enzimas proteolíticas das próprias células (lisossomas rompem-se e libertam as enzimas). Portanto.Impedir a: . tais como.Fechar as artérias mamárias e passar um laço no pedículo do coração.autólise.putrefacção.Manter as estruturas o mais possível iguais às que existiam in vivo.Dar resistência à peça para suportar as operações subsequentes na técnica da inclusão. destroem os microorganismos evitando a sua proliferacção e inactivam as enzimas hidrolíticas.quando se difunde pelas células do tecido não deve remover nem arrastar certos constituintes das mesmas.2. 4 . formol e álcool a 70º) para que este fluxo substitua o do sangue. fungos. . . Também se observam nos fixadores propriedades conservantes.3.começar o processo de endurecimento das peças.fermentação e lipólise.Cortar a veia cava inferior para aspirar o sangue e abrir imediatamente a perfusão (fixadores mais usados: fixador de Bouin.O tempo deve ser de 15-20 minutos e o volume deve ser 20 vezes superior ao do sangue do animal. . . . não produzem tumefacções. dá resistência ao tecido para as operações subsequentes da técnica de inclusão e prepara a coloração. degradação proteica por acção de microorganismos (bactérias.A fixação tem ainda duas funções acessórias: .facilitar certas colorações. . 2.Introduzir o catéter no ventrículo esquerdo penetrando na aorta ascendente. 2. Essas enzimas digerem e alteram a célula introduzindo aspectos que não existiam “in vivo” e que resultam das técnicas usadas e da própria morte celular. retracções ou remoções celulares. etc. 5 . isto é. um bom fixador é aquele que: . Objectivos Os objectivos da fixação são: . .tem bom poder de penetração e por isso mata o tecido rapidamente. . 6 . glúcidos ou lípidos.40 3 . Qualidades de um bom fixador Um fixador tem propriedades fixantes. isto é.deve preparar o tecido para não ser alterado pelos processos que se seguem: . para que cortes finos sejam possíveis.). degradação dos lípidos e dos glúcidos por acção de microorganismos.

desidratação. porque o formol é extraído mais depressa em álcool. .O tempo de fixação deve ser calculado em função dos resultados de uma boa fixação.revela todos os organitos da célula sem os mascarar. os tecidos devem ser lavados em água corrente de 1 a 24 horas para remover a coloração amarela deixada pelo dicromato de potássio. Nas fixações em Líquido de Zenker.Utilizar fragmentos pequenos (± 2 cm de comprimento e 4-5 mm de espessura) para que o fixador fixe igualmente à periferia e no interior do tecido. corte. Claro que. 5 . assim como citoquímicas específicas de enzimas. o tecido deve ser lavado rapidamente em água e ser transferido para o álcool a 70º. 3 . 2.5.Utilizar tecidos vivos logo após a morte.não causa retracção dos tecidos. 4 . Intestino).6.Havendo paredes contrácteis no tecido ou órgão a fixar (ex. 2. durante 6-48 horas a 4ºC. Mecanismo da fixação. o tempo da fixação depende do tamanho e da densidade da peça a fixar e da temperatura a que se processa a fixação.Pequenos blocos de tecido são colocados numa quantidade de fixador seleccionado o mais rapidamente possível depois da colheita.deve permitir usar várias técnicas de coloração (no entanto. .4. .). inclusão. Proteínas Na fixação dos tecidos as reacções mais importantes são aquelas que estabilizam as proteínas.diafanização.41 .O volume do fixador deve ser em média 20 vezes maior do que a peça a fixar. a coloração de detalhes celulares específicos como o aparelho de Golgi ou as mitocôndrias requerem fixadores especiais. 2. . Quando se usa o formol como fixador. Técnica de fixação 1 . Embora os detalhes não sejam conhecidos. 2 .preserva os fenómenos de osmose. parece que alguns fixadores têm a propriedade de formar "cross links" entre as proteínas formando um gel e idealmente .6. 2. devem ser fixados os dois topos para impedir a contracção. 2 . coloração e montagem. Regras gerais para uma boa fixação 1 .1.Remoção do fixador por lavagem com meios determinados pelo fixador.

preserva mal a estrutura das proteínas. como a que está na reacção anterior. reage com os ácidos gordos insaturados durante a fixação. Características: . não dissolve as gorduras pois.usa-se dissolvido em água a 5 ou 10%. . 2.irrita as mucosas. Aldeídos (Formaldeído ou formol. RH + CH2O R. . . Formol As reacções do formol com as proteínas tecidulares são numerosas e complexas. danifica pouco e é barato. . não deve acontecer na imunocitoquímica e trabalhos de microscopia electrónica de alta resolução. sendo formados 1:3 glicóis e 1:3 dioxanas. .42 conservando-as como se encontravam in vivo.é um bom fixador.presta-se a cortes por congelação. e a dupla ligação é atacada. Glutaraldeído e Acroleína) A formação de "cross links" entre os grupos terminais das proteínas são devidas a estes fixadores. .é simultaneamente um agente conservante. .6. .): R. As proteínas solúveis são fixadas a proteínas estruturais. são desfeitas por hidrólise. O formol também pode reagir com ligações duplas etilénicas nas cadeias de lípidos insaturadas.CH2(OH) + HR’ R–CH2 –R’ + H2O Estas pontes metilénicas.CH2O(OH) Este composto é reactivo e pode condensar-se com um átomo de Hidrogénio para formar uma ponte metilénica (-CH2.tem uma boa penetração. ficando assim insolúveis e deste modo dão uma força mecânica à estrutura total permitindo os passos subsequentes no processo de inclusão. .1. A desnaturação das proteínas causada pela fixação não é muito importante nas observações de rotina mas.a sua reacção é lenta e pode ser reversível com um excesso de água nas primeiras 24 h e depende do pH sendo mais rápida a pH alcalino.é ideal para microscopia óptica. A reacção mais frequente é a formação do composto metilol.1.

penetra mais dificilmente do que o formol nos tecidos a fixar. é um aldeído bifuncional que é capaz de fazer um maior número de “cross links” do que o formol. 2 . após a adição do aldeído. 3 .a sua reacção é reversível e também depende do pH sendo mais rápida a pH alcalino. . Glutaraldeído COH COH H C O H C O (CH 2) 2 Proteína (CH2 ) 2 CH2 + N (CH2 ) 3 (CH2 ) 2 C H O H N + CH2 Proteína (CH2 ) 2 C O Fig. . Características: .é sempre utilizado em microscopia electrónica.é mais rápido e eficaz na sua acção que o formaldeído. com as proteínas são análogas às do formol.CHO. pois consegue manter melhor que o glutaraldeído a antigenicidade das proteínas.causa uma perda de ± 30% da estrutura em hélice das proteínas. . . . Acroleína A acroleína penetra rapidamente o tecido preservando a morfologia e actividade enzimática. H2C = CH.é um dos fixadores eleitos para a imunologia. Reage de maneira semelhante ao formol com as proteínas. 2 e 3). ficando completas ao fim de 30 minutos. O aldeído acrílico ou acroleína. .Formação de cross-links com o As reacções do glutaraldeído (Figs.desnatura um pouco as proteínas e enzimas.Estrutura do glutaraldeído glutaraldeído Fig.43 . um aldeído bifuncional.

ou submentendo-as ao seu vapor. permanganato de potássio e dicromato de potássio) Tetróxido de ósmio Características: .6. É usado especificamente para preservar o glicogénio.o tetróxido de ósmio (OsO4) forma “cross links” com as proteínas. Agentes oxidantes (Tetróxido de ósmio.1. recomenda-se o seu uso em histologia. 2.muito caro. . Segue-se um processo de polimerização.devido a ser um coagulante enérgico e rápido do citoplasma (sem o retrair) e de se reduzir ao contactar com as gorduras dando uma cor característica. . No entanto. .44 A acroleína reage com os grupos -OH e -NH das proteínas para formar CH2=CH-CH-N-. Características: . álcool metílico e álcool etílico) Álcool metílico e álcool etílico Os álcoois reduzem a constante isoeléctrica das proteínas causando a sua precipitação próximo ou nos seus pontos isoeléctricos.alteram a estrutura terciária das proteínas fazendo com que haja ruptura das pontes hidrofóbicas. Agentes desnaturantes de proteínas (Ácido acético. .2.1.removem histonas.6. . O álcool absoluto é ocasionalmente usado como fixador porque desidrata. OH Também reage com ácidos gordos e com as duplas ligações dos alcenos.3.podem causar retracções. os álcoois conservam a estrutura secundária das proteínas.tem fraca penetração. A alteração da estrutura das proteínas causada pelo metanol e etanol é devida à disrupção das suas ligações hidrofílicas. importantes na manutenção da sua estrutura terciária. 2.pode empregar-se imergindo as peças no líquido. .altera-se facilmente. . .

os lípidos individualizados só recentemente foi possível observá-los. As propriedades de superfície dos lípidos determinam a sua permeabilidade aos reagentes aquosos ou aos solventes orgânicos. Os fosfolípidos com grupos básicos e polares fosforilados são hidrofílicos. imidazol. Os não combinados (colesterole ácidos gordos livres) e os simples ésteres têm uma preponderância de grupos não polares e são hidrofóbicos. A distinção mais útil do ponto de vista histoquímico é o facto de serem hidrofóbicos ou hidrofílicos. Agentes de Mecanismo desconhecido (Cloreto de mercúrio e Ácido pícrico) Cloreto de mercúrio Com este fixador existe um número relativamente grande de resíduos de aminoácidos a reagir (tiol. Mecanismo de fixação dos lípidos Os lípidos têm sido demonstrados em secções de tecido desde 1896 com os corantes Sudan.6. Contudo. Como se mostra.6. fosfato e grupos hidroxilo). Mostra-se o uadro. ou alternativamente ligados a bases por ligações amida. .2. é formado um grupo dimercaptide: RSH + HgCl2 RSHgCl + HCl RSHgCl + RSH (RS)2Hg + HCl Também existe evidência da reacção do cloreto de mercúrio com os grupos disulfureto formando produtos de reacção que podem variar com o pH da solução. Adicionalmente eles podem conter bases orgânicas.6. A reacção deste fixador com o grupo tiol tem merecido mais atenção. Os glicolípidos acídicos (gangliosidos e sulfatídeos) e os glicolípidos neutros (cerebrósidos) são também moderadamente hidrofílicos.45 2. 2.2. amino. ácido fosfórico e açúcares. Classificação de lípidos Os lípidos mais complexos consistem de ácidos gordos ligados a álcoois (glicerol) por ligações éster.1. com as características que influenciam a histoquímica dos lípidos.4. devido à sua estrutura molecular e depois da determinação das suas propriedades físicas e químicas 2.1.

Ésteres de cerebrósidos. Solúveis em água. Têm uma hexose (glucose) ligada à ceramida.46 Classe I. Com base esfingosina Esfingolípidos 2. longas cadeias de ácidos gordos. Muito Acídicos.glicéridos de saturação dos constituintes dos ácidos gordos. FOSFOLÍPIDOS Fosfatidil colina-Lecitinas a.e Tri . LÍPIDOS POLARES 1. álcoois polihídricos e várias bases nitrogenadas. Neutros. Básicos. Ácidos gordos 1. Lípidos não conjugados Colesterol 2. São básicos e com ligação éster. Com base glicerol Fosfatidil serina Fosfatidil etanolamina b. Ésteres Ponto de fusão depende do grau Ésteres do colesterol Mono. LÍPIDOS NÃO POLARES Membro Características que influenciam a histoquímica Ponto de fusão e Sudanofilia dependente do n. Ligação éster. HIDROFÍLICOS.Di . II. Um ácido gordo saturado liga-se à esfingosina por uma ligação amida mais fosforil colina. Não sudanofílico. Com ácido neuramínico Nacetil (ácido siálico). Básicos. Ligação éster. Fosfolípidos com ácido fosfórico. HIDROFÓBICOS. Acídicos. GLICOLíPIDOS Cerebrosidos Sulfatidos Gangliosidos . HIDROFÓBICOS. Acídicos.º de duplas ligações. Birrefringente à luz polarizada. HIDROFÓBICOS.

forma-se um diéster.6.47 2. no interior hidrofílico das micelas. CH O HO CH CH O Os O CH O CH O OsO 2 + CH O HO CH CH O Formação do diéster Em microscopía electrónica observa-se a deposição do ósmio nas micelas lipídicas no local dos grupos polares e não no local original de reacção ou seja. Fixação de lípidos A melhor maneira de os fixar é através da congelação.2. Na figura indica-se os dois locais possíveis da deposição do ósmio. CH + O O CH O OsO 2 CH O CH OsO 2 A outra porção livre na molécula pode reagir. se um grupo etilénico oxidado estiver à disposição e então. . Agentes oxidantes Os lípidos insaturados reduzem o OsO4 formando compostos negros. mas ambos alteram a sua reactividade química.2. e os únicos reagentes capazes de os fixar são o tetróxido de ósmio e o ácido crómico.

ácido acético (fixa bem o núcleo pois penetra bem) (6:3:1). . .é um fixador ácido bom para os cromossomas. Carnoy: . Mecanismo de fixação dos ácidos nucleicos Muitos fixadores têm sido usados para fixar ácidos nucleicos.6. .extrai as histonas. clorofórmio (fixa bem o citoplasma). O etanol e metanol são usados para fixar DNA e RNA e produzem-lhes pouca alteração apesar de os precipitarem.3.é constituído por: álcool absoluto. mas relativamente poucos reagem com estas moléculas. Outro fixador utilizado é o Carnoy.48 Grupos polares Ι Deposição intramicelar 45 Aº Ι P Deposição polar 45 Aº 2.é um bom penetrador. . A presença de sais na reacção é essencial para obter a máxima precipitação.

sublimado de cloreto de mercúrio (5g) e água destilada (95 ml).é um fixador universal compatível com a maior parte dos corantes. .4. extrai o RNA e depois o DNA. . .fixador do sangue ou doutros esfregaços. Zenker: . solução aquosa saturada de ácido pícrico e ácido acético glacial (25:75:5). Flemming: .utilizado para a fixação de lípidos. ácido acético cristalizável (1g) e água destilada (100ml). pois se o excedermos. .49 . núcleos e glicogénio. trióxido de crómio (15g). é uma regra a ter em conta. .excelente fixador citológico mas de fraca penetração por causa do ácido ósmico. a não ser que as peças sejam muito pequenas.é um bom fixador para estudos citológicos de glândulas.é constituído por: dicromato de potássio (2. . .a fixação pode durar de 24 h a 3 . . 2.bom fixador para o tecido nervoso.é utilizado para fixar o núcleo.8 dias. A presença de ácido acético atenua tal inconveniente.tempo de fixação: 10 min. órgãos linfóides.é constituído por: formol a 40 %.fixador universal.é utilizado para fixar núcleos e tecido conjuntivo. Misturas de fixadores Nem todos os fixadores apresentam as mesmas capacidades. acrescenta-se 5ml de ácido acético. . . . .é necessário ter cuidado com o tempo de fixação.passar logo por álcool absoluto e incluir.é constituído por: tetróxido de ósmio (4g).6. Álcool-formol (9:1): . Bouin: . Por vezes.em regra só ficam bem fixadas as partes superficiais. . determinadas formações do citoplasma.muito bom para estudos citológicos.fixa proteínas e ácidos nucleicos. Álcool-éter em partes iguais . ácidos nucleicos e glicogénio. o ideal é fazer misturas de fixadores.5g). . Uns conservam bem as estruturas do núcleo outros. Na altura de utilizar.

O etanol é o mais usado por não ser tóxico e ser rápido na acção.não causa retracção dos tecidos. Congelação e dessecação Este método consiste numa rápida congelação dos tecidos. cloreto de platina. as peças são imersas em azoto líquido (-160 a 190 º C) para serem dessecadas no vácuo a temperaturas da ordem dos 30 . As vantagens são semelhantes ao método anterior.a fixação é rápida. que permite passar directamente do fixador para a parafina sem os intermédios ordinários.2. . Este processamento consiste em passar o material fixado por álcoois de concentrações crescentes desde 70° até ao absoluto. Existe uma substância. A espessura ideal de tecido deve ser de 0. Inicialmente. etc. .6.5. 2.) ou requerem técnicas demoradas. celoidina ou outra substância de inclusão são miscíveis em água. . Mecanismo de fixação por meios físicos 2. A razão deste passo.50 NOTA: os fixadores que permitem obter boas fixações da estrutura citoplasmática ou são muito caros (por conterem ácido ósmico. O tempo da permanência em cada um dos álcoois depende do volume.não há extracção de moléculas solúveis.5.5. As vantagens são: . a dioxana.Desidratação A desidratação consiste na remoção da água livre ou possível de extrair do tecido fixado por acção do álcool. 2.6. espessura e do tipo de tecido. 3 . Nestas condições o gelo dos tecidos sublima ao estado gasoso e produz-se a desidratação.a fixação é homogénea. deve-se ao facto de que nem a parafina.a composição química mantém-se. seguida de desidratação no vácuo a baixas temperaturas.5 cm e o tempo médio da desidratação é de 1 hora.a estrutura conserva-se com raras modificações produzidas pelos cristais de gelo. . Congelação e substituição Neste caso.1.6. . .40º C. o tecido mantém-se congelado a baixa temperatura (-20 a -60ºC) num reagente que dissolve os cristais de gelo (etanol ou acetona).

Faz-se na estufa. mas não quebradiça. normalmente o xilol. A conversão pode ser feita por: ∗ cristalização por arrefecimento (parafina).Diafanização Consiste na passagem dos blocos de tecido fixados e desidratados por uma substância diafanizadora.Inclusão Este passo consiste na infiltração no tecido duma substância de suporte para que seja possível cortar o tecido em fatias finas de modo a observá-las ao microscópio.Conservação dos blocos por período indefinido. 6.Impregnação Substitui-se o xilol pela parafina ou celoidina. ∗ polimerização (plástico). A razão deste passo deve-se ao facto da parafina não ser solúvel em álcool.1 . 6 .A inclusão é fácil e rápida. ∗ evaporação do solvente (celoidina).Parafina A parafina é sólida à temperatura ambiente e aquecida a 45 . mas dura aproximadamente 1 hora e 30 min.Obtenção de cortes suficientemente finos e seriados. É insolúvel na água e quase insolúvel no álcool e é solúvel no xilol. acetona e éter de petróleo. 5 . 6. mas sim em xilol. O tempo de infiltração depende do volume. .51 4 . Vantagens . As substâncias a ser usadas devem ser convertidas rapidamente do estado líquido ao sólido e quando líquidas devem penetrar nos interstícios do tecido. . O xilol vai ocupar o espaço vazio anteriormente ocupado pela água. Os blocos diafanizados devem ser imersos num banho de parafina e serem mudados pelo menos duas vezes para novos banhos para remover o xilol que está presente nos tecidos. substância que por sua vez se dissolve no álcool.1.1.60°C. . Quando a peça é introduzida no xilol fica com um aspecto mais claro e translúcido. espessura e do tipo de tecido. A parafina e a celoidina são substâncias que penetram homogeneamente na célula na forma líquida e que depois de solidificarem a tornam rígida. O tempo de diafanização é de 30 min a 2h. torna-se líquida. ao mesmo tempo que o xilol vai evaporando a parafina ocupa os lugares deixados pelo xilol dando consistência ao meio celular depois de retirado da estufa.

52 6.1.2. Desvantagens - Não se deve sobreaquecer a parafina porque torna difícil a obtenção de bons cortes; - O prolongado tratamento dos tecidos com esta substância de inclusão, endurece-os; - Só dá bons resultados com peças pequenas; - Endurece demasiado certos tecidos e órgãos (músculo, pele); - Retrai mais ou menos os tecidos. 6.1.3. Técnica de inclusão com parafina 1 - Funde-se a parafina; 2 - Bafeja-se os quadros de Leuckart para a parafina não aderir (Actualmente usam-se cassetes de plástico); 3 - Tira-se a peça do banho de impregnação e posiciona-se com pinças de inclusão, dentro do molde; 4 - Deita-se a parafina líquida, mas não a ferver; 5 - Deixa-se solidificar à temperatura ambiente ou arrefecendo com água. No final da inclusão obtemos um bloco de parafina dentro do qual está incluída a peça. 6.1.4. Artefactos introduzidos pela inclusão em parafina - Remoção de constituintes: ∗ lípidos; ∗ glicogénio. - Precipitação; - Pregas; - Estrias causadas pela faca do micrótomo. Micrótomo de Minot

Micrótomo de Minot • Colher pequenos fixar 24 h em 10% fragmentos de um orgão e de formol em tampão

53 fosfato com pH neutro. • Desidratar com álcool 70º 12 h e mudar para o álcool absoluto duas vezes, a primeira 2h e a segunda 3 h. • Fazer dois banhos de xilol, o primeiro 2 h e o segundo 90 min. • Fazer o 1º banho de parafina numa estufa à temperatura do seu ponto de fusão (60º) 16h. Pode ou não ser feito um 2º banho de parafina nas mesmas condições 5h. • Fazer as inclusões em parafina em moldes de latão (Leuckart) ou em cassetes. 7 - Corte Os blocos com as inclusões devem ser cortados em micrótomos, depois de talhados em pirâmides quadrangulares, segundo secções específicas, que podem ser transversais ou longitudinais. As secções podem ter 5-10 µm de espessura. em fatias finas e regulares para serem estudados por transparência. 7.1. Equipamento necessário - Micrótomo; - Banho maria a 45º C, para suportar os cortes; - Placa aquecida, para secar os corte; - Pinça; - Escova para limpar a face do micrótomo; - Lâminas; - Água albuminosa (meio de colagem); - Cubos de gelo. 7.2. Tipos de micrótomos Faca de Valentim: - dupla faca com 2 lâmininas, em que o afastamento das duas lâminas é graduado e dá-se por meio de um parafuso. Corta o órgão por 2 planos muito próximos, sendo a largura do corte dependente da distância entre as duas lâminas. Mícrotomo de Minot: - representado na figura, é caracterizado por ter a faca fixa, sendo o suporte com o bloco que se desloca verticalmente, é mais cómodo e o mais usado. Micrótomo de Corrediça: - o suporte da faca (trenó ou corrediça) move-se numa goteira horizontal ou plano inclinado e o suporte do bloco é elevado a cada corte. Micrótomos de congelação e criostatos: São aparelhos utilizados para fazer os cortes mantendo a congelação e têm a vantagem de fazer cortes de boa qualidade. As suas principais vantagens são: O corte de peças não

54 destrói substâncias que se pretendem observar e também se usam quando é necessário uma observação rápida (ex. exames extemporâneos operatórios). 7.3. Técnica do corte 1 - Resfriar o bloco e talhá-lo; 2 - Fixação do bloco no suporte do micrótomo; 3 - Orientação do bloco e da faca, regulação da espessura dos cortes; 4 - Execução dos cortes, que se recolhem à superfície da água a 45 º C: 5 - Colagem dos cortes (água albuminosa ou gelatina); 6 - secagem na estufa das lâminas ou lamelas com os cortes colados. Talha-se o bloco debastando-o pouco a pouco por todos os lados, tirando assim sucessivas camadas de parafina. O suporte do bloco é móvel segundo as 3 dimensões no espaço o que permite orientá-lo de modo que a face superficial do bloco fique num plano vertical nos micrótomos de Minot e horizontal nos de corrediça. Orientada a peça, fixa-se solidamente a sua posição, por meio de parafusos, a faca é também solidamente fixada ao suporte e este ao aparelho. Uma vez acertado o aparelho para a espessura que se deseja, começa-se a cortar a peça. A cada movimento sai um corte e o que se lhe segue vem colar-se-lhe pela aresta vizinha, constituindo-se assim fitas ou ténias de cortes. 8 – Colagem A colagem assegura um perfeito estendimento dos cortes, de modo a que não fiquem dobras ou rugas. Meio de colagem → água albuminosa diluída: ∗ clara de ovo (50 ml); ∗ glicerina (50 ml); ∗ salicilato de sódio. Mistura-se, filtra-se e coloca-se uma gota antes de pôr a secção do corte. 8.1. Técnica de colagem 1 - Coloca-se algumas gotas do meio numa lâmina; 2 - Coloca-se o corte em cima da lâmina; 3 - Com agulhas e com calor moderado estica-se o corte; 4 - Escorre-se o excesso de água não deixando sair o corte;

55 5 - Leva-se a secar na estufa a 45º C. A seguir resumem-se os passos para a observação do material biológico em cortes de inclusões em parafina.

PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO DE HEMATOXILINA-EOSINA EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA

Células coradas com hematoxilina-eosina. As áreas escuras têm basofilia, núcleo (nucléolos e heterocromatina) e as mais claras (rosa) fundamentalmente citoplasma. 1. DESPARAFINAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 10 min. 2. HIDRATAÇÃO Cobrir a lâmina com alcoól 100º durante 3 min. Proceder da mesma forma com a série descendente de alcoois e finalmente com a água destilada durnte 1 min. 3. COLORAÇÃO Cobrir a lâmina com HEMATOXILINA – 10 min Lavar com H2O corrente (3 mudanças) Diferenciar com HCl 1% - 5 sec. Passar em H2O corrente (2 mudanças) Corar com eosina – 2 min. 4. DESIDRATAÇÃO

3 min.3 Nuclear stain. 3.5% de carbonato de sódio e 1 gota de 1% AZUL DE TOLUIDINA durante 2 min. When used in conjunction with eosin. DIAFANIZAÇÃO Cobrir a lâmina com xilol (2 mudanças). the nuclei come out dark blue and the cytoplasm and nucleoli. em cada álcool. 5. Rotular. MONTAGEM Depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. ´ Hematoxylin (Ehrlich's) C16H14O6 MW: 302. RESULTADOS e OBSERVAÇÃO Visualizar ao m. 7. DIAFANIZAÇÃO E MONTAGEM Cobrir a lâmina com xilol e depositar uma gota de meio de montagem e cobrir o corte com uma lamela. . DESPARAFINAÇÃO E HIDRATAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 5 min e depois cobrir a lâmina com alcoól 100º durante 3 min e finalmente com água destilada durante 1 min. red. Rotular. This is one of the two "cornerstone" dyes for all H & E techniques. the other being Eosin. DESIDRATAÇÃO E DESIDRATAÇÃO Lavagem 3 vezes com água destilada e desidratação com uma série ascendente de alcóois até ao álcool absoluto. used especially in histology and cytology. em cada álcool. COLORAÇÃO Cobrir a lâmina com 10 gotas de 2.56 Cobrir a lâmina sucessivamente com uma série ascendente de alcóois até ao álcool absoluto. 1 min. 2. 6. o. Mayer’s Hematoxylin PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO COM AZUL TOLUIDINA EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA 1. núcleos azuis e citoplasma rosa. 4.

7 gm Propileno glicol 100 ml . tornando-os visíveis. o azul de toluidina são azuis ortocromáticos. azul muito escuro e preto. o. Os corantes de tiazina tais como.57 5. O citoplasma violeta é metacromático porque a polimerização de uma molécula de coloraçao com certas estruturas resulta num determinado comprimento de onda de emissão alterado. OBSERVAÇÃO Visualizar ao m. O Negro do Sudão é uma susbstância não polar que se dissolve nos lípidos. Estes são então corados de vários tons de cinzento-escuro. Protocolo: Negro de Sudão/ Propileno glicol: Negro de Sudão 0. COLORAÇÕES CITOQUÍMICAS LÍPIDOS − Coloração Negro de Sudão Esta coloração é utilizada para corar todos os tipos de lípidos. que absorvem a um baixo comprimento de onda e aparecem vermelho metacromático. Os sinais de metacromasia são a mudança do espectro de aborção de certos corantes básicos quando estão unidos a polímeros polianiónicos como nucleoproteína. contudo podem estar agregadosmem dímeros ou polímeros.

Desparafinação e hidratação até alcoól a 70º do corte histológico 12. . Colocar 3 min em 85% de propileno glicol 6. TÉCNICA • • • • • Desparafinação e hidratação até alcoól a 70º do corte histológico Cubra a lâmina com o corante Sudan Black durante a noite à temperatura ambiente Lave e diferencie em alcoól a 70º o corte histológico até ver o fundo cinzento claro Lave com água da torneira Monte uma lamela por cima do corte histológico com liquído de montagem aquoso OBSERVAÇÃO DE LÍPIDOS EM CORTES HISTOLÓGICOS (SUDÃO III) Observação de lípidos em cortes efectuados em sementes. Lavar bem em água corrente e destilada 9. e agitar constantemente. 11. Lave com água da torneira 15. Cubra a lâmina com o corante Sudan Black durante a noite à temperatura ambiente 13. Agitar 7 min em Negro de Sudão 5. o.Faça um corte muito fino na semente em estudo com o auxílio de um bisturi. Passar duas vezes. Monte uma lamela por cima do corte histológico com liquído de montagem aquoso PROTOCOLO GERAL PARA COLORAÇÂO DE SUDAN BLACK B EM CORTES HISTOLÓGICOS INCLUIDOS EM PARAFINA FUNDAMENTO: O Sudão Black B é um corante básico e combina-se com grupos acídicos em compostos lipidicos e também fosfolípidos. 3 min em Nuclear fast red 8. Fixar cortes de congelação em 10% de formol 2. Visualizar ao m. Arrefecer e filtrar novamente por um filtro de vidro de meio poroso com sucção 1. A coloração dos lípidos é feita com Sudão III (corante específico) TÉCNICA 1. Filtrar em papel de filtro Whatman ≠ 2.58 Dossolver Negro de Sudão em Propileno glicol lentamente. cada 5 min em l propileno glicol 4. Lavar bem em água destilada 7. Lavar bem em água destilada 3. Montar em glicerina 10. Aquecer até 100ºC durante poucos minutos. Lave e diferencie em alcoól a 70º o corte histológico até ver o fundo cinzento claro 14.

Em seguida coloque um pouco de Sudão III noutro vidro de relógio e deixe o corte corar mergulhado no corante durante 3 a 5 minutos.Coloque um pouco de água destilada num vidro de relógio e com o auxílio de um pincel lave o corte. Os cortes são desparafinados 3.Finda a coloração lave o corte. 2. Col Sudam III COLORAÇÃO DE AZUL-DE. Montar Resultados: Os lípidos de natureza não ácida coram de rosa e os ácidos coram de azul assim como outros componentes cels bioquimicamente de natureza não lipídica . 4. 5. COLORAÇÃO VERDE DE METILO – PIRONINA Fundamento: DNA + RNA Coloração Verde-Metilo Pironina O método do verde-metilo pironina utiliza a elevada taxa de carga negativa dos ácidos nucleicos. O verde-metilo é um corante catiónico que se liga de um modo específico ao . passando-o por água destilada contida num vidro de relógio.Observe entre lâmina e lamela.NILO PARA LÍPIDOS NÃO ÁCIDOS 1. Corar 15 min numa solução de azul-de-Nilo 1%. Lavar em água 7. fazer a inclusão em parafina e cortar secções com espessura de 5µm. para retirar o excesso de corante. 3.59 2. Fixar o material biológico em formol a 10%. 4. Diferenciar rapidamente em ácido acético a 1% 6. Lavar em água 5.

Concentração da ribonuclease: 1 mg/ ml 1 para água destilada a 40 . HIDRÓLISE Colocar os cortes em ácido clorídrico normal à temperatura de 60º durante 10 min.. Passar por xilol.Duas lâminas: 1 para a ribonuclease a 40 ..Xilol (2 mudas de 10 minutos cada) 8..Água destilada 2.5 g 4.Butanol terciário (4 mudas) 7.. COLORAÇÃO DE DNA – REACÇÃO DE FEULGEN 1.5 g) 6..Purificar com clorofórmio e juntar Pironina Y (0... Lavar com água destilada....... Lavar com água destilada.Bálsamo 9. Montar... 2..4. DESIDRATAÇÃO E MONTAGEM Cobrir os cortes sucessivamente com a série ascendente de álcoois (70º..0.. uma vez que este método de coloração está sujeito a artefactos. 95º e 100º) durante 3 min. DESPARAFINAÇÃO Deitar xilol sobre o corte histológico durante 3 min.. 3. durante 4h seguida de verde de metilopironina. A execução e os resultados desta técnica dependem em grande parte da utilização de condições cuidadosamente controladas de pH da solução e da concentração dos dois corantes...Verde de metilo. Nas lâminas de controlo.100 ml 5. durante 4h seguida de verde de metilo-pironina.. Passar os cortes por 3 tinas contendo água sulfurosa durante 2 min. A existência de lâminas de controlo é importante para a interpretação dos resultados. COLORAÇÃO Colocar os cortes numa tina de coloração com o reagente de Schiff durante 1 h.60 DNA e portanto é adequado à coloração de núcleos.1M pH4..Verde de metilo-pironina (20 minutos) 3. A pironina é um corante vermelho cuja especificidade para o RNA não é tão elevada e portanto algumas proteínas podem de igual forma corar. 4... Técnica: 1. um ou ambos os ácidos nucleicos devem ser removidos.. tanto em células vivas como em material fixado... ... por extracção enzimática ou ácida.Tampão acetato 0....

Elementos que contenham DNA são corados de vermelho-púrpura. De DMAB a 5% em HCl conc. A ligação purina-ribose não é afectada pela hidrólise e consequentemente o RNA não é demonstrado por esta técnica . 9 – Passar por 2 banhos de Etanol Absoluto 10 – Passar pro acetona (para fixar o corante nuclear e não desaparecer com o tempo) 11 – Clarificar em xilol 12. da qual resultam aldeídos reactivos que sãoposteriormente demonstrados pelo reagente de Schiff. RESULTADO DA COLORAÇÃO: As proteínas ricas em triptofano coram de azul ( grânulos azuis ) Os núcleos coram de rosa vivo pela Safranina .Montar com DXP. em 100 ml de etanol absoluto e 50 ml de H2O dest. 6 – Lavar em H2O dest. utiliza-se uma hidrólise ácida com HCl 1N a 60 °C para quebrar a ligação purina-desoxirribose.Deitar xilol sobre o corte histológico durante 10 min. O método de Feulgen é sem dúvida o mais largamente utilizado e o mais quantitativo de todos os métodos citoquímicos. é possível efectuar observações morfométricas e micro-fotométricas e determinar as quantidades de DNA no núcleo das células. lavando bem o xilol 3 – Deixar secar ao ar 4 – Mergulhar 1 min o corte na sol. OBSERVAÇÃO E RESULTADOS Os núcleos celulares e o contorno nucleolar apresentam-se rosa resultante da presença de DNA. A intensidade da coloração é proporcional à concentração de DNA da nossa amostra. de Safranina de 1 gr. 8 – Lavar o excesso de corante em H2O dest. Assim. Nesta técnica. 5 – Oxidar o corte 1 min em nitrito de sódio a 1% em HCl conc.61 5. 7 – Contrastar os núcleos durante 1 min corando-os numa sol. 2 – Passar por etanol absoluto. COLORAÇÃO DE DIMETILAMINOBENZALDEÍDO/ NITRITO PARA PROTEÍNAS COM TRIPTOFANO 1 . É um procedimento específico de demonstração de desoxirribose.

7. durante 30 min. Resultados As proteínas totais coram de verde Solução Corante Fast green Ácido acético a 1% pH 2. a frio. Mergulhar os cortes em água oxigenada durante 3 min. MÉTODO DE VON KOSSA PARA A COLORAÇÃO DO CÁLCIO Fundamento: As secções de tecido são tratadas com solução de nitrato de prata. Mergulhar as secções de tecido cortadas no criótomo numa solução saturada de benzidina acidificada a pH 4. 2. Tratar os cortes com ácido tricloroacético a 5%. recém-preparado. em solução de ácido acético a 1%. recém-preparado.O local de actividade das peroxidades aparece em cor azul. Mergulhar as lâminas em ácido tricloroacético a 5%. e a seguir várias vezes em água destilada. montar e observar ao microscópio óptico. 6. Secar.5 com algumas gotas de ácido acético durante 3 min. o cálcio é reduzido pela luz forte e substituido com depósitos de prata visualizados como prata metálica. 3. 4. . Diafanizar em xilol e montar com entellan. 5. Desidratar em três banhos de butanol. 3.7 0. Corar com a solução fast green a pH 2. SEGUNDO PRENANT 1.1g 100ml EVIDENCIAÇÃO DE PEROXIDASES PELO MÉTODO DA BENZIDINA. a 90ºC.62 COLORAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS POR FAST GREEN ÁCIDO SEGUNDO DEITCH Procedimento 1. durante 15 min. 2. passando a castanho com o correr do tempo o que evidencia a presença de peroxissomas. Lavar os cortes durante 1 min.

os núcleos vermelhos e os citoplasmas rosa. EVIDENCIAÇÃO DE POLISSACÁRIDOS EM ESFREGAÇO DE SANGUE REACÇÃO DO ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF (P. Se fôr necessário deixar mais tempo até o cálcio ficar negro.A. 8 – Desidratar.S) TÉCNICA: 1) FIXAÇÃO Deitar alcool metílico sobre a lâmina durante 10 minutos 2) OXIDAÇÃO Colocar a lâmina numa tina de coloração com ácido periódico a 1% durante 15 minutos.Lavar em H2O corrente. Passar a lâmina por 3 tinas contendo água sulfurosa durante 2 minutos em cada. . 5 – Lavar uma vez em H2O corrente e outra em H2O dest. Lavar com água corrente.red para o núcleo. 2 – 1 h com uma solução de 5% de nitrato de prata em frente de uma lâmpada de 60-watt. 4 – 5 min com uma solução a 5% de tiosulfato de sódio. 3) COLORAÇÃO Colocar a lâmina numa tina de coloração com o reagente de Schiff durante 20 minutos. na estufa a 37ºC. RESULTADO DA COLORAÇÃO: Os sais de cálcio ficam negros. 7 . diafanizar e montar uma lamela em meio de montagem.63 1 – Desparafinar e hidratar com H2O dest. 3 – Lavar três vezes com H2O dest. 6 – Contrastar 5 min fast.

7. 5. Mergulhar os cortes durante 2 min em 2% de sulfato de amónio. 5. 3. Lavar rapidamente em água destilada Incubar 1-2 dias em nitrato de prata a 1. Lavar em água destilada Secar. Tratar os cortes 2% de nitrato de cobalto. Secar entre papel de filtro. 4. 3. formando aldeídos. A técnica mais utilizada na histoquímica de hidratos de carbono é a reacção ácido periódico − Schiff que é positiva para estruturas contendo hexoses neutras e/ou ácidos siálicos. que oxida a ligação carbonocarbono. A coloração PAS é utilizada para a demonstração de membranas basais e mucosubstâncias secretadas pelo epitélio de vários órgãos. PROTOCOLO GERAL PARA EVIDENCIAÇÃO DO COMPLEXO DE GOLGI. 2% de nitrato de cálcio e 1% de cloreto de magnésio a pH 9. Secar.5% Lavar em água destilada Incubar durante 12 h numa solução recém preparada de água destilada com 2% de hidroquinona. .24 horas em água destilada com 1% de nitrato de uranilo e 15 ml de formol. Os cortes de congelação são incubados em água destilada a 37º durante 6h com 2% de β. É uma técnica usada. os quais reagem com o reagente de Schiff.64 Lavar com água destilada.glicerofosfato de sódio.15% de sulfato de sódio e 15 ml de formol. 4) COLORAÇÃO DE CONTRASTE Cobrir a lâmina com hematoxilina durante 5 minutos. Lavar muito bem em água destilada. COLORAÇÃO DA FOSFATASE ALCALINA – EVIDENCIAÇÃO DO COMPLEXO DE GOLGI (GOMORI) 1. para fins de diagnóstico. No método de PAS as secções são tratadas com ácido periódico. formando a cor magenta. SEGUNDO RAMÓN E CAJAL 1. 6. 4. Lavar em água corrente. Fixar o material biológico 8. Lavar muito bem em água destilada. 2. por exemplo. em biópsias de fígado e rim. Observar ao microscópio.4. 0. montar e observar. 2.

arrefecida. Este método é muito utilizado para localizar lisossomas. formando fosfato de chumbo insolúvel. Lavar bem em água destilada. PROTOCOLO Soluções “stock”: A) Stock HCl-Pararosanilina • Pararosanilina 1g • Água destilada 20ml • HCl concentrado 5ml A Pararosanilina é dissolvida na água destilada e o HCl é adicionado.65 6. Numa segunda fase do método processa-se à imersão dos cortes numa solução de sulfato de amónio. que reagem com nitrato de chumbo. COLORAÇÃO DA FOSFATASE ÁCIDA – EVIDENCIAÇÃO DO LISOSSOMA Um dos métodos para demonstrar a actividade da fosfatase ácida é o método de Gomori. Pela acção da enzima ocorre a hidrólise do glicerofosfato. com liberação de ioes fosfato. A solução é aquecida gentilmente. B) Nitrito de sódio • • Nitrito de sódio 2g Água destilada 50ml . que consiste em incubar cortes de tecidos fixados em formol numa solução contendo glicerofosfato de sódio e nitrato de chumbo em tampão pH 5. que são partículas do citoplasma ricas em fosfatase ácida.0. que se precipita no local onde há actividade enzimática. que transforma o precipitado incolor de fosfato de chumbo num precipitado negro e electrão-denso de sulfatode chumdo. filtrada e guardada no frigorífico.

4 ml e armazenada no congelador. Ajuste o PH a 4.HCl (A) 0.vermelho . Protocolo: 1 -Incubação dos cortes histológicoa 10 a 60 min a 37 ºC 2 -Lave bem em água destilada e “tap” água 3 -Coloração 15 a 30 seg. Este fosfato é para guardar no congelador em aliquas de 0. com 2% de verde de metilo (A hematoxilina pode ser usada como alternativa) 4.Lave 5 – Desidrate “clear”.88 g Àgua destilada 200 ml D) Fosfato de Naftol • • Fosfato de Naftol 58 mg Dimetil formamida 5 ml.6 ml • Misture estas soluções e adicione a solução de nitrito de sódio/pararosanilina.0 “titter” e use imediatamente.5 ml Preparação da solução de incubação: • Pararosanilina . • Fosfato de naftol (D) • Tampão acetato (2 ml) • Àgua destilada 6. C) Tampão acetato de sódio • • • Acetato de sódio (3H2O) 3.66 A solução pode ser preparada na altura ou separada em alíquotas de 0.4 ml • Adicione a Pararosanilina gota a gota ao nitrito de sódio descongelado até que a solução esteja descorada.4 ml • Nitrito de sódio (40 mg/ml) (B) 0.7-5.88 g Barbitone de sódio 5. Monte as secções em DPX Resultado Actividade da fosfatase ácida .

Lavar em álcool 100° (2x).bservar a preparação ao microscópio e registar as observações. deixar secar ao ar. . água → 2 minutos. Material biológico: Esfregaço de sangue Procedimento: -Efectuar um esfregaço.Corar com Laranja G 10 segundos. escorrer o excesso. .Montar com DPX. -Deixar secar ao ar 1 hora.Fixar o esfregaço com a solução de álcool/ácido acético durante 15 minutos. .Lavar rapidamente em água.Clarear em xilol (3x).Observar ao microscópio e registar as observações. Corar 10 minutos com a solução de Giemsa (1:6) e lavar com água destilada. . . como a coloração de protozoários. .Lavar em álcool 100° (2x). . . -Fixar 2 a 3 minutos com etanol a 95 °C. -Corar 10 minutos com a solução de May-Grunwald e lavar com água destilada.Hidratar (álcool 100°→ 2 minutos. inclusões virais.-Comparar os diferentes tipos de Papanicolaou O método de Papanicolaou é uma técnica de rotina largamente utilizada pelos patologistas clínicos para reconhecer células derivadas de tumores malignos.Corar com hematoxilina-eosina 2 minutos. . Esta coloração permite observar a forma e dimensão das células e fornece uma boa visualização da morfologia nuclear e da presença no citoplasma de grandes quantidades de ribonucleoproteínas ou de depósitos de queratina ou muco. . álcool 50°→ 2 minutos.Diferenciar em álcool ácido 5 segundos . Material biológico: Esfregaço da mucosa oral Procedimento: .Corar com hematoxilina 4 minutos.Álcool 100° (2x). por exemplo). . . etc. álcool 70°→ 2 minutos. tecidos hematopoiéticos (sangue e medula óssea.Efectuar um esfregaço da mucosa oral.Azular em água corrente . .67 COLORAÇÕES CITOLÓGICAS Coloração de Giemsa Acoloração de Giemsa apresenta-se como um método histomorfológico convencional que tem uma grande variedade de aplicações.

Giemsa MICROMETRIA E CARIOMETRIA A micrometria consiste em fazer medições de preparações microscópicas com o microscópico óptico. . .Micrómetro ocular: corresponde à escala utilizada para fazer medições microscópicas (parte superior da Figura). Há 2 micrómetros: .68 .Micrómetro objectivo: lâmina na qual está gravada uma escala milimétrica em centésimos de milímetro (parte inferior da Figura). Col.

Material biológico: Esfregaço da mucosa oral Procedimento: Utilizar um palito para "raspar" ao longo do sulco gengival (espaço entre a superfície do dente e as gengivas). Cariometria consiste na determinação da superfície nuclear. lavar com solução de lugol .Retirar o excesso de corante. calcula-se o nº de divisões do micrómetro ocular que correspondem a um determinado nº de divisões do objectivo. Coloração de Gram A coloração de Gram é um método no qual se baseia a distinção entre bactérias Gram positivas (+) e Gram negativas (-).Cobrir a lâmina com a solução de violeta de cristal – deixar actuar l' . A reacção positiva ou negativa é uma resposta à presença ou ausência de componentes polissacáridos específicos nas paredes celulares das bactérias.Diferenciar com solução diferenciadora . ou seja o valor de cada divisão da escala do micrómetro ocular. e coloca-se na platina do microscópico a preparação.69 Para determinar as dimensões de um objecto microscópico. Fixar o esfregaço passando a lâmina rapidamente por uma chama 3 vezes. misturar. Fazer um esfregaço (figura 1) e deixar secar ao ar. Atenção: Não sobreaquecer a lâmina.Cobrir a lâmina com a solução de safranina . Colocar uma gota de tampão fosfato numa lâmina limpa e adicionar a amostra do líquido cravicular retirado da boca.deixar actuar l' . Remove-se este último. Calcula-se o valor do coeficiente micrométrico.Cobrir a lâmina com a solução de lugol .Lavar cuidadosamente com água destilada . 0 esfregaço tem de estar virado para cima! Deixar arrefecer e corar Coloração: .deixar actuar l' . Determina-se o nº de divisões da escala do micrómetro ocular.Lavar cuidadosamente com água destilada .

c) Esperar dois ou três dias até a solução ficar castanha e filtrar. 5. Colar os cortes semi. Mergulhar a lâmina na solução até o Epon dissolver (cerca de 10 min ou mais). 3. Fig 1. 3.70 . PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA INCLUÍDO EM EPON PARA COLORAÇÃO Remoção do Epon 1. com auxílio de um agitador magnético. O uso da ferritina em microscopia electrónica. Corar com a técnica pretendida. 4. até à saturação.peroxidase em microscopia óptica e electrónica. Localizaçäo dos anticorpos anti .Registar as observações. Preparação da solução b) Dissolver pastilhas de hidróxido de sódio em etanol absoluto. Lavar muito bem em etanol absoluto e depois em água.Imagem com contrastaçãonegativa de vírus .Observar ao microscópio com objectiva de imersão (100 x) .Deixar secar .peroxidase. 2. Imunofluorescência Directa e Indirecta. Nota: Bactérias Gram +: azul-violeta Bactérias Gram –: rosa a vermelho IMUNOCITOQUÍMICA 1. 2.Observaçäo de diferentes cortes histológicos mostrando várias proteínas marcadas com anticorpos anti .finos e deixar secar até ficarem bem colados.Lavar cuidadosamente com água destilada .

3 Cultura e meios de cultura . Com efeito. fazem. as quais são contudo. Como é evidente.1Escolha do tecido Para se observar cromossomas em mitose é necessário um tecido a partir do qual se obtenham com facilidade células em divisão. abordar alguns passos destas técnicas.2 Colheita Colhem. levando à detecção de numerosas alterações cromossómicas numéricas e estruturais e tornando possível em muitos casos um diagnóstico laboratorial seguro que. a cultura de sangue periférico é o método mais frequentemente usado na detecção laboratorial de anomalias cromossómicas.se igualmente culturas celulares a partir de fibroblastos. os tecidos que se encontram espontaneamente em divisão como é o caso da medula óssea. CULTURA CELULAR 1. até há relativamente pouco tempo. 2. Emboraa taxa de divisão celular seja baixa nos linfócitos circulantes. 1. nomeadamente quando se destina a uma cultura celular. Quando necessário.se aproximadamente 3 cc de sangue periférico com uma seringa heparinizada. Podemos referir. Entre os outros. bastante mais complexas 1.Endocitose de vírus mediada por receptores TÉCNICAS DE OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES CROMOSSÓMICAS stas técnicas têm vindo a ser aperfeiçoadas ao longo dos tempos e são de enorme importância para a obtenção de um cariotipo. era difícil de fazer. 1. recorremos a eles unicamente em casos particulares.71 Fig. para qualquer tipo de colheita. verificou-se ser o tecido sanguíneo aquele que mais facilmente proporciona o material necessário para uma cultura celular.los a sofrer divisão. é imprescindível que se trabalhe com assépsia. nomeadamente à medula óssea quando se trata de doentes leucémicos. em primeiro lugar. Iremos pois. vários agentes mitogénicos podem estimilá. tecido testicular e tecidos neoplásicos. Contudo.

Os tubos ficam no congelador durante aproximadamente 30 min para fixação dos cromossomas. Do outro fazem-se as lâminas (de 6 a 8). ser reduzido de 24 horas. igualmente. No fim do tratamento pela colchicina o conteúdo dos frascos é transferido para tubos de centrífuga. o Earle. adiciona-se colchicina a cad frasco (6 gotas) a fim de se fazer parar as mitoses em metafase. A partir desta altura não são necessários cuidados especiais de assépsia. deixando-se sempre uma pequena quantidade acima do depósito. A primeira centrifugação. Para cada caso são feitos habitualmente dois frascos que são mantidos numa estufa a 37ºC durante 72 horas. Este é posto cuidadosamente em suspensão para se fazer o choque hipotónico com aproximadamente 6 ml de KCl 0. Este tratamento é um dos passos essenciais da técnica. obtendo-se neste caso um menor número de mitoses. faz-se durante 5 min a 1500 r/m. Em cada um deita-se aproximadamente 0.soro de vitela fetal ou soro humano. assim como as seguintes. Em casos particulares.72 Há diversos meios de cultura. Termina aqui a primeira parte da técnica. o RPMI 1640. o Ham F 10. . Ao meio de cultura adiciona-se ainda: . alguns com característicasbastante diferenciadas. Podemos nomear entre outros. Um dos tubos fica geralmente de reserva e é guardado no congelador. como factor de crescimento .agente mitogénico. Na última lavagem deve-se conservar aproximadamente 4 a 5 mm de sobrenadante para se fazer as lâminas. As culturas são feitas em frascos de vidro esterilizados contendo todos os componentes indicados. o McCoy. Este último é o meio de cultura adequado para salientar afragelidade do cromossoma X.São ricos em aminoácidos. O sobrenadante é rejeitado por aspiração com pipeta de Pasteur. Este tem de ser preparado pouco antes de se usar e é mantido no congelador. Foi descoberto por Hsu em 1952 e constitui uma etapa decisiva pois provoca um aumento do volume celular que tem como efeito a rotura das membranas e consequente dispersão dos cromossomas. visto ser probre em ácido fólico.3 cc de sangue.antibióticos (estreptomicina e penicilina) . extraída do feijão encarnado (Phaseolus vulgaris).075M que fica a actuar durante 4 min em banho-maria a 37º C. Este tempo pode prolongar-se sem inconvenientes por mais 24 horas e pode. e específica para o linfócito T. Deitam-se então umas gotas de fixador (mistura de metanol e ácido acético glacial na proporção de 3:1) após o que se agita rapidamente para evitar a formação de grumos. Completa-se então a adição de 5 ml de fixador. o TC 199. rejeição do sobrenadante e adição de fixador) a fim de se eliminar os restos de hemoglobina e outros resíduos que estejam em suspensão. glúcidos e vitaminas. 1. para serem utilizados consoante o que se pretende observar com mais pormenor. O agente mitogénico mais usado é a fitohemaglutinina (PHA).4Técnica Hora e meia a duas horas antes do termo da cultura. de modo a obter-se um depósito o mais limpo possível. Seguem-se 2 ou 3 lavagens com fixador (centrifugação. podem utilizarse outras lecitinas mitogénicas como a concanavalina A e o pokeweed. Os tubos são novamente centrifiugados para separação do meio hipotónico que será aspirado com a pipeta de Pasteur.

.acção inibidora do fuso acromático pela colchicina. através de um conjunto de processos. etiquetam-se e guardam-se numa caixa à temperatura ambiente durante aproximadamente 1 semana para se proceder à técnica das bandas G. na maior parte das vezes por Giemsa a 4%. c) digestão enzimática dos cromossomas seguida de coloração por Giemsa (bandas G).V. com relativa facilidade. As técnicas principais designam-se por uma letra relacionada com o método utilizado ou com a região do cromossoma que põem em evidência. por ex) à experiência adquirida por cada técnico. BANDAS 2. de forma a que quando vão ser utilizadas possam ficar completamente cobertas por uma fina camada de água. . após coloração. o que se tornava praticamente impossível se se tratava de pequenas diferenças.acção mitogénica da fitohemaglutinina no linfócito T. pelo que se torna fácil distingui-las. b) tratamento térmico dos cromossomas em meio salino.73 As lâminas de que nos servimos têm que ser cuidadosamente lavadas.. seguido de coloração por Giemsa (bandas R e bandas C). tornou-se possível verificar se há falta ou excesso de material genético. São zonas do cromossoma que.1 Aspectos gerais Dá-se a designação de bandas a estruturas postas em evidência nos cromossomas mitóticos ou meióticos. na medida erm que cada cromossoma apresenta um conjunto típico de bandas. Além disso. pois são o único meio que permite distinguir inequivocamente os cromossomas com maiores semelhanças. cromossomas em metafase: . Os pormenores da técnica variam de laboratório para laboratório e as causas desta variação vão desde as características climéticas do país (como temperatura e humidade) e das condições ambientais criadas dentro do laboratório (existência ou não de ar condicionado. se paresentam com diferentes intensidades. Há vários métodos de obtenção de bandas. Para fazer as lâminas põe-se o depósito em suspensão com a pipeta e deita-se a cada uma 3 gotas.tratamento hipotónico. 2. Os mais comuns baseiam-se em: a) irradiação dos cromossomas com U. as lâminas eram simplesmente coradas. alternadamente claras e escuras. Deixam-se secar ao ar. Antes de terem sido descobertas as técnicas de obtenção de bandas. a uma altura aproximada de 4 cm. As técnicas de obtenção dos diversos tipos de bandas revelaram-se de primordial importância. . Antes de passar à técnica das bandas é importante recordar as 3 etapas fundamentais cuja descoberta permite obter hoje. após coloração específica e observação da fluorescência por eles emitida (bandas Q). Este continua a ser o corante mais utilizado pois permite a observação das bandas induzidas pela maior parte dos diversos métodos.

particularmente a humidade.2 Técnica das bandas G Esta é a técnica de rotina utilizada neste laboratório. Dest modo. quando a atmosfera está mais seca a tripsina precisa de mais tempo para actuar.0. havendo outros que preferem fazer habitualmente bandas R. (1971) e a Seabright (1971). o que significa que têm uma localização inversa das anteriores. o memso acontecendo para lâminas mais velhas. Todos os métodos de bandas são de difícil realização porque não há necessidade de obter de antemão o tempo exacto durante o qual se deve fazer actuar os seus agentes indutores. Para lâminas com uma semana. . Deixa-se secar e monta-se uma lamela por cima. isto é. Há também 2 tipos principais de bandas para a heterocromatina: a) bandas C (centrómero) b) bandas NOR (região dos organizadores nucleolares) 2. apresentam-se claras quando as anteriores são escuras e viceversa. Assim. mas há também um método térmico para as conseguir. evidenciada pela alternância das bandas Q ou G e R. coloca-se uma tina de lâminas de forma alta com 90 ml de uma solução de tripsina em soro fisiológico na proporção aproximada de 1:2. a concentração é de 250 mg de tripsina em pó em 100 ml de tampão fosfato de pH= 7. neste caso a tripsina. e a idade das lâminas têm grande influência. Pelo método proteolítico (enzimático) esta técnica deve-se a Dutrillaux e col. findos os quais se passa a lâmina por água corrente. lava-se 2 vezes em soro fisiológico e cora-se numa solução de Giemsa a 4% durante 10 min. isto é. b) Bandas R (reverse) Coram o restante da eucromatina. Introduz-se a lâmina na tina controlando-se o tempo com um cronómetro. As condições atmosféricas.74 É este último o método utilizado neste laboratório para obter bandas G. têm uma topografia coincidente e coram aproximadamente 50 % da eucromatina. faz-se actuar a tripsina de 10 seg a 1 min. é por tentativas que se obtém tempo de actuação necessário. para lâminas com a mesma idade. Seguidamente. Há dois tipos principais de bandas para a eucromatina: a) Bandas Q (quinacrina) e bandas G (Giemsa) Têm a mesma localização. tanto mais que se verificam ainda variações de caso para caso. Em banho-maria a 37º C. A eucromatina é pois.

As metáfases são procuradas com a objectiva de ampliação 10x e analisadas e fotografadas com a objectiva de imersão de . É o caso. nomeadamente se existe qualquer dúvida referente a uma zona terminal clara. se houver inversão pericêntrica ela passa. (1971). relativamente frequente. A coloração faz-se com Giemsa a 4% e as metafases apresentam-se bastante pálidas. desnaturação a 87º C e deve-se fundamentalmente a Dutrillaux e Lejeune (1971). (1975) e por um método de precipitação do nitrato de prata devido a Bloom e Goodpasture (1976). A coloração é feita com uma solução de mostarda de quilacrina e a observação é feita num microscópio de fluorescência.3 Outros tipos de bandas a) Bandas R Como já se disse. (1970). de tal modo intensa que ele pode ser reconhecido mesmo em núcleos interfásicos. Tudo deste cromossoma tem particular interesse este tipo de bandas. da inversão pericêntrica do cromossoma 9. visto que com este método as extremidades dos cromossomas se apresentam bem coradas. sobretudo a região distal do braço longo do cromossoma Y.75 2. na parte proximal dos braços longos dos cromossomas 1.OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO E FOTOGRAFIA A observação das lâminas faz-se em fundo claro. 9 e 16. os grãos de prata concentram-se nos braços curtos dos cromossomas acrocêntricos. b) Bandas Q Deve-se a Caspersson e col. A fluorescência do seu braço é. Coram especificamente a heterocromatina constitucional que está localizada nas regiões centrométricas. c) BANDAS C Devem-se fundamentalmente a Arrighi e Hsu (1971) e Yunnis e col. Com efeito. pelo que com este tipo de bandas se visualiza com facilidade uma alteração muitas vezes difícil de diagnosticar apenas com bandas G. assim como certo tipo de anomalias. O padrão das bandas é igual ao das bandas G e apresentam-se alternadamente escuras e brilhantes. d) BANDAS NOR Podem ser postas em evidência por um método de desnaturação (bandas N) devido a Funaki e col. por vezes. Certas regiões heterocromáticas brilham intensamente. é possível observar os polimorfismos resultantes da variação da heterocromatina. Neste último. pelo menos parcialmente. para o braço curto. É um método por tratamento térmico. na parte distal do braço longo do cromossoma Y e nos braços curtos dos cromossomas acrocêntricos. apresentam um padrão inverso do das bandas G e só se utilizam neste laboratório em casos particulares. Os cromossomas apresentam-se uniformemente pálidos e só as referidas regiões coram fortemente. visto a heterocromatina se situar na parte proximal do braço longo do cromossoma. 3. Deste modo.

no que se refere à medula. à sua má qualidade.76 ampliação 100x. O resto da técnica é praticamente igual. variando apenas o tempo do choque hipotónico que aumenta para 6 minutos. não constantes. as maiores dificuldades. O essencial das regras adoptadas foi agrupado num volume (ISCN. podendo. uma vez que a descoberta das bandas veio permitir a sua rigorosa identificação. As oculares são de 12. os cromossomas apresentam-se. os cromossomas apresentam-se com uma mapliação de aproximadamente 2800x. Na fotografia. grande parte das vezes. Actualmente.1 ml de medula. mesmo tratando-se de um mosaico (existência num indivíduo de mais do que uma linha celular) há a garantia de não passar despercebida qualquer anomalia. É feito na medula óssea e . Faz-se a análise directa de 10 a 20 metafases. Quando se encontra alguma alteração o número de metáfases analisadas aumenta. Como se disse. Observam-se também com frequência cromossomas anómalos que possuem uma morfologia diferente da dos cromossomas . Dentre as melhores metáfases observadas. e contam-se os cromossomas de mais 30 ou 40. além do reduzido número de metafases. consoante os casos. Com efeito. É precisamente ao resultado da ordenação dos pares de cromossomas que se chama cariotipo. contudo. A aneuploidia (desvio do número normal de cromossomas) é bastante frequente. faz-se um exame directo e um outro após 24 horas de incubação na estufa a 37° C. Paris (1971) e Estocolmo(1977). A determinação do tempo de actuação da tripsina é extremamente demorada e penosa e as bandas raramente ficam nítidas. essencialmente. Os principais critérios para essa ordenação são o tamanho relativo e a posição do centrómero. fotografam-se geralmente 4. Assim.5x o que equivale a dizer que observamos com uma ampliação de 1250x. Como é lógico. Chicago (1966). apresentando pequenas variações relacionadas com o tipo de tecido (medula óssea) e com o número de leucócitos. No caso do sangue periférico faz-se uma cultura de apenas 24 horas quando o número de leucócitos é superior a 100000 e de 48 horas se esse número oscila entre 50000 e 100000. Desta forma. em caso de aplasia medular. 1978) e é utilizado na generalidade dos laboratórios. a quantidade de sangue a cultivar deverá ser inferior à que se utiliza nos casos em que o número de leucócitos é normal. verificando-se muitas trissomias. o outro frasco fica a incubar 24 horas após o que se procede da mesma forma. visto ela estar espontaneamente em divisão activa. Em cada frasco com meio de cultura e soro deita-se 0. ser superior a 100. a arrumação dos cromossomas não apresenta qualquer dificuldade. A técnica é em tudo semelhante à já descrita. Num deles adiciona-se de imediato a colchicina que fica a actuar durante meia hora. em regra. muito pequenos e juntos. As alterações que podem surgir são muito variadas e. É o posterior exame ao microscópio que apresenta. no sangue periférico cultivado sem agente mitogénico. ESTUDO DAS LEUCEMIAS Este estudo é particularmente difícil devido não só ao reduzido número de metáfases que habitualmente se consegue obter como. nalguns casos. A partir das fotografias ampliadas recortam-se então os cromossomas que são arrumados segundo critérios bem determinados estabelecidos em diversas reuniões internacionais: Denver (1961).

no pericarpo de certos frutos e em raízes. Os amiloplastos são organitos celulares especializados no armazenamento de amido. Como por exemplo temos o chamado cromossoma de Filadélfia (Ph 1) que constitui das alterações mais frequentes e também mais procuradas devido ao seu importante valor diagnóstico na leucemia mieloide crónica. ORGANITOS CELULARES VEGETAIS. Basicamente é constituído por uma mistura de dois polissacáridos. Os cromoplastos são plastos pigmentados.77 normais e a que se chama cromossomas marcadores. de uma translocação entre este cromossoma e o 9 (por vezes o 8). Sua utilização como auxiliar na identificação de fármacos de origem vegetal. ricos em carotenos. . O amido é um polímero de condensação da glicose formada nas plantas durante a fotossíntese. Existem sobretudo em caules subterrâneos. Existem em epidermes de órgãos expostos à luz e em algumas raízes. leucoplastos e amiloplastos. xantofilas ou licopenos. Identificação e caracterização de grãos de amido. amarela ou vermelha. As clorofilas a e b são os pigmentos predominantes nestes plastos. as quais são denominadas estrias ou camadas. conferindo-lhes uma cor verde. é o que se verifica com o amido. Circundando o hilo pode-se observar ou não uma sucessão de zonas claras e zonas escuras. respectivamente. Os cloroplastos existem nas células fotossintéticas. cromoplastos. acumulando-o em grãos de vários tamanhos. raízes tuberculosas e sementes. A observação microscópica de um grão de amido pode revelar a presença de um ponto ou ranhura simples ou cruzada. Encontram-se Nas células epidérmicas das pétalas de algumas flores. merecem um estudo detalhado. em função da sua importância na identificação de fármacos de origem vegetal. apresenta-se como uma delecção do cromossoma 22. a amilose e a amilopectina. através da consulta da Farmacopeia Portuguesa. não possuem pigmentos. porém. formações estas denominadas hilo. APLICAÇÕES AO ESTUDO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL O SISTEMA PLASTIDIAL Observação de diferentes tipos de plastos em microscopia óptica: cloroplastos. Visualmente. Trata-se. central ou excêntrica. bolbos e tubérculos. conferindo-lhes uma cor laranja. Os plastos são organitos celulares com uma estrutura e função específica. Determinadas inclusões celulares. Os leucoplastos são plastos incolores.

o tipo de hilo e o estado de agregação. CROMOPLASTOS E AMILOPLASTOS.78 A posição e a forma do hilo são importantes na identificação do grão de amido. Observe à lupa os exemplares de um Briófito. GRÃOS DE AMIDO E A SUA IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS Material vegetal: 1 – filídeo de briófito 2 – folha de pteridófito 3 – raíz de Daucus carota 4 – baga de Lycopersicum esculentum 5 – tubérculo de Solanum tuberosum 6 – cariopses e/ou farinha de Oryza sativa.1.O. Faça o esquema com a respectiva legenda. originando compostos de inclusão nos quais a cor varia do azul ao arroxeado. O iodo forma um complexo com a amilose..O. . bem como a centricidade ou não das camadas. Destaque um fragmento da epiderme da página inferior da folha de um Pteridófito. 2. Destaque um dos seus filídeos. São características importantes na identificação de amidos: a forma. 1.. Zea mays e Triticum aestivum Material de apoio: 1 – lupa 2 – microscópio óptico composto (M. TIPOS DE PLASTOS: CLOROPLASTOS. LEUCOPLASTOS. da acordo com o tamanho da cadeia polissacarídica.C.C. Os grãos de amido adquirem cor azul-arroxeada característica.O. monte em água destilada e observe ao M. quando tratados pelo lugol diluído. Faça uma preparação e observe ao M. a estrutura. Registe a forma das células e tenha especial atenção ao tipo de plastos nelas existentes. Pelo método de irrigação coloque lugol na preparação anterior. Registe eventuais alterações.) 3 – lâminas e lamelas 4 – bisturi 5 – pinça 6 – pincel Reagentes: 1 – água destilada 2 – solução de lugol Métodos: 1. Consultar a Farmacopeia Portuguesa para as descrições dos amidos observados na aula.C.

O CONTEÚDO VACUOLAR E A SUA IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL Material vegetal: 1 . Pelo método de irrigação coloque lugol na preparação anterior. Faça o esquema com a respectiva legenda. Faça o esquema com a respectiva legenda.o.folhas.) 2 .. (T.água destilada 2 . Tem ao seu dispor material em pó. o. Repita o teste do lugol para esta preparação.O. o mais fino possível.C. Faça o esquema com a respectiva legenda.Faça o esquema com a respectiva legenda.bisturi e pinça 4 .microscópio óptico (m. 6. Registe eventuais alterações.amónia 3 .O. localização do hilo e faça os respectivos esquemas. Faça um corte longitudinal. 3. no tubérculo de Solanum tuberosum L. Zea mays L.3 .. 5.O. Anote os tipos de grãos de amido observados para cada material e refira a sua forma. Obsrve ao M.CONTEÚDO VACUOLAR DISSOLVIDO 1.1. 6. Faça um corte transversal.Caracterize o tipo de vacúolos encontrado.Destaque a epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor. Registe eventuais alterações e o tipo de plastos observados. 1. 1.C. Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m.O..2 .Observação de vacúolos corados naturalmente 1.1 .. assim como o tipo de substância neles armazenada e a forma de armazenamento. dimensões relativas..lâminas e lamelas 3 . 1. Monte em água destilada e observe ao M. na raiz de Daucus carota L. pétalas e pericarpos de frutos de várias espécies Material de apoio: 1 . vulgare Vill. entre lâmina e lamela. bem como a substância e a forma sob a qual aí se encontra armazenada. e faça o registo do tipo de plastos que encontra neste orgão. 4. e Triticum aestivum L. Monte em água destilada e observe ao M..79 2. De uma baga de Lycopersicum esculentum Mill.).Pelo método de irrigação introduza amónia como novo meio de montagem. 1.1.Registe eventuais alterações. proveniente de cariopses de Oryza sativa L.4 . retire um fragmento de mesocarpo (polpa) e esmague--o levemente.C.1. .pincel Reagentes: 1 . 5.C.5 ..reagente a designar A . Registe o tipo de plastos que observa neste orgão. Faça a preparação do material em água destilada e observe ao M. o mais fino possível. VACÚOLOS. Alguns amidos utilizados na Farmacopeia Portuguesa distinguem-se pelos seus caracteres particulares.

faça o esquema com a respectiva legenda. o.Destaque um pedaço de epiderme inferior do material vegetal ao seu dispor.Observação de vacúolos com inclusões 3. faça os respectivos esquemas com legenda. 2. pertencentes às classes Monocotiledoneopsida e Eudicotiledoneopsida. C .CONCLUSÕES Atendendo às várias observações feitas tire uma conclusão geral quanto à natureza do conteúdo vacuolar e a sua importância na identificação de fármacos. 2 – Recorrendo a um quadro ou a um esquema proceda à distinção entre os diferentes orgãos e estruturas dentro de cada classe.1 .3 . HISTOLOGIA – ANATOMIA VEGETAL. Faça o esquema com a respectiva legenda e registe a sua observação. caules e folhas de alguns exemplares de Anthophyta.Observação de vacúolos não corados naturalmente 2. 3 – De que modo é que a identificação dos diferentes tecidos e orgãos pode ser útil na identificação de fármacos. o. 4 . atendendo ao tipo de conteúdo vacuolar encontrado.CONTEÚDO VACUOLAR NÃO DISSOLVIDO 3.. Observe ao m.2 . o. 2. tendo como meio de montagem a mesma solução onde permaneceu anteriomente. o.Faça um corte transversal. fazendo ainda a interpretação do que observa. Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m. . Monte em água destilada entre lâmina e lamela e observe ao m. Coloqueo em contacto com o reagente disponível. registe eventuais alterações interpretando o que observa tendo em atenção o tipo de vacúolos observados e a natureza do seu conteúdo. Faça o esquema com a respectiva legenda e registe a sua observação.Proceda ao esmagamento de um pedaço de folha do material vegetal ao seu dispor.1 . Observe ao m.. B .80 2. no material vegetal ao seu dispor. 1 – Através da sua observação ao m. IMPORTÂNCIA NA IDENTIFICAÇÃO DE FÁRMACOS DE ORIGEM VEGETAL MATERIAL: Tem ao seu dispor preparações definitivas de cortes transversais de raízes. o mais fino possível.Monte agora o primeiro pedaço de epiderme.Monte o outro pedaço de epiderme entre lâmina e lamela tendo como meio de montagem água destilada. o.

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