1 I PARTE Aminocidos

Estrutura dos aminocidos: Da anlise de um nmero vasto de protenas, chegou-se concluso de que todas as protenas so compostos por 20 aminocidos, ditos fundamentais. Os aminocidos mais comuns so os conhecidos por -aminocidos, pois possuem um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxlico (-COOH):

NOTA: A excepo dos -aminocidos a prolina, pois possui um segundo grupo amino (-NH-). Todos os aminocidos diferem entre si no grupo R. Propriedades Gerais: Os grupos amino e carboxlicos tendem a ionizar-se. Assim, como o pK 1 (pK para o grupo carboxlico) roda o valor 2.2 e o pK 2 (pK para o grupo amino) ronda o valor 9.4, isto vai implicar que no pH fisiolgico o grupo amino esteja protonado e o grupo carboxlico esteja na sua forma ionizada COO-. Conclui-se assim que um aminocido pode comportar-se tanto como cido como base. Molculas como estas, que possuem grupos com cargas de sinal oposto so chamadas de zwitteries ou ies dipolares. Os aminocidos, tal como outros compostos inicos, so mais solveis em solventes polares do que em solventes apolares. Estas propriedades inicas dos aminocidos vo influenciar as propriedades qumicas e fsicas de um aminocido livre e dos aminocidos em complexos proteicos. Ligaes peptdicas: Os aminocidos podem ser polimerizados para formar cadeias; este processo pode ser representado como uma reaco de condensao (em que h a eliminao de uma molcula de gua). A resultante ligao CO-NH a chamada ligao peptdica.

Polmeros compostos por dois, trs, poucos ou vrios aminocidos so chamados dipeptdeos, tripeptdeos, oligopeptdeos e polipeptdeos, respectivamente. Depois de estarem includos num peptdeo, os aminocidos individuais so designados por resduos aminocidos. Polipeptdeos so polmeros lineares, em que cada residuo aminocido participa em duas ligaes peptdicas; os resduos das duas pontas do polipeptdeo apenas participam numa ligao peptdica. O resduo que tem o grupo amino livre (por conveno, a ponta esquerda do aminocido) chamado N-terminal, assim como o resduo com um grupo carboxlico livre ( direita) designado por C-terminal. Protenas vo ser molculas que contm uma ou mais cadeias polipeptdicas. Propriedades cido-base: Os -aminocidos possuem dois ou trs grupos cido-base. A valores baixo de pH, ambos os grupos esto totalmente protonados, predominando assim a forma catinica. Ao longo de uma titulao com uma base forte, estes vo perder dois ou trs protes, formando uma curva caracterstica de um cido diprtico ou triprtico. Os valores de pH dos vrios grupos podem ser calculados pela equao de Henderson-Hasselbalch: pH = pK + log [A-]/[HA] O pH a que a molcula adquirir carga electrnica neutra conhecido com ponto isoelctrico (pI): pI = (pKi + pKj) Os valores de pK dos grupos ionizveis dependem de grupos prximos: Os valores de pK 1 dos aminocidos so muito menores do que o valor de pK de um simples cido carboxlicos. A grande diferena causada pela influencia electrosttica do grupo carregado amnia. O grupo NH3+ estabiliza mais electrostaticamente o grupo COO- do que o grupo COOH. Igualmente o grupo NH3+ possui um pK mais baixo do que uma amina normal, devido tendncia electrnica negativa do grupo carboxlico. Assim, ambas as caractersticas electrnicas e electrostticas influenciam o pK do grupo NH3+.

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Estereoqumica: Todos os aminocidos que derivam de protenas (resduos) tm uma configurao estereoqumica L. Uma molcua com n centros quirais possui 2n diferentes possveis estereoismeros. Todos os aminocidos L nas protenas so S aminocidos excepto a cistena. Outros aminocidos para alm dos 20 fundamentais: O cdigo gentico universal especifica apenas 20 aminocidos. No entanto, muitos outros fazem parte de certas protenas. Estes aminocidos, na maior parte resultam de uma modificao especfica de um resduo aminocido, depois de uma cadeia polipeptdica ter sido sintetizada. Tambm os grupos amino e carboxilco terminais de um polipept deo podem ser modificados, modificao esta que muito importante para a funo da protena. Aminocidos D: Os resduos D-aminocidos so componentes de relativamente pequenos polipeptdeos bacterianos. Estes polipeptdeos so, talvez, grande parte integrante das paredes celulares bacterianas, para assim impedir o ataque das enzimas produzidas pelos outros organismos para digerir as bactrias. So tambm componentes dos antibiticos antibacterianos. Aminocidos biologicamente activos: Muitos aminocidos so sintetizados no para serem resduos de polipeptdeoss, mas para funcionarem como independentes; muitos organismos usam aminocidos para transportar azoto na forma de grupos amino. Tambm podem ser oxidados de maneira a produzirem energia, assim como funcionar como mensageiros qumicos para comunicao entre clulas. Protenas: Estrutura primria: As protenas so o centro da aco dos processos biolgicos. Quase todos os processos do metabolismo celular so catalisados por proteinas; as protenas tambm regulam as condies extra e intracelulares, assim como so parte essencial da estrutura celular; enfim, uma lista de todas as funes proteicas teria milhares e milhares de alneas. Um dos passos para decifrar a funo de uma protena compr eender a sua estrutura: tal como as outras biomolculas, as protenas so polmeros de pequenas unidades, s que no possuem uma estrutura regular, em parte devido aos 20 aminocidos seus constituintes no possuirem todas as mesmas propriedades fsicas e qumicas.

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Diversidade polipeptdica: Como os outros polmeros, as protenas podem descrever-se em termos de nveis de organizao, neste caso em estrutura primria, secundria, terciria e quaternria. A estrutura primria a sequncia de aminocidos da sua cadeia ou cadeias polipeptdicas, onde cada resduo est ligado ao outro por uma ligao peptdica. Com os 20 diferentes aminocidos possivel obter um nmero astronmico de diferentes protenas: para uma protena de n resduos, h 20n possibilidades de os sequenciar. Em geral, uma protena contm pelo menos 40 resduos, levando a que polipeptdeos mais pequenos que isso sejam apenas chamados de peptdeos; embora haja maiores, a maior parte dos polipeptdeos contm entre 100 e 1000 resduos. As protenas vo depender mais da sua sequncia de resduos do que dos seus resduos constituintes; podem tambm formar complexos com ies metlicos, como o Zn2+ e o Ca2+; podem ligar-se por ligaes covalentes ou no covalentes a outras pequenas molculas orgnicas e podem ser modificadas pela ligao covalente de grupos como fosfatos e hidratos de carbono. Purificao proteica: Felizmente, variaes nos tamanhos e na composio qumica dos polipeptdeos tornam mais fcil separar protenas umas das outras e doutras molculas biolgicas. Normalmente, quando uma substncia perfaz <0.1% do peso seco de um tecido, ento tem de ser convertida a uma pureza de 98%, o que implica certas tcnicas de purificao: O primeiro passo para isolar uma protena ou qualquer outra molcula biolgica, retir-la da clula para uma soluo: a maior parte dos processos usa uma variao de esmagamento e trituramento das clulas, seguido por uma filtrao e centrifugao para remover as partculas grandes insolveis. Por outro lado, se a protena desejada est dentro de uma membrana lipdica, um detergente ou um solvente orgnico podem ser usados para dissolver os lpidos e recuperar a protena.

Processos de estabilizao: Depois de uma enzima ter sido removida do seu ambiente natural, fica exposta a vrios agentes que a podem danificar irreversivelmente: pH: Existe uma gama onde cada material estvel. Violando essa propriedade pode levar desnaturao proteica, ou mesmo degradao qumica (lise).

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Temperatura: A estabi lidade trmica das protenas varia. Algumas apenas desnaturam a elevadas temperatura, outras a temperatura alguns graus acima do seu ambiente natural; normalmente, a purificao feita a temperaturas perto dos 0C, de maneira a superar esta barreira. Presena de enzimas degradantes: Quando os tecidos so destrudos para libertar molculas que nos interessam, tambm so libertadas enzimas, as quais podem ser proteases (estas enzimas degradam, como o prprio nome indica, as protenas). Estas podem ser inibidas pelo ajustamento do pH ou da temperatura para valores que as inactivam ou por compostos que inibam a sua aco (inibidores). Adsoro a superfcies: Muitas protenas so desnaturadas pelo contacto com o vapor de gua do ar ou com superfcies de vidro ou plsticos. Assim, as solues proteicas so feitas de forma a minimizar a espuma e mantidas a elevadas concentraes. Solues proteicas guardadas h demasiado tempo: As solues proteicas so, muitas vezes, guardadas envoltas em gs de azoto ou rgon e congeladas a 70C ou a 196C, de maneira a evitar uma lenta oxidao (oxignio do ar) ou contaminao por agentes microbianos.

Tcnicas de separao: As caractersticas das protenas e de outras biomolculas, que so usadas nos vrios processos de separao so: solubilidade, carga inica, tamanho molecular e especificidade da ligao com outras molculas biolgicas.

Processo de separao Cromatografia de permuta inica; Electroforese; Polaridade Cromatografia de interaco hidrofbica; Cromatografia de gel; Tamanho SDS-page; Ultra-centrifugao; Especificidade da ligao Cromatografia de afinidade;

Caracterstica Carga

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Solubilidade proteica: A solubilidade proteica em solues de baixa concentrao inica vai aumentando medida que se adiciona um sal, pois os ies vo formar um escudo molcula proteica, devido aos seus mltiplos grupos carregados, levando a que as foras atractivas entre as vrias molculas proteicas seja menor, foras essas que podem levar precipitao. No entanto, com a contnua adio de sal vai-se dar uma diminuio da solubilidade, como resultado da competio entre os ies do sal adicionado e outros dissolvidos no solvente. Como cada protena precipita a concentraes de sal diferentes, esta caracterstica aproveitada como um meio de purificao proteica. O sal mais usado o sulfato de amnia (NH4) 2 SO4, pois muito solvel. Cromatografia: Cromatografia de permuta inica: Na cromatografia de permuta inica, molculas carregadas ligam-se a grupos de carga oposta que se situam na matriz. A matriz pode ser catinica (quando fixa caties)ou aninica (quando fixa anies). Para protenas, a matriz mais usada so resinas celulosas. Cromatografia de interaco hidrofbica: Na cromatografia de interaco hidrofbica, o material da matriz levemente substitudo por grupos octil e fenil; grupos apolares da superfcie das protenas interagem com os grupos hidrofbicos, isto , ambos os grupos so excludos pelo solvente polar. Cromatografia em gel: Na cromatografia em gel, as molculas so separadas de acordo com o seu tamanho e forma; a fase estacionria (matriz) consiste num gel com poros que atingem um certo tamanho. Ao fazer passar uma soluo atravs da coluna, as molculas que so maiores no vo passar pelos poros, logo, atravessam a coluna mais rapidamente, enquanto que as molculas mais pequenas, ao terem de atravessar toda a coluna, demoram mais tempo. Cromatografia de afinidade: Uma caracterstica de muitas protenas a sua habilidade de se manterem perto de certas molculas. Esta propriedade usada para purificar protenas por cromatografia de afinidade. Nesta tcnica, um ligando que tem uma afinidade especfica a uma certa protena ligado a uma matriz inerte por ligao covalente. Quando uma soluo impura dessa protena passada atravs da matriz, a protena vai ligar-se ao ligando, ficando retida, enquanto que as outras substncias passam pela coluna. Depois, a protena desejada pode ser recolhida mudando as condies do eluente, de modo a libertar a

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protena da matriz, por exemplo, solues de grande concentrao de ligando livre ou solues de diferente pH ou fora inica. Electroforese: Electroforese de gel de poliacrilamida: Similar cromatografia por gel, s que a mobi lidade das grandes molculas menor que a mobilidade das molculas pequenas, com a mesma carga. Como o pH do gel ronda o valor de 9, quase todas as protenas tm cargas negativas e movem-se assim para o nodo atravs do gel. SDS-page: O detergente sulfato-dodecyl de sdio (SDS) usado para desnaturar protenas. Estas assumem assim uma forma linear na presena de SDS e algumas at se ligam a este numa proporo de 1.4g SDS/1g protena. Este tratamento leva a que as protenas fiquem com forma e carga por massa similares. Assim, so separadas por filtrao por gel, de acordo com a sua massa molecular. A mobilidade relativa das protenas no gel varia linearmente com o logaritmo das suas massas moleculares. Electroforese de capilaridade: Esta tcnica executada em muito finos tubos capilares. Tais capilares, como dissipam rapidamente o calor, permitem o uso de campos elctricos fortes, que reduzem o tempo de separao em relao electroforese por gel. No entanto tem a limitao de separar apenas pequenas quantidades de material. Ultracentrifugao: Numa soluo de protenas precipitadas, estas no se sedimentam por aco da gravidade, como solues de gua e areia. Assim, para separar solues de protenas saturadas usa-se a ultracentrifugao. Na ultracentrifugao atingem-se velocidades de 80 000 rpm. Sequenciao de protenas: As sequencias de aminocidos de centenas de milheres de polipeptdeos so agora conhecidas. Esta informao valiosa para: Determinar a estrutura tridimensional da protena, de modo a entender o seu mecanismo de aco molecular; Comparao das sequencias de protenas de espcies diferentes de forma a observar relaes em termos de evoluo; Muitas doenas so causadas por mutaes que tm como base a mudana de um aminocido numa protena. Logo, a anlise da sequencia de aminocidos pode desenvolver um diagnstico e a sua apropriada terapia.

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Primeiros passos: Achar N ou C terminais: Cada cadeia polipeptdica tem um resduo N-terminal e C-terminal. Logo, sabendo quantos N-terminais h numa protena, podemos saber quantas cadeias polipeptdicas a protena possui; os N-terminal de um polipeptdeo podem ser determinados por vrios mtodos, tal como por um composto fluorescente que se vai agarrar ao N-terminal. Por hidrlise separam-se os vrios aminocidos, em que por cromatografia se vai identificar os de cor fluorescente. Tambm h a possibilidade de atravs da enzima carboxipeptidase separar o aminocido C-terminal, que posteriormente pode ser isolado e identificado. Encontrar pontes de dissulfureto: As ligaes por ponte de dissulfureto entre as cistenas tm de ser partidas, de forma a garantir que a cadeia polipeptdica totalmente linear. Estas ligaes, podem ser partidas por oxidao ou reduo, atravs do cido pe rfrmico ou por mercaptans, respectivamente. A primeira reaco tem a desvantagem de tambm oxidar a metionina e parcialmente destruir a cadeia da tripsina. A combinao aminocida de um polipeptdeo pode ser determinada: A composio aminocida de um polipeptdeo determinada pela sua completa hidrlise, seguida pela anlise dos aminocidos libertados. Visto que a separao por cido ou base destri alguns aminocidos e a separao por enzimas no completa e, sendo enzimas tambm elas protenas, estas podem interferir na anlise dos aminocidos obtidos. Conclui-se assim que nenhum dos processos totalmente satisfatrio. A anlise quantitativa vai ser feita num instrumento que separa os vrios aminocidos hidrolisados por cromatografia e identifica-os em termos de % de volume, por tcnicas de absorvncia e fluorescncia. Clivagem polipeptdica: Polipeptdeos com mais do que 40 a 100 resduos no podem ser identificados por degradao de Edman e logo tm de ser partidos em fragmentos mais pequenos. Degradao de Edman: Depois das reaces de clivagem, a sequncia de aminocidos dos polipetdeos resultantes pode ser determinada atravs de vrios ciclos da degradao de Edman:

Protenas: Estrutura tridimensional: Como vimos, a estrutura primria de uma protena a sua sequncia linear de aminocidos. No entanto, no estudo da estrutura de protenas, mais trs nveis de complexidade estrutural so invocados: Estrutura secundria: o arranjo espacial dos tomos de um polipeptdeo, sem ter em conta conformaes ou cadeias laterias; Estrutura terciria: refere -se estrutura tridimensional de um polpeptdeo completo; Estrutura quaternria: como a maior parte das protenas so compostas por duas ou mais cadeias polipeptdicas, ento a sua estrutura quaternria ser o arranjo espacial das vrias cadeias.

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Estrutura secundria: O grupo dos pptidos: Estudos indicam que o grupo dos pptidos tem uma rgida e planar estrutura como resultado de interaces de ressonncia que do ligao pe ptdica um carcter duplo. Os grupos de pptidos assumem a conformao trans, na qual sucessivos tomos C esto em lados opostos da ligao peptdica que os liga. No entanto, a conformao cis no caso da prolina tem uma ocorrncia mdia de cerca de 10%. A cadeia principal de uma protena so os tomos que participam nas ligaes peptdicas, ignorando-se as cadeias laterais dos resduos aminocidos. Assim, na cadeia principal vai haver ngulos de torso para cada resduo, de modo a adquirirem a conformao trans. Esta toro pode provocar colises entre tomos adjacentes e mesmo entre tomos de resduos que esto afastados da sequncia. Assim, os valores de e podem ser calculados de modo a que os tomos distem da distncia mnima de contacto, sem haver ligao entre eles (diagramas de Ramachandran).

Estruturas secundrias regulares: Estas estruturas so consideradas regulares, pois os seus valores de e so repetitivos. A hlice : A hlice a nica hlice polipeptdica que possui uma ligao de hidrognio favorvel e os seus valores de e esto dentro da regio regulamentar do diagrama de Ramachandran. A hlice roda na direco na qual os dedos da mo direita dobram. As ligaes de hidrognio vo dar-se entro o oxignio do grupo C=O e o hidrognio do grupo N-H entre os resduos n e (n+4). Folha : Neste caso, a ligao de hidrognio vai ocorrer entre polipptideos vizinhos, formando duas variantes: A folha antiparalela: em que as duas cadeias polipeptdicas se encontram em direce s/posies opostas; A folha paralela (menos estvel, talvez devido distoro das ligaes por ponte de hidrognio): em que as duas cadeias polipeptdicas esto em posio/direco igual, ou seja, paralelas. Tambm possui rotao dada segundo a regra da mo direita.

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Protenas fibrosas: Historicamente, as protenas so classificadas como sendo fibrosas ou globulares. -queratina (um rolo enrolado): A queratina uma protena mecanicamente duradora e que no reage quimicamente. Encontra-se presente em todos os vertebrados superiores. a principal constituinte do cabelo, do corno, das unhas e das penas. A queratina pode ser classificada de -queratina, que aparece nos mamferos, e -queratina, que se encontra nos pssaros e rpteis. A -queratina vai ser o resultado do enrolamento left-handed de duas hlices-, de maneira a formar um rolo; as duas hlices esto inclinadas cerca de 18 uma em relao outra. Ao N e C terminais pode ligar-se outras queratinas (dmeros), de maneira a formar um protofilamento. Dois protofilamentos constituem uma protofibra e quatro protofibras do origem a uma microfibra. As microfibras associam-se a outras microfibras de forma a formarem macrofibras. A -queratina rica em resduos de cistena, logo, forma ligaes de dissulfureto. Estas ligaoes podem ser partidas (por meio de um mercaptan) e o rolo ser assim esticado, assumido uma conformao do gnero da da queratina. A fibrona da seda (uma folha ): As fibras das sedas consistem em folhas antiparalelas cujas cadeias se extendem paralelamente ao eixo da fibra. As folhas empilham-se de modo a formar um microcristal. Colagnio (a hlice tripla): O colagnio, que aparece em todos os animais multicelulares, composto por fibras fortes e insolveis. constituinte dos ossos, tendes, pele e vasos sanguneos. Uma molcula de colagnio constituda por trs cadeias polipeptdicas. Cada uma destas cadeias forma uma hlice esquerda, e as trs hlices paralelas enrolam-se de forma right-handed, formando assim a estrutura da triplahlice de uma molcula de colagnio. No colagnio as ligaes entra as hlices no so pontes de dissulfureto, pois quase no existem resduos de cistena. Assim, as ligaes vo dar-se na lisina e na histidina da cadeia lateral.

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Estruturas proteicas no repetitivas: Estruturas irregulares: Segmentos de cadeias polipeptdicas cujos resduos sucessivos no possuem um e similar so muitas vezes chamados de rolos. Estes rolos no devem ser confundidos com a estrutura de rolo aleatrio que adquirem as protenas desnaturadas. Variaes na estrutura secundria: A hlice- frequentemente se desvia da sua conformao ideal nas suas curvas finais e iniciais da hlice. Similarmente, uma cadeia de polipeptdeos de uma folha pode conter um resduo extra que no realiza a ponte de hidrognio com a cadeia vizinha, produzindo assim distores. Voltas e loops: Segmentos de estruturas secundrias regulares, como hlices ou folhas so tipicamente unidas por cadeias polipeptdicas que abruptamente mudam de direco. Estas voltas repentinas quase sempre ocorrem na superfcie da protena. Podem ser de dois tipos, ambos estabilizados por uma ponte de hidrognio. Quase todas as protenas com mais de 60 resduos tm uma ou mais loops, chamadas -loops; estas loops so entidades globulares compactas, pois as suas cadeias laterais tendem a ser preservadas nas suas cavidades internas. Estrutura terciria: A estrutura terciria das protenas descreve o envolvimento das suas estruturas secundrias e especifica a posio de cada tomo na protena. Determinando a estrutura proteica: A estrutura proteica pode ser determinada por cristalografia de raios X. Nem todas as protenas formam cristais, mas as que formam podem adquirir vrias formas, formas essas que possuem 40% a 60% de gua no seu volume total. Na cristalografia de raios X, uma resoluo de poucos A no suficiente para revelar a posio de tomos individuais, mas chega para observar a cadeia polipeptdica principal, logo, as cadeias laterais so deduzidas, obtendo-se assim o conhecimento da estrutura primria. Para determinar a estrutura de protenas que no cristalizam, usam-se tcnicas de ressonncia magntica nuclear (NMR).

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Estruturas supersecundrias e domnios: A posio das cadeias laterais varia com a polaridade: As estruturas primrias de protenas globulares geralmente no comportam uma sequncia regular. No entanto, as cadeias laterais de aminocidos das protenas globulares so espacialmente distribudas de acordo com as suas polaridades: Os resduos apolares aparecem quase sempre no interior da protena, fora do contacto com os solventes aquosos. Este efeito hidrofbico um dos grandes responsveis pela estrutura tridimensional das proteinas. Os resduos polares com carga esto normalmente localizados na superfcie da protena, em contacto com os solventes aquosos; tal facto devido a um io num meio virtualmente anidro se encontrar num estado energeticamente desfavorvel. Os resduos polares sem carga esto normalmente superfcie da protena, mas tambm aparecem no seu interior, pois so eles que normalmente fazem as pontes de hidrognio com os outros grupos. Hlices e folhas podem ter vrias combinaes: As principais estruturas secundrias das protenas (folhas e hlices ), ocorrem nas protenas globulares em variadssimas propores e combinaes. Certos grupos de estruturas secundrias, chamados estruturas supersecundrias, ocorrem na maioria das protenas globulares: A estrutura a mais comum, na qual uma hlice se liga a duas cadeia paralelas de folhas . A estrutura -hairpin, consiste em cadeias antiparalelas ligadas por voltas. A estrutura consiste em duas hlices antiparalelas sucessivas encostadas uma outra, segundo um eixo inclinado. A estrutura barril consiste em folhas extendidas e enroladas de maneira a formar um cilindro. Grandes polipptidos formam domnios: Cadeias polipeptdicas com mais de 200 resduos, usualmente juntam-se em dois ou mais empilhamentos globulares, chamados domnios. Estes domnios conferem protena uma aparncia bi ou multilobal. Uma cadeia polipeptdica movimenta-se dentro de um domnio, mas domnios vizinhos esto apenas ligados por um ou dois segmentos polipeptdicos. Assim, muitos domnios so unidades estruturalmente independentes, que tm caractersticas de pequenas protenas globulares.

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Famlia proteica: Os milhares de estruturas proteicas conhecidas, revem ainda um maior nmero de domnios existentes. Estes podem se agrupados em famlias, tendo em conta o caminho seguido pelas suas cadeias polipeptdicas, sem ter em conta a sua sequncia de aminocidos. Comparando as estruturas dos vrios domnios, chega-se concluso da existncia de apenas algumas centenas de domnios. Surpreendentemente, poucas dzias delas perfazem praticamente metade das estruturas proteicas conhecidas. Este facto leva a pensar que as estruturas proteicas esto, de algum modo, ligadas evolucionariamente. Estrutura quaternria e simetria: A maior parte das protenas consiste em mais do que uma cadeia polipeptdica. Estas cadeias esto associadas a uma geometria especfica. O arranjo espacial destas subunidades conhecido como a estrutura quaternria de uma protena. As subunidades geralmente ligam-se no-covalentemente: Uma protena de vrias subunidades pode possuir idnticas ou no-idnticas cadeias polipeptdicas. Protenas com mais de uma subunidade so chamadas oligmeros e as suas unidades protmeros; um protmero pode assim possuir uma ou vrias cadeias polipeptdicas. A regio de contacto entre duas subunidades prximas assemelha-se ao interior de uma protena de uma s unidade: possui cadeias laterais apolares, pontes de hidrognio envolvendo as cadeias principais e laterais do polipeptdeo e, por vezes, pontes de dissulfureto. As subunidades formam arranjos simtricos: Na vasta maioridade de oligmeros, os protmeros encontram-se simetricamente arranjados. Como as protenas no podem ter inverso ou simetria especular, para fazer um protmero coincidir com sua imagem no espelho seria necessrio converter os resduos L em D. Assim, as protenas s podem ter simetria rotacional. Pode existir simetria rotacional cclica, onde os protmeros esto relacionados a um nico eixo de rotao: C1, C3, Cn (n- nmero de subunidades). H tambm a simetria rotacional diedral, em que um eixo intersecta dois eixos de rotao: D2, Dn (n- 2n subunidades). Para alm destes dois tipos de simetria rotacional, h ainda a considerar a ocorrncia de simertrias rotacionais tetradricas, octadrica e icosadricas. Dobramento e estabilidade proteica: Por incrvel que parea, medidas termodinmicas indicam que a maior parte das protenas apenas so relativamente estveis em condies fisiolgicas. So ento os seus efeitos hidrofbicos, as suas interaces electrostticas e as suas pontes de hidrognio que as vo estabilizar.

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Foras que estabilizam uma protena: O efeito hidrofbico: O efeito hidrofbico, que faz com que substncias apolares minimizem o seu contacto com a gua, o efeito mais determinante de uma estrutura proteica. A agregao de cadeias laterais apolares no interior da protena favorecida pelo aumento da entropia das molculas de gua que em caso contrrio se organizariam ordenadamente volta dos grupos hidrofbicos. Interaces electrostticas: No interior das protenas, as foras de Van der Waals, embora fracas, so uma importante influncia estabilizadora, pois actuam apenas a pequenas distncias e desaparecem quando a protena desenrolada. Por incrvel que parea, as pontes de hidrognio contribuem de uma forma minoritria para a estabilidade da molcula, porque tambm formao de pontes de hidrognio entre a protena e a gua. A associao de dois grupos inicos de cargas opostas chamada de par inico ou ponte salina. Este caso ocorre na maior parte dos resduos carregados e contribui tambm para a estabilizao de uma protena, embora de forma minoritria, pois a energia livre de um io no compensa a perda de entropia e de energia livre aquando da formao de um par inico. Ligaes qumicas cruzadas: As ligaes de dissulfureto no so essenciais na estabilidade, pois uma protena sem estas ainda estvel, mas tm um importante papel sob o ponto de vista estrutural. Os ies metlicos que aparecem em muitas protenas podem interagir com ligandos presentes em muitos resduos aminocidos, contribuindo assim para alguma estabilizao. Desnaturao e renaturao de protenas: A baixa estabilidade conformacional das protenas torna fcil a sua desnaturao: O aquecimento faz com que propriedades das protenas se modifiquem abruptamente, levando ao desenrolamento ou lise da protena; Variaes de pH alteram os estados de ionizao das cadeias laterais dos aminocidos, modificando a distribuio das cargas na protena e pontes de hidrognio. Detergentes associados com resduos apolares da protena vo interferir com as interaces hidrofbicas, grandes responsveis pela estrutura proteica; Os agentes io guanidina e ureia, que em elevadas concentraes aumentam a solubilidade de substncias apolares na gua;

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Protenas desnaturadas podem ser renaturadas: As protenas podem enrolar-se espontaneamente para as suas conformaes habituais em condies fisiolgicas. Isto implica que a estrutura primria de uma protena dita o seu arranjo tridimensional. Passos do enrolamento proteico: No incio pensava-se que protenas desnaturadas, ao voltar ao seu estado habitual, iriam experimentar todas as conformaes possveis at encontrar a certa. Aps muitos anos de estudo, chegou-se concluso de que a renaturao por este processo levaria imenso tempo, enquanto se verifica que as protenas renaturam em apenas alguns segundos. Assim, concluiu-se que as protenas voltam sua conformao habitual por passos directos, de maneira sua estabilidade conformacional aumentar, ou seja, diminuindo a energia livre: comea com a formao das estruturas secundrias, que estabiliza, comeando a formar a estrutura terciria. De seguida sofre as transformaes estruturais necessrias de modo a produzir as estruturas terciria e quaternria. Isomeria dissulfdrica proteica: No renaturamento das protenas, muitas vezes h formao de pontes de dissulfureto que na conformao nativa da protena no existem; estas vo ento formar as ligaes nativas; a enzima PDI catalisa este processo. Chaperons moleculares: Chaperons moleculares so protenas essenciais que se unem a polipeptdeos desenrolados ou parcialmente enrolados, para assim prevenir a associao imprpria de segmentos hidrofbicos que possam levar ao no enrolamento ou precipitao do polipeptdeo. Permitem tambm que protenas mal enroladas se re-enrolem na sua conformao nativa. Dinmica proteica: De facto, as protenas so molculas flexveis e rapidamente variveis, cuja mobilidade estrutural funcionalmente significante.

17 II - PARTE
Catlise Enzimtica: Propriedades Gerais:

A catlise enzimtica difere de uma catlise qumica tradicional em vrios aspectos importantes: Grande aumento da velocidade de uma reaco (de 106 a 1012 vezes superior velocidade da mesma reaco no-catalisada); Condies mais suaves de reaco, ou seja, as condies em que reaces catalisadas por enzimas so mdias: temperaturas abaixo dos 100C, presso atmosfrica e pH prximo do fisiolgico; Especificidade muitissimo elevada, que tem a ver com a natureza do substrato e dos produtos finais da reaco; a enzima reconhece o seu substrato e catalisa a sua reaco de tal forma que raramente so formados produtos laterais (indesejados) da reaco; Capacidade de regulao: a actividade cataltica de muitas enzimas varia de acordo com a concentrao de substrato. Os mecanismos de regulao incluem controlo alostrico, modificao covalente de enzimas e variao da quantidade de enzima sintetizada; Especificidade do substrato: As foras no-covalentes pelas quais substratos e outras molculas se ligam s enzimas, envolvem foras de Van der Waals, electrostticas, pontes de hidrognio e interaces hidrofbicas. Em geral, o local de ligao do substrato consiste num buraco na superfcie da enzima que tem complementaridade com a forma geomtrica do substrato; este modelo tem como base o modelo da chave -fechadura proposto por Emil Fisher em 1894 e j abandonado, visto que a ligao enzima-substrato no se resume apenas complementaridade geomtrica entre ambos. Como veremos mais adiante, esta complementaridade geomtrica uma condio necessria mas no suficiente para uma catlise eficiente. As enzimas so estereospecficas: As enzimas so altamente especficas na sua ligao a substratos quirais e na catlise das suas reaces. Esta estereospecificidade tem origem na quiralidade inerente a todas as protenas (as protenas possuem apenas Laminocidos), que formam centros activos assimtricos. Como veremos, quase todas as enzimas que participam em reaces quirais so absolutamente estereospecificas. As enzimas variam na sua especificidade geomtrica: Em adio sua estereospecificidade, muitas enzimas so muito selectivas quanto identidade dos grupos qumicos nos seus substratos. Assim sendo, uma substncia com a quiralidade errada no encaixar no centro activo da enzima pela mesma razo de que no conseguimos encaixar a nossa mo direita numa luva esquerda. Muito poucas enzimas so especficas

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unicamente para um substrato, catalisando geralmente uma pequena poro de compostos quimicamente relacionados: o YADH catalisa a reaco de vrios pequenos lcoois primrios e secundrios nos seus respectivos aldedos e cetonas, mas nenhum to eficazmente como o entanol. Esta especificidade geomtrica bastante mais restrita do que a estereoespecificidade. Cofactores e Coenzimas: Os grupos funcionais das protenas podem facilmente participar em reaces cido/base, formando certos tipos de ligaes covalentes e tomam parte nas interaces carga/carga. So assim piores para catalisar reaces redox mas, apesar disso, as enzimas catalisam estas reaces, graas associao nestas de pequenas molculas, cofactores, que agem como dente qumico da enzima. Os cofactores so geralmente ies metlicos, Cu2+, Fe 3+ ou Zn2+. A natureza essencial destes compostos explica porque os organismos necessitam deles nas suas dietas (de outra forma no os conseguiriam produzir e as catlises enzimticas dentro dos prprios organismos no seriam eficazes). Explica-se da mesma forma da mesma maneira a toxicidade do Hg2+ e do Cd2+ que so do mesmo grupo da Tabela Peridica, substituindo o Zn2+ e o Cu2+ como cofactores, inactivando as enzimas. Os cofactores tambm podem ser molculas orgnicas, sendo nesse caso denominados como coenzimas e funcionam essencialmente como cosubstratos. Um exemplo de uma molcula deste tipo o NAD+ (nicotinamida). O utros cofactores chamados grupos prostticos esto geralmente associados enzima por ligaes covalentes. Um complexo enzima-confactor cataliticamente activo chamado holoenzima; Quando se remove o cofactor da holoenzima, resulta uma protena cataliticamente inactiva, denominada apoenzima. As coenzimas tm que ser regeneradas: As coenzimas so alteradas quimicamente pela reaco enzimtica em que participam. Assim, para completar o ciclo cataltico, a coenzima tem de voltar ao seu estado inicial. Nos grupos prostticos a regenerao ocorre numa fase separada da sequncia da reaco enzimtica. Muitas vitaminas so coenzimas: Muitos organismos no so capazes de sintetizar certas coenzimas. Assim, essas substncias tm de estar presentes na dieta desse organismo. Certas vitaminas esto assim nesta lista de coenzimas e a sua carncia pode provocar uma srie de doenas provocadas por catlises enzimticas incompletas. Mecanismos catalticos: As enzimas, tal como outros catalisadores, vo baixar a energia de activao duma determinada reaco. O que as torna to eficientes o facto de terem uma enorme especificidade de ligao ao substrato, combinada com o arranjo dos seus grupos catalticos e com a combinao de vrios mecanismos catalticos que iremos agora descrever. Existem assim seis grupos de catlises empregues pelas enzimas.

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Catlise cido-base: A catlise cida , geralmente, um processo no qual protes parciais se transferem de um cido e vo baixar a energia de transio de uma reaco. Uma reaco pode tambm ser estimulada por catlise bsica se a sua velocidade for aumentada por remoo parcial de protes por uma base. Algumas reaces podem ser simultaneamente sujeitas aos dois processos. Muitas reaces bioqumicas so susceptveis a catlise cido-base; as cadeias laterais de alguns resduos proteicos possuem pKs perto do pH fisiolgico, que vai assim permitir que ajam como catalisadores cidos ou bsicos. Assim, a habilidade das enzimas em arranjarem vrios grupos catalticos em volta do seu substrato, faz com que a catlise cido-base seja um mecanismo de catlise enzimtica bastante comum. Logo, vem que a actividade cataltica destas enzimas sensvel ao pH, j que o pH influencia o estado de protonao das cadeias laterais do centro activo. Catlise covalente: A catlise covalente acelera a reaco atravs da formao de uma ligao covalente catalisador-substrato. Usualmente, esta ligao covalente formada pela reaco de um grupo nuclefilo catalizador com um electrfilo no substrato. A catlise covalente pode ser decomposta em trs partes: 1. A reaco nuclefila entre o catalisador e o substrato para formar uma ligao covalente; 2. A troca de electres do centro da reaco com o agora electroflico catalisador; 3. A eliminao do catalisador, uma reaco que essencialmente a inversa de 1. Um aspecto importante da catlise covalente que quanto mais estvel for a ligao covalente formada, menos facilmente se decompe a reaco nos seus passos finais. Assim, vem que uma boa catlise covalente aquela que combina o poder nuclefilo com a habilidade de reverter formao dessa mesma ligao, tal como o fazem certas coenzimas. Catlise metal-inica: Perto de um tero de todas as enzimas conhecidas necessitam da presena de ies metlicos para a actividade cataltica. Este grupo de enzimas inclui as metaloenzimas que contm como cofactores ies metlicos (como o prprio nome indica). As enzimas metal-activadas, em contraste, ligam metais inicos de solues, usualmente metais alcalinos ou alcalino-terrosos. Os ies metlicos participam no processo cataltico de trs formas principais: 1. Ligando-se aos substratos, de maneira a orient-los adequadamente para a reaco; 2. Permitindo reaces redox, atravs de mudanas reversveis nos seus estados de oxidao; 3. Atravs de estabilizao electrosttica ou blindando cargas negativas.

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Em muitas das reaces catalisadas por ies metlicos, estes vo funcionar tal qual um proto, neutralizando uma carga negativa. No entanto, estes ies tm a vantagem de poderem existir em mais alto concentraes a pH neutro e de possuirem cargas superiores a +1. Catlise electrosttica: A ligao de um substrato geralmente exclui a gua do centro activo duma enzima. Assim, pode dizer-se que o centro activo tem as caractersticas polares dum solvente orgnico, onde as interaces electrostticas so muito mais fortes que numa soluo aquosa. Depois de muito estudo, verificou-se que as distribuies de carga volta do centro activo de uma enzima esto arranjadas de maneira a estabilizar os estados de transio das reaces catalisadas. Por outro lado, em muitas enzimas as distribuies das cargas vo, aparentemente, guiar substratos polares aos stios da ligao, aumentando assim a velocidade da reaco. Catlise atravs de proximidade e efeitos de orientao: Embora os mecanismos catalticos das enzimas se assemelhem aos modelos das reaces orgnicas, so muito mais eficientes do que estes ltimos. Tal eficincia deve advir das condies fsicas especficas nos centros activos das enzimas, que promovem a correspondente reaco qumica. Os efeitos mais bvios so proximidade e orientao: os reagentes tm de se unir enzima com a relao espacial prpria, de forma a poder dar-se a reaco. Assim, por simplesmente ligarem os seus substratos, as enzimas facilitam a reaco em trs aspectos: 1. As enzimas levam os substratos ao contacto com os seus grupos catalticos; 2. As enzimas ligam os seus substratos na orientao adquada para a reaco; 3. As enzimas param as deslocaes de translaco e rotao dos substratos e grupos catalticos. Este aspecto importante pois favorece o aparecimento do estado de transio, onde os movimentos relativos aos compostos so mnimos.

Catlise por preferncia de ligao do estado de transio: At agora ainda no se considerou um dos mais importantes mecanismos de catlise enzimtica: um enzima pode ligar o estado de transio da reaco que catalisa com maior afinidade que os substratos ou produtos. Assim, vem que as enzimas que se ligam preferencialmente ao estado de transio aumentam a concentrao deste, aumentando assim proporcionalmente a velocidade da reaco. Por este facto, os estados de transio anlogos so inibidores da reaco, uma vez que a enzima os agarra como se fossem a molcula a catalisar,

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inactivando-a. Acontece por vezes que estes anlogos tenham maior afinidade com a enzima do que a molcula que pretendemos catalizar.

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Propriedades cinticas de enzimas ( Modelo de Michaelis Menten) Geralmente, a velocidade de catlise V varia com a concentrao do substrato [S]. De tal forma que, para uma concentrao fixa de enzima, V quase linearmente proporcional a [S], quando [S] pequena. Por outro lado, quando a concentrao [S] tem valores elevados, a velocidade de catlise practicamente independente de [S]. O modelo proposto por Michaelis-Menten explica as propriedades cinticas das enzimas. E + S ES E + P

Figura 1 Progresso das curvas para uma reaco simples catalizada por uma enzima. Com excepo da fase inicial da reaco, os declives das curvas de [E] e [ES] so essencialmente zero enquanto [S] >> [E].

Uma enzima E combina-se com o substracto S para formar o complexo ES, com uma constante de velocidade K 1. O complexo ES pode dissociar-se em E e S, com uma constante de velocidade K 2, ou pode prosseguir para formar o produto P, com uma constante de dissociao K3. A equao que explica as propriedades cinticas das enzimas a equao de Michaelis-Menten : V=Vmx* [S]/( [S] + Km ) sendo Km=(K2+K1)/K3 a constante de Michaelis. De acordo com a equao, verifica-se que para concentraes muito baixas de S, quando [S] muito menor que KM, V=[S] V mx/KM; ou seja , a velocidade directamente proporcional a [S]. Para concentraes muito elevadas de substrato, quando [S] muito maior do que K M, V=Vmx; ou seja, a velocidade mxima independente da concentrao do substrato. Quando a concentrao de substrato S igual ao valor de K M, a velocidade de reaco metade da sua velocidade mxima; isto , V= Vmx. ( 1 ),

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Figura 2 O grfico de V0 (velocidade inicial) de uma reaco enzimtica simples vs. [S]

Os valores de V mx e KM podem ser determinados fazendo variar a concentrao de S a partir da linearizao de Lineweaver-Burk, a qual transforma a equao de Michaelis-Menten num grfico em linha recta de 1/V em funo de 1/[S] , o qual intersecta o eixo de 1/V no ponto 1/Vmx com uma inclinao de KM/Vmx. 1/V=1/Vmx+(1/[S])*KM/Vmx ( 2 )

Figura 3 Grfico de reciprocidade dupla (Lineweaver-Burk). As barras de erro representam 0.05Vmax .

Influncia do pH na actividade enzimtica A actividade cataltica aumenta, medida que o pH aumenta. No entanto, ao atingir um determinado valor de pH, a actividade cataltica atinge o seu mximo - pH ptimo. A partir deste valor de pH, a actividade cataltica das enzimas comea a diminuir, dado que valores pH muito elevados originam a desnaturao das protenas.

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Figura 4 Grfico da influncia do pH na actividade enzimtica

Influncia da Temperatura na actividade enzimtica medida que a temperatura aumenta, a actividade cataltica aumenta tambm, at atingir um determinado valor - Temperatura ptima. A partir desta tempe ratura, que corresponde ao valor mximo de actividade enzimtica, a actividade cataltica comea a diminuir, pois, a temperaturas elevadas inicia-se a desnaturao trmica das protenas.

-Figura 5 Grfico da influncia da Temperatura na actividade enzimtica

Inibio enzimtica As enzimas podem sofrer dois tipos de inibio: a inibio irreversvel, na qual o inibidor se dissocia muito lentamente da enzima-alvo;

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e inibio reversvel, que caracterizada por uma dissociao rpida do complexo enzima-inibidor. A inibio reversvel pode ser de trs tipos : Inibio competitiva : a enzima pode ligar-se ao substrato ( formando um complexo ES ) ou ao inibidor ( formando o complexo EI ), porm nunca se pode ligar aos dois ( ESI ). Um inibidor competitivo semelhante ao substrato, ligando-se ao centro activo da enzima, impedindo assim que o substrato se ligue ao centro activo da enzima. Portanto, este tipo de inibidor diminui a velocidade de catlise, reduzindo a proporo de molculas de enzima ligadas a um substrato.

- Figura 6

-Figura 7-

-Figura 81 -

-Figura 92 -

Inibio no competitiva : o substrato e o inibidor podem ligar-se enzima em simultneo. Ento, um inibidor no competitivo age pela diminuio do nmero de renovao, em detrimento da diminuio da quantidade de complexos ES.

Grfico de V0 em funo de [S] para a reaco Michaelis -Menten na presena de diferentes concentraes de inibidor competitivo. 2 Grfico Lineweaver-Burk correspondente Fig. 8.

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- Figura 10 -

- Figura 11-

-Figura 12 Grfico Lineweaver-Burk da enzima Michaelis-Menten na presena de um inibidor no -competitivo.

Inibio mista : um inibidor tanto afecta a ligao do substrato, quanto altera o nmero de renovao.

-Figura 13-

-Figura 14 Grfico Lineweaver-Burk da enzima Michaelis-Menten na presena de um inibidor misto.

As inibies competitivas so cinticamente distinguveis das no competitivas, ou seja, na presena de um inibidor competitivo a equao ( 2 ) substituda por 1/V = 1/ Vmx +(KM/Vmx) * (1/[S]) * (1+ [I]/ KI ) (3)

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Na qual [ I ] a concentrao do inibidor e KI a constante de dissociao do complexo E-I ( KI = [E] * [S] / [EI] ). Na inibio no competitiva , o valor de Vmx diminui, sendo o seu valor dado pela equao : V = Vmx / ( 1+ [I]/KI ) ( 4 )

Introduo ao Metabolismo: O metabolismo, o processo no qual sistemas vivos adquirem e usam energia para executar as suas variadas funes, pode ser dividido em duas partes: 1. Catabolismo: ou degradao, na qual os nutrientes e os constituintes celulares so partidos nos seus componentes ou para gerar energia; 2. Anabolismo: ou biossntese, no qual biomolculas so sintetizadas a partir de compostos simples. O Metabolismo: Estratgias Trophicas: Os requerimentos nutricionais dum organismo refletem-se na sua fonte de energia metablica. Alguns procariontes so autotrficos, ou seja, conseguem sintetizar todos os seus constituintes celulares a partir de molculas simples (H2O, CO2, NH3, etc.); estes seres podem assim obter a sua energia atravs de duas maneiras: os chemolitotrficos, que obtm energia atravs da oxidao de compostos inorgnicos e os fotoautotrficos, que obtm energia via fotossntese. Os heterotrficos, por seu lado, obtm a energia pela oxidao de compostos orgnicos, dependendo assim dos autotrficos para a obteno dessas substncias. Caminhos metablicos: Os caminhos metablicos so sries de reaces enzimticas interligadas, que produzem produtos especficos. Em geral, processos catablicos e anablicos esto relacionados da seguinte maneira: nos processos catablicos, complexos compostos (metablitos) so partidos em produtos mais simples; a energia livre libertada neste processo conservada pela consequente sntese de ATP a partir de ADP+Pi, ou pela reduo da coenzima NADP+ para NADPH. Assim sendo, vem que o ATP e o NADPH so as mais importantes fontes de energia para as reaces anablicas. A acetil-coenzima A participa na maior parte dos processos catablicos. Uma das caractersticas do metabolismo degradativo que os caminhos desse catabolismo para um grande nmero de substncias convergem em poucos campos intermedirios comuns:

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No caso dos eucariontes, cada processo vai ocorrer num organito celular caracterstico; nos procariontes, como no tm organitos celulares, os processos ocorrem num stio caracterstico do citosol. Assim, nos eucariontes, para que haja a sntese dos vrios metablitos, h que haver mecanismos que transportem as substncias entre os vrios compartimentos celulares. Existem assim protenas transportadoras que so responsveis por este processo.

Consideraes Termodinmicas: 1. Os mecanismos metablicos so irreversveis. Um reaco altamente exergnica irreversvel; se se tratar de uma reaco em vrios passos, se um deles for irreversvel, ento todo o processo se torna irreversvel; 2. Todos os mecanismos metablicos tm um primeiro passo cometido. Embora a maioria das reaces metablicas estejam

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muito prximas do equilbrio qumica, h quase sempre uma reaco exergnica irreversvel num dos primeiros passos do metabolismo. 3. Os mecanismos catablico e anablico so diferentes. Se um metabolito convertido noutro metabolito por um processo exergnico, tem que ser fornecida energia livre para converter o segundo metabolito novamente no primeiro e assim diferentes caminhos de reaco tm de ser tidos em conta pelo menos nalguns passos. Se uma clula requere o metabolito 2, tem de se desligar o caminho de 2 para 1 e ligar o caminho de 1 para 2. Controlo do Fluxo Metablico: Este controlo feito no intuito de manter o organismo num estado mais ou menos constante, o que necessrio, tendo em conta que os organismos vivos so sistemas termodinmicos abertos. Este controlo pode ser feito atravs de vrios mecanismos que contolam o fluxo atravs do passo determinante da reaco: 1. Controlo alostrico: Muitas enzimas so reguladas alostericamente, geralmente por substratos, produtos ou coenzimas. 2. Modificao covalente: Muitas enzimas controlam os fluxos de vrios ciclos. Possuem stios especficos que podem ser fosforilizados ou desforforilados enzimticamente ou modificados covalentemente; estas alteraes vo alterar a actividade das enzimas em causa. 3. Ciclos de substrato: Se vf e vr representarem as taxas de duas reaces opostas em no-equilbrio que so catalizadas por diferentes enzimas, vf e vr podem ser independentemente variadas. Por exemplo, o fluxo (vf-vr) pode ser aumentado no apenas acelerando a reaco directa mas tambm abrandando a reaco inversa. Este tipo de controlo mais sensvel s concentraes dos efectores alostricos do que o fluxo atravs de um a reaco simples em no-equilbrio. 4. Controlo gentico: A concentrao de enzimas pode ser alterada por sntese proteica em resposta s necessidades metablicas. Este tipo de controlo a resposta mais lenta de todos os que vimos at ao momento;

Compostos de alta-energia: Nas vrias reaces oxidativas que ocorrem no organismo, muitas delas libertam uma quantidade considervel de energia. Estes pacotes de energia so conservados pela sntese de poucos tipos de compostos altamente energticos, que pela quebra das suas ligaes qumicas iro libertar essa energia que vai ser utilizada nos processos endoenergticos. - ATP e grupo de transferncia fosfato: O ATP (adenosina trifosfato), que aparece em todas as formas de vida conhecidas, consiste numa adenosina (adenina+ribose) na qual trs grupos fosforil (-PO32-) esto sequencialmente ligados por uma ligao fosfoster e duas ligaes fosfoandricas. A importncia biolgica do ATP assenta na grande quantidade de energia que acompanha a quebra das suas ligaes fosfoandricas. De notar que a ligao

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fosfoandrica no difere muito da ligao fosfoster, se olharmos para os seus carcteres electrnicos. Ento porque que a ligao fosfoandrica no ATP to energtica? H trs factores que do resposta a esta pergunta: 1. Os requisitos electrnicos dos grupos fosforil so menos satisfeitos numa ligao fosfoandrica do que nos seus produtos de hidrlise. 2. Existe tambm o efeito de destabilizao das repulses electrostticas entre os grupos carregados duma ligao fosfoandrica comparada com os seus produtos de hidrlise. 3. Outra influncia destabilizadora a pequena energia de solvatao da ligao fosfoandrica, comparada com os seus produtos de hidrlise. De nota que, como os produtos da hidrlise do ATP so ies, o G desta vai assim tambm depender do pH e da fora inica. -Reaces Conjuntas: As reaces exergnicas de alta energia podem ser combinadas a processos endergnicos e assim complet-los. Exemplo: (1) A+B C+D (2) D+E F+G G1 G2

NOTA: G1+G2<0 Seja G10 e G2<0; como G10, logo o produto D vai existir em baixa concentrao; mas como G2<0, ento aqui D convertido em produtos, gastando assim o excesso em (1) levando a que a reaco (1) se d no sentido directo de forma a repor D(Princpio de Le Chatelier). - A hidrlise fosfoandrica conduz alguns processos bioqumicos: A energia das ligaes fosfoandricas pode ser usada para conduzir reaces ao seu equilbrio, mesmo quando os grupos fosforil no so transferidos para outro composto orgnico. Assim, o ATP vai-se ligar a, por exemplo, protenas, levando-as assim a uma alterao conformacional; aps isto, a hidrlise exergnica do ATP e a consequente libertao de ADP e Pi transforma essas alteraes conformacionais em irreversveis, levando a que o processo avance.

-A pirofosfatase inorgnica catalisa a quebra de ligaes fosfoandricas adicionais: Embora muitas reaces envolvendo ATP produzam ATP e Pi, outras produzem AMP e PPi. Neste ltimo caso o PPi rapidamente hidrolisado para dois Pi pela pirofosfatase inorgnica, levando a que a quebra do ATP pela pirofosfatase consuma duas ligaes fosfoandricas.

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Reaces redox: Os combustveis metablicos so oxidados para CO2, os electres so transferidos para mensageiros moleculares que, em organismos aerbicos, transferem os electres para o oxignio molecular. O processo de transporte electrnico resulta numa trans-membrana de concentrao pr otnica que, pelo gradiente de concentrao, guia a sntese do ATP. - NAD+ e FAD: Dois dos mais conhecidos transportadores de electres so as coenzimas nucleotdicas NAD+ e FAD. A NAD+ pode transportar um electro, resultando desse transporte um composto sob a forma de NADH. Por seu lado, a FAD uma coenzima que pode transferir um ou dois electres sob a forma de FADH e FADH2, respectivamente. As funes metablicas destas coenzimas levam a concluir que a sua reduo reversvel, de forma a que possam aceitar electres, pass-los para outro transportador electrnico e serem regenerados para participarem em novos ciclos de oxidao e reduo. De notar que a FAD no pode ser sintetizada pelos seres humanos, o que implica que a temos de ingerir na nossa dieta. Catabolismo da Glucose: A gliclise o processo que leva quebra da glucose. a sequncia de dez reaces enzimticas, na qual uma molcula de glucose convertida em duas molculas de gliceraldedo-3-fosfato. Dos trs piruvatos carbnicos h o aparecimento de 2 ATPs. A gliclise extremamente importante pois tem um papel de destaque no fornecimento de energia sob a forma de ATP e na preparao da glucose e outros composto para seguintes degradaes oxidativas. A gliclise pode ser decomposta em duas partes: -Parte I (Investimento energtico reaces 1-5): Na sua fase inicial a glucose fosforilada e partida de forma a aguentar duas molculas de fosfato. Este processo consome 2 ATPs. -Parte II (Recuperao energtica reaces 6-10): As duas molculas de gliceraldedo-3-fosfato so convertidas em piruvato, com a reduo de 4 ATPs. Assim a gliclise vai ter um balano total positivo de 2 ATPs, visto que na fase inicial so gastos dois ATPs.

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As reaces da gliclise:

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- Hexocinase: Primeira utilizao do ATP A reaco 1 da gliclise a transferncia de um grupo fosforil do ATP para a glucose, formando glucose-6-fosfato (G6P), numa reaco catalisada pela enzima hexocinase. H que notar que, para que a actividade da enzima seja adequada, tem que haver a presena do io Mg 2+, pois um ATP no complexado um potencial inibidor da hexocinase; assim, o Mg 2+ vai funcionar como um escudo para as cargas negativas dos ATPs, fazendo com que o -fsforo seja mais acessvel ao ataque nuclefilo do grupo C6-OH da glucose. - Isomerase fosfoglucosdica: A reaco 2 da gliclise a converso do G6P em frutose-6-fosfato (F6P), atravs da aco da enzima isomerase fosfoglucosdica (transformao de uma hexose numa pentose). O mecanismo reaccional proposto envolve catlise cido-base pela enzima: 1. 2. 3. 4. O substrato liga-se. Um cido enzimtico vai catalisar a abertura do anel da hexose. Uma base abstrai o proto cido formando um cis-enolato. O proto reposto em C1. Os protes abstrados pelas bases rapidamente trocam com os protes do solvente. 5. O anel fecha-se de maneira a formar o produto que consequentemente libertado da enzima, completando o ciclo cataltico. -Fosfofrutocinase: segunda utilizao de ATP A reaco 3 da gliclise catalisada pela enzima fosfofrutocinase. Esta ltima fosforila o F6P, formando fructose-1,6-bifosfato (FBP ou F1,6P). Esta reaco semelhante reaco 1 e tambm se d na presena do io Mg2+. -Aldolase: A reaco 4 da gliclise catalisada pela aldolase e onde h a quebra do FBP para formar duas trioses: gliceraldedo-3-fosfato (GAP) e dihidroxoacetonofosfato (DHAP). -Isomerase Fosfotriose: Apenas o GAP continua o processo glicoltico. No entanto, como o GAP e o DHAP so ismeros funcionais aldedo-cetona, podem ser interconvertidos por uma reaco de isomerizao por intermdio de um enodiol. A triosefosfato isomerase catalise este processo: reaco 5 da gliclise.

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-Gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase: primeira formao energtica: A reaco 6 da gliclise a oxidao e fosforilao do GAP pelo NAD+ e Pi, catalisada pela enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase. Nesta reaco (oxidao aldedica), uma reaco exergnica conduz sntese do altamente energtico 1,3-bofosfoglicerato (1,3-BPG). -Fosfoglicerato-cinase: primeira formao de ATP: Na reaco 7 da gliclise forma-se 1 ATP, sobrando 3-fosfoglicerato (3PG), numa reaco catalisada pela enzima fosfoglicerato-cinase. De notar a ligao Mg2+-ADP. -Fosfoglicerato-mutase: Na reaco 8 da gliclise 3PG convertido em 2-fosfoglicerato (2PG) pela enzima fosfoglicerato-mutase. Uma mutase cataliza a troca intramolecular de um grupo funcional de uma posio para outra. -Enolase: segunda formao energtica: Na reaco 9 o 2PG desidratado para fosfoenolpiruvato (PEP), numa reaco catalisada pela enolase. -Pirovato-cinase: segunda formao de ATP: Na ltima reaco da gliclise, a enzima pirovato-cinase junta a energia livre resultante da quebra do PEP, sintetizando ATP e formando piruvato. Controlo da gliclise: Em condies constantes, a gliclise opera continuamente, embora o fluxo glicoltico tenha de variar de acordo com as necessidades do organismo. O controlo dos mecanismos de fluxo, como o da gliclise, envolve m trs passos: 1. Identificao da velocidade de cada patamar do ciclo, medindo in-vivo o G de cada reaco. 2. Identificao in-vitro de modificadores alostricos das enzimas envolvidas. 3. Medio in-vivo dos nveis dos supostos reguladores, debaixo de condies variadas.

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Ciclo do cido ctrico (Ciclo de Krebs):

O ciclo do cido ctrico uma engenhosa srie de oito reaces que oxida o grupo acetil da acetil-CoA para duas molculas de CO2 de uma maneira tal que conserva a energia libertada nos compostos reduzidos NADH e FADH2. Um ciclo completo liberta duas molculas de CO2, trs NADH, um FADH2 e um composto altamente energtico: ATP+GTP.

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-Sntese da acetil-coenzima A: A acetil-coenzima A formado do piruvato atravs de descarboxilao oxidativa por um complexo multienzimtico (grupo de enzimas associadas entre si no covalentemente que catalizam dois ou mais passos sequenciais de um processo metablico) chamado desidrogenase pirvica. Este complexo possui mltiplas cpias de trs enzimas: E1, E2 e E3. O complexo desidrogenase pirvica cataliza cinco reaces sequenciais: - O piruvato oxidado a acetato, com a libertao de CO2. - Alguma energia da oxidao conservada pela reduo de NAD+ a NADH. - Parte da energia restante armazenada temporariamente, adicionando a molcula de CoA Acetil-CoA. A sequncia das reaces a seguinte: 1. 2. 3. 4. 5. Descarboxilao do piruvato (libertao de CO2). O carbono hidroxietil oxidado para um grupo acetil. O grupo acetil transferido para a CoA. Oxidao da desidrolipoamida, para regenerar o grupo lipoamida da E2. A E3 reduzida e reoxidade, produzindo NADH.

Enzimas do ciclo do cido ctrico: -Reaco 1: Citrato sintase: A enzima citrato sintase medeia a reaco da Acetil-CoA e oxaloacetato a citrato. -Reaco 2: Aconitase: Mediadora da reaco de isomerizao do citrato a isocitrato. -Reaco 3: Isocitrato desidrogenase: Esta enzima conduz descarboxilao oxidativa do isocitrato a cetoglutarato. -Reaco 4: -cetoglutarato desidrogenase: Esta reaco a reaco de descarboxilao oxidativa do -cetoglutarato a succinil-CoA.

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-Reaco 5: Succinil-CoA sintetase: Hidrlise da succinil-CoA a succinato por fosforilao do GTP. -Reaco 6: Succinato desidrogenase: Desidrogenao estereospecfica do succinato a fumarato. -Reaco 7: Fumarase: Hidratao estereospecfica do fumarato a L-malato. -Reaco 8: Malato desidrogenase: Oxidao do L-malato a oxaloacetato.

Regulao do ciclo do cido ctrico: A disponibilidade de substratos, a inibio pelos produtos e a inibio por feedback por outros intermedirios do ciclo, influenciam a operacionalidade deste ciclo. O ciclo assim regulado por mecanismos de feedback, que coordenam a produo de NADH com o gasto energtico. -Balano global em termos de nmero de molculas de ATP produzidas por molcula de glucose: Os cofactores NADH e FADH2 so reoxidados na cadeia de transporte electrnico, com a reduo de O2 a H2O. A energia do transporte electrnico conservada atravs da sntese de ATP pela fosforilao oxidativa: - Por cada NADH so produzidas cerca de 3 molculas de ATP. - Por cada FADH2 so produzidas cerca de 2 molculas de ATP. Assim, vem que, em condies aerbias:

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-Natureza Anfiblica do ciclo de Krebs: Um trajecto metablico ou catablico ou anablico. O ciclo de Krebs catablico, pois envolve degradao e um importante sistema de conservao energtico nos organismos. No entanto, muitos dos produtos intermedirios deste ciclo so usados em biossntese, ou seja, em reaces anablicas. O ciclo de Krebs assi anfiblico (catablico e anablico em simultneo). Reaces anaplerticas-> reaces que permitem repr os inetermedirios do ciclo que forem sendo consumidos.

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Transporte electrnico e fosforilao oxidativa: Os organismos anaerbicos consomem oxignio e geram dixido de carbono num processo de oxidao dos combustveis metablicos. A completa oxidao da glucose, por exemplo, pelo oxignio: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O Esta reaco pode ser separada em duas meias reaces que a mquina metablica leva a cabo. Na primeira d-se a oxidao dos tomos de carbono da glucose (gliclise e ciclo de Krebs): C6H12O6 + 6H2O 6CO2 + 24H+ +24e Na segunda, o oxignio molecular reduzido: 6O2 + 24H+ + 24e - 12H20 Assim, verificou-se que os 12 pares electrnicos libertados durante a oxidao da glucose no so directamente transferidos para o O2, so transferidos para as coenzimas NAD+ e FAD, formando 10NADH e 2 FADH2. Os electres depois passam para a cadeia de transporte electrnico mitocondrial, um sistema de percursos electrnicos interligados.

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-A mitocndria: Nos eucariontes, a fosforilao oxidativa ocorre na mitocndria. A mitocndria um organelo celular que possui uma membrana externa permevel maioria das molculas pequenas e uma outra membrana interna, que contm uma vasta rea de invaginaes. O nmero de invaginaes chama-se cristae e reflecte a actividade respiratria da clula, pois a que se d o transporte electrnico. Esta membrana interna divide a mitocndria em dois compartimentos, o espao intermembranar e a matriz interna. -Fosforilao oxidativa: A fosforilao oxidativa um processo pelo qual formado ATP quando os electres so transferidos do NADH e do FADH2 para o O2, atravs de uma srie de transportadores electrnicos. A fosforilao ocorre na membrana interna da mitocndria. O ciclo de Krebs e a oxidao dos cidos gordos, que fornecem a maior parte dos cofactores reduzidos, do-se na matriz mitocondrial. A oxidao do NADH origina 3 ATPs, enquanto que a oxidao do FADH2 origina 2 ATPs. A oxidao e a fosforilao so processos acoplados. A transferncia electrnica d-se passo a passo, do NADH ou FADH2 para o O2, atravs de uma srie de transportadores electrnicos (I, III, IV), o que produz um bombardeamento de protes para fora da matriz mitocondrial. Gera-se assim uma fora, que consiste num gradiente de pH e num potencial electroqumico transmembranar. O ATP assim sintetizado quando os protes voltam a entrar na matriz mitocondrial atravs de um complexo enzimtico (V-ATPase). A cadeia respiratria consiste em 3 complexos enzimticos (I, III, IV), ligados por dois transportadores electrnicos: CoQ e Citocromo C.

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-O transporte electrnico: Complexo I NADH CoQ reductase NADH + CoQ (ox) NAD+ + CoQ (red) NOTA: O complexo II (succinato-CoQ-reductase) tambm participa nesta reaco redox. Complexo III CoQ Citocromo C reductase CoQ (red) + Cit C (ox) CoQ (ox) + Cit C (red) Complexo IV Citocromo C oxidase Cit C (red) + O2 Cit C (ox) + H2O Fosforilao Oxidativa: A energia livre libertada no transporte electrnico conservada de modo a ser utilizada pela ATP sintetase. Tal conservao energtica chamada de acoplamento energtico de transduco de energia. Vamos ento explorar este mecanismo de acoplamento e a operao da ATP sintetase. Hiptese Quimiosmtica: Esta teoria pressupe que acoplamento do transporte electrnico gerando a sntese de ATP devido criao de um gradiente protnico na membrana mitocondrial interna. Dados experimentais que comprovam a Teoria de Mitchell: 1. A fosforilao oxidativa requer membranas intactas. 2. A membrana mitocondrial interna impermevel a ies, pois a sua livre difuso iria descarregar o gradiente electroqumico. 3. Durante o transporte electrnico gerado um gradiente protnico atravs da membrana. + 4. Compostos que aumentam a permeabilidade da membrana a H , dissipando assim o gradiente electroqumico (desacopladores), permitindo o transporte electrnico, mas parando a sntese de ATP. 5. O aumento artificial da acidez no exterior da membrana estimula a sntese do ATP.

Fora protomotriz:
Fora protomotriz = Gradiente Qumico ( pH) + Potencial da membrana (E m)

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G= 2.3 RT pH + Z F Z carga do proto - potencial da membrana F- constante de Faraday pH = (pH matriz) (pH citosol)

-Desacoplamento da fosforilao oxidativa: Este desacoplamento efeito de desacopladores (DNP, FCCP), que so cidos fracos, lipoflicos, que atravessam a membrana na forma protonada, dissipando assim o gradiente protnico e destruindo o acoplamento entre o transporte electrnico e a fosforilao oxidativa, libertando energia na forma de calor. -Desacoplamento da fosforilao oxidativa induzido hormonalmente: 1. 2. 3. 4. 5. 6. A norepinefrina liga-se ao receptor O receptor estimula a adenilato ciclase a produzir cAMP O cAMP activa a cinase cAPK A cAPK fosforila a lipase D-se a hidrlise dos triglicridos Desacoplamento e entrada de H+.

Metabolismo do glicognio e gluconeognese: O glicognio funciona nos animais como uma reserva de glucose (polimerizada) de fcil mobilidade, sendo uma constante fonte de glucose/energia para todos os tecidos. O glicognio armazenado principalmente no fgado. O glicognio assim um polmero de glicose, com ligaes -1,4 em cadeia e ligaes -1,6 para as ramificaes (cada ramificao tem de 8 a 12 resduos). Porqu glicognio? 1. Regulao dos nveis de glucose no sangue, pois o gerado pelo metabolismo das gorduras insuficiente; 2. Libertao da glucose entre refeies e durante a actividade muscular, pois os msculos no mobilizam a gordura to rapidamente como o glicognio;

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Porqu estrutura ramificada? 1. Maior solubilidade; 2. Maior nmero de pontos de metabolizao, ou seja, vai possuir vrios extremos no redutores por onde a remo sequencial se d, tendo por seu lado apenas um extremo redutor. Degradao do Glicognio. A degradao do glicognio d-se atravs de um processo que inclui 3 enzimas: glicognio fosforilase, transferase e fosfoglucomutase. 1. Glicognio fosforilase: Glicognio + Pi Glicognio + G1P (Glucose 1-P)
(n resduos) (n-1 resduos)

2. Debranching enzyme (transferase) Esta enzima remove as ramificaes do glicognio, tornando os resduos de glicose acessveis para a aco da enzima glicognio fosforilase.

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3. Fosfoglucomutase: Converte G1P em G6P, que pode ter vrios destinos metablicos.

Sntese do Glicognio:

Existem caminhos diferentes para a degradao e para a biossntese. Biossntese: 1. Activao da Glucose 1-P: G6P G1P (reaco mediada pela enzima mutase) G1P + UTP UDGP (uridinadifosfato glucose) + PPi 2. Glicognio sintetase: Formao de ligaes glicosdicas -1,4 no glicognio
UDP-Glucose + Glicognio (n resduos) UDP + Glicognio (n+1 resduos)

Mas, de notar que esta reaco apenas prolonga uma cadeia de glicognio j existente. Como se inicia ento a stese do glicognio: Uma glucosiltransferase tirosina junta uma glucose a uma tirosina duma protena chamada glicogenina; ento, a glicogenina autocataliza a extenso da cadeia de glucose atravs da enziza glicognio sintetase, at sete resduos.

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3. Ramificao da cadeia de glicognio: Quebra de ligaes glicosdicas -1,4 e formao de ligaes -1,6, atravs da enzima amilo (1,41,6) transglicosilase.

Controlo do metabolismo do glicognio: A sntese e degradao do glicognio so exergnicos em condies fisiolgicas, logo, tal facto torna a sua regulao importante, de acordo com as necessidades celulares. Assim, a glicognio fosforilase entra em competio com a glicognio sintetase, consoante as necessidades do organismo em questo. O controlo d-se por: 1. Regulao alostrica: controlo da concentrao de cada uma das enzimas anteriores por inibidores. 2. Modificaes covalentes, por controlo hormonal: Insula, situado no fgado, estimula a sntese do glicognio. Epinefrina (msculo) e glucagon (fgado), estimulam degradao do glicognio, mediada pelo AMP cclico (cAMP). a

3. Regulao em cascata: fosforilao/defosforilao/controlo hormonal.

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Assim, vem que a cAMP controla a percentagem de enzima na forma fosforilada, o que implica uma maior velocidade de activao da enzima e a consequente menor velocidade de desactivao. Para uma taxa de glucose baixa no sangue, temos: Pncreas segrega glucanona Receptores da glucanona no fgado activam a adenilato ciclase Aumento da cAMP Aumento da ve locidade de degradao do glicognio Aumento da G6P intra celular G6P + H2O Glucose + Pi Sangue Para uma taxa alta de glucose no sangue, temos: Pncreas segrega insulina ... Diminui cAMP Aumenta a velocidade de sntese do glicognio

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Gluconeognese: Questo central: Substituir as trs reaces irreversveis da gliclise.

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Regulao da glucanognese: - Para nveis elevados de glucose no sangue: Sntese de glicognio Activao da gliclise Produo de Acetil-CoA Biossntese de cidos gordos e armazenamento de gorduras

- Para nveis baixos de glicose no sangue:

Estimulada a degradao do glicognio Estimulada a gluconeognese Maior produo de glucanona Maior produo de cAMP Fosforilao das enzimas Activao do FBP-2 (inactivao do PKF-2) Maior concentrao de F2,6P Inibio da fosfofrutocinase (PFK) activada a frutosebifosfatase (FBP) Aumento da gluconeognese