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UNESP

INSTITUTO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

MEDICINA Disciplina de Microbiologia Humana

AULAS PRTICAS DE BACTERIOLOGIA

2009

NDICE

LEMBRETES................................................................................................................................................... 1 RELATRIO DE AULAS PRTICAS.......................................................................................................... 2 MORFOLOGIA, COLORAO E ESTRUTURAS DA CLULA BACTERIANA.................................. 3 MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO BACTERIANO .................................. 7 CONTROLE DE POPULAES BACTERIANAS .................................................................................... 9 TRANSFERNCIA DE RESISTNCIA A DROGAS ENTRE BACTRIAS......................................... 11 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS .................................................. 12 STAPHYLOCOCCUS................................................................................................................................... 13 STREPTOCOCCUS ..................................................................................................................................... 16 NEISSERIA.................................................................................................................................................... 19 PSEUDOMONAS.......................................................................................................................................... 21 ENTEROBACTRIAS.................................................................................................................................. 22

LEMBRETES 1. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so realizados. 2. No fume e no coma no laboratrio. Evite levar boca qualquer objeto (lpis, rtulo, etc.). 3. No use frascos do laboratrio para tomar gua. 4. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente (derramamento de culturas sobre a mesa ou assoalho, ferimentos de qualquer espcie, aspiraes de culturas na boca, etc.). 5. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado. 6. Lave bem as mos com desinfetante antes de deixar o laboratrio. 7. Antes de iniciar suas atividades e depois de termin-las, limpe, com desinfetante, o seu local de trabalho. 8. Durante a permanncia no laboratrio de aulas prticas necessrio o uso de avental.

RELATRIO DE AULAS PRTICAS Aps o trmino de cada aula prtica, o aluno dever entregar relatrio individual ao docente responsvel pela mesma. No caso da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatrio dever ser entregue ao final da ltima aula. Porm, para obter a nota o aluno dever ter freqentado as duas aulas. Caso comparea em apenas uma aula sua nota ser igual a zero. Os relatrios devero ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente no ocuparem mais que duas folhas.

MORFOLOGIA, COLORAO E ESTRUTURAS DA CLULA BACTERIANA A) Colorao de Bactrias pelo Mtodo de Gram Material - Culturas A, B, C e D. - Lminas bem limpas - Ala de nquel cromo - Soluo fisiolgica - Bateria de Gram: violeta genciana, lugol, lcool, fucsina. Tcnica 1. Com o auxlio da ala de nquel cromo, fazer esfregaos bem finos sobre a lmina de microscopia. Esperar secar. 2. Fixar os esfregaos, passando a lmina trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen. 3. Deixar a lmina esfriar e cobrir os esfregaos com a soluo de violeta genciana. Esperar 1 minuto. 4. Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaos com lugol. Esperar 1 minuto. 5. Escorrer o lugol e descorar os esfregaos pelo lcool. Para isto, deixe o lcool cair, gota a gota, sobre a lmina, mantendo-a inclinada. Considerar os esfregaos suficientemente descorados quando o lcool no mais retirar o corante dos mesmos. 6. Lavar a lmina em gua corrente. 7. Cobrir os esfregaos com a soluo de fucsina, esperar de 30 segundos a 1 minuto. 8. Lavar a lmina em gua corrente. Secar com auxlio de papel de filtro. 9. Observar ao microscpio e desenhar.

Desenhos: Lmina A Forma:________________ Gram:_________________

Lmina B Forma:________________ Gram: ________________

Lmina C Forma:________________ Gram: ________________

Lmina D Forma:________________ Gram:_________________

Lmina E Forma:________________ Gram:_________________

B) Colorao de Bactrias pelo Mtodo de Ziehl-Neelsen Material - Lmina de microscopia contendo esfregao de escarro - Bateria de Ziehl-Neelsen: fucsina fenicada, lcool-cido e azul de metileno. Tcnica l. Cobrir a lmina com fucsina fenicada. Com auxlio do bico de Bunsen, aquecer a preparao at a emisso de vapores. Manter o aquecimento durante 5 minutos. No deixar a fucsina ferver ou secar. 2. Escorrer a fucsina e descorar completamente pelo lcool-cido. 3. Lavar em gua corrente. 4. Cobrir o esfregao com a soluo de azul de metileno. Esperar entre 30 segundos a 1 minuto. 5. Lavar em gua corrente e secar com papel de filtro. 6. Observar ao microscpio e desenhar
Bacilos lcoolcido Resistentes

C) Demonstrao de algumas estruturas da clula bacteriana. Observar lminas das seguintes estruturas da clula bacteriana: parede celular, cpsula, granulaes metacromticas e esporos e desenhar.

Desenhos: Parede celular

Cpsula

Granulaes metacromticas

Esporos

MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO BACTERIANO A) Necessidades nutritivas de algumas bactrias Material - Cultura A - Cultura B - Cultura C - Caldo sinttico - Caldo comum - Caldo glicosado (caldo comum mais glicose) - Ala de nquel cromo Tcnica 1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios. 2. Deixar na estufa a 37C at o dia seguinte. 3. Verificar a presena de crescimento (turvao do meio). 4. Anotar os resultados. Cultura caldo sinttico A B C B) Dependncia do oxignio para o crescimento bacteriano Material - Meio de Tiogel - Caldo simples - Cultura A - Cultura D - Cultura F - Pipeta Pasteur - Ala de nquel cromo Tcnica Com a pipeta Pasteur, semear cada uma das culturas em tubos de tiogel. Em seguida, semear a cultura F, com ala de nquel cromo, em caldo simples. Colocar todos os tubos na estufa. No dia seguinte, observar os Crescimento em Caldo comum caldo glicosado

tubos, verificando, no meio de tiogel, a localizao do crescimento e, no caldo simples, se houve ou no crescimento. Culturas A D F Local de crescimento no meio de tiogel Superfcie Toda extenso Base do Meio

CONTROLE DE POPULAES BACTERIANAS I - Efeito de agentes fsicos sobre as bactrias Ao da temperatura, em funo do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada ou no. Material - Cultura A em gar inclinado (bactria no esporulada) - Cultura E em gar inclinado (bactria esporulada) - Tubo contendo 1 ml da soluo salina esterilizada - Placas de Petri contendo gar nutriente - Banho-Maria a 60 C - Ala de Nquel cromo Tcnica 1. Divida uma placa de gar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes perodos de tempo em cada um: 0, 10, 20 e 30. 2. Coletar com a ala de nquel cromo, um pouco do crescimento da cultura A e passar para o tubo contendo soluo salina. Homogeneizar a suspenso. 3. Inocule (com a ala de nquel cromo) a suspenso no quadrante correspondente ao tempo 0. 4. Coloque o tubo com a suspenso em banho-maria a 60 C e, aos 10', 20' e 30', retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri (proceda exatamente como no item 2). 5. Deixe a placa na estufa at o dia seguinte. 6. Fazer o mesmo com a cultura E 6. Observe a variao quantitativa de crescimento nos quadrantes em funo do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++, conforme a intensidade de crescimento). Cultura 0 A E Tempo de aquecimento 10 20 30

II - Efeito de agentes qumicos sobre bactrias Ao do fenol a 0,8% de acordo com o tempo. Material
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- Tubo contendo soluo aquosa a 0,8% de fenol (10 ml) - Cultura A em caldo - Placa de Petri contendo gar nutriente - Ala de nquel cromo - Pipeta de 1 ml esterilizada Tcnica 1. Adicione, com a pipeta, 1 ml da cultura A aos 10 ml da soluo de fenol e misture bem. 2. Imediatamente e aps 10', 20' e 30', retire com a ala de nquel cromo, amostra da mistura (fenol mais cultura A) e inocule nos respectivos quadrantes da placa de Petri (0', 10', 20' e 30'). 3. Deixe a placa na estufa, a 37oC, at o dia seguinte. 4. Leia os resultados, anotando a variao quantitativa de crescimento (+ a ++++) em cada um dos quadrantes da placa, em funo do tempo de tratamento da cultura com o fenol. Tempo de tratamento com o fenol 0 10 20 30

III - Efeito de agentes qumicos sobre bactrias (lcool iodado a 0,1% de acordo com o tempo) Tcnica 1. Umedea uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Aps retirar o excesso de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a vigorosamente no dorso de uma das mos; 2. Passe a zaragatoa em rea correspondente metade de uma placa com gar nutriente; 3. Umedea uma segunda zaragatoa em lcool iodado a 0,1% e esfregue no dorso da outra mo; 4. Aguarde 2 minutos para que haja ao do anti-sptico; 5. Passe ento, nessa rea, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando cuidado para no ultrapassar a rea higienizada. Inocule, passando a zaragatoa na superfcie da outra metade da placa com gar nutriente; 6. Incube a placa na estufa, durante uma noite. 7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.
Sem lcool-iodado 0,1% Com lcool-iodado 0,1%

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TRANSFERNCIA DE RESISTNCIA A DROGAS ENTRE BACTRIAS Material - Meio de MacConkey - Meio de MacConkey contendo Canamicina na concentrao de 20 mg/ml - Cultura em caldo da bactria A (Salmonella sp, lactose -). - Cultura em caldo da bactria B (Escherichia coli, lactose +). - Tubo de ensaio contendo mistura de cultura A mais cultura B (0,1 ml da cultura A + 0,1 ml da cultura B foram transferidos para 5 ml de caldo nutriente e esta mistura foi previamente incubada a 37 C, durante 18 horas). - Ala de nquel cromo Tcnica 1. Dividir as placas de Mac Conkey (com e sem canamicina) em duas partes. 2. Semear, por esgotamento com a ala de nquel cromo, a cultura A numa das metades da placa de MacConkey contendo canamicina e a cultura B na outra metade. Incubar a 37 C at o dia seguinte. 3. Repetir o procedimento do item 2 na placa de Mac Conkey sem canamicina 4. Tomar uma alada da mistura A + B e semear, por esgotamento, na placa de MacConkey contendo antibitico. Repetir este procedimento com uma diluio a 1/100 da mistura A+B. Incubar por 24 horas. 5. Observar ocorrncia de crescimento da cultura A e B separadas e da mistura A+B diluda e no diluda. Anotar os resultados Crescimento em Mac Conkey Com Sem Canamicina Canamicina Cultura A Cultura B Mistura A+B Bactria sensvel - ausncia de crescimento. Bactria resistente - presena de crescimento. Lactose

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DETERMINAO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS Interpretao de Antibiograma pelo Mtodo de Bauer e Kirby Material - Culturas bacterianas em gar Meller-Hinton crescidas em contato com 5 discos contendo drogas distintas - Rgua - Tabela de referncia

1. Com o auxlio da rgua, medir o dimetro do halo de inibio do crescimento. 2. Consultar a tabela de referncia, para interpretar os resultados e anotar no quadro abaixo. Droga 1 2 3 4 5 * S = Sensvel; R = Resistente; I = Intermedirio. Concentrao (g/ml) Dimetro do halo de inibio do crescimento Interpretao*

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STAPHYLOCOCCUS A) Observar placas de gar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever as caractersticas das colnias e verificar hemlise. Cultura A B Caractersticas das Colnias Hemlise

B) Corar, pelo mtodo de Gram, esfregaos das culturas A. Observar ao microscpio e desenhar.

Cultura A C) Prova da Catalase Colocar sobre as culturas A e B algumas gotas de gua oxigenada. Observar a reao e anotar o resultado. Cultura A Prova da Catalase

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D) Prova da Coagulase Princpio A coagulase uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sangneo. Tcnica Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura B e anotar os resultados. Resultado positivo - formao de cogulo. negativo - suspenso inalterada Cultura A B Prova da Coagulase

E) Prova da DNAse Princpio A DNAse uma enzima bacteriana que hidroliza o DNA. Para pesquis-la, basta colocar cido clordrico (HCl) sobre as colnias a serem testadas. O HCl precipita o DNA contido na cultura, turvando o meio. Se a bactria produzir DNAse, haver hidrlise de DNA e consequentemente no turvao do meio de cultura, pois o HCl no precipita DNA hidrolizado. Tcnica Verter cido clordrico 1N sobre a placa semeada com a cultura A e sobre a placa com a cultura B. Verificar o aparecimento de halo ao redor das colnias. Resultado: positivo: aparecimento de halo claro ao redor das colnias. negativo: turvao do meio. Cultura A B Prova da DNAse

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F) Identificao das culturas Cultura A Cultura B

ESQUEMA DE IDENTIFICAO DOS GNEROS Staphylococcus e Micrococcus (famlia Micrococaceae)

Cocos Gram positivos Isolados ou agrupados

Catalase +

OF

Micrococcus sp

Staphylococcus sp

Coagulase

(+)

DNAse

(-)

S. aureus

S. coag. negativa

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STREPTOCOCCUS EXERCCIOS A) Observar placas de gar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Descrever as caractersticas das colnias e verificar hemlise. Cultura C D E Caractersticas das Colnias Hemlise

B) Corar, pelo mtodo de Gram, esfregaos das culturas C e D, observar ao microscpio e desenhar.

Cultura C

Cultura D

C) Prova da catalase. Colocar sobre a cultura C (em caldo) algumas gotas de gua oxigenada. Verificar a reao e anotar o resultado (Positivo = formao de bolhas)

D) Prova da bilesolubilidade Princpio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactria lise por sais biliares Tcnica: Adicionar 0,1 ml de uma soluo a 10% de desoxicolato de sdio a 1 ml da cultura D. Incubar a 37o C e examinar aps 15 minutos. Anotar o resultado. Fazer o mesmo com a cultura E. Leitura. Resultado positivo (suspenso solvel) - a cultura fica transparente. Resultado negativo (suspenso insolvel) - a cultura
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permanece turva. Cultura D E E) Identificao das culturas Cultura C Cultura D Cultura E Bile-solubilidade

F) Prova de sensibilidade bacitracina. Princpio: O princpio desta prova baseia-se na inibio de crescimento do Streptococcus pyogenes (-hemoltico, grupo A) frente a uma pequena quantidade de bacitracina. Tcnica: Verificar se ocorre uma zona de inibio de crescimento ao redor do disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C. Leitura: sensvel: existncia de uma zona de inibio do crescimento. resistente: ausncia de zona de inibio de crescimento. G) CAMP Teste Princpio: A atividade da hemolisina do S. aureus aumentada pela atividade hemoltica do S. agalactiae (-hemoltico do grupo B). Tcnica: Verificar zona de hemlise, em placa de gar sangue (feito c/ sangue de carneiro), semeada com S. agalactiae e S. aureus. Leitura: resultado - positivo: formao de uma zona de hemlise semelhante "ponta de flecha" na unio das duas hemolisinas. negativo: no formao de "ponta de flecha".

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ESQUEMA DE IDENTIFICAO Famlia: Streptococcaceae Gnero: Streptococcus (cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia) Catalase (-) Tipo de hemlise

Optoquina

Bilesolubilidade

Letalidade em camundongos

Bacitracina

(+)

(-)

(+)

(-)

S*

R*

S. pneumoniae S. -hemoltico S. pneumoniae


S = sensvel; R = resistente

S. -hemoltico S. pneumoniae S. -hemoltico

S. pyogenes (g. A) Streptococcus (quaisquer dos grupos de Lancefield, exceto o A) provas sorolgicas

(grupos de Lancefield)

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NEISSERIA EXERCCIOS A) Observar, ao microscpio, esfregao de secreo uretral, corado pelo mtodo de Gram e desenhar.

B) Crescimento em gar-simples Verificar a diferena de crescimento, em meio de gar simples, entre Neisseria sp e N. meningitidis. Anotar o resultado. Cultura Neisseria sp Crescimento em gar simples

N. meningitidis

C)Teste de Citocromo-oxidase Fazer o teste da citocromo-oxidase com uma das culturas de Neisseria e com a cultura de Escherichia coli. Anotar os resultados. Cultura Neisseria sp Escherichia coli Prova da citocromo-oxidase

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ESQUEMA DE IDENTIFICAO Famlia: Neisseriaceae Gnero: Neisseria (diplococos Gram negativos) citocromo-oxidase positivos

Crescimento em gar simples

(+) N. sicca e outras espcies no patognicas de Neisseria

(-)

fermentao da maltose

(+) N. meningitidis

(-) N. gonorrhoeae

Reaes sorolgicas

Identificao do sorotipo

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PSEUDOMONAS

1. Observar placa de gar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa. Descrever as caractersticas das colnias e verificar hemlise. Observar, tambm, a pigmentao verde do crescimento em gar simples uma caracterstica peculiar da espcie. Cultura P. aeruginosa Caracterstica das colnias

2. Corar, pelo mtodo de Gram, esfregao da cultura de Pseudomonas aeruginosa. Observar ao microscpio e desenhar.

Pseudomonas aeruginosa 3. Prova da Citrocromo-oxidase Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparao. Anotar o resultado. Cultura P. aeruginosa Prova de citocromo-oxidase

Escherichia coli

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ENTEROBACTRIAS
1. Observar a colorao das colnias das bactrias A, B e C cultivadas em placas de gar MacConkey, SS e Hektoen. Anotar os resultados da prova de lactose (leitura em quaisquer dos trs meios) e de H2S (leitura no SS e Hektoen). Cultura A B C 2. Interpretar crescimento das culturas A, B e C em meio de TSI e EPM, citrato e MILi. Anotar abaixo os resultados das provas para cada cultura. Prova A Citrato Glicose Gs Urease H2S LTD* Motilidade Lisina Indol Lactose Sacarose Cultura B Colorao da colnia em MacConkey SS Hektoen lactose

*LTD = L-triptofano desaminase


Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da pgina 24, identificar cada uma das culturas. Culturas: A________________________ B________________________ C________________________

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3. Reao sorolgica para confirmao dos resultados de identificao bioqumica. Fazer reao de aglutinao em lmina com as culturas A, B e C, utilizando os soros anti - S. flexneri, anti - E. coli O55 e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou negativo). Soro A Anti Escherichia coli O55 Anti - Shigella flexneri Anti Salmonella Cultura B

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Perfil Bioqumico e Motilidade de Algumas Enterobactrias Prova


E. coli Shigella Edwardsiella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Proteus Morganella Providencia tarda flexneri sp freundii pneumoniae cloacae marcescens mirabilis vulgaris morganii rettigeri + ou + + + + + ou - + ou +

Citrato Glicose + + Gs + Urease H2S LTD* Motilidade + ou Lisina + ou Indol + + ou Lactose + -

+ + + + + + -

+ + + + + -

+ +
+ ou -

+ + + ou -

+ + + + +

+ +
+ ou -

+
+ ou + ou -

+ +
+ ou -

+
+ ou -

+
+ ou -

+
+ ou -

+ + ou -

+ + -

+ + + -

+ + + + + -

+ +
+ ou -

+ -

+ + + + -

*LTD = L-triptofano desaminase

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