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Relatorio-escurecimento enzimatico

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde Departamento de Nutrição Disciplina de Bioquímica dos Alimentos

ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO POR POLIFENOLOXIDASE(PFO)

Discentes: Ana Gabriella Costa Lemos da Silva Hoziana Cunha de Medeiros Ramon Morais Lopes

Docente: Nély Holland

Natal/RN 2010.2

enediol ou grupos funcionais dienos conjugados para compostos carbonilas ativos. etc) estão separados da PFO em tecidos intactos e o escurecimento não ocorre. ácido clorogênico. os substratos fenólicos naturais (ácido caféico. as oxidases (polifenoloxidase. As reações que seguem as oxidações enzimáticas não são enzimáticas. o substrato fenólico é oxidado e o oxigênio serve como aceptor de hidrogênio. Na reação catalisada PFO. A polifenoloxidase contém o cobre como produto prostético.1 – INTRODUÇÃO No escurecimento enzimático. descascamento e contusão são suficientes para causa escurecimento enzimático. A fenolase ou a polifenoloxidase catalisa dois tipos de reação: a) Hidroxilação de monofenóis para difenóis. A exposição das superfícies de frutas e vegetais cortados ao ar resultam em rápido escurecimento devido à oxidação enzimática dos compostos fenólicos presentes para ortoquinonas. Assim. b) Oxidação de difenóis para ortoquinona. lipoxidase. referido como fenol hidrolase ou cresolase. na conversão de fenol. etc) são ativas somente nos primeiros passos da reação. que por sua vez polimerizam-se rapidamente para formar pigmentos marrons de melaninas. monofenol ou terosinase. . ascorbato oxidase. ácido protocatechico. podendo este ser removido. referida como atividade de catecolase ou polifenoloxidase. Normalmente. O escurecimento enzimático devido à PFO é de importância comercial particularmente em tecidos vegetais. tornando a enzima inativa. operações como corte.

Foram adicionadas 30 g de batata em água fervente por 1 minuto e outras 30 g por 2 minutos. O processo foi seguido com as três amostras seguintes. ácido cítrico. como amostra: batata.0 em 5 tubos de ensaio.5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos.0 e em seguida adicionados 0.5%. Foram pipetados 4 ml de catecol 0. 3.2 . inclusive a 0.05 M pH 6.05M pH 6.02%. A partir de soluções de ácido ascórbico 0. Foram adicionados também 0.2% em tampão fosfato 0. 0. nos 5 tubos de ensaio. para que em seguida a coloração obtida pudesse ser observada. Os tubos de ensaio foram encubados em banho-maria termostatizado a 40 °c durante 20 minutos.25%. . 0. 3 – METODOLOGIA 3.2 – OBJETIVOS Inativar termicamente a polifenoloxidase (método do branqueamento).2% em tampão fosfato 0.5 de amostra obtida anteriormente. em liquidificador com 300 ml de água destilada. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0. maçã e berinjela.5%. as quais foram adicionadas. respectivamente. Em seguida cada amostra foi resfriada em água fria e homogeneizada.Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) No procedimento foram utilizados os seguintes componentes. verificar o efeito do ácido ascórbico e do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase e verificar o efeito do ácido ascórbico.05% e 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela.5 ml de água destilada e 0.Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0. para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor. banana.1%.1.

1%. 30 ml de cada concentração foram colocadas em placas de Petri numeradas.1%.5%. Uma berinjela foi descascada e cortada em fatias de 0.25%.5%. As amostras foram trituradas com bastão de vidro em suas respectivas placas.02% e cloreto de sódio a 1.2% em tampão fosfato 0.7 cm de espessura e foi colocada uma fatia sobre cada placa de Petri. Foram adicionados também 0. 0. ácido cítrico a 0. 0.5%. foram preparadas soluções de ácido ascórbico de concentrações de 0.02%.0% e 0.5%.05% e 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela Foram preparadas 30 ml de solução de ácido ascórbico a 0.0%.5%. para que então pudessem ser observadas as colorações e a ocorrência ou não de escurecimento enzimático em cada concentração de inibidor. nos 5 tubos de ensaio. 0.25%.3 . .Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase Foram adicionados 4 ml de solução de catecol 0.Efeito do ácido ascórbico.5 ml de extrato de PFO e deixados em repouso por 10 minutos. as quais foram adicionadas. inclusive a 0.4 .0 em 5 tubos de ensaio.05% e 0. ácido cítrico. bissulfito de sódio a 0. A partir de soluções de bissulfito de sódio 0.3. 0. para que em seguida fossem observadas suas colorações diante de cada solução. 3.5% e 1. 0.05M pH 6.

Para inativação do PPO da banana foi necessário 2 minutos na água em temperatura de fervura.4 – RESULTADOS E DISCUSSÕES 4. Esse processo inativa a enzima polifenoloxidase (PPO). pois ao fim desse tempo a .Inativação térmica da PFO – tratamento térmico (branqueamento) A mudança de cor de acordo com tempo em que as amostras foram imersas em água fervente pode ser observada na tabela 1. uma vez que a exposição da mesma a altas temperaturas pode causar mudanças na sua forma dimensional (desnaturação) tirando sua capacidade de catalisar reações de oxidação dos compostos fenólicos. onde esse é exposto à água em temperatura de pré-fervura e em seguida exposto a uma baixa temperatura. concluise isso pela ausência de cor do líquido.1. catecol e água destilada ao calor é eficiente para inativar a PPO em apenas 1 minuto. Consiste na promoção de um choque térmico no alimento.: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de intensidade leve O branqueamento é um processo bastante utilizado na indústria de alimentos. as quais são responsáveis pelo escurecimento das frutas. O resultado mostrou que o a exposição da mistura contendo extrato da batata. Tabela 1: Mudança de cor das amostras de acordo com o tempo de imersão em água fervente PFO Batata Banana Maça Berinjela 1 minuto ++ ++ 2 minutos + Legenda: .

4. Isso indica que a enzima não foi inativada e desenvolveu sua atividade catalítica da oxidação dos fenóis. A exposição da mistura contendo catecol. A exposição da mesma mistura durante 1 minuto na água em temperatura de fervura resultou em um líquido de cor classificada como marrom de intensidade média. água destilada e extrato de banana gerou uma solução incolor.02% + ++ + ++ +++ + ++ + ++ PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: . pois o resultado foi um líquido incolor. a exposição da mistura contendo catecol.Efeito do ácido ascórbico na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de ácido ascórbico pode ser observada na tabela 2. Assim como na batata. gerando escurecimento.50% 0. a mistura gerou respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade média e marrom de intensidade leve. água destilada e estrato de maçã durante 1 minuto foi o suficiente para inativar a enzima PPO. água destilada e extrato de berinjela à água em temperatura fervente durante 1 e 2 minutos não foi suficiente para inativar a enzima PPO.: incolor +: marrom de intensidade muito leve .mistura contendo catecol. indicando que houve atividade enzimática de escurecimento realizado pela PPO. Tabela 2: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de ácido ascórbico Ácido ascórbico 0.2 .05% 0.25% 0.10% 0.

a mínima concentração do ácido ascórbico capaz de não permitir a reação de escurecimento enzimático é igual a 0. responsáveis pela coloração amarronzada dos frutos injuriados mecanicamente ou cortados. 4. sendo assim a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenóis não será iniciada e as frutas permanecerão com a cor de colheita por um bom tempo. Já na banana a concentração de 0. Essa mínima concentração permaneceu para manutenção da cor de colheita da maçã e da berinjela. essa ação favorece a inibição da atividade da polifenoloxidase. a qual tem máxima atividade por volta de pH 6. . isso indica que essa concentração não foi capaz de inibir a reação de escurecimento. conhecido popularmente por Vitamina C.10%.3 . impedindo-as de se polimerizarem formando as melaninas. A propriedade já citada desse ácido.Efeito do bissulfito de sódio na atividade da polifenoloxidase A mudança de cor das amostras de acordo com as diferentes concentrações de bissulfito de sódio pode ser observada na tabela 3. Para a banana a mínima concentração foi 0. atua reduzindo as ortoquinonas ao fenol anterior. Como se pode perceber através da análise da tabela 2.25%.10% foi responsável por uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. Outra ação desse ácido é a sua capacidade de diminuir o pH do meio.++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária O ácido ascórbico é um potente antioxidante que atua de duas formas na manutenção das cores naturais das frutas.

que aquele é mais eficaz. A menor concentração desse composto responsável pela inativação da polifenoloxidase foi igual a 0.5% 0.05% 0. mesmo se o escurecimento tiver sido iniciado e estiver nas fazes citadas. Ela também atua revertendo a reação de hidroxilação dos fenóis em orto-difenois e reação de oxidação dos orto-difenois em orto-quinonas.10%. o cobre. Essa alta eficácia é garantida pela capacidade que esse composto de fórmula NaHSO3 tem de se complexar ao grupo prostético da enzima polifenoloxidase.10% 0.25% 0.: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++:marrom de intensidade leve +++:marrom de Intensidade intermádiária Comparando a ação do bissulfito sobre a conservação da coloração natural dos frutos com a ação do acído ascórbico. pela análise da tabela 3. podemos perceber. .Tabela 3: Mudança de cor das amostras de acordo com as concentrações de bissulfito de sódio Bissulfito sódio 0. Quando isso ocorre essa enzima perde sua capacidade de hidroxilação dos fenois. o bissulfito tem a capacidade de reverter. Para que a inativação ocorrese foi necessário uma mínima concentração de 0. Essa mesma concentração usada na banana gerou uma coloração classificada como marrom de intensidade leve. não ocorrendo o escurecimento enzimático. Isso demonstra que ela não foi inativada.02% para batata.02% ++ + +++ ++ ++ de PFO batata PFO banana PFO maçã PFO berinjela Legenda: . Ou seja. maçã e berinjela.

cítrico 1.4 .5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.05% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. Tabela 4: Mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico.5% Berinjela + 30 mL ác. o bissulfito de sódio tem seu uso limitado pela legislação por ser tóxico e seu resíduo causar vários problemas ambientais (Oga. 1996).5% RESULTADO ++++++ ++ +++ ++++ + + ++ +++++ ++++ Legenda: -: incolor +: marrom de intensidade muito leve ++: marrom de iIntensidade leve +++: marrom de intensidade intermediária .02% Berinjela + 30 mL NaCl 1. ácido cítrico. bissulfito de sódio e cloreto de sódio na atividade da polifenoloxidase da berinjela A mudança de cor das amostras de acordo das diferentes concentrações de ácido ascórbico. ácido cítrico.25% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio pode ser observada na tabela 4.0% Berinjela + 30 mL ác.Apesar dos resultados bastante efetivos na inativação da polifenoloxidase. 4. cítrico 0. ácido cítrico.0% Berinjela + 30 mL NaCl 0. bissulfito de sódio e cloreto de sódio PLACAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AMOSTRA Berinjela + 30 mL água Berinjela + 30 mL ác. ascórbico 0.Efeito do ácido ascórbico.5% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.1% Berinjela + 30 mL NaHSO3 0.

normalmente com o aumento da concentração do bissulfito de sódio ocorre diminuição da atividade da polifenoloxidase.05% e 0. os mesmos apresentaram respectivamente uma coloração classificada como marrom de intensidade forte e marrom de intensidade intermediária. pois o resultado foi um líquido classificado como incolor.1% e 0.++++: marrom de intensidade forte +++++: marrom de intensidade muito forte ++++++: marrom super intenso Agentes acidulantes são freqüentemente usados para manter o pH do meio mais baixo que o pH ótimo para a ação catalítica das enzimas em alimentos.05%. málico e fosfórico (ZEMEL et all.1% geraram uma líquido incolor. ou nos compostos de reação. Exemplos de acidulantes que podem inibir o escurecimento enzimático são os ácidos cítrico.0%. No entanto. Ele pode agir como redutor do pH ou como quelante do cobre da enzima polifenoloxidase. Na prática experimental foi utilizado o ácido cítrico que age de duas formas para o cancelamento do escurecimento enzimático. indicando a inativação da enzima. O bissulfito de sódio pode agir diretamente nas enzimas pela diminuição do número de pontes dissulfeto no centro catalítico (SAYAVEDRA-SOTO e MONTGOMERY. 1988.5% e 1. A remoção desses íons do sítio ativo por quelação inativa a enzima. WALKER e FERRAR.5% garantiram uma coloração para o líquido que circundava a berinjela classificado como marrom de intensidade muito leve e a concentração 0. para a prática experimental. formando sulfonatos sem coloração. 1999). 1998). Segundo Macedo (2005) as polifenoiloxidases são enzimas que possuem os íons Cu2+.02 uma cor marrom de iIntensidade leve. o ácido cítrico não foi um bom inibidor do escurecimento enzimático nas concentrações 0. . 1990). No entanto na literatura os resultados para essa prática não são coerentes com esse resultado. 1995.25% e 0. Na prática experimental a melhor concentração para inativação da polifenoloxidase foi 0. As concentrações 0. ARAÚJO. As concentrações 0. com isso pode se concluir que o aumento da concentração desse ácido provoca diminuição da atuação da polifenoloxidase da berinjela. que resulta em um líquido incolor. ou reduzindo-os aos fenóis precursores (WONG.

além da enzima polifenoloxidase se ligar ao seu substrato. Isso indica a fraca ação do NaCl para o bloqueio dessa reação. a enzima foi obtida através do extrato de berinjela. também apresenta ação redutora. 1998). impedindo a formação dos pigmentos escuros (SAPERS e MILLER. onde as únicas enzimas que estavam agindo eram provenientes da superfície do tecido vegetal que tinha sido cortado da berinjela. O ácido ascórbico. que ficou em maior concentração.05% foi responsável pela coloração do líquido que circundava a berinjela classificada como marrom de intensidade forte e a concentração 0. O ácido ascórbico foi usado na presente prática experimental para inativação da polifenoloxidase da berinjela em dois momentos. causando sua inibição.A imersão do tecido vegetal em água após injúria mecânica ou corte faz com que a reação de escurecimento enzimático não seja realizada. Esse fato pode ser explicado por duas causas. por esse motivo na água a reação de escurecimento enzimática é mais lenta. é preciso o oxigênio. já que grupos diferentes realizaram os experimentos. podendo agir com maior eficácia. no primeiro experimento contendo ácido ascórbico e berinjela. Outro motivo pode ter sido advindo de erros na legenda. isso pode ter resultado em uma melhor extração da polifenoloxidase. os compostos fenóis. além de atribuir valor nutricional aos alimentos. (2) reduzindo as quinonas a sua forma anterior de fenóis.5% resultou em um líquido incolor. quando comparado com o segundo experimento. O NaCl não apresentou um bom resultado para o bloqueio da reação de escurecimento enzimático. complexando o cobre do grupo prostético da PPO. a qual foi classificada como marrom super intenso. . no entanto ela ainda se processa e na prática experimental a imersão da berinjela em água destilada resultou na coloração mais intensa do estudo. Na água a concentração do O2 é muito limitada quando comparada com a concentração do ar.1% gerou uma coloração marrom de intensidade muito forte. no segundo a mesma concentração promoveu uma coloração classificada como marrom de iIntensidade leve. A concentração de 0. no primeiro a concentração de 0. pois para ela ocorrer é necessário. ou vitamina C. Juntamente com seus sais neutros compõe um dos principais grupos de antioxidantes empregados em produtos vegetais com o intuito de prevenir o escurecimento e outras reações oxidativas de duas maneiras: (1) agindo diretamente na enzima.

SAYAVEDRA-SOTO.OGA. Aditivos alimentares. . 6 . W. 2003. S. p. p. In: Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Atheneu. J. 3. 1999. ed.SAPERS. n. v. S. D. M.. G. 319-329. n.. 372. L. Análise da imagem em química analítica: empregando metodologias simples e didáticas para entender e prevenir o escurecimento de tecidos vegetais. Química de alimentos: teoria e prática. A. 53. MONTGOMERY.LUPETTI. M. R.ARAÚJO.1998. p.REFERÊNCIAS 1 . v. J. 1988. Food Sci. 2. MILLER. Browning inhibition in fresh-cut pears. 7 . p. Zaragoza: Acríbia. Karina et al. A. 1995. Cristine et al. Estudo das atividades de peroxidades e polifenoloxidase de guariroba (Syagrus oleracea Becc) sob a ação de diferentes inibidores. 2005. L. 5 .. and sulfur dioxide on color of dried apples.. M. parte 5. 2.WONG. 4 . storage. 63. 342-346. 2 – CARNEIRO. Response contour diagrams to describe effects of moisture. 405-440. p. Química de los alimentos: mecanismos e teoria. 233-236. São Paulo: Química Nova. 365. 2. Food Sci. Goiás: Acta Scientiarum: Biological Sciences. J. 1996. temperature. W. Viçosa: UFV. 643-644.

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