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Bioqumica de los alimentos Prctica # 7

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Facultad de Ingeniera Qumica e Industrias Alimentaras Escuela Profesional de Industrias Alimentaras


ASIGNATURA: BIOQUIMICA DE LOS ALIMENTOS TEMA:

DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE MICROKJELDAHL Y METODO DE SORENSEN.

DOCENTE:

Jos Reupo Periche


ALUMNO: SANDOVAL BANCES RICARDO. QUEVEDO OLAYA JHONSON. REQUEJO ESCURRA MIGUEL.

CICLO: 2009 - I

Lambayeque Agosto del 2009

Bioqumica de los alimentos Prctica # 7

INTRODUCCIN

Las protenas existen en los alimentos en combinacin fsica o qumica con carbohidratos o lpidos. Las glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne est relacionado con cambios qumicos en las protenas. Las protenas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullicin, panificacin, asado) las cadenas laterales de aminocidos se degradan o interactan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azcares reductores) para conferir sabores tpicos. El calentamiento excesivo puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo. El analista de alimentos comnmente desea saber el contenido protico total de los alimentos, aunque dicho contenido est conformado por una mezcla compleja de protenas. Actualmente todos los mtodos para determinar el El

contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica.

aislamiento y pesado directo de la protena proporcionara un mtodo absoluto, sin embargo, dicho mtodo es llevado a cabo slo a veces en investigaciones bioqumicas pero es completamente imprctico para el anlisis de alimentos.

DETERMINACIN DE PROTENAS 2

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POR EL MTODO DE MICROKJELDAHL Y METODO VOLUMETRICO SORENSEN I. OBJETIVOS El estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl y Sorensen. Familiarizarse con los equipos y el procedimiento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl y la recuperacin de amonaco. Aprender a realizar los clculos pertinentes para la determinacin de nitrgeno en protenas. Determinar la concentracin de nitrgeno presente en la muestra para luego ser transformado a travs de un factor en protena. II. FUNDAMENTO TERICO: 2.1. - PROTENAS El termino protena fue utilizado por primera vez por el qumico alemn Gerardus Mulder, en 1838, tomo este nombre del vocablo griego PROTERIOS, que significa primordial nivel primario. Las protenas son un grupo de biopolmeros constituidos de aminocidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. Las protenas como un grupo de biomoleculas, desempean una gran variedad de funciones, algunas participan en la contraccin muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan molculas pequeas. Desde un punto de vista qumico, las protenas son polmeros grandes. Son poliamidas y los monmeros de los cuales derivan son los cidos aminocarboxlicos. Una sola molcula protenica contiene cientos, e incluso miles, de unidades de aminocidos, las que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El nmero de combinaciones diferentes, es decir, el nmero de molculas protenicas distintas que pueden existir, es casi infinito. Es probable que se necesiten decenas de miles de protenas diferentes para formar y hacer funcionar un organismo animal; este conjunto de protenas no es idntico al que constituye un animal de tipo distinto. Las protenas son necesarias para la formacin y renovacin de los tejidos. Los organismos que estn en perodo de crecimiento necesitan un adecuado suministro de protenas para su aumento de peso. Los organismos adultos que tienen su peso estabilizado estn en equilibrio dinmico, en el que sus 3

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protenas se degradan y se regeneran continuamente, aunque su composicin permanece constante. Para ello debe existir en la dieta un suministro regular y continuo de protenas. Las protenas pueden llevar a cavo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en la composicin y secuencia de aminocidos. Las protenas tambin se clasifican segn su composicin, las que se forman solo de residuos de aminocidos y no tienen otras biomoleculas son PROTENAS SIMPLES; no todas las protenas son solubles en agua, de hecho las protenas insolubles son esenciales para dar soporte y mantener la integridad estructural de las clulas y organismos. 2.2. - ANLISIS DE PROTENAS POR EL MTODO KJELDAHL: En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso bsico del conocido mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solucin de cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el nitrgeno de la muestra. El resultado del anlisis representa el contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no proticos. Este mtodo ha sufrido varias modificaciones. As, Kjeldahl us originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin, sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin con cido sulfrico aadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugiri la adicin de sulfato de potasio para elevar el punto de ebullicin de la mezcla de la digestin para acortar la reaccin. Por lo tanto, el procedimiento de esta tcnica es ms correctamente conocido como Mtodo Kjeldahl-Wilforth-Gunning.

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2.2.1. - REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL:

1. DIGESTIN Transformacin de las distintas formas de Nitrgeno presente en la muestra a forma amoniacal (NH4+), mediante una digestin cida y en caliente en presencia de un catalizador. (1) n - C -NH2 + mH2SO4
Protena catalizadores calor

CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

2. NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN El NH4+ es posteriormente neutralizado a NH3, mediante una base fuerte en exceso, y destilado por la accin del vapor. El amoniaco liberado es recogido en forma de NH4+ mediante burbujeo del destilado en una disolucin de cido brico. (2) (NH2)SO4 + 2 NaOH (3) NH3 + H3BO3 (cido brico) 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O NH4 + H2BO3- (in borato)

3. TITULACIN Que se valora posteriormente con una solucin de cido clorhdrico diluida de concentracin conocida. El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl estandarizado: (4) H2BO3- + H+ H3BO3

2.2.3. DESVENTAJAS DE USA EL MTODO DE KJELDAHL Constituyen fuentes de error en este mtodo son: La inclusin de nitrgeno no protico como parte de la protena. La prdida de nitrgeno durante la digestin. La digestin incompleta de la muestra. Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido (para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por calor y la consecuente prdida de amonaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestin de 370-410C. Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado selenio o la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente; las condiciones 5

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son an ms crticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores. 2.2.4. RECOMENDACIONES PARA EL ANLISIS DE PROTEINAS En la prctica comercial se tienen que analizar un gran nmero de muestras diariamente, as que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de anlisis. En el anlisis de la harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra usando una cantidad conocida de cido sulfrico 0.1253N, y titulando (mediante una bureta de lectura invertida) con hidrxido de sodio 0.1253N, as se hace posible reportar el porcentaje de protena directamente de la lectura de la bureta. 2.2.5.- FORMULA PARA EL CLCULO: % Protena = (VMuestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x 100 M Donde: 1.4008 mg de nitrgeno por cada ml de gasto de disolucin de valorada de HCl 0.1 N VMuestra ml de cido gastados en la valoracin de la muestra VBlanco ml de cido gastados en la valoracin del blanco NAcido normalidad del cido sulfrico 0.014 peso del meq de nitrgeno, en g F factor de conversin de nitrgeno a protena Mmuestra peso en g de la muestra V: gasto de HCl 0.1 N en la muestra. M: masa de la muestra, en gramos factor:6.25: para carne, pescado, huevo, leguminosas y protenas en general. 5.7: para cereales, trigo, harinas refinadas y derivados de soya. 6.38: leche. 5.55: gelatina. 5.95: arroz. 5.83: avena, cebada, centeno. 5.18: almendras. 5.83: trigo (grano entero).

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2.3.- DETERMINACIN DE PROTEINAS POR MTODO SORENSEN 2.3.1.- APLICACIN DEL MTODO DE SORENSEN:

VOLUMTRICO DE

Sirve para determinar N amnico en muestras lquidas o extractos. La finalidad es poder determinar la concentracin de amonaco o grupos amino libre de aminocidos, pptido y protenas. Se basa en que el formaldehido va a actuar bloqueando los grupos amino, dando como resultado la liberacin de los grupos carboxlico con el

consiguiente aumento de la acidez, la cual se valor con hidrxido de sodio 0.1 N. Es til para dosar aminocidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrlisis de una protena, o amonio despus de la destruccin de materia orgnica en el mtodo de Kjeldahl, etc.

2.3.2.- MTODO DE SORENSEN: 1. Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftalena como indicador. Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que aparece una dbil coloracin rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro y llegar a pH 8. 2. Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftalena y titular de inmediato la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este ltimo valor para el clculo de N amnico y el primero para el clculo de la acidez. 2.3.3.- FORMULA PARA EL CLCULO:
Entonces se calcula el % de protena con la formula:

% PROTEINAS = V x Factor x 5 m Donde: Factor casena = 0.1909. 5 = protenas totales.

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III.- MATERIAL Y REACTIVOS: 3.1.- MATERIAL 1 matraz de digestin Kjeldahl con capacidad de 125 ml. 1 matraz de Erlenmeyer de 250 ml. 1 matraz volumtrico de 100 ml. 1 mechero de Bunsen. 1 soporte universal 1 pipeta de 10 ml. 1 frasco gotero de 25 ml. 1 piseta grande con agua destilada.

1 pinzas largas.

Perlas de vidrio

3.2.- EQUIPO 1 Equipo Destilador 1 Equipo de titulacin REACTIVOS cido sulfrico 98%. Mezcla catalizadora para la digestin: 3 g de xido de titalico (TiO2) + 10g de sulfato de potasio + 1g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por la coordinacin de laboratorios). Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%. cido brico al 4%. cido clorhdrico 0.1N (solucin valorada). Hidrxido de sodio al 50%. Grnelas de Zinc

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3.3.- ELABORACION DE REACTIVOS 1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%. Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solucin de rojo de metilo en un frasco gotero. 2.- cido Brico.- Disuelva de cido brico (en cristales) en agua destilada hirviendo. Despus de que se enfre transfiera la solucin a un frasco tapado. Se conserva indefinidamente. 3.- cido Clorhdrico 0.1N.- Prepare un litro y valrela con una solucin de NaOH de la misma normalidad. 4.- Hidrxido de Sodio al 50%.- Disuelva 100g de perlas de hidrxido de sodio en 100 ml. de agua destilada. Almacene la solucin en un frasco mbar con tapn de vidrio. 6.Catalizadores para la Digestin.- Mezcle 2.5g de dixido de selenio (SeO2), 100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 . 5H2O).

IV.- PROCEDIMIENTO: 4.1.- DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE KJELDAHL a. DIGESTIN 1. Pese exactamente 0.1g de harina (seco) en un matraz de micro-Kjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las paredes o al cuello del matraz. 2. Aada 3.0 ml. de H2SO4, una perlas de ebullicin y aproximadamente 1.0 g de mezcla catalizadora. 3. Someta a digestin la muestra en una hornilla de digestin del multiKjeldahl, con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestin, rotando el matraz de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestin terminar cuando el color de la muestra sea Azulverde claro. El proceso tomar aproximadamente 15 a 30 minutos. 4. Enfre el matraz durante unos 4min. a temperatura ambiente.

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b. DESTILACIN 1. Aada 4.0 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida. Mezcle y 4 gotas de fenolftalena. 2. Se aade disolucin de hidrxido de sodio al 40 % hasta neutralizar (se vera un cambio de color azulino). 3. Luego de ese Cambio de color agregar 2 ml de NaOH en exceso. 4. Agregar 12 14 grnelas de zinc 5. Colocar el baln en una de las hornillas para destilacin y conectarlo al tubo condensador correspondiente mediante un bulbo de seguridad de vidrio, ajustar bien las uniones.

6. Colocar en un Erlenmeyer o beaker de 100 ml, 5.0 ml de cido brico al 4% para retener los gases de amoniaco y 4.0 gotas del indicador rojo de metilo. 7. Luego el Erlenmeyer o beaker se coloca en la parte inferior del tubo condensador de tal manera que el extremo se encuentre sumergido en el cido brico. 8. Hacer circular el agua de cao por el condensador de Kjeldahl y comenzar la destilacin a temperatura controlada. 9. Continuar la destilacin hasta que se haya eliminado el amoniaco, comprobar con papel de tornasol o Fenolftalena. 10. Retirar el Erlenmeyer los 50 primeros ml del destilado.

c. FASE DE TITULACIN. 1. Titular el contenido del Erlenmeyer con una solucin de acido clorhdrico (HCL) al 0.1 N (cada ml de esta solucin equivale a 1,4008 mg de Nitrgeno) hasta que vire de color (amarillo a rojo verde a azul) esto depende del indicador que se adiciona. Efectuar los clculos de acuerdo a la muestra utilizada y el factor de conversin de acuerdo a la muestra. Un color violeta indica el punto final de la titulacin. Comprese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg est dado por miliequivalentes del cido X 14 (el peso equivalente del N).

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1. NOTA: El contenido porcentual de protena %P de la muestra se calcula: % P = (a-b) N (1,4008) F M a: Gasto en ml de la disolucin de cido clorhdrico (0,1 mol/1), en la muestra. b: Gasto en ml de la solucin de cido clorhdrico (0,1 mol/1), en el blanco. F: Factor de conversin para calcular el contenido proteico. M: Peso en gramos de la muestra. 1,4008 mg de nitrgeno por cada militro de gasto de disolucin valorada de cido clorhdrico. 4.2.- DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO VOLUMETRICO SORENSEN PROCEDIMIENTO 1- PARA LA LECHE: a. DETERMINACIN DE LA DENSIDAD:

Para determinar la densidad se utiliza el lactodensmetro y un termmetro. Verter la leche en un a probeta suficientemente grande para que entre libremente el lactodensmetro (anotar la lectura). Luego medir la temperatura a que se encuentra la leche (anotar la lectura). usando la sgte. formula: D = L 0.2N. Donde: L = lectura del lactodensmetro. 0.2 = factor de correccin. N = (T 15) C .diferencia de temperatura a 15 C. T= temperatura a la que se encuentra la leche.

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b. DETERMINACION DE LA ACIDEZ Tomar 20ml de la muestra (leche) y verter en un vaso precipitado y 10ml de muestra testigo a parte (para que sirva de referencia del color). Agregar a la muestra 2 3 gotas de fenolftalena. Ahora titular la muestra con NaOH 0.1 N (anotar el gasto). Observar el viraje de color ligeramente Grosella por 20 a 30 segundos. El viraje nos indicara la culminacin de la titulacin. Para determinar la acidez se emplea la siguiente formula: % A = G x N x 100 x F Vmuestra Volumen mx. = 0.14 % - 0.18 % en acido lctico. c. PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL % DE PROTEINAS

1. Agregar ahora 4.0 mL de formaldehido (HCHO) neutro (neutralizando con NaOH 0.1N), se agrega el formaldehido a la leche y desaparece el color rosado.

2. Titular nuevamente con hidrxido de sodio (NaOH) al 0.1 N.

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V.- CLCULOS 5.1.- % PROTENAS POR EL MTODO DE KJELDAHL 2. El contenido porcentual de protena %P de la muestra se calcula: % PROTEINAS = (VMuestra - VBlanco) X NAcido X (1.4008)
X

M
VMuestra = 1.5 ml: Gasto en mL de la disolucin de cido clorhdrico (0,1 mol/L), en la muestra. VBlanco = 0.0 ml: Gasto en ml de la solucin de cido clorhdrico (0,1 mol/1), en el blanco. F = 5.7: para cereales, trigo, harinas refinadas. M = 0.1 g: Peso en gramos de la muestra. N = 0.1 Reemplazando los datos en la formula: % PROTEINAS = (1.5) (0.1) (1,4008) 5.7 0.1 % PROTEINAS = 11.98 % Vegetal = 5.70 Animal =6.25 Leche = 6.38

El factor ser segn el tipo de protena.

5.2.- % PROTENAS EN LECHE POR EL MTODO DE SORENSEN

1. DETERMINACIN DE LA DENSIDAD DE LA LECHE: La temperatura a la que se encontraba la leche fue: 22.2 C. La lectura del lactodensmetro fue: 25 QUEVENNE. Aplicando la formula tenemos: D = L 0.2 N D= 25 + 0.2 (22.2 - 15) D= 26.44 Por lo tanto la densidad de la leche se expresa 1.027 Tomamos el signo + por que la diferencia de T esta por encima de los 15C 13

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2. DETERMINACIN DE LA ACIDEZ DE LA LECHE: El volumen de base gastada V= 3.5ml. F= 0.09 calculando la acidez :

% A = 3.5 x 0.1 x 0.09 x 100 = 0.1534 %. 20 x 1.027

3. EL CONTENIDO PORCENTUAL DE PROTENA %P DE LA MUESTRA SE CALCULA: % PROTEINAS = Vg (NaOH) x Factor x 5 m f = 0.1909: Factor casena 5= protenas totales. Vg(NaOH) = 3.5ml. Reemplazando los datos en la formula: % PROTEINAS = 3.5 x 0.1909 x 5 20 % PROTEINAS = 0.167%. El valor mx. = 3.0- 3.3 %(normalmente).

VI.- RESULTADOS: TABLA # 0.1 RESULTADO DEL % DE PROTEINAS EN LAS MUESTRAS: DETERMINACION DE PROTEINAS Mtodo usado Kjeldahl Sorensen Muestra Harina de trigo Leche %Protenas 11.98% 0.167 % El valor mx.=3.0- 3.3% calculadas %Protenas por tablas 13.3% 3.5%

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TABLA # 0.2: CONTENIDO PROTICO EN LOS ALIMENTOS


CARNES RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO PECHUGA DE POLLO PESCADO BACALAO COCINADO ATN EN ACEITE ENLATADO PRODUCTOS LCTEOS LECHE ENTERA LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA QUESO CHEDDAR HUEVOS CEREALES ARROZ, INTEGRAL, CRUDO ARROZ REFINADO, CRUDO HARINA DE TRIGO INTEGRAL HARINA DE MAZ SPAGHETTI, SECO ALMIDN DE MAZ FRUTAS Y VEGETALES PAPA ENTERA, CRUDA ESPRRAGOS VERDES TAPIOCA FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES SOYA SECA FRUTAS Y SEMILLAS MANZANA ENTERA, CRUDA ALMENDRAS ENTERAS %PROTEINAS 28.6% 17.1% 27.3% %PROTEINAS 28.5% 24.2% %PROTEINAS 3.5% 35.9% 25% 12.9% %PROTEINAS 7.5% 6.7% 13.3% 7.8% 12.5% 0.3% %PROTEINAS 1.6% 2.5% 0.6% 22.3% 34.1% %PROTEINAS 0.2% 18.6%

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VII.- DISCUCIONES Y CONCLUSIONES: % de protenas con respecto a la de la leche no es aceptable, aprox. y por lo tanto al ser consumida no cumplira con todos los fines de nutritivos. Con la muestra procesada por el mtodo de Kjeldahl, arrojo un resultado de %p= 11.98 %, la cual al compararlos con los datos obtenidos por tablas de asemejan, por lo tanto es aceptable para el consumo. Es recomendable tener un listado de factores de conversin de protenas de diversos alimentos para hacer ms fcil el clculo. Hay que verificar el buen funcionamiento de todo el equipo Kjeldahl, Digestor, extractor y destilador, para evitar posteriormente errores de clculos. Lavar con agua destilada antes de usar los refrigerantes y los extremos de recoleccin del destilado VIII.- ANEXOS: DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE KJELDAHL 1. DIGESTIN

2. NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

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3. TITULACIN

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE LA DENSIDAD:

DETERMINACIN DE LA ACIDEZ DE LA LECHE:

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IX.- BIBLIOGRAFA ALMANZA, F.; BARRERA, E. 1991 Tecnologa de Leches y Derivados; Editorial Unisur; Bogot, Colombia. CHEFTEL, J y H. CHEFTEL. 1983, Introduccin a la bioqumica y tecnologa de los alimentos. Vols I y II, Zaragoza. Acribia. HART, F. y H. FISCHER. 1998. Anlisis moderno de los alimentos, 3a reimpresin. Zaragoza. Acribia. PEARSON, L. 1998. Tcnicas de laboratorio para el anlisis de los alimentos, Acribia. Zaragoza. VOLMER, G.; JOST, J. et al. 1999. Elementos de Bromatologa Descriptiva;; Editorial Acribia; Zaragoza, Espaa; 1.999. WALSTRA, P.; Jennes, R. 1987. Qumica y Fsica Lactolgica; Editorial Acribia; Zaragoza, Espaa. ZIEGLER, E.E.; FILER, LJ. 1997. Conocimientos Actuales sobre Nutricin, Organizacin Panamericana de la Salud; Sptima Edicin; Washington, D.C. A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Methods of Analysis. Washington, D.C. Official

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